Molekularne metody diagnostyki mikrobiologicznej

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2009 • Volume 45 • Number 4 • 325-331
Praca poglądowa • Review Article
Molekularne metody diagnostyki mikrobiologicznej
Katarzyna Kondak
Katedra i Zakład Mikrobiologii we Wrocławiu
Streszczenie
Kliniczna mikrobiologia przechodzi nową erę. Metody molekularne oparte na technikach hybrydyzacji kwasów nukleinowych,
PCR i innych są najnowszymi metodami stosowanymi w identyfikacji patogenów. Umożliwiają bezpośrednie wykrywanie czynnika etiologicznego w materiale klinicznym bez konieczności hodowli danego szczepu. Dodatkowo: metody te są czułe i szybkie, dlatego stanowią doskonałe narzędzie diagnostyczne przyszłości.
Molecular methods in microbiological diagnostics
Summary
Clinical microbiology is the midst of a new era. Molecular methods based on nucleic acid hybridization, polymerase chain reaction (PCR) and other are the newest techniques of the detection or typing of infectious agents. They make direct detection
of the etiologic factor in clinical material possible without the necessity of the strains isolation. Additionally: these methods are
sensitive and rapid therefore they are proved to be the perfect diagnosis tools for the future
Słowa kluczowe:chipy DNA, hybrydyzacja kwasów nukleinowych, metody molekularne, reakcja łańcuchowa polimerazy
(PCR)
Key words:chip DNA, hybridization nucleic acid, molecular methods, polymerase chain reaction (PCR)
Wstęp
Najnowocześniejszymi metodami diagnostyki chorób infekcyjnych wykorzystywanymi w laboratorium mikrobiologicznym są metody molekularne. Metody te pozwalają bezpośrednio wykryć czynnik etiologiczny w materiale klinicznym
(bez konieczności hodowli danego szczepu), pozwalają
także na identyfikację i typowanie mikroorganizmów, wykrywanie nowych mechanizmów oporności na leki oraz np. śledzenie ewolucji mikroorganizmów.
Metody molekularne zawdzięczają swój rozwój odkryciom
w latach siedemdziesiątych metod hybrydyzacji DNA.
W latach osiemdziesiątych szeroko rozwinęły się techniki
sekwencjonowania DNA oraz enzymatycznego powielania
DNA (PCR), a w latach dziewięćdziesiątych na rynku pojawiły się już pierwsze komercyjne zestawy diagnostyczne oraz
aparaty, które umożliwiają i ułatwiają diagnostykę molekularną w szpitalnych laboratoriach [12].
Najczęstszymi sekwencjami DNA używanymi do identyfikacji patogenów są geny, które kodują rybosomalny RNA
(rRNA) dużej i małej podjednostki rybosomu. Ponieważ geny
te występują u wszystkich organizmów z wyjątkiem wirusów,
izolacja rRNA, sekwencjonowanie rRNA lub fragmentu genomu, który koduje te cząsteczki, jest jedną z najlepszych
metod klasyfikacji bakterii i organizmów wyższych.
Obecnie techniki molekularne z powodzeniem uzupełniają
tradycyjne metody diagnostyki mikrobiologicznej, a w przyszłości będą prawdopodobnie rutynowo stosowane w większości laboratoriów.
Przegląd metod molekularnych stosowanych w diagnostyce mikrobiologicznej
Metody wykorzystywane do wykrywania drobnoustrojów
w głównej mierze oparte są na hybrydyzacji kwasów nukleinowych, która polega na komplementarnym łączeniu się ze
sobą nukleotydów wg reguły Watsona-Cricka. Nukleotydy
znajdujące się na obu niciach kwasu nukleinowego łączą się
za pomocą wiązań wodorowych (adenina-tymina i guaninacytozyna dla DNA oraz adenina-uracyl i guanina-cytozyna
dla RNA). Metody hybrydyzacyjne są to więc metody identyfikacyjne oparte na badaniu homologii fragmentów kwasu
nukleinowego.
Sondy genetyczne
Przykładem zastosowania tych właściwości w mikrobiologii
jest metoda hybrydyzacji kwasów nukleinowych z wykorzystaniem sond genetycznych – krótkich, jednoniciowych
325
Molekularne metody diagnostyki mikrobiologicznej
fragmentów DNA, o określonej sekwencji nukleotydowej,
unikalnej dla danego mikroorganizmu. Sondy są całkowicie
lub częściowo komplementarne do fragmentu sekwencji poszukiwanego genu. Kwas nukleinowy, który pełni rolę sondy
genetycznej jest znakowany za pomocą enzymu, barwnika
fluorescencyjnego radioaktywnych izotopów biotyny lub digoksygeniny. Ze względu na dużą aktywność własną i krótki
czas rozpadu, z izotopów radioaktywnych najczęściej jest
stosowany izotop fosforu 32P, który jest wbudowany w łańcuch nukleotydowy głównie jako dCTP. Biotyna i digoksygenina są stosowane wtedy, kiedy chce się uniknąć ryzyka
związanego z użyciem izotopu radioaktywnego. Po odpowiednim przygotowaniu materiału i dodaniu znakowanej
sondy genetycznej następuje hybrydyzacja sondy z komplementarną cząsteczką kwasu, a tak powstały kompleks wykrywany jest za pomocą odpowiednich metod. Metoda pośrednia służy do detekcji sygnału sond nieradioaktywnych.
