(11) PL/EP 2379704 PL/EP 2379704 T3

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO
(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
16.12.2009 09795406.9
(19) PL
(11) PL/EP
(13)
(51)
2379704
T3
Int.Cl.
C12N 1/20 (2006.01)
C12N 1/36 (2006.01)
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej
Polskiej
(54)
(97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:
20.02.2013 Europejski Biuletyn Patentowy 2013/08
EP 2379704 B1
C12N 15/01 (2006.01)
C12R 1/125 (2006.01)
A23K 1/00 (2006.01)
A23K 1/18 (2006.01)
A23L 1/30 (2006.01)
Tytuł wynalazku:
Kompozycja Bacillus opornych na żółć wydzielających wysokie poziomy niezbędnych aminokwasów
(30)
(43)
Pierwszeństwo:
19.12.2008 EP 08172353
Zgłoszenie ogłoszono:
26.10.2011 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2011/43
(45)
O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
30.08.2013 Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/08
(73)
Uprawniony z patentu:
Chr. Hansen A/S, Hoersholm, DK
PL/EP 2379704 T3
(72)
Twórca(y) wynalazku:
METTE DINES CANTOR, Birkeroed, DK
PATRICK DERKX, Tikoeb, DK
INGE KNAP, Broenshoej, DK
ANE KNARREBORG, Lynge, DK
THOMAS DYRMANN LESER, Frederiksberg, DK
LUND BENTE, Frederiksberg, DK
(74)
Pełnomocnik:
rzecz. pat. Magdalena Tagowska
PATPOL
KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O.
ul. Nowoursynowska 162 J
02-776 Warszawa
Uwaga:
W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący
udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za
sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
EP 2 379 704 B1
Opis
DZIEDZINA WYNALAZKU
[0001] Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji Bacillus, charakteryzujących się szybką germinacją (kiełkowaniem) i wzrostem w solach kwasów żółciowych (symulowanym środowisku jelitowym) i wysokim poziomem wydzielania niezbędnych aminokwasów. Kompozycję Bacillus można stosować jako suplement w paszy zwierzęcej, gdzie ma ona działanie probiotyczne (promujące zdrowie i wzrost) i zwiększa trawienie i
dostępność substancji odżywczych z pasz zwierzęcych.
TŁO WYNALAZKU
[0002] Bakterie probiotyczne, takie jak Bacillus subtilis i Bacillus licheniformis, stosowane są w przemyśle
pasz zwierzęcych jako suplementy diety. Ich zastosowanie dotyczy zdolności Bacillus do zastępowania lub
zmniejszania stosowania antybiotyków, które stosuje się jako promotory wzrostu w przemyśle pasz zwierzęcych.
[0003] Christian Hansen A/S; Dania, komercjalizuje przykład takiego probiotycznego, promującego wzrost
produktu pod nazwą handlową GalliPro® (zdeponowany dla celów patentowych jako DSM 17231). GalliPro®
jest kompozycją komórek przetrwalnikowych Bacillus subtilis.
[0004] Poza sugerowanymi sposobami działania (np. modulowanie immunologiczne, modyfikator flory jelitowej) probiotyczne Bacillus zdolne są do wytwarzania wielu korzystnych składników, takich jak enzymy, które
wydzielane są do przewodu żołądkowo-jelitowego (GIT), gdy są stosowane jako suplement paszy zwierzęcej. Enzymy, takie jak fitazy, są wydzielane i poprawiają trawienie oraz lepsze pobieranie paszy zwierzęcej
(wyższą strawność). Dieta (pasza) jest głównie złożona ze składników pochodzenia roślinnego, takich jak
zboża, kukurydza, ziarno soi, olej sojowy i aminokwasy. Ogólnie, działania te przyczyniają się do wytwarzania opłacalnych produktów zwierzęcych.
[0005] Probiotyczne Bacillussą również zdolne do wytwarzania innych korzystnych składników, takich jak
niezbędne aminokwasy.
[0006] Przetrwalniki Bacillus mogą przechodzić przez kwasową barierę żołądkową i kiełkować i wzrastać w
przewodzie pokarmowym (GIT) zwierząt. Ma to wielkie zalety, ponieważ po spożyciu mogą one wydzielać
liczne typy korzystnych składników, np. bakteriocyn, a także wydzielać użyteczne, niezbędne aminokwasy.
Ponadto, przetrwalniki Bacillus są termostabilne podczas procesu peletowania paszy, a zatem są doskonałym systemem dostarczania dla doprowadzania zarówno bakteriocyn, jak i np. niezbędnych aminokwasów
do GIT.
