plateliatm aspergillus eia 96 testów 62796 - Bio-Rad

Transkrypt

PLATELIATM ASPERGILLUS EIA
96 TESTÓW
62796
PLATELIA™ ASPERGILLUS EIA JEST MIKROPŁYTKOWYM, KANAPKOWYM TESTEM
IMMUNOENZYMATYCZNYM DO OZNACZANIA ANTYGENU GALAKTOMANNANOWEGO
ASPERGILLUS W SUROWICY
1
PRZEZNACZENIE
Platelia™ Aspergillus EIA jest mikropłytkowym, kanapkowym testem immunoenzymatycznym do
oznaczania antygenu galaktomannanowego Aspergillus w surowicy.
2
ZASTOSOWANIE
Platelia™ Aspergillus EIA jest testem, który w połączeniu z innymi metodami diagnostycznymi,
takimi jak hodowla, badanie histologiczne bioptatów i badania radiologiczne, może być pomocny w
diagnozowaniu aspergilozy inwazyjnej.
3
ZASADA DZIAŁANIA
Zakażenie grzybami Aspergillus rozwija się zazwyczaj w wyniku inhalacji występujących
powszechnie w środowisku zarodników. Inwazyjna forma, której częstość występowania w ciągu
ostatnich 10 lat znacznie wzrosła, jest najcięższą postacią zakażenia. Występuje ona głównie u
pacjentów neutropenicznych (w wyniku leczenia przeciwnowotworowego) oraz u pacjentów
leczonych immunosupresantami (transplantacja narządów, a zwłaszcza transplantacja szpiku
kostnego) i kortykosterydami 7.
Grzybnia Aspergillus jest rzadko izolowana z hodowli krwi. Diagnoza opiera się często na
metodach niespecyficznych lub radiologicznych (objawy kliniczne, tomografia komputerowa,
prześwietlenie klatki piersiowej itp.).
Oznaczanie w surowicy rozpuszczalnego antygenu galaktomannanowego wydaje się obecnie być
metodą serologiczną pomocną w diagnozowaniu aspergilozy inwazyjnej 6, 9, 14, 34, 39.
4
ZASADA OZNACZENIA 27
Platelia™ Aspergillus EIA jest jednostopniowym, mikropłytkowym, kanapkowym testem
immunoenzymatycznym do oznaczania antygenu galaktomannanowego w surowicy pacjenta. W
teście wykorzystano szczurze przeciwciała monoklonalne EBA-2, skierowane przeciw
galaktomannanowi Aspergillus, opisane literaturze16, 28. Przeciwciała monoklonalne używane są do
(1) opłaszczenia dołków mikropłytki i wiązania antygenu (2) oraz do wykrywania związanego z
uczuloną mikropłytką antygenu (koniugat: monoklonalne przeciwciała związane z peroksydazą). W
celu rozpuszczenia kompleksów immunologicznych oraz precypitacji białek surowicy, które
mogłyby wpływać na przebieg oznaczenia, próbki surowicy ogrzewa się w obecności EDTA15.
Przygotowane próbki i koniugat dodaje się do dołków opłaszczonych przeciwciałami
monoklonalnymi i inkubuje. W obecności galaktomannanu tworzy się kompleks : przeciwciało
monoklonalne– galaktomannan – przeciwciało monoklonalne / peroksydaza.
Paski płucze się, w celu usunięcia niezwiązanego materiału. Następnie, dodaje się roztwór
substratu, który reaguje z kompleksami związanymi z dołkiem wywołując niebieskie zabarwienie.
Po dodaniu kwasu, reakcja enzymatyczna zostaje zatrzymana, a zabarwienie z niebieskiego
zmienia się na żółte. Wartości absorbancji próbek i kontroli określa się spektrofotometrycznie przy
długości fali 450 i 620 nm.
1
5
ODCZYNNIKI
Platelia™ Aspergillus: nr kat. 62796 (96 testów)
Zestaw należy przechowywać w temperaturze 2-8°C. Przed użyciem wszystkie odczynniki
przenieść do temperatury pokojowej (18-25°C). Natychmiast po użyciu wszystkie odczynniki z
wyjątkiem kontroli, powinny być przeniesione do temperatury 2-8°C. Po rekonstytucji, nieużyta
surowica kontrolna ujemna, surowica kalibracyjna i surowica kontrolna dodatnia muszą być
zamrożone w temp. -20°C. Niezużyte paski/płytki włożyć do opakowania, zamknąć szczelnie. Nie
usuwać środka pochłaniającego wilgoć. Paski powinny być zużyte w ciągu 5 tygodni od
pierwszego otwarcia opakowania. Rozcieńczony bufor do płukania można przechowywać przez 14
dni w temp. 2-8°C. Wszystkie pozostałe odczynniki po otwarciu są stabilne do daty ważności
podanej na opakowaniu. Dostarczona ilość odczynników wystarcza do przeprowadzenia 96 testów
w maksimum 9 seriach.
Składnik
Mikropłytka
Zawartość
Mikropłytka:
-96 dołków (12 pasków z 8 dołkami każdy)
opłaszczonych monoklonalnymi przeciwciałami antygalaktomannanowymi
R2 Stężony bufor Stężony bufor do płukania (10X):
do płukania
- bufor Tris NaCl (pH 7.4)
-1% Tween® 20
-0,01% tiomersal
R3 Kontrola
Surowica kontrolna ujemna:
ujemna
Liofilizowana surowica ludzka, ujemna pod
względem glaktomannanu, przeciwciał anty-HIV-1,
anty-HIV-2, anty-HCV i antygenu HBs
R4 Surowica
Surowica kalibracyjna:
kalibracyjna
- Liofilizowana surowica ludzka, ujemna pod
względem przeciwciał anty-HIV-1, anty-HIV-2, antyHCV i antygenu HBs
R5 Kontrola
Surowica kontrolna dodatnia:
Dodatnia
- Liofilizowana surowica ludzka, dodatnia pod
względem glaktomannanu, ujemna pod względem
przeciwciał anty-HIV-1, anty-HIV-2, anty-HCV
i
antygenu HBs
R6 Koniugat
Koniugat (gotowy do użycia):
-Monoklonalne
przeciwciało
antyantygalaktomannanowe znakowane peroksydazą.
-Środek konserwujący : 0,01% tiomersal
R7 Roztwór
do Roztwór do przygotowywania (gotowy do użytku):
przygotowywan -kwaśny roztwór EDTA, bez środka konserwującego
ia surowicy
R8 Bufor substratu Bufor substratu TMB (gotowy do użycia):
TMB
-Roztwór kwasu cytrynowego i octanu sodu pH 5.2
-0,009% Nadtlenek wodoru
-4% Dwumetylosulfotlenek (DMSO)
R9 Chromogen:
Roztwór TMB (stężony):
roztwór TMB
-90%
roztwór
dwumetylosulfotlenku
(DMSO)
zawierający 0,6% tetrametylobenzydynę (TMB)
R10 Roztwór
Roztwór zatrzymujący (gotowy do użycia):
zatrzymujący
-1.5 N Kwas siarkowy (H2SO4)
Folia adhezyjna Folia adhezyjna do mikropłytek
R1
Ilość
1 płytka /
12 × 8 dołków
1 × 100 ml
3 × qs* 1 ml
3 × qs* 1 ml
3 × qs* 1 ml
1 × 8 ml
1 × 10,5 ml
1 × 60 ml
1 × 1 ml
1 × 12 ml
8 arkuszy

Uwaga: TMB (tetrametylobenzydyna) - jest nierakotwórczym i niemutagennym substratem chromogennym dla peroksydazy.
*Uwaga: qs: uzupełnić do
2
6
HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY
1.
Wyrób do diagnostyki in vitro.
2.
Tylko do użytku profesjonalnego.
3.
Nie zaleca się stosowania próbek innych niż ludzka surowica.
4.
Surowica kontrolna dodatnia, surowica kalibracyjna i surowica kontrolna ujemna to
inaktywowana termicznie surowica ludzka. Próbki zostały przebadane z użyciem
zatwierdzonych we Francji testów i uznane za ujemne w kierunku: przeciwciał anty-HIV -1/2
i anty-HCV, jak również antygenu HBs. Ponieważ żadna ze znanych metod badawczych
nie może dać całkowitej pewności co do nieobecności czynników zakaźnych, z
odczynnikami jak i z próbkami pacjentów należy obchodzić się tak jak z materiałem
zakaźnym. Oznaczenia należy prowadzić zgodnie z OSHA Standard for Blood Borne
Pathogens, w laboratorium 2 poziomu bezpieczeństwa lub z zastosowaniem innych
środków ochrony właściwych dla zagrożeń biologicznych.