Wykorzystuje przeciwciała skierowane przeciwko biotynie
lub digoksygeninie, które są dodatkowo sprzężone z enzymem. Najczęściej stosowanymi enzymami są: fosfataza alkaliczna (AP) i peroksydaza chrzanowa (HRP). Enzymy te
katalizują reakcję przekształcenia bezbarwnego substratu
w barwny produkt (reakcja barwna) lub też wywołujących
emisję światła w momencie utworzenia kompleksu: sonda-badany materiał (chemiluminescencja). Metoda bezpośrednia służy do detekcji sygnału sondy radioaktywnej lub
znakowanej barwnikiem fluorescencyjnym. W pierwszym
przypadku detekcja powoduje zaczernienie się kliszy radioaktywnej (autoradiografia), a w drugim przypadku detekcja
sygnału sondy polega na odczycie przez odpowiednie czytniki intensywności fluorescencji, która pochodzi ze znakowanego fluorescencyjnie badanego DNA [26, 34]. Zdolność
różnicująca takiej analizy związana jest bezpośrednio z liczbą, a także wielkością fragmentów, które zostały uwidocznione (połączyły się z sondą). Zaletami tak skonstruowanych
sond jest wysoka powtarzalność otrzymanych wyników oraz
możliwość poddania analizie wszystkich szczepów, które
posiadają miejsca homologiczne do sekwencji sondy. Wadą
zaś jest to, iż użycie sond wymaga doświadczenia technicz-
terystycznej dla identyfikacji mikroorganizmu sekwencji rybosomalnego RNA (rRNA). Pojedyncza nić rRNA nie wymaga już przeprowadzenia procesu denaturacji, oprócz tego
(w przeciwieństwie do DNA) występuje w bardzo dużej
liczbie kopii w komórce (od 1000 do 10 000), dzięki czemu
sondy tak skonstruowane charakteryzują się dużo wyższą
czułością niż sondy DNA. Sondy RNA (rRNA) pozwalają wykryć każdą komórkową formę życia, a ponieważ wykrywają
wysoce konserwatywne obszary oraz takie, które podlegają
niewielkim zmianom, umożliwiają określenie podobieństwa
genetycznego między gatunkami. Sondy rRNA w oparciu
o 16S i 23S RNA (ze względu na konserwatywny charakter
genów) stosowane są do wykrywania gatunków należących
do jednego taksonu.
nego od wykonawców, głównie wtedy, gdy sondy znakowane są pierwiastkami radioaktywnymi.
Zdolność wykrywania określonych kwasów nukleinowych
stała się podstawą podziału sond genetycznych na sondy
DNA i RNA. Sondy DNA charakteryzują się tym, że fragmentem docelowym jest DNA, który występuje w liczbie kilku
kopii w komórce. Zaletą takich sond jest wysoka czułość,
ponieważ mogą one rozpoznawać konserwatywne geny dla
danego mikroorganizmu, np. geny kodujące toksynę, antygen lub oporność na antybiotyki [34]. Wadą sondy DNA jest
brak możliwości wykrywania pojedynczej matrycy w badanym materiale, ponieważ pojedynczy produkt hybrydyzacji
nie daje wyraźnego i rzetelnego sygnału. Sondy DNA stosowane są z powodzeniem do identyfikacji M. avium, M. intracellulare i M. tuberculosis [34].
Sondy RNA charakteryzuje komplementarność do charak-
a także określić ekspresję tysięcy genów w jednym eksperymencie.
Chipy DNA stwarzają możliwość szybkiej diagnostyki infekcji
bakteryjnych wywołanych przez takie czynniki etiologiczne
jak: C. pneumoniae, Legionella spp., H. pylori, Mycoplasma
spp.[34]. Znajdują one również zastosowanie w diagnostyce
wirusów: HIV, HBV, HCV [22, 33, 34]. Fukushima M. i wsp.
wykorzystali metodę chipów DNA w identyfikacji M. intracellulare, M. avium i M. kansasii [14]. Bekal S. i wsp. za pomocą
tej metody określali obecność genów wirulencji E. coli [4] np.
fim A1, fim A2 (kodujących fimbrie) czy cdt2, cdt3 (odpowiedzialne za pozajelitowe infekcje). Wg tych samych autorów
za pomocą chipów DNA możliwe jest rozróżnienie różnych
wariantów homologicznego genu. Natomiast Kessler N.
i wsp. ocenili metodę chipów DNA jako czułą i pozwalającą
na pewną identyfikację wirusa grypy [22]. Chipy DNA oka-
326
Chipy DNA
Obecnie w badaniach molekularnych stosowane są także
sondy DNA upakowane na podłożu stałym z dość dużą gęstością [26, 34]. Sondy takie określane są w literaturze jako
chipy DNA (ang. DNA chip), niekiedy również jako mikrowiązki DNA (ang. DNA miccroarray) lub wiązki genów (ang.
gene array) [26]. Podłożami stosowanymi do produkcji chipów są: płytki szklane, krzemowe lub plastikowe [14, 22, 26,
34] o niskiej fluorescencji, a także silikon [22, 34], membrany
nylonowe [22] bądź nitrocelulozowe o niewielkich wymiarach
(od 1 do kilku cm²) [26, 34]; charakteryzuje je sztywna, podatna na chemiczną modyfikację powierzchnia. Na podłoża
te naniesione są w regularnych odległościach mikroskopowej wielkości pola (ang. spots) zawierające różniące się od
siebie sekwencją sondy DNA. Zasadą działania chipów jest
odwrócenie techniki Southern blot. Wiązka sond o znanej
sekwencji zakotwiczona na stałym podłożu poddawana jest
działaniu nieznanych fragmentów badanego DNA, wcześniej
amplifikowanego i znakowanego. W momencie powstania
kompleksu: sonda-badany materiał tworzy się sygnał, który
jest wykrywany za pomocą wcześniej już opisanych metod.