[0007] W procesie przeżywania i proliferacji Bacillus w GIT, ważna jest rola żółci. Żółć wytwarzana jest w
wątrobie, a przechowywana w pęcherzyku żółciowym. Żółć zawiera wodę, lecytynę, bilirubinę i biliwerdynę
oraz sole żółciowe.
[0008] Z literatury wiadomo, że żółć ma pewne negatywne wpływy na przeżywanie oraz germinację i wzrost
komórek przetrwalnikowych Bacillus do komórek wegetatywnych w GIT zwierząt. Z tego względu prowadzi
się badania nad znalezieniem probiotycznych szczepów Bacillus odpornych na żółć.
[0009] Artykuł (Antonie Van Leeuwehhoek. 2006 Aug; 90(2): 139-46. pub. elektron. 4 czerwca 2006) opisuje
izolację licznych próbek/komórek Bacillus bezpośrednio z jelita kurczaków. Wyizolowane komórki Bacillus
1
EP 2 379 704 B1
testowano pod kątem aktywności probiotycznej. Sześć Bacillus z najwyższą aktywnością probiotyczną testowano pod kątem odporności na sól żółciową i stwierdzono, że szczególnie silnie probiotyczne Bacillus
miały względnie wysoki poziom oporności na sól żółciową.
W tym artykule nie skupiano się szczególnie na żadnych przedziałach czasowych dla testowania oporności
na żółć. W części eksperymentalnej, komórki przetrwalnikowe Bacillus testuje się po prostu pod kątem oporności po 5 dniach obecności w solach żółciowych (patrz paragraf "Simulated small intestinal fluid tolerance
test" na stronie 141).
[0010] W US2003/0124104A opisano, że probiotyczne, konwencjonalne endospory Bacillus są wrażliwe na
niskie stężenie soli żółciowych, tj. w obecności nawet niskich stężeń soli żółciowych zahamowane jest namnażanie i/lub rehydratacja przetrwalników. Jest to sprzeczne z innymi bakteriami, takimi jak patogeny jelitowe, takie jak E. coli lub S. aureus (patrz część [0014] do [0015]). W świetle tego sugeruje się badanie przesiewowe/selekcjonowanie pod kątem przetrwalników Bacillus, które są oporne na hamujące działanie soli
żółciowych i w efekcie germinują (kiełkują) do komórek wegetatywnych, które następnie kolonizują okrężnicę
(patrz [0019]).
Wszystkie przykłady robocze są obecne, a w opisie nie zapewniono żadnych rzeczywistych danych eksperymentalnych dotyczących faktycznie zbadanej przesiewowo specyficznej komórki Bacillus.
Ponadto, warunki badania przesiewowego z solami żółciowymi opisano stosunkowo ogólnie. W szczególności, nie ma tam żadnych wskazań przedziałów czasowych do selekcji oporności na żółć. Innymi słowy, opierając się jedynie na rozległym/ogólnym instruktażu z tego dokumentu, można wybrać komórki Bacillus, które
mogą wzrastać (germinować) jedynie powoli, tj. zdolne są do kiełkowania z przetrwalników do komórek wegetatywnych po np. 20 godzinach w obecności istotnej ilości soli żółciowej.
[0011] W dokumencie tym nie ma opisu lub sugestii selekcji pod kątem komórek Bacillus, które mogą szybko
wzrastać (germinować), tj. zdolne są do kiełkowania i wzrostu od przetrwalników do komórek wegetatywnych, osiągając określony punkt rozwoju w pewnym przedziale czasowym w obecności stosowanej ilości
soli żółciowej.
[0012] Podsumowując, odnośniki ze stanu techniki dotyczące selekcji/badania przesiewowego komórek
Bacillus opornych na żółć nie skupiają się na szybkim wzroście/germinacji z komórek przetrwalnikowych do
komórek wegetatywnych Bacillus.
[0013] Międzynarodowe zgłoszenie PCT z numerem zgłoszenia PCT/EP2008/057296 złożono 11. 06. 2008.
Zgłaszającym jest Chr. Hansen A/S, a zgłoszenie NIE BYŁO OPUBLIKOWANE w dacie złożenia niniejszego
zgłoszenia.
[0014] W PCT/EP2008/057296 opisano nowe przetrwalniki Bacillus charakteryzujące się tym, że mają poprawioną/szybką prędkość germinacji i wzrostu z przetrwalnika do komórki wegetatywnej w obecności pożywki z soli żółciowej.