5.
Stosować się do zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej, w trakcie pracy z odczynnikami i
próbkami używać środków ochrony osobistej, w tym fartucha, osłony oczu/twarzy i
rękawiczek jednorazowych (zalecane są syntetyczne rękawice nielateksowe). Po
wykonaniu testu umyć dokładnie ręce.
6.
Nie pipetować ustami.
7.
Nie palić, nie pić i nie jeść w miejscu pracy z próbkami i odczynnikami zestawu.
8.
Unikać rozlania próbek i roztworów zawierających próbki.
9.
Niezawierające kwasów rozlane płyny zawierające materiały biologiczne, należy wytrzeć
dokładnie z stosując środek dezynfekujący. Jako środka dezynfekującego można użyć
między innymi: 10% wybielacza (0.5% roztwór podchlorynu sodu), 70% etanolu lub 0.5%
Wescodyne Plus™. W przypadku rozlania kwaśnych cieczy, należy je dokładnie wytrzeć
bibułą lub zobojętnić dwuwęglanem sodu, a następnie przemyć środkiem dezynfekującym.
Materiały użyte do wycierania rozlanych cieczy należy wyrzucić do pojemnika na odpady
biologiczne.
UWAGA: Nie wstawiać roztworów zawierających wybielacz do autoklawu.
10. Rozlane płyny zawierające kwasy należy dokładnie osuszyć (wytrzeć) lub zneutralizować
dwuwęglanem sodu, spłukać i wytrzeć. Jeżeli zawierają materiał biologiczny, przetrzeć
powierzchnię jednym z dezynfektantów chemicznych.
11. Wszystkie próbki i materiały używane do wykonania testu należy traktować jak materiał
potencjalnie zakaźny. Należy przestrzegać wszelkich wymagań odnośnie usuwania
odpadów tego rodzaju.
12. UWAGA: Poniżej podano listę potencjalnych zagrożeń chemicznych właściwych dla
substancji zawartych w odczynnikach zestawu (patrz rozdział 5 - Odczynniki)
1.5N Kwas siarkowy (7,2% H2SO4) jest żrący, może powodować oparzenia
oczu i skóry; może być szkodliwy w przypadku połknięcia lub kontaktu ze
skórą; może powodować poważne uszkodzenia oczu, w tym trwałe
upośledzenie widzenia lub ślepotę.
C - żrący Trzymać z dala od silnych zasad oraz czynników redukujących.
R34-41 Wywołuje oparzenia. Ryzyko poważnego uszkodzenia oczu.
S24/25-26-30-36/37-39-60 Unikać kontaktu ze skóra i oczami. W razie kontaktu z oczami
natychmiast przemyć dużą ilością wody i zasięgnąć porady lekarza. Nosić odpowiednią
odzież ochronną, rękawice oraz osłonę oczu/twarzy. Odczynnik oraz opakowanie muszą
być usuwane jako odpady niebezpieczne.
Odpady tego odczynnika są klasyfikowane jako niebezpieczne odpady kwaśne; jednakże,
jeżeli pozwalają na to przepisy lokalne, regionalne i krajowe, mogą być zneutralizowane do
pH 6-9, przez przeszkolony i posiadający odpowiednie środki personel, w celu usuwania
jako środek nie-niebezpieczny
3
13.
7
0.01% tiomersal (mertiolan sodu) jest organiczno-rtęciowym środkiem konserwującym o
właściwościach biobójczych, działającym na centralny układ nerwowy (CUN), środkiem
działającym toksycznie na układ rozrodczy oraz środkiem silnie uczulającym; długotrwała
lub częsta ekspozycja u niektórych wrażliwych osób może wywołać reakcję alergiczną.
Liczne są przypadki uczuleń będących wynikiem ekspozycji na rozcieńczone roztwory
tiomersalu. Unikać uwalniania do środowiska, ryzyko kumulacji. Roztwory zawierające
powyżej 0.2 ppm rtęci, muszą być usuwane jako odpady niebezpieczne, zgodnie z US
Federal RCRA (D009); jednakże, wszystkie odpady musza być usuwane zgodnie z
lokalnymi, regionalnymi i krajowymi przepisami. (Informacja : rtęć (Hg) stanowi 49.55%
cząsteczki tiomersalu, tak więc odczynniki z 0.01% tiomersalu zawierają 0.005% w/v
(~50ppm) rtęci). W razie kontaktu ze skórą przemyć natychmiast wodą. Uwaga: tiomersal
jest zaklasyfikowany w stanie Kalifornia jako środek działający toksycznie na układ
rozrodczy.
Karta charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) jest dostępna na żądanie.
ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA
1.
ZAMROŻONE PRÓBKI, PRZECHOWYWANE W NIEZNANYCH WARUNKACH MOGĄ
DAWAĆ WYNIKI FAŁSZYWE DODATNIE Z POWODU ZANIECZYSZCZENIA GRZYBAMI
I/LUB BAKTERIAMI.
2.
Nie używać odczynników po upływie terminu ważności.
3.
Z wyjątkiem stężonego buforu do płukania (R2) oraz roztworu zatrzymującego (R10), nie
mieszać odczynników z różnych zestawów posiadających odmienny numer serii.
4.
Przynajmniej 15 minut przed użyciem przenieść wszystkie odczynniki do temperatury
pokojowej.
5.
Starannie mieszać odczynniki w trakcie rekonstytucji, unikając ich zanieczyszczenia.
6.
Nie wykonywać testu w obecności reaktywnych par związków (kwasów, zasad, aldehydów)
lub kurzu, które mogą pływać na aktywność enzymatyczną koniugatu.
7.
Do przygotowywania roztworu substrat-chromogen używać czystych, jednorazowych,
polipropylenowych pojemników. W przypadku stosowania naczyń szklanych, należy
przemyć je 1N kwasem solnym, a następnie wypłukać wodą destylowaną i wysuszyć.
8.
Podczas ręcznego pipetowania kontroli i próbek, w celu uniknięcia zanieczyszczania
materiałem pochodzącym z próbek, za każdym razem zmieniać jednorazową końcówkę.
9.
W celu zapewnienia dokładnego przemycia dołków, należy przestrzegać zalecanej ilości
cykli płukania oraz zwracać uwagę, czy studzienki są całkowicie napełniane a następnie
opróżniane. Do przemywania nie należy stosować tryskawki.
10. Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki między etapem płukania a dodawaniem
kolejnego odczynnika.
11. Nigdy nie używać tych samych pojemników dla roztworów koniugatu i substratu.
12. Nie dopuszczać do kontaktu koniugatu i roztworu substrat-chromogen z metalami i jonami
metali.
13. Przechowując odczynniki i wykonując oznaczenie, unikać ekspozycji koniugatu i roztworu
substrat-chromogen na silne światło. Nie dopuszczać do kontaktu roztworów chromogenu z
utleniaczami.
14. Unikać kontaktu roztworu zatrzymującego z utleniaczami. Nie dopuszczać do kontaktu
roztworu zatrzymującego z metalami i jonami metali.
15. W celu zminimalizowania prawdopodobieństwa zanieczyszczenia sporami Aspergillus z
otoczenia, używać czystych, nie zakurzonych materiałów (probówki, końcówki do pipet,
pojemniki itp.). Ponieważ galaktomannan jest odporny na działanie wysokiej temperatury,
sterylizacja nie gwarantuje jego usunięcia. Optymalnym jest korzystanie z materiałów
apirogennech, lecz także stosowanie standardowych materiałów przy zachowaniu czystości
i ostrożności pozwala uzyskać prawidłowe wyniki.
16. Ograniczyć do minimum kontakt roztworów (próbek, roztworu do przygotowywania próbek,
koniugatu) oraz otwartych pojemników (mikropłytek, próbówek i pipet) z powietrzem.
17. Nie zlewać niezużytego koniugatu do oryginalnego opakowania.
4
18.