Zaletą chipów DNA jest możliwość równoczesnego prowadzenia reakcji hybrydyzacji przez sondy DNA (każda o innej
sekwencji), co pozwala ocenić obecność określonego genu,
K. Kondak
zały się narzędziem użytecznym w klinicznej diagnostyce
infekcji wywołanych wirusem HPV [20, 23], przy czym według niektórych autorów detekcja wirusa HPV była niższa
w porównaniu z detekcją tego wirusa za pomocą metody
PCR (opisanej w dalszej części pracy) [20]. Oprócz wykorzystania w diagnostyce, chipy DNA stosowane są także do
badania ludzkiego genomu [34], wykrywania mutacji [26]
i genotypowania [33].
Chipy DNA w zależności od gęstości upakowania (wielkości
jaką zajmuje pojedyncza sonda DNA) dzielimy na zawierające makrozwiązki (plamki DNA o średnicy 300 mm na jedną
sondę) i mikrozwiązki (plamki DNA o średnicy poniżej 200
mm na jedną sondę). W zależności od długości sond wyróżnia się dwa rodzaje macierzy (chipów): cDNA oraz oligonukleotydowe [26, 34]. Te pierwsze to naturalne odcinki
cDNA o długości 500-5000 jednostek nukleotydowych, natomiast te drugie to syntetyczne oligonukleotydy (niemodyfikowane, krótkie fragmenty naturalnego DNA) długości 20-80
jednostek nukleotydowych, których 5’koniec jest związany
z podłożem. Otrzymywane są na drodze syntezy chemicznej
bezpośrednio na chipie (in situ) lub oddzielnie, a następnie
nanoszone na podłoże i przyłączane w odpowiednich miejscach. Macierze takie dobrze zastępują elektroforezę, ponieważ charakteryzują się bardzo wysokim stopniem uporządkowania, gdyż oligonukleotydy sąsiadujące ze sobą w pionie
lub poziomie mogą różnić się tylko jednym nukleotydem.
Zhou W. i wsp. stwierdzają nawet, że metoda ta jest bardziej
czuła od elektroforezy. Podkreślają również, że dużą zaletą
macierzy oligonukleotydowych jest możliwość wielokrotnego
użycia oraz umieszczenia na jednej, małej powierzchni nawet kilkuset tysięcy sekwencji, których hybrydyzację można
przeprowadzić w jednym czasie [40].
Macierze oligonukleotydowe wykorzystywane są w diagnostyce mikrobiologicznej, medycznej, genetycznej i farmakogenomice [26], a także do sekwencjonowania kwasów
nukleinowych, monitorowania ekspresji genów, wykrywania
na szeroką skalę mutacji i polimorfizmu [33, 34]. W zakresie
diagnostyki mikrobiologicznej, macierze te znajdują zastosowanie w wykrywaniu N. gonorrhoeae [34, 40] oraz w bada-
cierze PNA (ang. peptide nucleic acid), w których naturalny
szkielet oligonukleotydowy zastępuje szkielet o strukturze
oligopeptydu z przyłączonymi zasadami nukleinowymi (A,
G, T, C) [26]. Ponieważ PNA charakteryzuje się dużym powinowactwem do sekwencji komplementarnych, swoistość
reakcji hybrydyzacji jest obniżona. Zaletą tych macierzy jest
jednak odporność na działanie enzymów nukleolitycznych
oraz silniejszy sygnał (przy zastosowaniu krótszych sond)
wynikający z większej trwałości dupleksu: sonda typu PNAnaturalna sonda DNA niż dupleksu typu: DNA-DNA czy
DNA-RNA [26].
niu oporności M. tuberculosis na rifamycynę [9, 16, 30, 34].
Gilbert G. L. wykorzystał metodę detekcji DNA za pomocą
macierzy oligonukleotydowych do zidentyfikowania 54 różnych szczepów Mycobacterium, używając 82 unikalnych sekwencji 16S rRNA i wszystkich znanych mutacji związanych
z rifamycyno- i izoniazydoopornością. Uznał jednocześnie,
że obecnie metoda ta jest stosunkowo mało czuła, dlatego
chętnie stosowana tylko w przypadku charakteryzowania
izolatów [16]. Z kolei Park H. i wsp. podczas identyfikacji rifamycyno- i izoniazydoopornych szczepów M. tuberculosis,
ocenili czułość zastosowanych oligonukleotydowych chipów
DNA na 93,0% a swoistość na 98,4%, samą metodę uznając za łatwą, szybką, użyteczną, i dokładną [30]. Podobnego
zdania byli Deng J. Y. i wsp. badający rifamycyno-oporne
szczepy M. tuberculosis [9].
W grupie macierzy oligonukleotydowych wyróżnia się ma-
które są komplementarne do przeciwstawnych nici DNA. Primery rozpoczynają reakcję amplifikacji pożądanego odcinka
DNA poprzez reakcję hybrydyzacji z sekwencjami oskrzydlającymi (krótkie fragmenty DNA po każdej stronie przeznaczonej do powielania) [16, 34]. Sekwencje oskrzydlające nie
mogą być większe niż kilka tysięcy par nukleotydów, a dobór
odpowiedniej temperatury sprzyja ich dokładnemu dopasowaniu do matrycy DNA. Jeden cykl reakcji PCR składa się
z trzech etapów, a każdy z nich przebiega w innej temperaturze [19]. Pierwszym z nich jest denaturacja podwójnej
helisy DNA, czyli rozdysocjowanie nici DNA pod wpływem
temperatury 93-96 ˚C w czasie 20-30 s [19]. Kolejnym etapem jest reakcja hybrydyzacji pojedynczej nici DNA z primerami (temperatura około 50 ˚C). Jako ostatnia przebiega
reakcja elongacji (wydłużania) fragmentu DNA. Elongacja
przebiega jednocześnie na obu komplementarnych niciach
Metody oparte na amplifikacji materiału genetycznego
W identyfikowaniu mikroorganizmów bardzo przydatne okazały się techniki oparte na amplifikacji materiału genetycznego NAATs (ang. nucleic acid amplification tests). Należą do
nich wszystkie techniki (określane w literaturze także jako
testy) oparte na reakcji PCR czy LCR.