Przetrwalniki Bacillus, jak tu opisane, mają taką samą poprawioną/szybką prędkość germinacji i wzrostu z
przetrwalnika do komórki wegetatywnej, jak opisano w PCT/EP2008/057296.
[0015] W PCT/EP2008/057296 opisano jedynie wegetatywne komórki Bacillus, które w wytwarzają fitazę w
ilości zwiększonej w porównaniu do komórki referencyjnej Bacillus DSM 19467. NIE opisano, ani nie zasugerowano badania przesiewowego pod kątem komórki wegetatywnej Bacillus, która wytwarza niezbędne aminokwasy w zwiększonej ilości w porównaniu do komórki referencyjnej Bacillus DSM 19467.
[0016] Gdy poniżej znajduje się odniesienie do stanu techniki, należy je rozumieć jako stan techniki udostępniony do publicznej wiadomości (np. opublikowane artykuły/patenty) w dacie niniejszego zgłoszenia.
2
EP 2 379 704 B1
KRÓTKI OPIS WYNALAZKU
[0017] Problemem, który ma być rozwiązany przez niniejszy wynalazek, jest dostarczenie kompozycji Bacillus, które wydzielają duże ilości niezbędnych aminokwasów w przewodzie żołądkowo-jelitowym (GIT) zwierzęcia.
[0018] Rozwiązanie opiera się na tym, że niniejsi twórcy opracowali nowy sposób selekcji do identyfikacji
nowych, ulepszonych kompozycji Bacillus.
Nowym, ważnym etapem opisanego tu nowego sposobu selekcji jest specyficzne badanie przesiewowe/selekcjonowanie pod kątem komórek przetrwalnikowych Bacillus o ulepszonej/szybkiej prędkości germinacji i wzrostu od przetrwalników do komórek wegetatywnych w obecności soli żółciowych.
[0019] Jak opisano powyżej, w stanie techniki opisano sposoby selekcji komórek Bacillus zdolnych do wzrostu w obecności soli żółciowych, ale sposoby badania przesiewowego/selekcji ze stanu techniki nie skupiają
się na szybkości germinacji i wzrostu w obecności soli żółciowej. Odpowiednio, komórki Bacillus oporne na
żółć wyselekcjonowane w stanie techniki nie kiełkują i nie rosną wystarczająco szybko, aby spełniać kryterium szybkości germinacji i wzrostu, jak opisano niniejszym. Na przykład, komórki Bacillus wyizolowane bezpośrednio z jelita np. kurczaków (jak np. opisano w omówionym powyżej artykule Antonie Van Leeuwenhoeka) w środowisku jelita nie są wyselekcjonowane (pod naturalną presją) do szybkiej germinacji i wzrostu w
jelicie.
[0020] Jak przedstawiono niniejszym w przykładach roboczych, jest to również prawdą dla handlowo dostępnej kompozycji Bacillus GalliPro®, która zwyczajnie kiełkuje i wzrasta zbyt powoli i nie osiąga określonego punktu wzrostu w ciągu pierwszych 20 godzin w obecności fizjologicznych poziomów soli żółciowych, aby
spełniać kryterium szybkości germinacji i wzrostu, jak niniejszym opisano. GalliPro® jest kompozycją Bacillus
subtilis, która jest sukcesem komercyjnym.
[0021] Opisany niniejszym szczep, zdeponowany jako DSM 19467, wyselekcjonowano stosując GalliPro®
jako szczep wyjściowy oraz metodę presji selekcyjnej i późniejszą izolację pod kątem szybkiej germinacji
(kiełkowania) i wzrostu od przetrwalników do komórek wegetatywnych w obecności soli żółciowej, jak opisano niniejszym.
W celu zapoznania się z dalszymi szczegółami, patrz np. tabela 1 (GalliPro® może być niniejszym nazywana
również DSM 17231).
Schematycznie zilustrowano to na niniejszej Figurze 1.
[0022] Podsumowując uważa się, że w żadnym stanie techniki nie opisano wyizolowanej kompozycji Bacillus, która zawiera od 105 do 1012 CFU/g komórek Bacillus, przy czym komórki kompozycji Bacillus spełniają
kryterium szybkiej germinacji i wzrostu w obecności soli żółciowej.