8
Roztwór substrat-chromogen musi być bezbarwny. Pojawienie się wkrótce po rozcieńczeniu
niebieskiego zabarwienia, wskazuje na zanieczyszczenie odczynnika i oznacza, iż nie może
być on stosowany. Należy przygotować nowy odczynnik.
PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW I WARUNKI PRZECHOWYWANIA
Mikropłytka (R1)
Po otwarciu oryginalnego opakowania, studzienki mikropłytek zachowują zdolność reakcyjną przez
5 tygodni, o ile są przechowywane w temp. 2-8 °C, w szczelnie zamkniętej torebce, w obecności
pochłaniacza wilgoci.
Stężony bufor do płukania (R2)
Przygotować roboczy bufor do płukania dodając jedną część stężonego buforu do płukania do
dziewięciu części jałowej wody dejonizowanej lub destylowanej. Roboczy bufor do płukania może
być przechowywany przez 14 dni w temp. 2-8°C. Przygotowywać odpowiednią ilość buforu na całe
badanie (80 ml buforu wystarcza na jeden pasek : 8 ml R2 + 72 ml wody destylowanej).
Stężony odczynnik po otwarciu należy przechowywać w temp. +2-25°C, przy braku
zanieczyszczenia, odczynnik jest stabilny do daty ważności podanej na opakowaniu.
Surowica kontrolna ujemna (R3)
Zawartość fiolki rozpuścić w 1 ml super czystej, jałowej wody (najlepiej wody apirogennej).
Surowice uwodnić bezpośrednio przed wykonaniem testu. Pozwolić na uwodnienie się surowicy
przez 2-3 minuty, a następnie dokładnie wymieszać. Zawartość fiolki rozporcjować po 300 µl do
trzech polipropylenowych mikroprobówek. Niewykorzystane probówki z uwodnioną surowicą
natychmiast zamrozić w -20°C.
Uwaga: Uwodnione, zamrożone surowice kontrolne mogą po rozmrożeniu być używane bez
ponownej rehydratacji. Zamrożone, uwodnione surowice kontrolne można przechowywać w -20°C
przez pięć tygodni. Z surowicami kontrolnymi postępować w taki sam sposób jak z próbkami
pacjentów (300 µl surowicy + 100 µl roztworu badanego, itd.).
Surowica kalibracyjna (R4) i Surowica kontrolna dodatnia (R5)
Przygotować jak opisano powyżej dla surowicy kontrolnej ujemnej (R3).
Roztwór roboczy substrat-chromogen (R8 + R9)
Przygotować roztwór substrat-chromogen, dodając jedną część stężonego roztworu chromogenu
TMB (R9) do 50 części buforu substratu TMB (R8). Przygotować 2 ml roztworu substratchromogen na każdy pasek: 40 µl (R9) + 2 ml (R8). Roztwór zachowuje trwałość przez 6 godz.
przechowywany w ciemności, w temperaturze pokojowej (+18-25°C).
Po otwarciu, odczynniki R8 i R9 przechowywane w temp. +2-8°C, przy braku zanieczyszczenia, są
stabilne do daty ważności podanej na opakowaniu.
Koniugat (R6), roztwór do przygotowywania surowicy (R7) i roztwór zatrzymujący (R10)
Po otwarciu, odczynniki R6, R7 i R10 przechowywane w temp. +2-8°C przy braku
zanieczyszczenia, są stabilne do daty ważności podanej na opakowaniu.
9
POBIERANIE PRÓBEK
Pobrać krew zgodnie z rutynową procedurą. Oznaczenie należy wykonywać z użyciem surowicy.
Próbki surowicy muszą być wolne od spor grzybiczych i/lub bakterii. Próbówki z próbkami podczas
przechowywania i transportu powinny być szczelnie zamknięte, bez dostępu powietrza.
Przechowywane przed oznaczeniem próbki w zamkniętej probówce, w temp. 2-8°C zachowują
trwałość przez 5 dni. Po otwarciu, próbki mogą być przechowywane przed oznaczeniem w temp.
2-8°C przez 48 godzin. W celu dłuższego przechowywania surowicę należy zamrozić w -70°C.
Próbki surowicy można maksymalnie 4 razy zamrozić i rozmrozić. Przed wykonaniem oznaczenia
rozmrażane próbki należy dobrze wymieszać.
5
Na oznaczenie nie wywiera wpływu obecność w surowicy 20 mg/l bilirubiny, poziom lipemii
odpowiadający 2 g/l trójglicerydów (trioleiny), ani hemoliza wynosząca 165 mg/l hemoglobiny. Nie
badano wpływu nadmiaru albumin.
Nie używać surowicy pozbawionej dopełniacza.
10 PROCEDURA
Materiały dostarczone
Patrz rozdział ODCZYNNIKI.
Materiały potrzebne ale niedostarczone w zestawie
1. Jałowa woda destylowana lub dejonizowana, do rozcieńczania buforu do płukania.
2. Jałowa woda oczyszczona do rekonstytucji surowic kontrolnych.
3. Bibuła.
4. Rękawice jednorazowego użytku.
5. Okulary ochronne.
6. Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu.
7. Pipety lub pipety wielokanałowe, nastawne lub stało-objętościowe, pozwalające odmierzać i
dozować 50 µl, 100 µl, 300 µl i 1000 µl.
8. polipropylenowe mikroprobówki na 1.5ml ze szczelnymi korkami, odporne na temperaturę
120°C (bloki grzewcze) i 100°C (łaźnie wodne).
a. Probówki z nakrętkami: 1.5 ml probówki stożkowe, Bio-Rad nr kat. 224-0100 lub
zamiennik.
b. Probówki z wieczkiem: EZ Micro Test Tubes, 1.5 ml, Bio-Rad nr kat. 223-9480 lub
zamiennik.
9. Blokada do wieczek mikroprobówek (VWR nr kat. 6054001 lub zamiennik). Blokada ma na
celu zabezpieczenie probówki przed otwarciem w wyniku zmian temperatury i ciśnienia.
Ułatwia także wyjmowanie probówek z bloków grzewczych i łaźni wodnych.
10. Wirówka laboratoryjna do mikroprobówek osiągająca przyspieszenie 10.000 g.
11. Okrągły, pływający statyw pasujący do zlewki o pojemności 1 l.
12. Wortex.
13. Termoblok. Polecane są następujące bloki grzejne:
a. model z jednym blokiem: Grant nr kat. QBD1 (VWR nr kat. 460-0074)
b. model z dwoma blokami: Grant nr kat. QBD2 (VWR nr kat. 460-0076)
14. Wkład do termobloku: obydwu bloków grzewczych należy używać z Grant block nr kat. QB-E1
(VWR nr kat. 460-8517).
15. Łaźnia wodna nastawiona na 100°C.
16. Inkubator mikropłytek nastawiony na temp. 37 ± 1°C.
17. Półautomatyczna lub automatyczna płuczka mikropłytek.
18. Czytnik mikropłytek wyposażony w filtry 450nm i 620 nm.
Uwagi proceduralne
W celu walidacji każdej serii oznaczeń należy zawsze stosować surowice kontrolne: ujemną
dodatnią i cut-off.
Obróbka surowic
Z surowicami kontrolnymi: ujemną (R3), dodatnią (R5) i kalibracyjną (R4) należy równocześnie
postępować w ten sam sposób, jak z surowicami badanymi.
1. Dodać po 300 µl kontroli i próbek do próbówki Eppendorfa na 1.5 ml.
2. Dodać 100 μl roztworu do przygotowywania surowicy (R7) do każdej probówki.
3. Wymieszać dokładnie zawartość probówek, wstrząsając je, korzystając z worteksu lub
pipetując. Zamknąć szczelnie probówki, probówki z wieczkiem zabezpieczyć blokadami. Nie
przekłuwać wieczek.
6
4. Ogrzewać probówki przez 6 minut w termobloku ustawionym na 120°C. Probówki umieścić w
bloku dopiero po osiągnięciu zalecanej temperatury. (*)
(*) W przypadku korzystania z łaźni wodnej: ogrzewać probówki przez 3 minuty w 100°C.
5. Wyjąć ostrożnie gorące probówki z bloku lub łaźni wodnej i umieścić je w wirówce. Wirować
probówki przy 10 000 g przez 10minut.
6. Do oznaczania antygenu galaktomannanowego używany jest supernatant.
7. Oznaczenie wykonać zgodnie z poniższą procedurą. Supernatant może być przechowywany
przed oznaczeniem w temp. 2-8°C przez 48 godz. Jeżeli wskazane jest powtórzenia badania,
należy opracować kolejną próbkę surowicy.