Reakcja służąca amplifikacji (namnożeniu) wybranego, ściśle gatunkowo-swoistego fragmentu DNA in vitro w czasie
krótszym niż kilka godzin (powielanie DNA bez klonowania)
[34], nazwana została reakcją PCR (ang. polymerase chain
reaction – reakcja łańcuchowa polimerazy). Za opracowanie tej techniki Karl Mullis otrzymał w 1993 Nagrodę Nobla.
Początkowo przeprowadzenie reakcji amplifikacji wymagało dodawania kolejnej porcji polimerazy DNA (pochodzącej
z E. coli) w każdym cyklu. Odkrycie termostabilnej polimerazy pochodzącej z bakterii T. aquaticus (żyjącej w gorących
źródłach wulkanicznych) pozwala przeprowadzać reakcję
amplifikacji bez otwierania próbówki. Reakcja prowadzona
jest w aparatach zwanych termocyklerami charakteryzującymi się możliwością szybkich zmian temperatury. W skład
standardowej mieszaniny reakcyjnej wchodzą: para primerów, matryca DNA (dwuniciowy odcinek DNA, który chcemy
amplifikować), bufor, trifosforany deoksyrybonukleozydów
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), termostabilna polimeraza DNA
(np. polimeraza Taq), jony Mg 2+ [20]. Primery (czyli startery) to odpowiednio skonstruowane pary oligonukleotydów –
jednoniciowe fragmenty DNA o długości 18-24 nukleotydów,
327
Molekularne metody diagnostyki mikrobiologicznej
matrycy, zaczynając od 3’końca. Polimeraza dobudowuje
kolejne nukleotydy w tempie około kilkudziesięciu na sekundę w temperaturze 72 ˚C [19]. Rozpoczęcie całego cyklu od
początku wymaga ponownego ogrzania mieszaniny reakcyjnej do temperatury denaturacji. Powielanie DNA następuje
w postępie geometrycznym, gdyż każdy cykl PCR pozwala
na uzyskanie dwóch cząsteczek potomnych z jednej macierzystej cząsteczki DNA. Wydajność metody PCR jest zatem
bardzo duża. Po około 35 cyklach liczba kopii przekracza 68
bilionów [34]. Taka ilość powstałego DNA pozwala na uwidocznienie produktów PCR z wykorzystaniem bromku etydyny, który zabarwia obecne w żelu agarozowym powstałe
DNA. Zaletą techniki PCR jest możliwość wykrycia, amplifikacji i identyfikacji bardzo małych ilości materiału genetycznego. Metoda charakteryzuje się bardzo dużą swoistością
i czułością. Materiałem do badań może być DNA pochodzący z każdej tkanki (a nawet z jej wycinków zatopionych
w parafinie) oraz z płynu ustrojowego. Van Dyck i wsp. ocenili czułość metody PCR na około 95-96,5%, a swoistość na
około 98,9-99,5% [39].
Technika PCR znajduje zastosowanie w diagnostyce mikroorganizmów nierosnących lub wolno namnażających się na
podłożach sztucznych, a więc takich, które są trudne do diagnostyki za pomocą klasycznych metod hodowlanych. Metoda PCR jest wykorzystywana do wykrywania patogenów
układu oddechowego, mimo takich wad jak: niezdolność
rozróżniania martwych patogenów od żywych czy możliwość
otrzymania wyników fałszywie pozytywnych (niektóre substancje obecne w próbce mogą połączyć się z inhibitorem
amplifikacji) [39]. Przykładem wykrywanych metodą PCR
mikroorganizmów jest M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare [34, 38]. W przypadku tych patogenów (głównie dwóch
ostatnich) bardzo ważne jest ich rozróżnienie ze względu na
odrębne leczenie. Metoda ta okazała się szczególnie użyteczna w przypadku diagnostyki M. tuberculosis, ponieważ
czas otrzymania wyników metodami tradycyjnymi trwa od 1
do 2 miesięcy, a za pomocą PCR diagnostyka gruźlicy trwa
zaledwie 1 dzień [16]. Metodę tę wykorzystuje się do szybkiej
identyfikacji penicylinoopornych S. pneumoniae [16]. Technika ta pozwala również wykryć bezpośrednio w wymazach
z gardła lub popłuczynach pęcherzykowych czynniki etiologiczne zakażeń układu oddechowego u dzieci i dorosłych,
np. M. pneumoniae [10]. Pomocna jest również w identyfikacji całej rodziny Chlamydiaceae w tym: C. pneumoniae [16]
oraz C. trachomatis [16, 27, 34, 47, 57]. Z udziałem techniki
PCR mogą być także wykryte i zidentyfikowane takie mikroorganizmy jak: C. difficile [29], Helicobacter spp. [5], N. meningitidis [16], N. gonorrhoeae [25, 34, 39], B. pertussis [16].
Za pomocą tej techniki można także wykryć rzadkie, wcześniej rzadko identyfikowane patogeny, takie jak: R. henselae
(czynnik etiologiczny angiomatozy), E. chaffeensis (czynnik
etiologiczny choroby Whiple’a – ehrlichiozy) i E. ewingii [1].
