D obra Praktyka Pipetow ania

RAININ
Dobra Praktyka Pipetowania
Pipetting 360o
Kalibracja pipet i technika pipetowania
Wpływ tych czynników na wyniki badań
Przenoszenie cieczy przy pomocy pipet jest działaniem powszechnie realizowanym w laboratoriach naukowych działających w obszarze nauk biologicznych.
Sprawność pipet oraz technika stosowana przez użytkownika w istotny sposób
wpływa na jakość otrzymywanych wyników badań, niezależnie od tego, czy są
to zaawansowane technologiczne badania prowadzone przez laboratoria akademickie, czy też rutynowe badania wykonywane zgodnie z normami w laboratorium badawczym.
Sprawność pipety jest funkcją wielu czynników. Jednym z nich jest prawidłowa konserwacja pipety w celu utrzymania jej sprawności na odpowiednim poziomie. Kolejnym z
czynników jest okresowe sprawdzanie pipety w celu potwierdzenia, że pipeta ciągle spełnia wymagania określone w specyfikacji technicznej. Wśród innych czynników wymienić
można technikę pipetowania. Użytkownik powinien opanować technikę prawidłowego pipetowania w celu osiągnięcia odpowiedniej sprawności podczas badań oraz zapewnienia,
że wszystkie otrzymywane wyniki badań są wiarygodne.
Jeśli wymagania dotyczące rutynowej konserwacji i techniki użytkownika zostaną spełnione, niedokładności wynikające ze zmienności w tym zakresie ulegają istotnemu zmniejszeniu, a otrzymywane wyniki są wiarygodne niezależnie od rodzaju realizowanej aplikacji.
W literaturze naukowej ciągle podkreśla się, że pipety i technika pipetowania mają kluczowy wpływ na to, czy badania naukowe zakończą się sukcesem, czy też nie. Konsekwencją zignorowania wytycznych dotyczących pipetowania mogą być poważne straty
czasu i straty finansowe, co dla każdego laboratorium nie jest bez znaczenia.
Publikacje można podzielić na kilka klas aplikacji. Niniejszy dokument opiera się na informacjach pochodzących z obszaru genomiki i proteomiki, które zostały opublikowane
na przestrzeni ostatnich kilku lat.
Część GPP Seria o Dobrej Praktyce Pipetowania
Dobra Praktyka Pipetowania
Wpływ kalibracji pipet na wyniki badań
W wielu badaniach genomicznych stosowana jest technika PCR lub qPCR, gdzie wymagane jest bardzo
dokładne dozowanie składników reakcji lub przygotowanie krzywej wzorcowej. W wielu publikacjach podkreśla się, że warunkiem otrzymania wiarygodnych wyników badań jest stosowanie prawidłowej techniki
pipetowania oraz przeprowadzanie kalibracji pipet. Pennington i Edwards1, stosując qPCR do ekspresji
genów w małych próbkach kultur tkankowych i komórkowych, zalecają, aby unikać pipetowania objętości
mniejszych niż 2 μL, ponieważ precyzyjne pipetowanie decyduje o sukcesie badania qPCR. Toh2, również
stosujący qPCR, zaleca, aby użytkownicy poddawali pipety regularnej kalibracji. Grgicak3 dowodzi,
że zmienność pomiędzy rozcieńczeniami podczas przygotowania krzywej wzorcowej ma istotny wpływ
na jej stabilność. Korzystanie z jednej kalibrowanej pipety dawało mniejszy błąd w porównaniu z użyciem
dwóch pipet lub jednej niekalibrowanej pipety.
Autorzy powyższych publikacji podkreślają ogromne znaczenie kalibracji pipet w celu zminimalizowania
wpływu ich mechanicznej zmienności wynikającej z rutynowego użytkowania. Kalibracji pipet może towarzyszyć program ich regularnego sprawdzania w celu upewnienia się, że pipety spełniają wymagania określonych specyfikacji. Sprawdzanie można przeprowadzać, korzystając z wagi o wysokiej rozdzielczości.
Wpływ techniki pipetowania na wyniki badań
W wielu publikacjach autorzy podają wytyczne dotyczące technik pipetowania, podkreślając, że brak
stosowania odpowiednich technik może prowadzić do poważnych błędów. Morga4 w swojej publikacji
podkreśla, że wiele czynników wpływa na jakość wyników badań qPCR. Jednym z nich jest „umiejętne
pipetowanie.”
Vallania5 wykazał, że na proces ilościowego określenia zawartości alleli wpływają błędy pipetowania podczas sekwencjonowania DNA z zastosowaniem techniki “DNA pooling”. Potwierdziły to wyniki skanowania
genomu, tzw. GWAS (Genome-Wide Association Study), gdzie niedokładne pipetowanie było głównym
źródłem błędów.