(*) Ścisłe przestrzeganie podanej temperatury, procedury oznaczenia oraz stosowanych
materiałów ma istotne znaczenie dla powodzenia w wykonaniu testu. Nie polegaj na temperaturze
podanej na wyświetlaczu, sprawdź wartość faktyczną sondą temperaturową (wykalibrowany
termometr umieszczony w parafinie w eppendorfie): temperatura wewnątrz probówki, musi
osiągnąć 120°C w bloku grzewczym, a w łaźni wodnej 100°C.
Procedura testu EIA
Oznaczenie należy wykonać ściśle wg opisanej procedury.
Stosować się do zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej.
1. Wszystkie odczynniki przenieść do temperatury pokojowej (18 - 25°C) przynajmniej 15 min.
przed użyciem.
2. Przygotować bufor do płukania, roztwór substrat-chromogen oraz surowice kontrolne:
dodatnią, ujemną i kalibracyjną.
3. Należy ustalić rozkład używanych dołków dla badanych surowic i kontroli. Zaplanować jeden
dołek dla surowicy kontrolnej ujemnej (R3), dwa dołki dla surowicy kalibracyjnej (R4) i jeden
dołek dla surowicy kontrolnej dodatniej (R5).
4. Wyjąć ramkę i paski (R1) z opakowania. Paski, które nie będą używane schować do
opakowania z pochłaniaczem wilgoci i szczelnie zamknąć.
5. Przed użyciem koniugat (R6) wymieszać przez odwracanie. Dodać po 50 µl koniugatu (R6) do
każdego dołka. Następnie, zgodnie z przygotowanym planem, do każdego dołka dodać po 50
µl supernatantu próbek. Nie dodawać próbek surowicy do dołków przed dodaniem koniugatu.
6. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną lub podobnym materiałem, tak by zapewnić
ochronę przed odparowaniem płynu z dołków. Upewnić się, iż zamknięcie jest wodoszczelne i
przykryta jest cała powierzchnia.
7. Inkubować płytkę w suchym inkubatorze mikropłytek przez 90 ± 5 min. w temp. 37°C (± 1°C).
8. Zdjąć przykrycie. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika na odpady z
podchlorynem sodu). Wykonać 5 cykli płukania używając co najmniej 370 µl buforu do
płukania. Po ostatnim płukaniu, odwracając i ostukując, osuszyć mikropłytkę z resztek płynu
na bibule.
9. Unikając ostrego światła, szybko nanieść do studzienek po 200 ul roztworu substratchromogen (R8+R9).
10. Inkubować mikropłytkę w ciemności, przez 30 ± 5 min, w temp. pokojowej (18-30°C). Nie
zakrywać folią adhezyjną.
11. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do każdej studzienki 100 ul roztworu
zatrzymującego (R10). Roztwór ten dodawać w tej samej kolejności jak roztwór substratu.
Wymieszać dokładnie.
12. Wytrzeć starannie spód każdej mikropłytki.
13. Odczytać gęstość optyczną dla każdego dołka przy 450 nm (z filtrem referencyjnym 620 nm).
Wyniki odczytać w ciągu 30 min. Od zatrzymania reakcji.
11 KONTROLA JAKOŚCI (KRYTERIA WAŻNOŚCI)
Surowica kalibracyjna: Wartość O.D. każdej surowicy kalibracyjnej musi zawierać się w zakresie
≥ 0.3 i ≤ 0.8
7
Kontrola dodatnia: Indeks dla surowicy kontrolnej dodatniej musi być większy niż 2.
OD kontroli dodatniej (R5)
I=
>2
Wartość średnia OD surowicy kalibracyjnej
Kontrola ujemna: Indeks dla surowicy kontrolnej ujemnej musi być mniejszy niż 0,4.
OD kontroli ujemnej (R3)
I=
< 0,4
Jeżeli którekolwiek z powyższych kryteriów nie zostało spełnione, test należy uznać za nieważny i
nie należy wydawać wyników analizy. Osoba wykonująca badanie po sprawdzeniu procedury
może podjąć decyzję o powtórzeniu badania lub poprosić o pomoc producenta. Do powtórnego
badania należy przygotować nową porcję surowicy z tej samej próbki pacjenta.
Przykład obliczeń:
Próbka
OD surowicy kontrolnej ujemnej (R3)
OD surowicy kalibracyjnej (R4)
OD surowicy kontrolnej dodatniej (R5)
Absorbancja (OD)
0.117
0.596
0.576
2.602
Obliczenia
Aby obliczyć wartość średnią OD surowicy kalibracyjnej (R4), należy dodać odczytane wartości
OD dla obu powtórzeń i sumę podzielić przez 2.
(0.596 + 0.576) ÷ 2 = 0.586
Indeks surowicy kontrolnej ujemnej
Aby obliczyć indeks surowicy kontrolnej ujemnej, należy podzielić odczytaną wartość OD surowicy
kontrolnej ujemnej przez wartość średnią OD surowicy kalibracyjnej:
0.117
I=
= 0.20
0.586
Indeks surowicy kontrolnej dodatniej
Aby obliczyć indeks surowicy kontrolnej dodatniej, należy podzielić odczytaną wartość OD
surowicy kontrolnej dodatniej przez wartość średnią OD surowicy kalibracyjnej:
2.602
I=
= 4.44
0.586
Walidacja
Na powyższym przykładzie:
• Każda z wartości OD surowicy kalibracyjnej zawiera się w przedziale ≥ 0.3 i ≤ 0.8, co
oznacza, że test dla surowicy kalibracyjnej spełnia kryteria ważności.
• Wartość indeksu surowicy kontrolnej ujemnej jest < 0.4, co oznacza, że test dla surowicy
kontrolnej ujemnej spełnia kryteria ważności.
• Wartość indeksu surowicy kontrolnej dodatniej jest > 2, co oznacza, że test dla surowicy
kontrolnej dodatniej spełnia kryteria ważności.
Przykładowy test należy uznać za ważny gdyż zostały spełnione wszystkie z kryteriów walidacji dla
surowic kontrolnych.
12 INTERPRETACJA WYNIKÓW
Obecność lub brak antygenu galaktomannanowego ocenia się w oparciu o wyliczoną dla każdej
próbki wartość indeksu. Indeks (I) jest to wartość uzyskana w wyniku podzielenia OD próbki
pacjenta przez średnią wartość OD surowicy kalibracyjnej.
8
Obliczanie średniej wartości OD surowicy kalibracyjnej:
OD dla obu powtórzeń i sumę podzielić przez 2.
Obliczanie indeksu (I) dla każdej surowicy badanej:
Dla każdej badanej próbki surowicy wykonaj następujące obliczenie:
OD próbki
I=
Surowice o indeksie < 0.5 uznawane są za ujemne pod względem obecności antygenu
galaktomannanowego.
Uwaga: Wynik ujemny może oznaczać, że ilość antygenu w materiale od pacjenta jest niższa niż
próg czułości testu.
Uwaga: Wynik ujemny nie wyklucza rozpoznania inwazyjnej aspergilozy. Jeżeli podejrzewa się
zakażenie a wynik testu jest ujemny, zaleca się powtórzenie badania.
Surowice o indeksie ≥ 0.5 uznawane są za dodatnie pod względem obecności antygenu
galaktomannanowego.
Zaleca się wykonanie powtórnego oznaczenia z nowej porcji opracowanej surowicy pochodzącej
tej samej próbki dla wszystkich surowic uznanych za dodatnie, a także w celu monitorowania,
pobranie kolejnej próbki od pacjenta.
Uwaga: Wartość absorpcji mniejsza od 0,000 może wskazywać na błędy w wykonaniu oznaczenia
lub pomiaru, co należy wyjaśnić. Wynik takiego badania jest nieważny i test należy powtórzyć.
W celu podniesienia czułości i jak najwcześniejszego stwierdzenia dodatniego wyniku badania,
rekomendowane jest regularne (dwa razy w tygodniu) oznaczanie próbek od pacjentów z grupy
wysokiego ryzyka.