Wykrycie dwóch ostatnich możliwe jest dzięki zastosowaniu starterów, które wyznaczają do amplifikacji obszar 16S
RNA, występujący u wszystkich gatunków drobnoustrojów
328
i zawierający sekwencje charakterystyczne dla każdego
z nich. Technika PCR pozwala także identyfikować we wczesnym stadium choroby (zanim jeszcze wystąpią objawy ze
strony układu nerwowego) trudny do diagnostyki patogen:
B. burgdorferi obecny w płynie mózgowo-rdzeniowym oraz
w moczu [27]. Znajduje ona również zastosowanie w identyfikacji grzybów z rodzaju Candida np. C. glabrata [6] oraz
patogenów wirusowych: HBV, HCV, Cytomegalowirusów,
Herpeswirusów czy Enterowirusów [34].
Odmianą techniki PCR, która umożliwia równoczesne zastosowanie kilku par gatunkowo specyficznych starterów, prowadząc do amplifikacji kilku odcinków DNA w tym samym
czasie jest Multiplex PCR (czyli amplifikacja równoczesna).
Dzięki tak dobranym starterom skraca się czas potrzebny
do przebadania większych fragmentów DNA. Ginevra C.
i wsp. identyfikowali za pomocą tej metody takie mikroorganizmy jak: C. pneumoniae, M. pneumoniae i Legionella spp.,
oceniając metodę jako czułą, swoistą oraz szybką (całkowity
czas zidentyfikowania wszystkich trzech mikroorganizmów
wynosił: 6,5 h) [17]. Kamiya i wsp. twierdzą, że jest to dobra
metoda do identyfikacji grzybów Candida spp. [21]. Natomiast Mason W. i współpracownicy stwierdzili, że szczepy
oksacylinooporne Staphylococcus spp. nie są identyfikowane tą metodą [28].
W przeciwieństwie do techniki PCR, która charakteryzuje się niezdolnością rozróżniania martwych patogenów od
żywych, jest jej odmiana, która umożliwia zidentyfikowanie
drobnoustroju w formie aktywnej (czyli replikującej się) –
dzięki czemu można wykazać formę aktywną bądź latentną
(utajoną) zakażenia. Oprócz tego metoda ta znajduje zastosowanie w diagnostyce drobnoustrojów, których materiałem
genetycznym jest RNA (wirusy). Technika ta polega na przeprowadzeniu procesu odwrotnej transkrypcji (przepisanie
mRNA na cDNA) przed właściwą reakcją PCR i nosi nazwę
RT-PCR (ang. reverse transcription PCR) [8]. Po przepisaniu mRNA na cDNA (na matrycy RNA powstaje dwuniciowy
DNA) ma miejsce amplifikacja cDNA podczas reakcji PCR.
Otrzymane produkty poddawane są elektroforezie w żelu
akrylamidowym. Kolejnym etapem jest poszukiwanie różnic między próbką kontrolną a badaną. Następnie przeprowadzana jest reamplifikacja i sekwencjonowanie prążków
w celu porównania ich z już istniejącymi bazami sekwencji
genetycznych znanych już genów. Technika ta nosi nazwę
pokazu różnicowego (ang. differential display) i znalazła
szerokie zastosowanie – głównie w diagnostyce odzwierzęcych chorób człowieka, np. w wykrywaniu E. chaffeensis
[13]. De Paula i wsp. dodatkowo podkreślają, że metoda RTPCR jest szybka, czuła i prosta [8].
Dzięki rozwojowi molekularnych sond hybrydyzacyjnych,
takich jak: TaqMan czy Molecular Beacons (produkowane
przez firmę Rohe Molecular Systems), umożliwiony został
monitoring amplifikacji kwasów nukleinowych w czasie rzeczywistym w warunkach klinicznych [34]. Do tego celu wykorzystuje się sondy znakowane barwnikami fluorescencyjnymi [33], które hybrydyzują z sekwencjami wewnętrznymi
K. Kondak
powielanego fragmentu oraz startery, które hybrydyzują
z sekwencjami zewnętrznymi powielanego fragmentu. Molekular Beacons jest oligonukleotydową sondą o kształcie
spinki do włosów, która zawiera fluorofory i jest mocno zasocjowana z wygaszaczem (ang. quencher), który absorbuje
fotony [33, 34]. W obecności komplementarnego łańcucha
DNA struktura spinki do włosów sondy rozwija się (powodując zwiększenie odległości między sondą fluoroforową
a sondą wygaszającą) i wtedy emitowana jest fluorescencja,
która może być zmierzona, określając ilość powstałego DNA
w danej chwili [13, 33, 34].
Technika, która wykorzystuje takie sondy jest odmianą łańcuchowej reakcji polimeryzacji PCR i nosi nazwę Real-Time
PCR.
Metoda Real-Time PCR znajduje szerokie zastosowanie
w identyfikacji enterokrwotocznych szczepów E. coli [24],
Salmonella, Listeria [24], Mycobacterium (w tym M. bovis, M.
tuberculosis) [36], Campylobacter spp. [24], C. difficile [29],
F. tularensis [35], L. pneumophila [3], N. gonorrhoeae [15]
oraz wszystkich koagulazo-negatywnych Staphylococcus
[9, 10]. Z wykorzystaniem tej techniki dokonano identyfikacji
wirusów: HIV, HCV, HBV [25]; grzybów z rodzaju Candida
np. C. glabrata, C. dubliniensis, C. kefyr, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis [24] oraz innych grzybów np. Cryptococcus spp. [22], Aspergillus spp. [22, 33]. Real-Time PCR
pozwala również na diagnostykę wirusów grypy A i B [37],
mikroorganizmów i wirusów weterynaryjnych (oraz wirusów
takich jak: FIV, CSFV, FCV) [24], a także badanie oporności
na antybiotyki, np. P. aeruginosa [11].
