Innowacyjne metody monitoringu jako przyszłość

Innowacyjne metody monitoringu jako przyszłość

PIOTR ŁASZCZYCA, MARIA AUGUSTYNIAK, ANDRZEJ PASIERBIŃSKI,
EUGENIUSZ MAŁKOWSKI, MIROSŁAW KWAŚNIEWSKI, ANDRZEJ WOŹNICA,
PAWEŁ MIGULA
Uniwersytet Śląski w Katowicach
Wydział Biologii i Ochrony Środowiska
Innowacyjne metody monitoringu
jako przyszłość zintegrowanych analiz środowiskowych
w racjonalnym gospodarowaniu zasobami wodnymi
Narastająca lawinowo wiedza o zanieczyszczeniach środowiska wodnego oraz
postęp w metodach analiz środowiskowych powodują konieczność wdrażania
nowych metod monitoringu biologicznych
elementów jakości wody. Metody takie
(standaryzowane biotesty ekotoksykologiczne, analiza wielospektralnych obrazowań satelitarnych szaty roślinnej, analiza
bioróżnorodności mikroorganizmów wodnych technikami metagenomicznymi i poprzez chromatograficzne profilowanie składu bakteryjnych fosfolipidowych kwasów
tłuszczowych) wdrożono w monitoring badawczy i operacyjny prowadzony w latach
2010–2013 w zbiorniku goczałkowickim
w ramach Projektu ZiZOZap. Uzyskane wyniki dokumentują poznawczą i praktyczną
wartość wdrożonych metod do oceny jakości wód i tworzenia podstaw do podejmowania decyzji w zarządzaniu zbiornikami
zaporowymi.
■ Monitoring jako podstawa wspo-
magania zarządzania zbiornikami
wodnymi
Zbiornik
goczałkowicki (ZG), ze
względu na znaczenie hydrologiczne, gospodarcze i przyrodnicze, został wybrany jako modelowy obiekt badań w projekcie „Zintegrowany system
wspomagający zarządzaniem i ochroną zbiornika zaporowego” (POIG
01.01.02-24-078/09 – ZiZOZap). Monitoring badawczy i operacyjny prowadzony w latach 2010–2014 miał na celu
scharakteryzowanie zachodzących tu
292
Rys. 1. Lokalizacja punktów monitoringu prowadzonego w Projekcie ZiZOZap (Geoportal
ZiZOZap – http://geoportal.zizozap.pl/zizozapgeoportal)
zjawisk hydrologicznych i ekologicznych oraz zasilenie danymi modeli cyfrowych, które pozwalają na prognozowanie i wspomaganie zarządzania pracą zbiornika.
Zakres monitoringu odzwierciedla regulacje zawarte w Ramowej Dyrektywie Wodnej, rozporządzeniach
i przewodnikach metodycznych określających zasady monitoringu, a także
aktach prawnych dotyczących ochrony środowiska i kontroli zagrożeń chemicznych. Zespół realizujący projekt
przetestował i zastosował innowacyjne
metody monitoringu, będące odpowiedzią na wyzwania związane z antropopresją i postępami ekologii środowiska
wodnego, w tym: badanie szaty roślinnej zbiornika przez analizy wielospektralnych obrazowań satelitarnych terenu, metody mikrobiotestów do badań
ekotoksykologicznych oraz analizy metagenomiczne i analizę fosfolipidowych
kwasów tłuszczowych (PFLA) jako zaawansowane metody mikrobiologii środowiskowej.
Gospodarka Wodna nr 8/2014
■ Monitoring
ekotoksykologiczny
– wczesne ostrzeganie o zagrożeniach
Chemiczne zagrożenie środowiska
odzwierciedla liczba substancji w bazie Chemical Abstract Services (CAS)
– w maju 2014 r. wynosiła ona ponad
88 milionów i wykazywała w ciągu 5 lat
dzienny wzrost o ok. 22 tysiące. Około 75% tych substancji jest dostępnych
w handlu, a kilkanaście tysięcy, podlegając masowemu obrotowi, może trafić
do środowiska. Duża liczba substancji
uniemożliwia skuteczną ich identyfikację. Rozwiązaniem są biotesty ekotoksykologiczne, w których zagrożenie
jest oceniane na podstawie reakcji organizmu wskaźnikowego [3, 6]. W monitoringu ZG zastosowano biotesty:
Daphtoxkit F, Ostracodtoxkit F, Algaltoxkit F i Phytotoxkit (MicroBioTests Inc.,
Belgia) oraz test MARA (Microbial Array
for Risk Assessment Assay – NCIMB
Ltd. – Wielka Brytania). W testach tych
bioindykatorami są standardowe szczepy rozwielitki Daphnia magna, małżoraczków Hetetocypris incongruens, zielenic Selenastrum capricornutum oraz
siewki sorgo, rukwi i gorczycy. Organizmy eksponuje się w okresie od 24 godzin do 6 dni na działanie prób wody lub
podłoża pobranych ze środowiska, po
czym bada się ich przeżywalność i/lub
tempo wzrostu. W teście MARA wskaźnikiem jest hamowanie metabolizmu 11
szczepów bakterii i drożdżaków, wizualizowane przez reakcję barwną [1, 7].