Uwaga: Platelia™ Aspergillus EIA jest testem pomocniczym w diagnozowaniu aspergilozy
inwazyjnej. Wyniki dodatnie w teście Platelia™ Aspergillus EIA należy interpretować w połączeniu
z wynikami innymi badań diagnostycznych, takich jak: posiewy bakteriologiczne, badanie
histologiczne bioptatów i badania radiologiczne.
Przykład obliczeń:
Próbka
OD surowicy kontrolnej ujemnej (R3)
Absorpcja (OD)
0.117
OD surowicy kalibracyjnej (R4)
OD surowicy kontrolnej dodatniej (R5)
0.596
0.576
2.602
Próbka pacjenta #1
0.134
Próbka pacjenta #2
0.436
Próbka pacjenta #3
1.196
Obliczenia
Sprawdź w rozdziale Kontrola jakości (Kryteria Ważności) przykłady obliczeń wykonywanych w
celu walidacji oznaczenia.
OD dla obu powtórzeń i sumę podzielić przez 2:
(0.596 + 0.576) ÷ 2 = 0.586
9
Próbka pacjenta #1
Aby obliczyć indeks próbki pacjenta #1, należy podzielić wartość OD Próbki Pacjenta #1 przez
wartość średnią OD surowicy kalibracyjnej:
0.134
I=
= 0.23
0.586
W powyższym przykładzie wynik badania jest ujemny, gdyż wartość indeksu równa 0.23 jest < 0.5.
Próbka pacjenta #2
Aby obliczyć indeks próbki pacjenta #2, należy podzielić wartość OD próbki pacjenta #2 przez
0.436
I=
= 0.74
0.586
W powyższym przykładzie wynik badania jest dodatni, gdyż wartość indeksu równa 0.74 jest ≥ 0.5.
Próbka pacjenta #3
Aby obliczyć indeks próbki pacjenta #3, należy podzielić wartość OD próbki pacjenta #3 przez
1.196
I=
= 2.04
0.586
W powyższym przykładzie wynik badania jest dodatni, gdyż wartość indeksu równa 2.04 jest ≥ 0.5.
13 OGRANICZENIA TESTU
1. Wynik ujemny nie wyklucza rozpoznania aspergilozy inwazyjnej. Pacjentom
zagrożonym wystąpieniem aspergilozy inwazyjnej badanie należy wykonywać dwa razy
w tygodniu.
2. Wykonując oznaczenie na obecność antygenu galaktomannanowego należy przestrzegać
procedury wykonania testu oraz zasad interpretacji wyników testu Platelia™ Aspergillus.
Przed przystąpieniem do wykonania testu użytkownik powinien dokładnie zapoznać się z
instrukcją obsługi. W szczególności dokładnie przestrzegana musi być procedura pipetowania
próbek i odczynników, płukania płytki i oraz czasy inkubacji.
3. Dodanie próbki lub odczynnika niezgodnie z procedurą może prowadzić do uzyskania wyników
fałszywie ujemnych. W przypadku podejrzenia aspergilozy inwazyjnej w oparciu o dane
kliniczne lub wystąpienia błędu proceduralnego, należy rozważyć powtórzenie badania.
4. W przypadku nieostrożnego obchodzenia się z mikropłytkami lub technicznie nieprawidłowego
pipetowania odczynników, możliwe jest zanieczyszczenie dołków z ujemną próbką pacjenta na
skutek przelania się do nich zawartości dołka z kontrolą lub próbką dodatnią.
5. Nie przeprowadzono ewaluacji testu Platelia™ Aspergillus EIA na próbkach surowicy od
niemowląt i dzieci.
6. U pacjentów z przewlekłą chorobą ziarniniakową (CGD) i zespołem Hioba zdolność
wykrywania galaktomannanu w teście Platelia™ Aspergillus EIA może być ograniczona 36, 37.
7. U niektórych pacjentów z aspergilozą inwazyjną celowana kuracja przeciwgrzybicza może
spowodować obniżenie czułości testu Platelia™ Aspergillus EIA20.
8. Nie przeprowadzono ewaluacji testu Platelia™ Aspergillus EIA na próbkach osocza oraz dla
materiałów takich jak: mocz, popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelowe (BAL) i PMR.
9. Nie przeprowadzono ewaluacji testu Platelia™ Aspergillus EIA dla odczytu manualnego i/lub
wzrokowej oceny wyniku analizy.
10. Dla stosowanych w tym teście do wykrywania galaktomannanu, szczurzych przeciwciał
monoklonalnych EBA-2, wykazano powinowactwo do grzybów należących do rodzajów
Penicillium, Alternaria, Paecilomyces, Geotrichum i Histoplasma. W niektórych rejonach
endemicznych, włącznie z częścią terenów USA, należy rozważyć możliwość występowania
histoplazmozy23,32,38.
10
11. Wyniki dodatnie przy braku objawów klinicznych:
Reakcje dodatnie otrzymywane są zazwyczaj przed wystąpieniem objawów klinicznych i/lub
zmian w obrazie radiologicznym i wynikają z wczesnego wykrywania antygenu
galaktomannanowego w surowicy: odpowiadają one faktycznie dodatniemu wynikowi u
pacjentów, u których postawiono następnie rozpoznanie potwierdzonej lub domniemanej
aspergilozy.
W niektórych szczególnych przypadkach należy jednakże podczas interpretacji testu
uwzględnić również inne czynniki:
a. Można uzyskać dodatnie wyniki testu bez objawów klinicznych, zwłaszcza w przypadku
małych dzieci26. Mimo iż niektóre z tych przypadków można skorelować z rzeczywistym
występowaniem antygenów Aspergillus 5, w większości są to wyniki fałszywie dodatnie.
b. W różnych produktach spożywczych, zwłaszcza w produktach zbożowych oraz w
deserach na bazie śmietany, występuje galaktofuranoza1,17. Mleko w proszku, w
odróżnieniu od mleka ludzkiego, zawiera wysokie stężenie galaktomannanu10. Podczas
interpretacji przebiegu antygenemii u małych dzieci oraz u pacjentów ze zaburzeniami
działania bariery jelitowej należy uwzględnić rodzaj diety4, 10. W tej grupie pacjentów, każdy
przypadek dodatniej antygenemii powinien być interpretowany z jeszcze większą
ostrożnością17.
c. Są doniesienia literaturowe o dodatnich wynikach testu na obecność galaktomannanu u
pacjentów otrzymujących piperacylinę / tazobaktam. Raportowano również, że niektóre
serie lub partie piperacyliny / tazobaktamu dawały wyniki dodatnie w teście na obecność
galaktomannanu. W związku z tym, dodatnie wyniki testu u pacjentów przyjmujących
piperacilinę / tazobaktam powinny być interpretowane z dużą ostrożnością i potwierdzone
innymi metodami diagnostycznymi. Obecność galaktomannanu stwierdzono również w
niektórych partiach parenteralnych form amoksycyliny z kwasem klawulanowym. W
związku z tym, interpretując wyniki testu należy uwzględnić leczenie półsyntetycznymi
antybiotykami β-laktamowymi1, 21. Z uwagi na zdolność testu Platelia™ Aspergillus EIA do
wykrywania glaktomannanu na długo przed wystąpieniem objawów klinicznych i
radiologicznych, nie można wykluczyć wystąpienia inwazyjnej aspergilozy. W związku z
tym, dodatnie wyniki testu u pacjentów przyjmujących piperacylinę / tazobaktam powinny
być interpretowane ostrożnie.
d. Dodatnie wyniki reakcji bez współtowarzyszących objawów klinicznych zakażenia można
zaobserwować u pacjentów otrzymujących produkty zawierające galaktomannan
parenteralnie lub doustnie (w przypadku zaburzenia bariery jelitowej).
Obecność galaktomannanu w tych produktach może być często wytłumaczona
stosowaniem na etapie produkcji procesów fermentacji wykorzystujących grzyby.
Dodatni wynik dla próbek pacjenta nie zostanie jednak uzyskany o ile stężenie
egzogennego galaktomannanu w surowicy nie osiągnie lub nie przewyższy progu detekcji.
Dlatego, przy podejrzanym, dodatnim wyniku testu i braku stosownych objawów
zakażenia, zalecamy sprawdzenie przyjmowanych przez pacjenta środków oraz
prześledzenie produkcyjnego procesu fermentacji i użytych materiałów wyjściowych11, 24, 31.