[0023] Bez ograniczania się do teorii, niniejsi twórcy stwierdzili, że szybka germinacja i wzrost są bardzo
ważnym aspektem wynalazku, ponieważ przetrwalniki Bacillus, które są oporne na żółć, ale nie kiełkują, ani
nie wzrastają wystarczająco szybko, zostaną wydalone zanim komórki wegetatywne Bacillus będą mogły
wytworzyć w znacznych ilościach jakiekolwiek pozytywne cechy, takie jak wytwarzanie niezbędnych aminokwasów. Przetrwalniki Bacillus kiełkujące zbyt wolno przejdą po prostu przez przewód żołądkowo-jelitowy
(GIT) zanim bakterie będą mogły wytworzyć jakąkolwiek znaczną ilość np. niezbędnych aminokwasów.
[0024] Po licznych, szczegółowych testach i analizach, twórcy wybierają z tego względu pracę z zakresem
czasu do 20 godzin i wybierają przetrwalniki najszybciej w tym czasie kiełkujące i wzrastające w obecności
wysokich, fizjologicznych stężeń soli żółciowych. Bez ograniczania się do teorii i opierając się na niniejszym
3
EP 2 379 704 B1
ujawnionej szczegółowej pracy eksperymentalnej, niniejsi twórcy stwierdzili, że jest ważne, aby mieć szybką
germinację i wzrost w ciągu pierwszych 18 i 19 godzin w obecności, odpowiednio, 4 i 6 mM soli żółciowej.
[0025] Następnie, niniejsi twórcy stwierdzili, że po wyselekcjonowaniu komórek Bacillus o szybkiej germinacji i wzroście w pożywce soli żółciowej, komórki te są wysoce użyteczne jako komórki wyjściowe do mutagenezy dla uzyskiwania nowych komórek z ulepszonym wytwarzaniem niezbędnych aminokwasów.
[0026] Jak zilustrowano schematycznie na figurze 1 i w przykładzie 4, wyselekcjonowany, szybko wzrastający szczep oporny na żółć, DSM 19467, zastosowano jako szczep wyjściowy do klasycznej mutacji i wyselekcjonowano szczepy o wysokim wytwarzaniu niezbędnych aminokwasów. Jak można zobaczyć w przykładzie
4, niektóre z wyselekcjonowanych szczepów wytwarzają co najmniej 5 razy więcej niezbędnego aminokwasu
leucyny niż DSM 19467 i GalliPro®.
[0027] Opisane niniejszym nowe, probiotyczne komórki Bacillus są z tego względu tymi, które są oporne na
żółć, szybko kiełkują i wzrastają i wydzielają duże ilości niezbędnego aminokwasu. Uzyskane szczepy są
niezwykle przydatne jako probiotyczne kompozycje Bacillus do dodawania do pasz zwierzęcych. Łączą one
wszelkie korzystne zdolności probiotycznej bakterii do przeżycia i proliferacji w jelitach zwierząt (z obecnością soli żółciowej na wysokich poziomach), hamowania bakterii patogennej (produkcja bakteriocyn) i dodatkowo wydzielania dużych ilości korzystnych, niezbędnych aminokwasów.
[0028] Odpowiednio, pierwszy aspekt wynalazku dotyczy kompozycji Bacillus, która zawiera od 105 do 1012
CFU/g przetrwalników Bacillus, przy czym kompozycja Bacillus charakteryzuje się:
(i): przetrwalnikami Bacillus mającymi szybką germinację i wzrost od przetrwalnika do komórki wegetatywnej
w obecności pożywki z solą żółciową, zawierającej 4 i 6 mM soli żółciowych, określone przez to, że przetrwalniki Bacillus osiągają punkt wzrostu komórki wegetatywnej wynoszący 0,4 OD630 w czasie mniejszym
niż 18 i 19 godzin, odpowiednio, przy czym punkt wzrostu komórki wegetatywnej jest punktem na krzywej
wzrostu, w którym wartość OD zaczyna wzrastać (ze względu na wzrost komórek wegetatywnych) w sposób
ciągły i osiąga OD 630 wynoszące 0,4;
(i): przy czym pożywka z solą żółciową jest standardową, znaną, nieselektywną pożywką z bulionem infuzyjnym cielęcym Broth (VIB), wzbogaconą mieszaniną soli żółciowych, zawierającą skoniugowane sole
żółciowe stanowiące taurodeoksycholan i glikodeoksycholan i dekoniugowaną sól żółciową - deoksycholan w proporcjach 60% taurodeoksycholanu, 30% glikodeoksycholanu i 10% deoksycholanu; i
