Chromatografia

Chromatografia – podstawa
metod analizy laboratoryjnej
GraŜyna Chwatko
Zakład Chemii Środowiska
Chromatografia
gr. chromatos = barwa
grapho = pisze
Michaił Siemionowicz Cwiet
2
Chromatografia
jest metodą rozdzielania mieszanin, w której
rozdzielane składniki ulegają podziałowi pomiędzy
dwie fazy, z których jedna jest fazą nieruchomą
(stacjonarną), a druga fazą ruchomą (mobilną)
układu chromatograficznego.
Faza stacjonarna:
ciało stałe,
ciecz na nośniku,
Ŝel.
Faza ruchoma:
gaz,
ciecz,
gaz w stanie nadkrytycznym
(fluid).
3
Faza stacjonarna i faza ruchoma
Faza stacjonarna:
substancja umieszczona w kolumnie
chromatograficznej (chromatografia kolumnowa)
lub na płaszczyźnie (chromatografia
cienkowarstwowa), oddziaływanie z którą
umoŜliwia rozdzielanie składników mieszanin.
Faza ruchoma
substancja przechodząca w sposób ciągły przez
fazę stacjonarną, oddziałująca z nią oraz ze
składnikami rozdzielanej mieszaniny.
4
Podział ze względu na stan skupienia
fazy ruchomej
Chromatografia gazowa
Chromatografia cieczowa
Chromatografia fluidalna
5
Podział ze względu na stan
skupienia fazy stacjonarnej
Faza
Faza
ruchoma stacjonarna
Gaz – ciecz
Ciecz – ciecz
(ang. Gas-Liquid Chromatography – GLC)
(ang. Liquid-Liquid Chromatography – LLC)
Gaz – ciało stałe (ang. Gas-Solid Chromatography – GSC)
Ciecz – ciało stałe (ang. Liquid-Solid Chromatography – LSC)
6
Podział ze względu na naturę zjawisk
będących podstawą procesu
chromatograficznego
Chromatografia adsorpcyjna
Chromatografia podziałowa
Chromatografia jonowymienna
Chromatografia Ŝelowa (sitowa
lub sączenie molekularne).
7
Techniki eksperymentalne
Chromatografia planarna
Chromatografia kolumnowa
8
Chromatografia
planarna
dwuwymiarowa
9
Chromatografia kolumnowa
(klasyczna)
10
Rodzaje chromatografii i techniki
chromatograficzne
11
Wysokosprawna chromatografia
cieczowa
(HPLC - ang. High Performance
Liquid Chromatography
hromatography))
12
Oddziaływania między cząsteczkowe w
chromatografii cieczowej
Próbka
Faza stacjonarna
Faza ruchoma
13
Schemat rozdzielania chromatograficznego
mieszaniny składającej się z dwóch składników
KA =
KB =
C As
C Ar
C Bs
C Br
14
15
15
Krzywa elucji - chromatogram
16
Pik chromatograficzny
17
zbiorniki z rozpuszczalnikami
degazer
pompa
autosampler /zawór dozujący
termostat z kolumną
detektor
Schemat
blokowy
chromatografu
cieczowego
rejestrator i integrator
18
19
Symulacje separacji
chromatograficznej
20
Rozpuszczalniki stosowane jako
fazy ruchome w HPLC powinny:
• wykazywać odpowiednią zdolność
rozpuszczania próbki,
• umoŜliwiać detekcję próbki,
• charakteryzować się wysokim stopniem
czystości,
• nie reagować chemicznie ani z fazą stacjonarną,
ani z rozdzielaną próbką,
• charakteryzować się trwałością w warunkach
chromatografowania,
• być tanie.
21
Chromatografia w normalnym
i odwróconym układzie faz
Normalny układ faz (ang. normal phase – NP)
to taki układ, w którym faza stacjonarna jest
bardziej polarna niŜ faza ruchoma
Odwrócony układ faz (ang. reversed phase – RP) to
układ, w którym faza stacjonarna jest mniej polarna
niŜ faza ruchoma
22
Eluenty stosowane w normalnym (NP) i
odwróconym (RP) układzie faz:
Normalny układ faz
Odwrócony układ faz
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Heksan
Izooktan
Chloroform
Chlorek metylenu
Octan etylu
Metanol
Acetonitryl
Izopropanol
Tetrahydrofuran
Woda (wodne
roztwory buforowe)
23
Podział kolumn stosowanych
w HPLC
Mikrokolumny
Kolumny analityczne
Kolumny preparatywne
24
Fazy chemicznie związane na
bazie krzemionki
Z grupami niepolarnymi
Z grupami polarnymi
Z grupami jonowymiennymi
Z grupami optycznie czynnymi
25
Schemat Ŝelu krzemionkowego z chemicznie związaną
grupą n-oktylodimetylosililową
C-8
26
Powierzchnia ziarna fazy
stacjonarnej C18
27
Dobór fazy stacjonarnej
i ruchomej
28
Techniki chromatograficzne
stosowane są do:
jakościowej i ilościowej analizy mieszanin
związków nieorganicznych i organicznych,
kontroli procesów przemysłowych,
kontroli zanieczyszczeń środowiska,
analiz klinicznych,
badań fizykochemicznych,
badań strukturalnych związków
organicznych.
29
Chromatogram próbki osocza
355
CSH
Wysokość piku [mAU]
315
275
HCSH
GSH
10
235
195
155
0
115
0
1
2
3
4
5
6
7
8
CGSH
75
35
-5
-1
1
3
5
7
9
11
13
Czas [min]
30
Absorbance (mAU)
Chromatogram próbki moczu
95
85
75
65
55
45
35
25
15
5
-5
0
2
4
6
8
Time (min)
31
Dziękuję za uwagę
32