Venegas6 w prowadzonych przez siebie badaniach mitochondrialnego DNA metodą qPCR wskazał, że niespójności w seriach wyników były spowodowane błędami w pipetowaniu odczynników, matrycowego DNA
lub starterów DNA, podkreślając również ogromne znaczenie dokładnego pipetowania.
Frendewey7 w swoich badaniach nad przesiewaniem komórek i genotypowaniem myszy przy pomocy
techniki qPCR wskazuje, że różnice w wynikach dla podwójnych próbek wynikają z różnic w dokładności
i odtwarzalności pipetowania.
Firma Life Technologies będąca wiodącym dostawcą produktów qPCR, zapewnia istotne wsparcie
dla swoich platform, w tym wskazówki dotyczące optymalizacji i rozwiązywania problemów. Ponieważ
pipetowanie małych objętości (<5 μL) ma niekorzystny wpływ na precyzję, firma w swoich protokołach
qPCR nie zaleca takiego trybu postępowania, chyba że stosowane są pipety dedykowane specjalnie
do odmierzania tak małych objętości. Konsekwencją niedokładnego pipetowania badanych próbek
są wysokie wartości odchylenia standardowego i wiele błędów, które mogą wystąpić podczas przygotowania krzywej wzorcowej. Większość tych błędów sprawia, że przygotowane krzywe wzorcowe są niedokładne, czego konsekwencją jest sztucznie niski lub wysoki wynik efektywności amplifikacji w zależności
od tego, czy błąd jest spowodowany pipetowaniem nadmiernej, czy też niewystarczającej objętości.
Może to spowodować naruszenie wytycznych MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative
Real-Time PCR Experiments).8
2
Proste obliczenia błędu pipetowania wskazują na potencjalny niekorzystny wpływ tych znaczących niedokładności w badaniach qPCR. Na przykład, do odmierzania objętości 5 μL jest stosowana pipeta 10 μL, jej
dokładność mechaniczna wynosi ± 0.075 μL. Jeśli liczba kopii w 5 μL wynosi 30,000, to zmienność liczby
kopii dla samej pipety (wyłączając technikę użytkownika) może wahać się w zakresie od 30,450
do 29,550 kopii DNA. Zakładamy oczywiście, że pipeta jest prawidłowo wykalibrowana i objęta programem
konserwacji.
W zależności od umiejętności użytkownika technika może przyczynić się do powiększenia błędu na poziomie od ± 2 do 7%. Konsekwencją tego dodatkowego błędu jest zakres ilości kopii od 31,972 do 28,072.
Błędy te sumują się podczas serii rozcieńczeń. Sumowanie to może powodować istotne różnice na krzywej
wzorcowej, prowadząc w ostatecznym rozrachunku do różnic w uzyskanych wynikach badania.
W przeciwieństwie do badań genomicznych, gdzie występuje ograniczona liczba analiz i technik detekcji,
w badaniach proteomicznych mamy do czynienia z wieloma systemami detekcji mającymi różne wymagania, jeśli chodzi o objętość, format i czystość białka. Badanie końcowej próbki w wybranym systemie
detekcji odbywa się po wielu etapach przygotowania, w których stosowane jest pipetowanie, i każdy z tych
etapów ma swój udział w zmienności i niedokładności otrzymywanych danych.
W badaniach nad chorobą Alzheimera prowadzonych przez zespół Teunissena10 dokonano analizy wyników badań międzylaboratoryjnych, przedmiotem których było oznaczanie specyficznego biomarkera.
Z badań tych można wyciągnąć jednoznaczny wniosek: chociaż każde laboratorium otrzymało taką samą
próbkę i wykonało takie samo badanie z wykorzystaniem takich samych materiałów, odnotowano dużą
zmienność wyników otrzymanych w różnych laboratoriach. Jednym z obszarów, na który zwrócono uwagę,
były techniki pipetowania, wskazując, że różnice w technice doprowadziły do wystąpienia zmienności międzylaboratoryjnej.
Jeśli chodzi o technikę, to dodatkowo należy upewnić się, że właściwe końcówki są prawidłowo zamocowane na pipecie, aby zachować wystarczającą szczelność całego układu. Na przykład, w rozdziale. “Badania immunologiczne szczepionek weterynaryjnych,” Guzman11 sugeruje, że w badaniach ELISA technika
pipetowania ma ogromne znaczenie, przypominając czytelnikowi ponadto, aby “zawsze sprawdzał pipety
i końcówki pod kątem zapewnienia odpowiedniej szczelności oraz upewniał się, że stosuje prawidłową
technikę pipetowania.”