przy czym analizę oznaczenia OD przeprowadza się w następujących etapach:
(a): wypełnianie studzienki w płytce do mikromiareczkowania 0,150 ml pożywki z solą żółciową,
8
mającej 10 przetrwalników Bacillus na ml pożywki (tj. jest to czas zero) i
(b): inkubowanie płytki w 37°C w warunkach atmosferycznych i mierzenie wartości OD630, z zastosowaniem spektrofotometru i z wstrząsaniem przed każdym odczytem dla uzyskania reprezentatywnej krzywej wzrostu w czasie;
i
(ii) komórki wegetatywne Bacillus wytwarzają co najmniej jeden niezbędny aminokwas w ilości, która jest co
najmniej 2 razy większa niż komórki referencyjnej Bacillus DSM 19467, przy czym wytwarzana ilość niezbędnego aminokwasu mierzona jest w supernatancie za pomocą standardowego oznaczania aminokwasów opartego na sposobie GC-MS dla próbek wodnych, z zastosowaniem chloromrówczanu metylu jako
środka derywatyzującego po dwóch dniach wzrostu komórek Bacillus w 37°C i przy 150 rpm, inkubowanych
w probówkach z 10 ml pożywki w postaci standardowej, znanej pożywki wzrostowej z minimalnymi solami o
następującej kompozycji:
4
EP 2 379 704 B1
(NH4)2SO4 (Merck 1:01217.1000)
1 g/l
K2HPO4 (Merck 1.05101.1000).
7 g/l
KH2PO4(Merck 1.04873.1000)
3 g/l
MgSO47H2O (Merck 1.05886.1000)
0,1 g/l
którą autoklawowano przez 15 min. w 121°C oraz autoklawowanej glukozy, dodanej do końcowego stężenia
0,5%.
[0029] Jak omówiono powyżej, referencyjną komórkę Bacillus DSM 19467 wybiera się do szybkiej germinacji i wzrostu w obecności soli żółciowej przez zastosowanie GalliPro® jako szczepu wyjściowego. DSM
19467 nie jest wybrany pod kątem ulepszonego wytwarzania niezbędnego aminokwasu. Bez ograniczania
się do teorii uważa się, że istotne niniejszym wytwarzanie niezbędnego aminokwasu przez DSM 19467 odpowiada GalliPro®.
W odniesieniu do punktu (i) punkt wzrostu komórki wegetatywnej dla GalliPro® występuje co najmniej 20
godzin po inkubacji w 4 i 6 mM soli żółciowej, a dla nowego szczepu DSM 19467, jak tu opisano, występuje
on po 14 i 15 godzinach w 4 i 6 mM solach żółciowych, odpowiednio (patrz tu figura 2 i przykład roboczy 3).
[0030]Istotne jest tu odnotowanie, że niniejsi twórcy przetestowali również handlowo dostępny produkt CALSPORIN® (Calpis Co., Ltd., Japonia), aby określić punkt wzrostu komórki wegetatywnej w warunkach punktu (i) z pierwszego aspektu. Podobnie jak dla GelliPro®, produkt handlowy CALSPORIN® jest kompozycją
Bacillus subtilis stosowaną jako probiotyczny dodatek do pasz. Punkt wzrostu komórki wegetatywnej w warunkach punktu (i) z pierwszego aspektu dla CALSPORIN® wynosił więcej niż 20 godzin przy 4 i 6 mM soli
żółciowych, odpowiednio. Jest to znacząco więcej niż 18 i 19 godzin wymaganych w punkcie (i) i ilustruje to,
że do tej pory nie wyselekcjonowano handlowo dostępnych produktów pod kątem szybkiej germinacji i wzrostu. Jak omówiono powyżej, "naturalne" komórki Bacillus nie były pod jakąkolwiek presją selekcyjną dla
osiągania szybkiej germinacji i wzrostu. Bez ograniczania się do teorii, z tego względu uważa się, że "naturalne" komórki Bacillus nie spełniają warunków z punktu (i) z pierwszego aspektu.
[0031] Zarówno oporność na żółć [z punktu (i)], jak i oznaczenie niezbędnego aminokwasu [z punktu (ii)]
oparte są na znanych, dostępnych handlowo elementach standardowych (takich jak np. standardowe pożywki, sole żółciowe; standardowe pomiary OD i standardowe testy). Komórka referencyjna Bacillus zdeponowana jest jako DSM 19467 i jest zatem dostępna publicznie.
[0032] Komórka Bacillus subtilis GalliPro® jest zdeponowana dla celów patentowych jako DSM 17231 (nazwana GalliPro®") i jest zatem dostępna publicznie.
