Ćwiczenie 6 OKSYDOREDUKTAZY

Ćwiczenie 6
OKSYDOREDUKTAZY
Część doświadczalna obejmuje:
− wykrywanie aktywności katalazy, peroksydazy, oksydazy polifenolowej i oksydazy cytochromowej w ekstrakcie z bulwy ziemniaka
WPROWADZENIE
Oksydoreduktazy katalizują przeniesienie równoważników redukcyjnych między
dwoma układami redoks. Termin równoważnik redukcyjny określa kombinację elektronów i
protonów, które pojawiają się w procesach redoks (Ryc. 1).
Ryc. 1. Równoważniki redukcyjne w biologicznych układach redoks
Procesy oksydacyjno-redukcyjne w komórkach zachodzą we wszystkich przedziałach
subkomórkowych (cytozolu, wewnętrznej błonie mitochondriów, w błonie tylakoidów, błonach
siateczki śródplazmatycznej, błonie jądrowej, a także w przestrzeni międzykomórkowej). Procesy te są katalizowane przez enzymy współdziałające z rozpuszczalnymi (koenzymy) lub
związanymi z białkiem enzymatycznym (grupy prostetyczne) kofaktorami. Najważniejszymi
kofaktorami oksydoreduktaz są: NAD+, NADP+, FMN, FAD, ubichinon (koenzym Q), plastochinon, plastocyjanina, lipoamid, hem oraz kilka rodzajów centrów żelazowo-siarkowych.
Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD+) oraz jego forma ufosforylowana – fosforan
dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADP+), koenzymy przenoszące jony wodorkowe
(2e- i 1H+) (Ryc. 2A), wykorzystywane są przez ponad 200 oksydoreduktaz. W utlenionej formie tych koenzymów w pierścieniu aromatycznym amidu kwasu nikotynowego dodatnie ładunki są zdelokalizowane (Ryc. 2B). Jedna z dwóch przechodzących w siebie struktur ma w
położeniu para do atomu azotu ubogi w elektrony, dodatnio naładowany atom węgla. W to
1
miejsce zostaje wprowadzony jon wodorkowy, tworząc zredukowane formy NADH-H+ i
NADPH-H+. Poprawny zapis zredukowanych koenzymów pokazuje, że przyjęciu jonu wodorkowego przez koenzym towarzyszy uwolnienie protonu.
A
B
Ryc. 2. Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy. A – ogólny wzór NADH.H+, B - przyłączenie
jonu wodorkowego do węgla w pierścieniu kwasu nikotynowego (Koolman i Röhm, 2005)
Powstawanie nadtlenku wodoru (H2O2) w komórce
W komórce nadtlenek wodoru powstaje w wielu różnych reakcjach. Jednym z jego źródeł jest reakcja katalizowana przez dysmutazę ponadtlenkową – enzym usuwający aniony
ponadtlenkowe zgodnie z reakcją:
O-2 + O-2 + 2H+ → H2O2 + O2
Anion ponadtlenkowy (O-2) jest produktem ubocznym wielu reakcji redoks powstającym w
wyniku częściowej redukcji tlenu cząsteczkowego (przyjęcie jednego elektronu). W komórkach
roślin aniony ponadtlenkowe powstają np. jako produkty uboczne przepływu elektronów przez
centra żelazowo-siarkowe (reakcja Mehlera) w obrębie fotosystemu I, czy w reakcji katalizowanej przez oksydazę NADPH.H+ zlokalizowaną w błonie komórkowej, gdzie aktywne formy
tlenu służą do obrony przed patogennymi drobnoustrojami.