14 WARTOŚCI SPODZIEWANE
Spodziewana częstość występowania aspergilozy inwazyjnej jest zmienna w zależności od
populacji pacjentów, raportowano wartości z zakresu 5 - 20% 7, 13.
Ocenę własności testu Platelia™ Aspergillus EIA przeprowadzono w oparciu o badania kliniczne
przeprowadzone w dwóch centrach badawczych w Europie na 4873 próbkach surowicy pobranych
z 239 epizodów (203 pacjentów) zdiagnozowanego, złośliwego nowotworu krwi lub po
transplantacji szpiku kostnego, z rozpoznaniem (lub bez) aspergilozy inwazyjnej.
Ponieważ pacjent mógł być włączany do badań więcej niż jeden raz, analizę prowadzono w
oparciu o ilość epizodów poddanych leczeniu.
Za epizod uważany jest okres bezpośrednio towarzyszący procedurze klinicznej (np.
transplantacja, GVHD itp.). W związku z tym, więcej niż jeden epizod może przypadać na jednego
pacjenta.
11
Średnia prewalencja dla tych badań wyniosła 16% (38/239). Rozkład wartości indeksów dla tej
populacji przedstawiono na poniższym wykresie.
Pacjenci zdiagnozowani bez inwazyjnej aspergilozy (populacja kontrolna)
Rozkład wartości indeksów dla
pacjentów grupy kontrolnej N = 3691
3240
330
54
32
13
4
4
3
0
1
0
0
3
1
6
0
>1
.5
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
00.
1
0.
10.
2
0.
20.
3
0.
30.
4
0.
40.
5
0.
50.
6
0.
60.
7
0.
70.
8
0.
80.
9
0.
91.
0
1.
01.
1
1.
11.
2
1.
21.
3
1.
31.
4
1.
41.
5
Ilość surowic
Z
użyciem
testu
Platelia™
Aspergillus
EIA przebadano w sumie
3691 próbek surowic z
201
epizodów
(168
pacjentów) w dwóch
laboratoriach
badawczych w Europie.
Rozkład
wartości
indeksów przedstawiono
na poniższym wykresie.
Indeks
POPULACJA KONTROLNA:
ROZKŁAD INDEKS/EPIZODÓW
(N= 201 epizodów u 168 pacjentów)
2
1,5
Indeks
Wykres punktowy
przedstawia wyniki
testów na obecność
galaktomannanu
przeprowadzonych na
3691 próbkach surowicy
pochodzących z 201
epizodów (168
pacjentów kontrolnych)
objętych tym badaniem
(pacjenci poddawani
terapii
immunosupresyjnej na
HSCT lub leczeni na
złośliwe nowotwory
krwi).
1
0,5
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Liczba epizodów
12
Indeks
Pacjenci ze zdiagnozowaną inwazyjną aspergilozą
Poniższy wykres punktowy
przedstawia wyniki testów
POTWIERDZONA / PRAWDOPODOBNA INWAZYJNA
na obecność
ASPERGILOZA:
ROZKŁAD INDEKS / EPIZOD
galaktomannanu dla 1182
(N=38 epizodów u 35 pacjentów)
próbek surowicy
pochodzących z 38
10,0
epizodów (35 pacjentów)
8,0
objętych tym badaniem
zdiagnozowanych jako
6,0
potwierdzona lub
4,0
prawdopodobna inwazyjna
aspergiloza, zgodnie z
2,0
definicją EORTC/NIAID. Nie
0,0
dla każdej próbki od danego
0
10
20
30
pacjenta spodziewany jest
Numer Epizodu
dodatni wynik badania.
Cut-off
0.5
40
Oczekiwana częstość występowania aspergilozy inwazyjnej jest zmienna w zależności od
populacji pacjentów i wynosi 5 - 20% 7, 13. Prewalencja dla tych badań wyniosła 16%.
Poniższe wykresy przedstawiają przykłady wyników pacjentów bez objawów klinicznych lub
symptomów aspergilozy inwazyjnej (ujemni w kierunku antygenu galaktomannanowego) i
pacjentów z potwierdzoną aspergilozą inwazyjną (dodatni w kierunku antygenu
galaktomannanowego).
„Pacjent Ujemny”:
indeks
PACJENT KONTROLNY
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
10
20
30
40
50
60
dni
13
„Pacjent Dodatni”:
indeks
PACJENT Z POTWIERDZONĄ INWAZYJNĄ ASPERGILOZĄ
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
10
20
30
40
50
60
dni
15 CHARAKTERYSTYKA TESTU
A Powtarzalność
Powtarzalność wewnątrz-testowa i odtwarzalność między seriami dla testu Platelia™ Aspergillus
EIA oceniano oznaczając panel 6 spulowanych próbek surowicy pacjentów (jedna ujemna, jedna
słabo reaktywna, dwie dodatnie i dwie silnie reaktywne), otrzymanych z trzech laboratoriów
klinicznych w Ameryce Północnej. Każda z 6 próbek była oznaczana w tryplikacie (x3) przez 3 dni,
w jednej serii, w dwóch różnych laboratoriach (całkowita liczba replikatów oznaczonych w każdym
laboratorium = 9). Każda z 6 próbek była oznaczana w duplikacie (x2) przez 3 dni, w jednej serii, w
trzecim laboratorium (całkowita liczba replikatów oznaczonych w trzecim laboratorium = 6). W
każdym laboratorium wszelkie operacje związane z oznaczeniami wykonywała jedna osoba.
Analizę danych przeprowadzono zgodnie z zaleceniami Narodowego Komitetu d/s Standardów
Laboratoryjnych (NCCLS). W poniższych tabelach przedstawiono średnie wartości gęstości
optycznej (OD) oraz średnie wartości indeksu, odchylenie standardowe (SD), współczynnik
zmienności (%CV) oznaczane w badaniach powtarzalności wewnątrz i między-laboratoryjnej dla
każdej próby z panelu w każdym z laboratoriów.
14
B Reakcje krzyżowe
Potencjalne interferencje czynników klinicznych niezwiązanych z aspergilozą inwazyjną zbadano
dla jednej serii testu Platelia™ Aspergillus EIA. Reakcje krzyżowe w teście Platelia™ Aspergillus
EIA oznaczono z użyciem podanych niżej surowic. Przebadano 151 próbek surowic.
15
Patologia
Czynnik reumatoidalny
Dodatnie ANA
IgG Hypergammaglobulinemia
IgM Hypergammaglobulinemia
Nowotwór *
Marskość wątroby o etiologii niewirusowej
(żółciowa pierwotna;
poalkoholowa; polekowa)
Wielokrotne transfuzje
Wieloródki
HAV
HCV
Różyczka
CMV
Kiła (RPR+)
Toksoplazmoza
Mykoplazmy
Liczba zbadanych
próbek
10
10
10
10
11
Liczba próbek
dodatnich
0
0
0
0
0
10
0
10
10
10
10
10
10
10
10
10
0
0
0
0
0
0
0
0
0
* pęcherza, sutka (2), okrężnicy, śluzówki macicy, płuca, prostaty, nerek i płaskokomórkowy (3).
C Badania Kliniczne
Badania kliniczne w celu określenia czułości, swoistości i wartości predykcyjnych dla testu
Platelia™ Aspergillus wykonano w dwóch laboratoriach, w Belgii i w Holandii. Badania
przeprowadzono na 4873 próbkach surowic pochodzących od 203 pacjentów z następujących
grup*:
• pacjenci bez objawów aspergilozy inwazyjnej (grupa kontrolna)
• pacjenci z prawdopodobną aspergilozą inwazyjną
• pacjenci z potwierdzoną aspergilozą inwazyjną
* Invasive Fungal Infection Cooperative Group (IFICG) działająca przy Europejskiej Organizacji na
rzecz Badań i Leczenia Raka (EORTC) i oraz Mycosis Study Group (MSG przy NIAID)
zdefiniowały kryteria diagnozowania inwazyjnej aspergilozy (IA) u pacjentów z nowotworami
złośliwymi krwi oraz po przeszczepie szpiku kostnego 2.
Potwierdzona inwazyjna aspergiloza została zdefiniowana jako potwierdzona przez dodatnią
hodowlę mikrobiologiczną uzyskaną z zachowaniem aseptyki z miejsc zmienionych chorobowo,
histopatologiczne potwierdzenie odpowiedniej formy morfologicznej grzyba oraz objawy kliniczne
związane z infekcją grzybiczą.