[0033] Odpowiednio, w oparciu o niniejszy szczegółowy opis (patrz np. niniejszy przykład 1 dla oznaczenia
oporności na żółć oraz niniejszy przykład 2 dla oznaczenia niezbędnego aminokwasu) specjalista jest w
stanie rutynowo powtórzyć te oznaczenia w celu obiektywnego określenia, czy konkretna komórka Bacillus,
będąca przedmiotem zainteresowania, spełnia poziomy oporności na żółć [z punktu (i)] i niezbędnego aminokwasu [z punktu (ii)] z pierwszego aspektu wynalazku.
[0034] Nową kompozycję Bacillus, jak tu opisano, stosować można jako probiotyczny suplement do paszy
zwierzęcej. Dawkę i podawanie można przeprowadzić według techniki, przykładowo jak zrobiono dla kompozycji Bacillus GalliPro® ze stanu techniki.
[0035] Odpowiednio, drugi aspekt wynalazku dotyczy sposobu karmienia zwierzęcia, obejmującego podawanie zwierzęciu kompozycji Bacillus według pierwszego aspektu i opisanych niniejszym pokrewnych wykonań, w połączeniu z innymi składnikami paszy zwierzęcej.
5
EP 2 379 704 B1
[0036] Trzeci aspekt wynalazku dotyczy sposobu badania przesiewowego i izolowania nowej komórki Bacillus, obejmującego następujące etapy:
(a): selekcjonowanie i izolowanie z puli pojedynczych komórek przetrwalnikowych Bacillus nowej komórki przetrwalnikowej Bacillus, która jest zdolna do kiełkowania i wzrostu tak szybko, że osiąga ona punkt
wzrostu komórki wegetatywnej w ciągu mniej niż 18 i 19 godzin w warunkach z punktu (i) z pierwszego
aspektu;
(b): wytwarzanie wegetatywnej komórki Bacillus z wyizolowanej komórki przetrwalnikowej z etapu (a) i
mutowanie nowej, wyselekcjonowanej i wyizolowanej komórki w celu uzyskania puli nowych, pojedynczych, komórek wegetatywnych Bacillus;
(c): selekcjonowanie i izolowanie z puli nowych pojedynczych komórek wegetatywnych Bacillus z etapu
(b) nowej komórki wegetatywnej Bacillus, która zdolna jest do wytwarzania co najmniej jednego niezbędnego aminokwasu w ilości większej niż komórka referencyjna Bacillus DSM 19467 w warunkach z
punktu (ii) z pierwszego aspektu; oraz (d): analizowanie wysokoproduktywnej, komórki wegetatywnej
Bacillus z etapu (c) w celu potwierdzenia, że utrzymała ona szybką germinację i wzrost z etapu (a) i izolowanie wyselekcjonowanej komórki Bacillus.
[0037] Dla znawcy oczywistym jest, że po ujawnieniu tu przez twórców istotnych oznaczeń testowych (w
szczególności oznaczenia do testowania szybkiej germinacji i wzrostu z przykładu 1) plus szczepu referencyjnego DSM 19467, dla znawcy będzie pracą rutynową wyselekcjonowanie innych, nowych komórek Bacillus, spełniających kryterium z niniejszego pierwszego aspektu.
[0038] Jak niniejszym omówiono, przez stosowanie nowego sposobu badania przesiewowego/ selekcji, jak
opisano niniejszym, twórcy wyselekcjonowali i wyizolowali pewną liczbę nowych, ulepszonych komórek Bacillus.
[0039] Wykonania niniejszego wynalazku opisano poniżej jedynie w sposób przykładowy.
DEFINICJE
[0040] Wszystkie definicje ważnych tu terminów są w zgodzie z tym, co byłoby rozumiane przez specjalistę
w odniesieniu do niniejszego, istotnego kontekstu technicznego.
[0041] Wyrażenie "komórka Bacillus" dotyczy tu zarówno komórki przetrwalnikowej Bacillus, jak i komórki
wegetatywnej Bacillus.
[0042] Wyrażenie "przetrwalnik Bacillus" w odniesieniu do komórki przetrwalnikowej Bacillus dotyczy tu przetrwalnika, który według techniki można scharakteryzować jako drzemiącą, wytrzymałą, niereprodukcyjną
strukturę wytwarzaną przez bakterie Bcillus. Podstawową funkcją przetrwalników jest ogólnie zapewnianie
przeżycia bakterii w okresach stresu środowiskowego. Z tego względu są one oporne na promieniowanie
ultrafioletowe i gamma, odwodnienie, lizozym, temperaturę, głodzenie i chemiczne środki dezynfekujące.