2
Ważnymi enzymami wytwarzającymi H2O2 są także oksydazy flawoproteinowe, do
których należą m. in. oksydazy L-aminokwasowe i D-aminokwasowe. Utlenianie aminokwasu
przebiega zgodnie z reakcją:
aminokwas + O2 + H2O → ketokwas + H2O2 + NH3
W komórkach zwierząt H2O2 powstaje także w peroksysomach w reakcji utleniania
kwasów tłuszczowych o dłuższym niż 18C łańcuchu węglowodorowym. W tym wypadku szlak
β-oksydacji, podobnie jak utlenianie kwasów tłuszczowych u roślin, rozpoczyna się od reakcji
katalizowanej przez oksydazę acylo-CoA zgodnie z równaniem:
acylo-CoA + O2 → ∆2–enoilo-CoA + H2O2
Bogatym źródłem H2O2 w komórkach roślin jest szlak przemian określany jako fotooddychanie. Enzym „rubisco” (karboksylaza/oksygenaza rybulozo-1,5-bisfosforanu) może do
rybulozo-1,5-bisfosforanu przyłączać CO2 lub O2. W pierwszym wypadku powstają 2 cząsteczki kwasu 3-fosfoglicerynowego, natomiast w reakcji, w której zamiast CO2 uczestniczy O2
powstaje 1 cząsteczka kwasu fosfoglicerynowego i 1 cząsteczka kwasu 2-fosfoglikolanowego.
Powstający w chloroplastach 2-fosfoglikolan jest najpierw defosforylowany, a następnie powstający glikolan w peroksysomach zostaje utleniony przez oksydazę glikolanową do glioksalanu zgodnie z reakcją:
glikolan + O2 → glioksalan + H2O2
Nadtlenek wodoru jest związkiem szkodliwym, głównie ze względu na możliwość powstawania w obecności Fe2+ rodników hydroksylowych .OH, a także tlenu singletowego 1O2.
Enzymatyczne usuwanie H2O2
Enzymami funkcjonującymi w usuwaniu H2O2 są katalaza i peroksydaza. Katalaza, enzym zawierający hem, dysproporcjonuje dwie cząsteczki H2O2 do H2O i O2 zgodnie z równaniem:
2 H2O2 → 2H2O + O2
Katalazy mogą także wykazywać aktywność peroksydacyjną, w której H2O2 jest wykorzystywany do utleniania alkoholi, aldehydów, fenoli czy azotynów.
Peroksydazy redukują nadtlenek wodoru równocześnie utleniając (odwodorowując)
różne substraty. Reakcję katalizowaną przez peroksydazy można zapisać:
SH2 + H2O2 → S + 2H2O
SH2 i S to, odpowiednio, substrat w stanie zredukowanym i utlenionym. Grupą prostetyczną
peroksydaz roślinnych jest żelazoprotoporfiryna (hemina), natomiast enzymy zwierzęce zawie3
rają inny typ heminy. Ważną funkcję ochronną w komórkach zwierząt i roślin spełnia peroksydaza glutationowa współdziałająca z glutationem w usuwaniu nadtlenku wodoru i szkodliwych nadtlenków organicznych. W centrum aktywnym tego enzymu występuje analog cysteiny
(selenocysteina), w którym siarka została zastąpiona selenem.
Oksydazy fenolowe – przenoszą elektrony i protony z orto- lub para-dwufenoli na tlen. Oksydaza o-dwufenolwa poza utlenianiem o-dwufenolu katalizuje także reakcję hydroksylacja.
Oksydaza cytochromowa (EC 1.9.3.1) – końcowe ogniwo łańcucha transportu elektronów
zlokalizowanego w wewnętrznej błonie mitochondriów
Łańcuch oddechowy katalizuje transport elektronów z NADH-H+ lub zredukowanego
ubichinonu na tlen cząsteczkowy. Ubichinon może być redukowany enzymatycznie w reakcjach, w których np. utleniany jest bursztynian bądź flawoproteina (ETF) redukowana przez
dehydrogenazę acylo-CoA, dehydrogenazę 3-fosfoglicerynianu lub dehydrogenazy utleniające
cholinę czy dihydroorotan. Większa część energii towarzysząca reakcjom redoks wykorzystywana jest do formowania w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej gradientu protonowego, który z kolei napędza syntezę ATP katalizowaną przez syntazę ATP. Łańcuch oddechowy obejmuje 3 białkowe kompleksy (kompleks I, III i IV) oraz dwie cząsteczki przenośnikowe: ubichinon (Q) i cytochrom c (Ryc. 3). Poza tym, z błoną wewnętrzną związana jest
dehydrogenaza bursztynianowa (kompleks II) oraz inne dehydrogenazy przekazujące elektrony na ubichinon (Q) (nie pokazano na Ryc. 3).