Zalecenia: “sprawdzenie wewnętrzne” i kalibracja zewnętrzna
Technika stosowana przez operatora jest ważna, ale sprawdzać należy również fizyczne możliwości pipety
w celu potwierdzenia, że spełnia ona wymagania aplikacji, które będą realizowane. W swojej publikacji
Alamooti12, prowadząc badania obejmujące testy immunoenzymatyczne (ELISA) oraz stosując metodę
cytometrii przepływowej, potwierdził, że dokładność i odtwarzalność wszystkich pipet i techników była
sprawdzana raz w miesiącu metodą grawimetryczną. Należy w tym miejscu odnotować, że odpowiednio
przeszkoleni i doświadczeni technicy serwisu mogą z powodzeniem wykonywać bardzo dokładne i niezależne sprawdzanie pipet. Wiele organizacji proponuje różną częstotliwość kalibracji i sprawdzania pipet.
Na przykład, FDA sugeruje w swoich wytycznych ORA-LAB. 5.5, aby wszystkie urządzenia stosowane
do odmierzania objętości, takie jak pipety mechaniczne, były kalibrowane przynajmniej co sześć miesięcy.13 Bertermann14 w swojej publikacji zaleca, aby pipety były “kalibrowane zgodnie z udokumentowanymi procedurami oraz okresowo sprawdzane w celu zapewnienia ich ciągłej sprawności.” Poszczególne
laboratoria i osoby prowadzące badania powinny określić swoje własne potrzeby w zakresie rutynowego
sprawdzania pipet, biorąc pod uwagę wpływ błędów pipetowania na wyniki prowadzonych badań
oraz poziom akceptowanego ryzyka, jeśli wyniki zostały narażone na szwank. Przydatnym narzędziem
umożliwiającym określenie poziomu ryzyka dla pipetowania jest „Risk Check”. Narzędzie to dostępne
jest na stronie internetowej www.mt.com/gpp.
3
Literatura
1Pennington, CJ, Edwards, DR. Real-Time PCR Expression Profiling of MMPs and TIMPs. Matrix Metalloproteinase Protocols,
Methods in Molecular Biology 622.
2Toh,
WS, Lee, EH, Richards, M, Cao, T. Invitro Derivation of Chondrogenic Cells from Human Embryonic Stem Cells. Human
Embryonic Stem Cell Protocols, Methods in Molecular Biology 584.
3Grgicak,
CM, Urban, ZM, Cotton, RW. Investigation of Reproducibility and Error Associated with qPCR Methods using Quantifiler® Duo DNA Quantification Kit. J Forensic Sci, September 2010. Vol. 55, No.5.
4Morga, B, Arzul, I, Faury, N, Renault, T. Identification of Genes from Flay Oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes
for quantitative real-time PCR. Institut Français de Recherche pour l’Exploitation de la Maer (IFREMER).
5Vallania,
FLM, Druley, TE, Ramos, E, et al. High-Throughput Discovery of Rare Insertions and Deletions in Large Cohorts.
Genome Res. 2010 20: 1711-1718.
6Venegas, V, Wang, J, Dimmock, D, Wong, L-J. Real-Time Quantitative PCR Analysis of Mitochondrial DNA Content. Current
Protocols in Human Genetics, 19.7.1 – 19.7.12, January 2011.
7Frendewey,
D, Chernomorsky, R, Esau, L, Om, J, Xue, Y, Murphy, AJ, Yancolpoulos, GD, Valenzuela, DM. The Loss-of-Allele
Assay for ES Cell Screening and Mouse Genotyping. Methods in Enzymology, Volume 476.
8Bustin
SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele
J, Wittwer CT. The MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-time PCR Experiments. Clin
Chem. 2009 Apr; 55(4):611-22. Epub 2009 Feb 26.
9Teunissen,
CE, Verwey, NA, Kester, MI, Uffelen, Kv, Blankenstein, MA. Standardization of Assay Procedures for Analysis of the
CSF Biomarkers Amyloid ß(1-42), Tau, and Phosphorylated Tau in Alzheimer’s Disease: Report of an International Workshop.
International Journal of Alzheimer’s Disease, Vol 2010, Article ID 635053.
10Guzman,
GD, Shepherd, RP, Walmsley, AM. Immunoassays in Veterinary Plant-Made Vaccines, Immunoassays in Agricultural
Biotechnology. 2011.
11Alamooti,
AA, Ardalan FA, Abdolahi, A, Zeidi, M, Firouzjaie, F. Determination of Lymphocyte Subsets Reference Values in Healthy Iranian men by a Single Platform Flow Cytometric method. Cytometry Part A, 77A: 890-894, 2010.
12Procedura
Laboratorium ORA, ORA-LAB.5.5, Załącznik B, Tabela 2, Kalibracja wyposażenia. 10/03. Food and Drug Admini-
stration.
13Bertemann,
R. Pipet Quality Control: A Microliter of Prevention… American Biotechnology Laboratory, June 2004.
Mettler-Toledo Sp. z o.o.
ul. Poleczki 21
02-822 Warszawa
Telefon: +48 22 545 06 80
Faks:
+48 22 545 06 88
Internet: www.mt.com
Podlega zmianom danych technicznych
© 01/2012 Rainin Instrument, LLC
www.mt.com
Aby uzyskać więcej informacji