Przetrwalniki zwykle znajduje się w glebie i wodzie, gdzie mogą przeżywać długie okresy. Powłoka przetrwalnika jest nieprzepuszczalna dla wielu cząsteczek toksycznych, a także może zawierać enzymy, które
zaangażowane są w germinację. Wnętrze ma normalne struktury komórkowe, takie jak DNA i rybosomy, ale
jest nieaktywne metabolicznie. Gdy bakteria wykryje, że warunki środowiskowe stają się niekorzystne, może
ona rozpocząć proces sporulacji, który zajmuje około ośmiu godzin.
[0043] Wyrażenie "komórka wegetatywna Bacillus" dotyczy funkcjonalnej, komórki wegetatywnej Bacillus,
która może dzielić się, aby wytwarzać więcej komórek wegetatywnych.
[0044] Wyrażenie "germinacja i wzrost" dotyczy tego, że przetrwalnik Bacillus kiełkuje i wzrasta do komórek
wegetatywnych Bacillus. Jak wiadomo specjaliście, reaktywacja przetrwalnika odbywa się, gdy warunki są
6
EP 2 379 704 B1
korzystne i obejmuje germinację i wzrost. Germinacja obejmuje rozpoczęcie aktywności metabolicznej przez
nieaktywny przetrwalnik, a zatem przełamanie uśpienia. Charakteryzuje się ona zazwyczaj rozerwaniem lub
absorpcją powłoki przetrwalnika, pęcznieniem przetrwalnika, wzrostem aktywności metabolicznej i utratą
oporności na stres środowiskowy. Wzrost następuje po germinacji i obejmuje wytwarzanie przez wnętrze
przetrwalnika nowych składników chemicznych i opuszczanie powłoki starego przetrwalnika, aby rozwinąć
się w funkcjonalną wegetatywną komórkę bakteryjną, która może dzielić się, aby wytwarzać więcej komórek.
Krzywe wzrostu (OD versus czas) komórek Bacillus wykazują wyraźne fazy wzrostu. Gdy przetrwalniki przenosi się do bogatej pożywki odżywczej, inicjowana jest germinacja, po której następuje przejściowy spadek
OD (faza I), wynikający z uwolnienia kwasu dipikolinowego, a następnie nawodnienia powłoki przetrwalnika.
W drugiej fazie (faza II = faza wzrostu) istnieje okres o względnie małej zmianie OD, dopóki przetrwalniki nie
rozwiną się w funkcjonalne, wegetatywne komórki bakteryjne, które mogą się dzielić, aby wytwarzać więcej
komórek i w ten sposób dawać ciągły wzrost wartości OD. Punkt, gdy zaczyna się ciągły wzrost wartości OD,
osiągając OD 0,4, określa się tu "punktem wzrostu komórki wegetatywnej".
[0045] Wyrażenie "gęstość optyczna" definiuje się jako pomiar absorbancji z zastosowaniem spektrofotometru. Gęstość optyczna (OD) jest absorbancją elementu optycznego dla danej długości fali A na jednostkę
odległości. Jeśli OD jest np. mierzona przy długości fali 630 nm, to można ją określić jako OD630.
RYSUNKI
[0046]
Figura 1: Na tej figurze zilustrowano etapy dla otrzymania niniejszych, nowych, ulepszonych szczepów. Niniejsze przykłady robocze rozpoczęto od DSM 17231 (GalliPro®), którą zmutowano klasycznie
i badano przesiewowo/selekcjonowano pod kątem szybkiej germinacji i wzrostu w obecności soli żółciowej w celu uzyskania nowego, wyselekcjonowanego szczepu DSM 19467. DSM 19467 zastosowano jako szczep wyjściowy dla klasycznej mutacji i wyselekcjonowano szczepy silnie produkujące niezbędny aminokwas.
Figura 2a i 2b: Figury te przedstawiają wyraźnie poprawę szybkiej germinacji i wzrostu przetrwalników
Bacillus DSM 19467 według niniejszego wynalazku w porównaniu z DSM 17231, w obecności 4 i 6
mM soli żółciowej, jak tu opisano.
SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU
Kompozycja Bacillus:
[0047] Wyrażenie "kompozycja Bacillus" należy rozumieć zgodnie z dziedziną. Niniejszym rozumie się ją
jako kompozycję Bacillus, zawierającą pewną liczbę komórek przetrwalnikowych Bacillus z cechą będącą
przedmiotem zainteresowania.