Wzór hamowania (fingerprint) pozwala
na przybliżoną ocenę rodzaju zagrożenia [1]. Biotesty zalecane są przez
Organizację Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD), Amerykańską
Agencję Ochrony Środowiska (EPA)
i Międzynarodową Organizację Normalizacyjną (ISO).
Monitoring ZG obejmował w latach
2010–2013 wykonywane osiem razy
w roku badanie prób wody i osadów
z czterech lub ośmiu stanowisk w toni
oraz ośmiu stanowisk w strefie brzegowej (rys. 1). Wyniki testów jedynie
sporadycznie i na pojedynczych stanowiskach wykazywały podwyższoną toksyczność wód lub materiału
dennego, co jest objawem lokalnych
i chwilowych spływów zanieczyszczeń
w związku z ekstremalnymi warunkami
pogodowymi lub oddziaływaniem zrzutów z przepompowni wód depresyjnych. Test MARA nie wykazywał przy
tym znaczącego zahamowania metaGospodarka Wodna nr 8/2014
Rys. 2. Obraz różnego stopnia uszkodzeń DNA w jądrach komórek krwi karpia; analiza częstości występowania poszczególnych stadiów pozwala rozróżnić efekty spowodowane naturalnym starzeniem się komórek od efektów genotoksyczności
bolizmu mikroorganizmów, a co za tym
idzie – zagrożenia jakości chemicznej
wód. Wyniki biotestów potwierdziły dobry stan wód ZG, wykazany zaawansowanymi technikami monitoringu fizykochemicznego.
Występujące w ilościach śladowych
substancje hormonomimetyczne, kancerogenne, mutagenne i neurotoksyczne wykazują działania kumulatywne,
a efekty narażenia na nie są oceniane
testami biologicznymi, wykazującymi
m.in. objawy genotoksyczności lub zaburzenia rozwoju i rozmnażania zwierząt. W celu oceny tych zagrożeń wdrożono metodę „mezokosmów” – klatek
hodowlanych z organizmami testowymi
[2, 4]. Do badań użyto drugorocznych
kroczków karpia z linii hodowanej w Zakładzie Ichtiobiologii i Gospodarki Rybackiej PAN w Gołyszu. Mezokosmy
umieszczono w zatoce Bajerki, w okolicy portu w Goczałkowicach i w macierzystym stawie w Gołyszu. Po okresie
ekspozycji w narządach karpi oznaczano m.in. zwartość metali ciężkich (Zn,
Pb, Cd, Cu), aktywność markerowych
enzymów detoksykacyjnych i antyoksydacyjnych, zawartość glutationu, białek szoku termicznego (HSP) i metalotionein, a także zawartość nukleotydów
adenylowych (ATP, ADP) jako wskaźnika żywotności komórek. Czterotygodniowe testy powtarzane wiosną i jesienią w ciągu dwóch lat nie wykazały istotnego oddziaływania środowiska
zbiornika na badane ryby.
W monitoringu zastosowano również „test kometowy” ostrej genotoksyczności (elektroforeza pojedynczych
komórek w żelu agarozowym). Polega
on na ocenie liczby „nienaprawionych”
pęknięć nici kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) w chromosomach
jąder komórek krwi zwierząt, na które
oddziaływały czynniki środowiska [2,
5]. W wypadku uszkodzeń z jąder komórek unieruchomionych na podłożu
żelowym i poddanych działaniu pola
elektrycznego wypływają pofragmentowane odcinki DNA, tworząc „ogon
komety”, uwidaczniany w obrazie mikroskopowym (rys. 2). Częstość występowania i rozmiar ogona jest miarą uszkodzeń [2]. Wyniki testu kometowego nie ujawniły występowania efektów toksycznych zarówno u dzikich ryb
ze ZG, jak i karpi przetrzymywanych
w mezokosmach.