Edwards K. J. i wsp. podkreślają zalety metody Real-Time
PCR takie jak: zredukowane ryzyko zanieczyszczenia próbki (ponieważ nie ma konieczności otwierania lightcyklera po
amplifikacji) oraz konieczność przeprowadzenia np. jedynie
trzech reakcji PCR do scharakteryzowania 15 szczepów
CNS [10]. Dieter Klein wymienia dodatkowo takie zalety
metody jak: wysoka precyzja, wysoka reproduktywność, wysoka wrażliwość techniczna, szeroki zakres kwantyfikacji,
otrzymywanie gotowego wyniku (nie trzeba dokonywać dalszej analizy). Uważa, że ograniczeniami metody są: wzrost
ekspotencjalny produktu PCR, wzrost liczby otrzymywanych
wariantów wraz z kolejnym cyklem PCR, zwiększające się
ryzyko otrzymania wyników fałszywie negatywnych, pokrywanie się spektrum emisji oraz to, że równoczesnych reakcji
może być tylko cztery [24]. Podobnego zdania byli Greiner
O. i wsp., którzy stwierdzili, że technika ta jest dużo szybsza
i precyzyjniejsza niż konwencjonalne procedury identyfikacji
mikroorganizmów (do 24 godzin można otrzymać gotowy wynik, materiałem analizowanym może być bezpośrednio badana próbka materiału klinicznego), a swoistość metody wynosi
ok. 90-96% (w temperaturze optymalnej dla primerów, czyli
65ºC). Autorzy stwierdzili, iż metoda ta zwiększa możliwość
detekcji genów pochodzących ze szczepów S. pneumoniae,
które były przedmiotem badań ich pracy [18]. Zaś GeraatsPeters C.W.M. i wsp. na postawie identyfikacji N. gonorrhoeae, również ocenili tę technikę jako czułą i swoistą [15].
Skrócenie czasu potrzebnego do przebadania większych
fragmentów DNA umożliwia odmiana techniki Real-Time
PCR zwana Multiplex Real-Time PCR (czyli amplifikacja
równoczesna). Technika ta umożliwia zastosowanie kilku
par starterów równocześnie, prowadząc w ten sposób do
amplifikacji kilku odcinków DNA (w czasie rzeczywistym)
w jednej probówce [7]. Za pomocą tej metody Courtney J.W.
i wsp. identyfikowali takie mikroorganizmy jak: B. burgdorferi i A. phagocytophilum [7]. Według nich swoistość techniki
Multiplex Real-Time PCR jest bardzo duża w stosunku do
testowanych przez nich gatunków Borrelia (B. burgdorferi,
B. bissettii, B. andersoni, B. parkeri), a także A. phagocytophilum. Zaś DNA pochodzący z takich szczepów jak: A.
marginale, R. rickettsii, R. prowazekii, E. coli, E. canis, E.
chaffeensis, N. sennetsu oraz B. henselae nie udało się amplifikować za pomocą tej metody. Autorzy stwierdzają, że
technika ta jest szybka, czuła i swoista, a jej wadą są: wspomniany wcześniej wzrost ekspotencjalny produktu PCR czy
liczby otrzymywanych wariantów (wraz z kolejnym cyklem
PCR), zwiększające się ryzyko otrzymania wyników fałszywie negatywnych oraz pokrywanie się spektrum emisji [7].
Qin X. i wsp. [31] porównali metodę Real-Time PCR w identyfikacji P. aeruginosa i innych gram ujemnych pałeczek
niefermentujących do metody testów biochemicznych. W
zależności od użytego primera odsetek wyników pozytywnych wahał się w granicach: 92-100%. Wyniki fałszywie pozytywne zdarzały się w pojedynczych przypadkach i tylko
przy użyciu określonego primera. Autorzy ocenili czułość
metody na 98,4%, a swoistość na 98,9%. Ponieważ gram
ujemne pałeczki niefermentujące są trudne do identyfikacji
ze względu na swoją fenotypową różnorodność, metoda
Multiplex Real-Time PCR, okazała się bardzo dobrym narzędziem wykorzystywanym w identyfikacji tych mikroorganizmów. Autorzy podkreślają dodatkowo takie zalety techniki
jak: tańszy koszt wykonania od tradycyjnych testów biochemicznych, możliwość pełnej automatyzacji diagnostyki oraz
dużo krótszy czas wykonania (mniej niż 3 h) w porównaniu
z czasem potrzebnym na otrzymanie wyników testów biochemicznych (18-48 h w zależności od potrzebnego czasu
inkubacji).
Techniką bardzo podobną do PCR, ale wykorzystującą nie
dwie, a cztery pary starterów [39] jest reakcja LCR (ang.
Ligase Chain Reactions lub Ligase Chain Reaction Amplification – reakcja łańcuchowa ligazy). Startery przyłączają
się do czterech komplementarnych sekwencji matrycowego
DNA (dwa startery na jednej nici DNA). Obszar powstały
między parą komplementarnych starterów na jednej i drugiej
nici DNA łączy enzym zwany ligazą. W ten sposób podczas
jednego cyklu otrzymuje się dwa zligowane produkty, które
stanowią matrycę w następnych cyklach reakcji.
Metoda LCR znajduje zastosowanie w diagnostyce mikrobiologicznej, zwłaszcza w sytuacji, gdy czynnikiem etiologicznym są: C. trachomatis [39], M. tuberculosis [24, 32]
czy N. gonorrhoeae [2]. Bachmann L.H. i wsp. stwierdzili, że
technika LCR charakteryzuje się dużą czułością i swoisto329
Molekularne metody diagnostyki mikrobiologicznej
ścią w diagnostyce N. gonorrhoeae (materiałem do badania
była próbka moczu) [2]. Podobnego zdania byli Koumans
E. H. i współpracownicy, którzy stwierdzają dodatkowo, że
metoda LCR w diagnostyce zakażeń wywołanych przez C.
trachomatis i N. gonorrhoeae charakteryzuje się większą
czułością niż np. metoda hodowlana [25].