Ryc. 3. Transport elektronów w łańcuchu oddechowym utworzonym przez trzy kompleksy
białkowe i dwa ruchome nośniki (ubichinon i cytochrom c) przenoszące elektrony z utlenianego substratu na tlen. Transportowi elektronów wzdłuż łańcucha oddechowego towarzyszy wektorowe pompowanie protonów z matriks do przestrzeni międzybłonowej (Alberts i wsp. 1999)
4
Oksydaza cytochromowa przejmuje elektrony z małego białka, cytochromu c, zawierającego żelazo w układzie hemowym i przekazuje je na tlen cząsteczkowy (Ryc. 3). Do redukcji cząsteczki tlenu (O2) do dwóch cząsteczek wody potrzebne są 4 elektrony (4 cząsteczki zredukowanego cytochromu c). Przeniesieniu dwóch elektronów przez związane z enzymem kofaktory (dwa jony miedzi: CuA i CuB, jony żelaza w dwóch układach hemowych: hem a i hem
a3) towarzyszy wypompowanie z matriks do przestrzeni międzybłonowej 4 H+.
WYKONANIE
Odczynniki:
1. 3% roztwór H2O2
2. Roztwór KCN, UWAGA! KCN jest silną trucizną !
3. Roztwór benzydyny w kwasie octowym
4. Odczynnik NADI (przygotować bezpośrednio przed użyciem, mieszając p-fenylenodwuaminę z α-naftolem w stosunku 1 : 1 (1 ml + 1 ml)
5. 0,1M bufor fosforanowy o pH 7,4
6. Bufor fosforanowy o pH 7,4
7. Roztwór pirokatechiny
Materiał:
Ekstrakt z ziemniaka – obrany i umyty ziemniak utrzeć na tarce. Miazgę włożyć do woreczka
z gazy i zanurzyć w zlewce zawierającej około 200 ml wody, a następnie lekko wycisnąć zawartość. Roztwór łagodnie wymieszać. Po opadnięciu skrobi na dno zlewki, płyn ostrożnie zlać
znad osadu. Uzyskujemy w ten sposób wodny ekstrakt enzymu. Część nadsączu (około 50
ml) przelać do zlewki i zagotować, a następnie zdenaturowany termicznie ekstrakt ostudzić
wkładając zlewkę do zimnej wody.
Zasada wykrywania katalazy:
Tlen uwolniony w reakcji dysproporcjowania H2O2 katalizowanej przez katalazę, wydzielając się z roztworu powoduje jego silne pienienie:
2 H2O2 → 2 H2O + O2
5
Postępowanie:
Do trzech probówek napipetować po około 2 ml: a – ekstraktu z ziemniaka, b – zagotowanego ekstraktu z ziemniaka oraz c – ekstraktu z ziemniaka z dwoma kroplami roztworu
NaCN. Do każdej z prób dodać 5 kropli 3% nadtlenku wodoru. Gwałtownie wydzielające się
pęcherzyki tlenu są świadectwem prawidłowo przebiegającej reakcji.
Zasada wykrywania peroksydazy:
Benzydyna w obecności H2O2 ulega utlenieniu przez peroksydazę do błękitu benzydynowego, zgodnie z poniższym równaniem reakcji:
Postępowanie:
Do 5 probówek odmierzyć podaną w Tabeli1 objętość ekstraktu z ziemniaka, benzydyny, H2O2, KCN i H2O. Do probówki nr 4 dodać zagotowany ekstrakt. Zawartość probówek
wymieszać i postawić na 20 min. w temperaturze pokojowej. Obserwować zachodzące zmiany
i zanotować wyniki.