■ Teledetekcja brzegowej szaty ro-
ślinnej – kontrola działania filtra biologicznego
Głównym składnikiem szaty roślinnej
ZG są zbiorowiska szuwarowe, zajmujące obszary wokół brzegów i na płyciznach. Ekologiczna rola tych zbiorowisk wiąże się z produkcją znacznej
ilości biomasy, która stanowi bufor zatrzymujący powierzchniowy spływ biogenów.
Tradycyjne, terenowe badania szaty roślinnej są czasochłonne i często obarczone błędami, wynikającymi z niedokładnego określenia lokalizacji zbiorowisk roślinnych, błędnego
oszacowania ich powierzchni i biomasy. Skuteczniejszą metodą są techniki
teledetekcji [10], polegające m.in. na
analizie matematycznej i klasyfikacji
zobrazowań wielospektralnych oraz
danych LIDAR (skaning laserowy, Light
Detection and Ranging), pozyskanych
za pomocą przyrządów umieszczonych na pokładzie satelity lub samolotu. Metody te opierają się na badaniu
różnic widma i natężenia promieniowa-
293
cjału fitoremediacyjnego. Opracowany
model pozwala na przewidywanie zasięgu i biomasy roślinności szuwarowej w zakładanych warunkach piętrzenia wody w ZG oraz oszacowanie ilości
pierwiastków biogennych, które są zatrzymywane przez roślinność, przyczyniając się do utrzymania dobrego stanu
wody. Bieżące oszacowania wskazują, że całkowita ilość azotu w biomasie
szuwarowisk wynosi ok. 28 ton, a fosforu ok. 2,2 tony, z czego połowa jest wiązana przez trzcinę pospolitą (Phragmites australis).
■ Molekularne metody monitoringu
zbiorowisk mikroorganizmów w wodach
Rys. 3. Uproszczony model roślinności zbiornika Goczałkowice i jego najbliższego otoczenia, będący wynikiem klasyfikacji aktualnego zobrazowania satelitarnego WorldView-2
nia elektromagnetycznego, które odbija powierzchnia roślin (rys. 3). Różnice te zależą od składu chemicznego
tkanek roślinnych, w szczególności od
zawartości barwników fotosyntetycznych, barwnych związków organicznych i wody. W teledetekcji roślinności
najczęściej stosuje się promieniowanie
w kilku lub nawet kilkuset zakresach
widma światła widzialnego i podczerwieni, zwanych kanałami spektralnymi. Dalsze etapy analizy polegają na
klasyfikacji treści obrazu satelitarnego,
czyli przypisaniu wyróżnionych obiektów (np. jednorodnych płatów roślinności) do zdefiniowanych klas. Odbywa
się to przy użyciu specjalistycznego
oprogramowania GIS. Metoda pozwala też na określenie kondycji fizjologicznej roślinności (biomasy, nawodnienia itp.).
Komplementarną metodą jest lotnicze skanowanie terenu z użyciem
sensorów LIDAR – wyniki pozwalają
zbudować numeryczny model terenu
(NMT) i numeryczny model pokrycia
terenu (NMPT). NMPT dostarcza informacji o wysokości pokrywy roślinnej,
natomiast NMT pozwala na kalkulację
podstawowych wskaźników morfometrycznych, określających wysokość,
ekspozycję i nachylenie terenu, nasłonecznienie oraz potencjalną wilgotność podłoża i zdolność do kumulacji
składników odżywczych [8]. Dane te
są gromadzone m.in. w postaci cyfrowych map rastrowych, dających informację o strukturze roślinności i warun-
294
kach siedliskowych. Użycie teledetekcji
w mapowaniu roślinności zainicjowano w latach 70. przez umieszczenie na
orbicie ziemskiej satelity Landsat, zaopatrzonej w sensory wielospektralne.
Rozwój satelitarnych technik teledetekcyjnych pozwala obecnie udostępniać badaczom dane o coraz wyższej
rozdzielczości przestrzennej, czasowej
i informacyjnej.