Prawdopodobna inwazyjna aspergiloza została zdefiniowane jako potwierdzona przez jedno
kryterium mikrobiologiczne oraz przez co najmniej jedno pierwszorzędowe lub dwa drugorzędowe
kryteria kliniczne związane z miejscem odpowiadającym zakażeniu. u pacjenta z objawami
klinicznymi związanymi z infekcją grzybiczą.
Możliwa inwazyjna aspergiloza została zdefiniowana jako potwierdzona przez jedno kryterium
mikrobiologiczne lub przez co najmniej jedno pierwszorzędowe lub dwa drugorzędowe kryteria
kliniczne związane z miejscem odpowiadającym zakażeniu. u pacjenta z objawami klinicznymi
związanymi z infekcją grzybiczą.
Z uwagi na rzadkie występowanie potwierdzonej i prawdopodobnej aspergilozy, do celów
niniejszego badania przyjęliśmy następujące definicje czułości i swoistości klinicznej.
16
CZUŁOŚĆ
Wyniki oznaczeń z użyciem omawianego testu analizowano jako czułość w odniesieniu do
pacjenta. Czułość testu oznaczono dla Platelia™ Aspergillus EIA w dwóch niezależnych
laboratoriach, na próbkach pochodzących w sumie z 38 epizodów, od pacjentów po przeszczepie
szpiku kostnego (BMT) i z białaczkami, z aspergilozą inwazyjną potwierdzoną lub prawdopodobną.
1. Aspergiloza potwierdzona (wg definicji IFICG / EORTC; patrz wyżej)
N = 19 epizodów u 16 pacjentów
Łącznie
Czułość: 100% (19/19).
Uwaga: Z powodu niedostatecznej ilości próbek nie można było obliczyć 95% przedziału ufności.
2. Aspergiloza prawdopodobna (wg definicji IFICG / EORTC; patrz wyżej)
Łącznie
Czułość: 94.7% (18/19).
Uwaga: Z powodu niedostatecznej ilości próbek nie można było obliczyć 95% przedziału ufności.
3. Łącznie: aspergiloza potwierdzona i prawdopodobna (wg definicji IFICG / EORTC; patrz
wyżej)
Łącznie
Czułość: 97.4% (37/38). 95% przedział ufności 86.2 –99.9%.
SWOISTOŚĆ
Swoistość określono dla testu Platelia™ Aspergillus EIA w dwóch niezależnych laboratoriach, na
3691 próbkach pochodzących z 201 epizodów (168 pacjentów) bez objawów aspergilozy
inwazyjnej (grupa kontrolna).
Laboratorium 1: N = 3060 próbek, 103 epizody (70 pacjentów)
Swoistość: 92.2% (95/103) 95% przedział ufności 85.3 –96.6%.
Laboratorium 2: N = 631 próbek, 98 epizodów (98 pacjentów)
Łącznie N = 3691 próbek, 201 epizodów (168 pacjentów)
WARTOŚĆ PREDYKCYJNA
Dodatnia wartość predykcyjna i ujemna wartość predykcyjna (PPV, NPV) została określona dla
badanej populacji w oparciu o średnią 16% prewalencję obserwowaną w tym badaniu.
PPV: 66.1% (37/56)
NPV: 99.4% (182/183)
Analizy wykonywano również dla wyników dodatnich uznawanych jako 2 kolejne próbki o indeksie
wyższym lub równym 0.5.
Charakterystykę testu przedstawia poniższa tabela:
PPV
Czułość*
Swoistość
Łącznie uwzględniając 1
97.4%
90.5%
66.1%
(37/38)
(182/201)
(37/56)
próbkę ≥ 0.5
Łącznie uwzględniając
92.1%
97.5%
87.5%
(35/38)
(196/201)
(35/40)
2 kolejne próbki ≥ 0.5
*: czułość obliczono dla potwierdzonej i prawdopodobnej aspergilozy inwazyjnej
NPV
99.4%
(182/183)
98.5%
(196/199)
16 KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA
Wszystkie produkty Bio-Rad są przygotowane zgodnie z naszym systemem jakości, poczynając
od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego.
Każda seria ostatecznego produktu podlega oznaczeniu kontrolnemu i jest dopuszczona do
użytku, jeśli spełnia wymagane kryteria. Bio-Rad posiada protokoły produkcji i kontroli jakości
każdej serii.
17
17 LITERATURA
1. Ansorg, R., R. Van Den Boom, and P. M. Rath. 1997. Detection of Aspergillus
galactomannan antigen in foods and antibiotics. Mycoses 40: p. 353-7.
2. Ascioglu, S., J. H. Rex, B. De Pauw, J. E. Bennett, J. Bille, F. Crokaert, D. W. Denning, J.
P. Donnelly, J. E. Edwards, Z. Erjavec, D. Fiere, O. Lortholary, J. Maertens, J. F. Meis, T.
F. Patterson, J. Ritter, D. Selleslag, P. M. Shah, D. A. Stevens and T. J. Walsh. 2002.
Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer
and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin. Infect. Dis. 34: p. 714.
3. Aubry, A., R. Porcher, J. Bottero, S. Touratier, T. Leblanc, B. Brethon, P. Rousselot, E.
Raffoux, J. Menotti, F. Derouin, P. Ribaud and A. Sulahian. 2006. Occurrence and kinetics
of false-positive Aspergillus galactomannan test results following treatment with beta-lactam
antibiotics in patients with hematological disorders. J. Clin. Microbiol. 44 (2): p. 389-94.
4. Blijevens, N. M., J. P. Donnelly, J. F. Meis, P. E. Verweij, and B. E. De Pauw. 2002.
Aspergillus galactomannan antigen levels in allogeneic haematopoietic stem cell transplant
recipients given total parenteral nutrition. Transpl. Infect. Dis. 4: p. 64-65.
5. Chambon-Pautas, C., J. M. Costa, M. T. Chaumette, C. Cordonnier, and S. Bretagne.
2001. Galactomannan and polymerase chain reaction for the diagnosis of primary digestive
aspergillosis in a patient with acute myeloid leukaemia. J. Infect. 43: p. 213-214.
6. De Repentigny, L., L. Kaufman, G. T. Cole, D. Kruse, J. P. Latge, and R. C. Matthews.
1994. Immunodiagnosis of Invasive Fungal Infections. J. Med. Vet. Mycol. 32: p. 239-252.
7. Denning, D. W. 1998. Invasive Aspergillosis. Clin. Infect. Dis. 26: p. 781-803.
8. Dupont, B., M. Richardson, P. E. Verweij, and J. F. G. M. Meis. 2000. Invasive
Aspergillosis. Medical Mycology 38: p. 215-224.
9. Erjavec, Z. and P. E. Verweij. 2002. Recent progress in the diagnosis of fungal infections in
the immunocompromised host. Drug Resist. Updat. 5: p. 3-10.
10. Gangneux, J. P., D. Lavarde, S. Bretagne, C. Guiguen, and V. Andemer. 2002. Transient
Aspergillus antigenaemia: think of milk. Lancet 359: p. 1251.
11. Hage,C. A., J. M. Reynolds, M. Durkin, L. J. Wheat, K. S. Knox. 2007. Plasmalyte as a
Cause of false-positive results for Aspergillus galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid.
J. Clin. Microbiol. 45: p. 676-677.
12. Herbrecht, R., V. Letscher-Bru, C. Oprea, B. Lioure, J. Waller, F. Campos, O. Villard, K. L.
Liu, S. Natarajan-Ame, P. Lutz, P.Dufour, J. P. Bergerat, and E. Candolfi. 2002.
Aspergillus galactomannan detectionin the diagnosis of Invasive Aspergillosis in cancer
patients. J. Clin. Oncol. 20: p.1898-1906.
13. Herbrecht, R., D. Denning, T. Patterson, J. Bennett, R. Greene, J. Oestmann, W. Kern, K.
Marr, P. Ribaud, O. Lortholary, R. Sylvester, R. Rubin, J. Wingard, P. Stark, C. Durand, D.
Caillot, E. Thiel, P. Chandrasekar, M. Hodges, H. Schlamm, P. Troke, B. DePauw. 2002.
Voriconazole Versus Amphotericin B for Primary Therapy of Invasive Aspergillosis. N. Engl. J.
Med. 347, 6: p. 408-415.