Podobnego zdania byli Van Dyck E. i wsp., którzy ocenili
czułość metody LCR na około 88,9 %, a swoistość na około
99,1 % [39] oraz Rajo M.C. i wsp. [32], którzy ocenili czułość
i swoistość tej metody odpowiednio na 55,5% i 100%.
Podsumowanie
Metody biologii molekularnej oparte na technikach hybrydyzacyjnych i reakcji PCR są narzędziem nowej ery do wykrywania i identyfikacji mikroorganizmów. Są one szczególnie
przydatne wtedy, gdy detekcja i identyfikacja patogenów
metodami tradycyjnymi są utrudnione lub wręcz niemożliwe. Metody biologii molekularnej uznane są w środowisku
naukowym za czułe, szybkie i wiarygodne. Wiarygodność
identyfikacji opartej o analizę genomu wynika z komplementarności zasad azotowych, a więc podstawowej budowy kwasu nukleinowego. Dobrana sekwencja nukleotydowa
sondy lub starterów wybranych do analizy może być swoista
dla rodzaju, gatunku, a nawet określonego szczepu, a możliwość identyfikacji powstałych produktów poprzez detekcję
kompleksu: sonda-materiał badany, rozdział elektroforetyczny produktów PCR czy analiza obrazu sprawia, że techniki
te są coraz szerzej stosowane. Dynamiczny rozwój metod
biologii molekularnej znajduje coraz szersze zastosowanie
w laboratorium mikrobiologicznym.
Piśmiennictwo
1. Arens MQ, Liddell AM, Buening G i wsp. Detection of Ehrlichia
spp. in the Blood of Wild White-Tailed Deer in Missouri by PCR
Assay and Serologic Analysis. J Clin Microbiol 2003; 41: 12631265.
2. Bachmann LH, Desmond RA, Stephens J i wsp. Duration of
Persistence of Gonococcal DNA Detected by Ligase Chain Reaction in Men and Women following Recommended Therapy
for Uncomplicated Gonorrhea. J Clin Microbiol 2002; 40: 35963601.
3. Baskova L, Landlinger Ch, Preuner S i wsp. The Pan-AC assay:
a single-reaction real-time PCR test for quantitative detection
of a broad range of Aspergillus and Candida species. J Med
Microbiol 2007; 56: 1167-1173.
4. Bekal S, Brousseau R, Masson L i wsp. Rapid Identyfication of
Escherichia coli Pathotypes by Virulence Gene Detection with
DNA Microarrays. J Clin Microbiol, 2003; 41: 2113-2125.
5. Choi YK, Han JH, Joo HS. Identification of Novel Helicobacter
Species in Pig Stomachs by PCR and Partial Sequencing. J Clin
Microbiol 2001; 39: 3311-3315.
6. Correia A, Sampaio P, Almeida J i wsp. Study of Molecular Epidemiology of Candidiasis in Portugal by PCR Fingerprinting
of Candida Clinical Isolates. J Clin Microbiol 2004; 42: 58995903.
7. Courtney JW, Kostelnik LM, Zeidner NS i wsp. Multiplex RealTime PCR for detection Anaplasma phagocytophilum and Borrelia burdorferi. J Clin Microbiol 2004; 42: 3164-3168.
8. De Paula S, Fonseca BA. Dengue: a review of the laboratory
tests a clinician must know to achieve a correct diagnosis. Braz
330
J Infect Dis 2004; 8: 390-398.
9. Deng JY, Zhang XE, Lu HB i wsp. Multiplex Detection of Mutations in Clinical Isolates of Rifampin – Resistant Mycobacterium
tuberculosis by Short Oligonucleotide Ligation Assay on DNA
Chips. J Clin Microbiol 2004; 42: 4850-4852.
10. Edwards KJ, Kaufmann ME, Saunders NA. Rapid and Accurate
Identification of Coagulase-Negative Staphylococci by Real-Time PCR. J Clin Microbiol 2001; 39: 3047-3051.
11. Edwards KJ, Saunders NA. Real-time PCR used to measure
stress-induced changes in the expression of the genes of the
alginate pathway of Pseudomonas aeruginosa. J Appl Microbiol
2001; 91: 29-37.
12. Farkas DH. Molecular diagnostic: the best is yet to come. Trends
Mol Med 2006; 8: 245.
13. Felek S, Unver A, Stich RW i wsp. Sensitive Detection of Ehrlichia chaffeensis in Cell Culture, Blood, and Tick Specimens
by Reverse Transcription PCR. J Clin Microbiol, 2001; 39: 460463.
14. Fukushima M, Kakinuma K, Hayashi H i wsp. Detection and
identyfikation of Mycobacterium Species Isolates by DNA Microarray. J Clin Microbiol 2003; 41: 2605-2615.
15. Geraats-Peters CWM, Hermans MHA i wsp. Specific and Sensitive Detection of Neisseria gonorrhoeae in Clinical Specimens
by Real-Time PCR. J Clin Microbiol, 2005; 43: 5653-5659.
16. Gilbert GL. Molecular diagnostics in infectious diseases and
public health microbiology: cottage industry to postgenomics.
Trends Mol Med 2002; 8: 280-287.
17. Ginevra C, Barranger C, Ros A, i wsp. Development and Evaluation of Chlamylege, a New Commercial Test Allowing Simultaneous Detection and Identification of Legionella, Chlamydophila
pneumoniae, and Mycoplasma pneumoniae in Clinical Respiratory Specimens by Multiplex PCR. J Clin Microbiol 2005; 43:
3247-3254.