W monitoringu roślinności ZG wykorzystano archiwalne zobrazowania wielospektralne Landsat z lat 1986–2010,
WordView-2 z lat 2010–2012 oraz dane
LIDAR. Analiza archiwalnych zobrazowań Landsat umożliwiła prześledzenie
zmian zasięgu roślinności szuwarowej
zbiornika na tle zmian poziomu piętrzenia wód w zbiorniku. Badania te ujawniły
dynamiczne reakcje zbiorowisk szuwarowych na zmiany poziomu piętrzenia
wody. Dane WorldView-2 oraz NMPT
w wysokiej rozdzielczości posłużyły do
identyfikacji płatów roślinności szuwarowej, w szczególności do rozróżnienia
trzech najobficiej reprezentowanych
typów zbiorowisk. Analizy danych teledetekcyjnych wspomagały prace terenowe obejmujące zarówno badania
fitosocjologiczne, jak i pobór prób materiału roślinnego w celu oszacowania
biomasy i zawartości biogenów w tkankach. Zebrane dane pozwoliły na opracowanie sklasyfikowanego obrazu, będącego cyfrowym modelem roślinności
otaczającej zbiornik oraz oszacowanie
powierzchni i biomasy zbiorowisk szuwarowych, a pośrednio także ich poten-
Występujące w środowisku wodnym
populacje mikroorganizmów są ważnym elementem ekosystemu. Cechuje je duża bioróżnorodność, odpowiadająca dziesiątkom tysięcy gatunków
w mililitrze wody. Dynamika rozmnażania i szybki obrót biomasy wskazują, że
mikroorganizmy pełnią ważne funkcje
w przemianie materii i energii w zbiornikach wodnych, wpływając znacząco
na jakość wody. Mikroorganizmy szybko reagują na pojawiające się w wodzie
substancje oraz na zmiany warunków
środowiska, co wskazuje, że mogą być
użyteczne w prowadzenia monitoringu
stanu środowiska.
Tradycyjne, hodowlane metody mikrobiologiczne pozwalają wykazać zaledwie ok. 1% występujących w środowisku mikroorganizmów. Większe możliwości dają metody molekularne, które
opierają się na analizie występujących
w komórkach makrocząstek: kwasów
tłuszczowych, białek i kwasów nukleinowych – RNA i DNA.
Niewymagające stosowania hodowli analizy metagenomiczne osiągnęły poziom skuteczności analitycznej
w końcu XX wieku, pozwalając zidentyfikować w środowisku wiele nowych
taksonów mikroorganizmów. W badaniach występujących w ZG zbiorowisk
mikroorganizmów z pobranej wody izolowano pochodzące od nich fragmenty
16S rDNA (DNA kodującego RNA rybosomalne), które były następnie namnażane i poddawane sekwencjonowaniu.
Porównanie sekwencji z sekwencjami
zgromadzonymi w bazach danych pozwoliło na identyfikację (rybotypowanie) mikroorganizmów.
Z 10 pobranych w zbiorniku prób wyizolowano i zsekwencjonowano łączGospodarka Wodna nr 8/2014
nie ponad 760 tysięcy fragmentów 16S
rDNA o długości ok. 500 par zasad, należących do ok. 600 rodzajów mikroorganizmów występujących w wodzie. Na
poszczególnych stanowiskach w ZG
identyfikowano w ten sposób od 4000
do 8000 operacyjnych jednostek taksonomicznych (OTU) mikroorganizmów
(rys. 4). Największą bioróżnorodnością
przy najniższym zagęszczeniu mikroorganizmów charakteryzowało się ujście
Wisły. Szczególnie interesujące były,
cechujące się dużym udziałem ilościowym, mikroorganizmy z rodzajów Limnohabitans, występujące w ujściu Wisły
do ZG, Pelagiobacter – występujący
w ploso zbiornika i cyjanobakterie z rodzaju Synechococcus, pojawiające się
masowo w okresie zakwitów. Ze względu na specyficzne cechy organizmy te
mogą być wykorzystane jako wskaźnikowe w analizach jakości wody. W ramach projektu opracowaliśmy szybkie
(ok. 2 godziny od poboru próby) i stosunkowo tanie (przy masowym oznaczaniu) jakościowe i ilościowe metody
analizy tych mikroorganizmów [9].
Użyta także w projekcie komplementarna metoda analizy fosfolipidowych
kwasów tłuszczowych (PFLA) opiera
się na izolacji lipidów z wody i ich identyfikacji metodami chromatograficznymi. Metoda ta ma mniejszą rozdzielczość, pozwala jednak wyróżnić takie
grupy, jak: bakterie gram ujemne, gram
dodatnie, actinobakterie i grzyby. Dostarcza również informacji o biomasie
mikroorganizmów w wodach zbiornika.