14. Latge, J. P. 1995. Tools and trends in the detection of Aspergillus fumigatus. Curr. Top. Med.
Mycol. 6: p. 245-281.
15. Latge, J. P. 1999 Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. Clin. Microbiol. Rev. 12[2], 310-50.
16. Latge, J. P., H. Kobayashi, J. P. Debeaupuis, M. Diaquin, J. Sarfati, J. M. Wieruszeski, E.
Parra, J. P. Bouchara, and B. Fournet. 1994. Chemical and immunological characterization
of the extracellular galactomannan of Aspergillus fumigatus. Infect. Immun. 62: p. 5424-5433.
17. Letscher-Bru, V., A. Cavalier, E. Pernot-Marino, H. Koenig, D. Eyer, J. Waller, and E.
Candolfi. 1998. Recherche d'antigène galactomannane aspergillaire circulant par PlateliaTM
Aspergillus: antigénémies positives persistantes en l'absence d'infection. J. Med. Mycol. 8: p.
112-113.
18
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
Maertens, J., J. Verhaegen, H. Demuynck, P. Brock, G. Verhoef, P. Vandenberghe, J. Van
Eldere, L. Verbist, and M. Boogaerts. 1999. Autopsy-controlled prospective evaluation of
serial screening for circulating galactomannan by a sandwich enzyme-linked immunosorbent
assay for hematological patients at risk for Invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 37: p.
3223-3228.
Maertens, J., J. Verhaegen, K. Lagrou, J. Van Eldere, and M. Boogaerts. 2001. Screening
for circulating galactomannan as a noninvasive diagnostic tool for Invasive Aspergillosis in
prolonged neutropenic patients and stem cell transplantation recipients: a prospective
validation. Blood 97: p. 1604- 1610.
Marr K. A., M. Laverdiere, A. Gugel and W. Leisenring. 2005. Antifungal therapy decreases
sensitivity of the Aspergillus galactomannan enzyme immunoassay. Clin. Infect. Dis. 40: p.
1762-9.
Mattei, D., D. Rapezzi, N. Mordini, F. Cuda, C. Lo Nigro, M. Musso, A. Arnelli, S.
Cagnassi, and A. Gallamini. 2004. False-positive Aspergillus galactomannan enzyme-linked
immunosorbent assay results in vivo during amoxicillin-clavulanic acid treatment. J. Clin.
Microbiol. 42: p. 5362-5363.
Mennink-Kersten M. A. S. H., D. Ruegebrink, R. Klont, A. Warris, H. J. M. Op den Camp
and P. Verweij. 2005 Bifidobacterial Lipoglycan as a New Cause for False-Positive Platelia™
Aspergillus Enzyme Immunoabsorbent Assay Reactivity. J. Clin. Microbiol. 43(8): p. 39253931.
Nareddy, S., P. H. Chandrasekar. 2008. False-positive Aspergillus galactomannan (GM)
assay in histoplasmosis. J. Infection 56: p. 80-81.
Racil, Z., I. Kocmanova, M. Lengerova, J. Winterova, J. Mayer. 2007. Intravenous
PLASMALYTE as a Major Cause of False-Positive Results of Platelia™ Aspergillus EIA Test
for Galactomannan Detection in Serum. J. Clin. Microbiol. 45(2): p. 3141-3142
Rimek, D., T. Zimmermann, M. Hartmann, C. Prariyachatigul, and R. Kappe. 1999.
Disseminated Penicillium marneffei infection in an HIV-positive female from Thailand in
Germany. Mycoses 42: p. 25-8.
Siemann, M., M. Koch-Dorfler, and M. Gaude. 1998. False positive results in premature
infants with the PlateliaTM Aspergillus sandwich enzyme-linked immunosorbent assay.
Mycoses 41: p. 373-7.
Stynen, D., A. Goris, J. Sarfati, and J. P. Latge. 1995. A new sensitive sandwich enzymelinked immunosorbent assay to detect galactofuran in patients with Invasive Aspergillosis. J.
Clin. Microbiol. 33: p. 497-500.
Stynen, D., J. Sarfati, A. Goris, M. C. Prevost, M. Lesourd, H. Kamphuis, V. Darras, and J.
P. Latge. 1992. Rat monoclonal antibodies against Aspergillus galactomannan. Infect. Immun.
60: p. 2237-2245.
Sulahian, A., F. Boutboul, P. Ribaud, T. Leblanc, C. Lacroix, and F. Derouin. 2001. Value
of antigen detection using an enzyme immunoassay in the diagnosis and prediction of Invasive
Aspergillosis in two adult and pediatric hematology units during a 4-year prospective study.
Cancer 91: p. 311-318.
Sulahian, A., M. Tabouret, P. Ribaud, J. Sarfati, E. Gluckman, J. P. Latge, and F. Derouin.
1996. Comparison of an enzyme immunoassay and latex agglutination test for detection of
galactomannan in the diagnosis of Invasive Aspergillosis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15:
p. 139-145.
Surmont ,I., W. Stockman. 2007. Gluconate-containing intravenous solutions: Another cause
of false-positive galactomannan assay reactivity. J. Clin. Microbiol. 45: p. 1373.
Swanink, C. M., J. F. Meis, A. J. Rijs, J. P. Donnelly, and P. E. Verweij. 1997. Specificity of
a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detecting Aspergillus galactomannan. J.
Verweij, P. E., E. C. Dompeling, J. P. Donnelly, A. V. Schattenberg, and J. F. Meis. 1997.
Serial monitoring of Aspergillus antigen in the early diagnosis of Invasive Aspergillosis.
Preliminary investigations with two examples. Infection 25: p. 86-89.
19
34.
35.
36.
37.
38.
39.
Verweij, P. E. and J. F. Meis. 2000. Microbiological diagnosis of Invasive Fungal Infections in
transplant recipients. Transpl. Infect. Dis. 2: p. 80-87.
Verweij, P. E., D. Stynen, A. J. Rijs, B. E. de Pauw, J. A. Hoogkamp -Korstanje, and J. F.
Meis. 1995. Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay compared with Pastorex latex
agglutination test for diagnosing Invasive Aspergillosis in immunocompromised patients. J.
Verweij, P. E., C. M. Weemaes, J. H. Curfs, S. Bretagne, J. F. Meis. 2000. Failure to detect
circulating Aspergillus markers in a patient with chronic granulomatous disease and Invasive
Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 38: p. 3900-3901.
Walsh T. J., R.L. Schaufele, T. Sein, J. Gea-Banacloche, M. Bishop, N. Young, R. Childs,
J. Barrett, H. L. Malech, and S.M. Holland. 2002. Reduced expression of galactomannan
antigenemia in patients with Invasive Aspergillosis and chronic granulomatous disease or
Job’s syndrome. Abstracts of the 40th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of
America. Arlington, VA. P. 105 ; Abstr. 345.
Wheat, L. J., E. Hackett, M. Durkin, P. Connolly, R. Petraitiene, T. J. Walsh, K. Knox, C.
Hage. 2007. Histoplasmosis-associated cross-reactivity in the Bio-Rad Platelia™ Aspergillus
enzyme immunoassay. Clin. Vaccine Immunol. 14 (5): p. 638-40.
Yeo, S. F. and B. Wong. 2002. Current Status of Nonculture Methods for Diagnosis of
Invasive Fungal Infections. Clin. Microbiol. Rev. 15: p. 465-484.
20
• CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)
• Znak CE (Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady nr 98/79/CE o wyrobach diagnozy medycznej in vitro)
• For in vitro diagnostic use
• Wyrób do diagnostyki in vitro
• Catalogue number
• Numer katalogowy
• Manufacturer
• Wytwórca
• Authorised Representative
• Autoryzowany przedstawiciel
• Batch code
• Kod partii
• Expiry date YYYY/MM/DD
• U y przed RRRR/MM/DD
• Storage temperature limitation
• Przestrzega zakresu temperatur
• Consult Instruction for use
• Sprawd w instrukcji obsługi
Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette France
Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00
Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33
881045
03/2009
21

plateliatm aspergillus eia 96 testów 62796 - Bio-Rad

Transkrypt

Podobne dokumenty

Romku, fragmenty napisane różowa czcionką wymagają

BSA 22% (Bovine Serum Albumin)

Pelikloon anti-D mix (IgG/IgM) monoclonal K1157 0344