Tabela 1. Wykrywanie aktywności peroksydazy
Próba
nr
Wyciąg
ml
Woda
ml
Benzydyna
ml
KCN
H2O2
ml
1
2,5
0
0,1
0
0,1
2
2,5
0,1
0
0
0,1
3
2,5
0
0,1
2 krople
0,1
4
2,5
0
0,1
0
0,1
5
2,5
0,1
0,1
0
0
6
Wykrywanie aktywności oksydazy polifenolowej (EC 1.10.3.2)
Zasada wykrywania oksydazy polifenolowej:
Oksydaza polifenolowa jest metaloproteiną, zawierającą miedź i przenosi wodór bezpośrednio na tlen cząsteczkowy. Substratami w tej reakcji są fenole, które utleniają się do chinonów. W ćwiczeniu wykorzystano jako substrat pirokatechinę. Jest ona utleniana przez enzym
do chinonów, które kondensując dają ciemnobrunatne zabarwienie:
Postępowanie:
Do 5 probówek odmierzyć podane w Tabeli 2 objętości ekstraktu z ziemniaka, wody,
buforu, pirokatechiny i 4% roztworu NaCN. Do probówki nr 4 dodać ekstrakt zagotowany.
Zawartość wszystkich probówek starannie wymieszać, zanotować czas i pozostawić w temperaturze pokojowej. W celu lepszego dostępu tlenu, próby 1-4 co pewien czas wstrząsnąć. Po
20 min zanotować wyniki reakcji.
Tabela 2. Wykrywanie aktywności oksydazy polifenolowej
Próba
Nr
Wyciąg
ml
Woda
ml
Bufor pH 7,4
ml
KCN
Pirokat.
ml
1
1
0
1
0
0,1
2
1
0,1
1
0
0
3
1
0
1
2 krople
0,1
4
1
0
1
0
0,1
5
1
0
1
0
0,1
Wykrywanie aktywności oksydazy cytochromowej
Zasada wykrywania oksydazy cytochromowej:
Obecność oksydazy cytochromowej w ekstrakcie tkankowym można wykazać w reakcji, w której wykorzystywany jest odczynnik NADI. W skład odczynnika wchodzą: α-naftol i
p-fenylenodwuamina zmieszane w stosunku 1:1. W wyniku nieenzymatycznej redukcji zawar7
tego w mitochondriach cytochromu c przez p-fenylenodwuaminę powstaje p-fenylenodwuimina, która w obecności α-naftolu przechodzi w barwny, niebieski kompleks:
Postępowanie:
Do 4 probówek odmierzyć podane w Tabeli 3 objętości poszczególnych roztworów. Do
probówki nr 4 dodać zagotowany wyciąg. Próby starannie wymieszać i pozostawić na 30 min
w temperaturze pokojowej. Obserwować powstanie niebieskiej barwy. Wyniki zapisać w
tabeli.
Tabela 3. Wykrywanie oksydazy cytochromowej
Próba
Nr
Wyciąg
Ml
Woda
ml
Bufor pH 7,4
ml
KCN
NADI
ml
1
1
0
1
0
0,1
2
1
0
1
1 kropla
0,1
3
1
0,1
1
0
0
4
1
0
1
0
0,1
Zagadnienia do przygotowania:
− koenzymy oksydoreduktaz
− reakcje produkujące w komórce nadtlenek wodoru
− enzymy usuwające H2O2 (różnica między katalazą a peroksydazą)
− łańcuch transportu elektronów w mitochondriach (przenośniki elektronów związane z kompleksem I, III i IV; generowanie transbłonowego gradientu protonowego)
Literatura:
Biochemia – JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005
Ćwiczenia z biochemii – pod redakcją L Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa, 2005
Biochemia. Ilustrowany przewodnik – J Koolman, K-H Röhm, PZWL, Warszawa 2005
8