18. Greiner O., Day PJR, Bosshard PP i wsp. Quantitative Detection
of Streptococcus pneumoniae in Nasopharyngeal Secretions by
Real-Time PCR. J Clin Microbiol 2001; 39: 3129-3134.
19. Hartley JC, Kaye S, Stevenson S i wsp. PCR Detection and Molecular Identification of Chlamydiaceae Species. J Clin Microbiol
2001; 39: 3072-3079.
20. Jeong Oh T, Jim Kim C, Kyung Woo S i wsp. Development and
Clinical Evaluation of a Highly Sensitive DNA Microarray for
Detection and Genotyping of Human Papillomaviruses. J Clin
Microbiol 2004; 42(7): 3272-3280.
21. Kamiya A, Kikuchi A, Tomita Y i wsp. Epidemiological study of
Candida species in cutaneous candidiasis based on PCR using
a primer mix specific for the DNA topoisomerase II gene. J Dermatol Sci 2005; 37: 21-28.
22. Kessler N, Ferraris O, Palmer K i wsp. Use of the DNA FlowThru Chip, a Three-Dimensional Biochip, for Typing and Subtyping of Influenza Viruses. J Clin Microbiol 2004; 42: 2173-2185.
23. Klaassen CHW, Prinsen CFM, De Valk HA, i wsp. DNA microarray Format for Detection and Subtyping of Human Papillomavirus. J Clin Microbiol 2004; 42: 2152-2160.
24. Klein D. Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations. Trends Mol Med 2002; 8: 257-260.
25. Koumans EH, Black CM, Markowitz LE i wsp. Comparison of
Methods for Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria
gonorrhoeae Using Commercially Available Nucleic Acid Amplification Tests and a Liquid Pap Smear Medium. J Clin Microbiol
2003; 41: 1507-1511.
26. Leśnikowski ZJ, Paradowska E, Przepiórkiewicz M i wsp. DNA
chips and theirs applications. Postępy Mikrobiol 2002; 41: 1318.
27. Lin T, Oliver JH, Gao L i wsp. Genetic heterogeneity of Borrelia
burgdorferi sensu lato in the Southern United States based on
Restriction Fragment Length Polymorphism and sequence analysis. J Clin Microbiol 2001; 39: 2500-2507.
K. Kondak
28. Mason W, Blevins JS, Beenken K i wsp. Multiplex PCR Protocol
for the Diagnosis of Staphylococcal Infection. J Clin Microbiol
2001; 39: 3332-3338.
29. Moncrief JS, Zheng L, Nevill LM i wsp. Genetic Characterization
of Toxin A-Negative, Toxin B-Positive Clostridium difficile Isolates by PCR. J Clin Microbiol 2000; 38: 3072-3075.
30. Park H, Chang CL i wsp. Comparison of a Conventional Antimicrobial Susceptibility Assay to an Oligonucleotide Chip System
for Detection of Drug Resistance in Mycobacterium tuberculosis
Isolates. J Clin Microbiol 2006; 44: 1619-1624.
31. Qin X, Emerson J, Stapp J i wsp. Use of Real-Time PCR with
Multiple Targets To Identify Pseudomonas aeruginosa and Other
Nonfermenting Gram-Negative Bacilli from Patients with Cystic
Fibrosis. J Clin Microbiol 2003; 41: 4312-4317.
32. Rajo MC, Molino MLPD, Lado Lado FL i wsp. Rapid Diagnosis
of Tuberculous Meningitis by Ligase Chain Reaction Amplification. Scand J Infect Dis 2002; 34: 14-16.
33. Raoult D, Fournier PE, Drancourt M. What does the future hold
for clinical microbiology? Nat Rev 2004; 2: 151-159.
34. Robertson BH, Nicholson JK. New microbiology tools for public
health and their implications. Annu Rev Public Health 2005; 26:
281-302.
35. Splettststoesser WD, Tomaso H, Al Dahouk S, i wsp. Diagnostic
procedures in tularaemia with special focus on molecular and
immunological techniques. J Vet Med B Infect Dis Vet Public
Health 2005; 52: 249-262.
36. Taylor MJ, Hughes MS, Skuce RA i wsp. Detection of Mycobacterium bovis in bovine clinical specimens using realm-time flu-
orescence and fluorescence energy transfer probe rapid-cycle
PCR. J Clinic Micro 2001; 39: 1272-1278.
37. Templeton KE, Scheltinga SA, Beersma ME i wsp. Rapid and
sensitive method using multiplex real-time PCR for diagnosis
of infections by influenza A and influenza B viruses respiratory
syncytial virus, and parainfluenza viruses 1, 2, 3 and 4. J Clin
Microbiol 2004; 42: 1564-1569.
38. Torrea G, Sechi LA i wsp. PCR-based detection of the Mycobacterium tuberculosis complex in urine of HIV-infected and uninfected pulmonary and extrapulosis patients in Burkina Faso.
J Med Microbiol 2005; 54: 39-44.
39. Van Dyck E, Ieven M, Pattyn S i wsp. Detection of Chlamydia
trachomatis and Neisseria gonorrhoeae by Enzyme Immunoassay, Culture, and Three Nucleic Acid Amplification Tests. J Clin
Microbio 2001; 39: 1751-1756.
40. Zhou W, Du W, Cao H, Zhao J i wsp. Detection of gryA and pacC
Mutations Associated with Ciprofloxacin Resistance in Neisseria gonorrhoeae by Use of Oligonucleotide Biochip Technology.
J Clin Microbiol 2004; 42: 5819-5824.
Adres Autorów:
Katedra i Zakład Mikrobiologii we Wrocławiu
ul. Chałubińskiego 4
50-368 Wrocław
(Praca wpłynęła do Redakcji: 2009-09-15)
(Praca przekazana do opublikowania: 2009-12-04)
331