Oszacowana tymi metodami biomasa
saprofitycznych i fotosyntetyzujących
mikroorganizmów w ZG wahała się sezonowo w granicach 5–44 ton suchej
masy (średnio 16,5 t). Analogiczne
oszacowanie wykonane wstępnie na
podstawie analiz metagenomicznych
daje wartość 5–10 razy niższą.
*
Wprowadzanie nowych metod monitoringu jest koniecznością wynikającą jednocześnie z nasilającej się presji
człowieka na środowisko oraz z postępu wiedzy i metod badawczych. Metody, które dziś mogą się jeszcze wydawać zbyt skomplikowane i zbyt kosztowne, tanieją systematycznie i stają się
ekonomicznie uzasadnione ze względu
na rosnące koszty utrzymania dobrego stanu środowiska. Jednocześnie
odzwierciedlają rosnącą wiedzę o złożoności procesów w przyrodzie, którą
trzeba uwzględniać w zarządzaniu.
Gospodarka Wodna nr 8/2014
Rys. 4. Przetworzone wyniki analiz metagenomicznych obrazujące udział wybranych grup
mikroorganizmów w wodach zbiornika Goczałkowickiego, w dwóch okresach roku na
trzech stanowiskach; zwraca uwagę możliwość identyfikacji głównych grup glonów zakwitotwórczych
LITERATURA
1. J. GABRIELSON, I. KÜHNA, P. COLQUE-NAVARRO, M. HART, A. IVERSEN, D. MCKENZIE, R. MÖLLBY: Microplate-based microbial
assay for risk assessment and (eco)toxic fingerprinting of chemicals. Analytica Chimica
Acta 485 (2003) 121–130.
2. G. KLOBUCAR, A.M. STAMBUK, M. PAVLICA, M. SERTIC-PERIC, B. KUTUZOVIC, i in.
Genotoxicity monitoring of freshwater environments using caged carp (Cyprinus carpio)
Ecotoxicology (2010) 19:77–84.
3. P. ŁASZCZYCA, J. FRANCIKOWSKI, J. GUZIK, A. NIKIEL, M. KŁOSOK, K. MICHALCZYK, A. AUGUSTYNIAK, P. MIGULA: Przydatność biotestów ekotoksykologicznych do
oceny stanu biologicznego wód na przykładzie
Zbiornika Zaporowego w Goczałkowicach.
Kosmos Tom 61/3; (296), 2012, 381–392.
4. A. OIKARI, Caging techniques for field exposures of fish to chemical contaminants Aquatic
Toxicology 78 (2006) 370–381.
5. C. PELLACANI, A. BUSCHINI, M. FURLINI, P.
POLI, C. ROSSI, A battery of in vivo and in vitro tests useful for genotoxic pollutant detection in surface waters Aquatic Toxicology 77
(2006) 1–10.
6. G. PERSOONE, B. MARSALEK, I. BLINOVA,
A. TOROKNE, D. ZARINA, L. MANUSADZIANAS, G. NAŁĘCZ-JAWECKI, L. TOFAN, N.
STEPANOVA, L. TOTHOVA, B. KOLAR, 2003.
A practical and user-friendly toxicity classification system with microbiotests for natural waters and wastewaters. Environ. Toxicol. 18,
395–402.
7. K. WADHIA, T. DANDO, K. C. THOMPSON,
2007. Intra-laboratory evaluation of Microbial
Assay for Risk Assessment (MARA) for potential application in the implementation of the
Water Framework Directive (WFD). J. Environ.
Monitoring 9, 953–958.
8. J.P. WILSON, J.C. GALLANT, 2000. Terrain
Analysis – Principles and Applications. New
York: John Wiley & Sons.
9. A. WOZNICA, A. NOWAK, P. ZIEMSKI, M.
KWASNIEWSKI, T. BERNAS, (2013) Stimulatory Effect of Xenobiotics on Oxidative Electron Transport of Chemolithotrophic Nitrifying Bacteria Used as Biosensing Element.
PLoS ONE 8(1): e53484. doi:10.1371/journal.
pone.0053484.
10. Y. XIE, Z. SHA, M. YU, 2008. Remote sensing imagery in vegetation mapping: a review.
J. Plant Ecol 1 (1): 9–23 doi:10.1093/jpe/rtm005.
Prace zrealizowano w ramach projektu Zintegrowany system wspomagający zarządzaniem i ochroną zbiornika zaporowego
sfinansowanego ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego
w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka na podstawie umowy POIG 01.01.02-24-078/09
295