[0048] Kompozycja Bacillus może zawierać różne typy komórek Bacillus (np. B. subtilis i Bacillus licheniformis). Zasadniczo, kompozycja powinna po prostu zawierać ilość komórek przetrwalnikowych Bacillus podaną niniejszym w pierwszym aspekcie, przy czym komórki Bacillus spełniają kryterium podane w pierwszym
aspekcie.
7
EP 2 379 704 B1
[0049] Jak wiadomo specjaliście, niniejsze, handlowo istotne kompozycje komórek przetrwalnikowych Bacillus wytwarza się na ogół przez fermentację. Uzyskane komórki przetrwalnikowe ogólnie zatęża się, osusza,
miesza z nośnikiem i pakuje do odpowiedniego pojemnika.
5
12
[0050] Stosowne np. od 10 do 10
CFU/g komórki Bacillus kompozycji mogą być obecne w handlowo od-
powiedniej postaci, znanej specjaliście.
[0051] Odpowiednio, w wykonaniu, od 105 do 1012 CFU/g komórek przetrwalnikowych Bacillus kompozycji
jest obecnych jako komórki wysuszone (np. wysuszone rozpyłowo) lub jako zamrożone komórki przetrwalnikowe.
6
12
[0052] W korzystnym wykonaniu kompozycja Bacillus zawiera od 10 do 10
7
CFU/g komórek przetrwalni-
12
kowych Bacillus, korzystniej od 10 do 10 CFU/g komórek przetrwalnikowych Bacillus.
Wyrażenie "CFU/g" dotyczy masy w gramach kompozycji jako takiej, w tym, odpowiednich, istotnych dodatków obecnych w kompozycji. Nie obejmuje ono masy odpowiedniego pojemnika, zastosowanego do opakowania kompozycji Bacillus.
[0053] Przykład wykonania dotyczy tego, że kompozycja Bacillus pakowana jest do odpowiedniego pojemnika.
[0054] Jak wiadomo specjaliście, ważna handlowo kompozycja bakteryjna zawiera ogólnie również inne
ważne dodatki, takie jak np. jeden nośnik/składnik z grupy należącej do serwatki, permeatu serwatki, węglanu wapnia/wapienia i środków przeciw zbrylających, takich jak krzemiany glinu i datonit (ziemia okrzemkowa).
[0055] Oprócz istotnych tu komórek Bacillus, kompozycja może również zawierać inne istotne mikroorganizmy, będące przedmiotem zainteresowania, takie jak np. bakterie kwasu mlekowego będące przedmiotem
zainteresowania.
Komórka Bacillus
[0056] Komórka Bacillus może być jakąkolwiek istotną komórką Bacillus będącą przedmiotem zainteresowania.
[0057] W korzystnym przykładzie wykonania komórka Bacillus oznacza co najmniej jedną komórkę Bacillus
wybraną z gatunków Bacillus wybranych z grupy składającej się z:
Bacillus subtilis, Bacillus uniflagellatus, Bacillus lateropsorus, Bacillus laterosporus BOD, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus i Bacillus sterothermophilus, Bacillus coagulans, Bacillus thermophilus, Bacillus mycoides, Bacillus cereus i Bacillus circulans.
[0058] W korzystniejszym przykładzie wykonania komórką Bacillus jest komórka B. subtilis lub komórka
Bacillus licheniformis.
[0059] Najkorzystniej, gdy komórką Bacillus jest komórka B. subtilis.
Oznaczenie do selekcji pod kątem szybkiej germinacji i wzrostu w obecności soli żółciowej
[0060] Jak omówiono powyżej, oznaczenie oporności na żółć z punktu (i) z pierwszego aspektu oparte jest
na znanych, dostępnych handlowo elementach standardowych (takich jak np. standardowe pożywki, sole
żółciowe; standardowe pomiary OD).
[0061] Odpowiednio, opierając się na niniejszym szczegółowym opisie oznaczenia (patrz, np. niniejszy przykład 1), specjalista jest zdolny rutynowo powtórzyć to oznaczenie, aby obiektywnie określić, czy konkretna
komórka przetrwalnikowa Bacillus, będąca przedmiotem zainteresowania, spełnia kryteria szybkiej germinacji i wzrostu od przetrwalnika do komórki wegetatywnej, jak opisano w punkcie (i).
8
EP 2 379 704 B1
[0062] W punkcie (i) wyjaśniono, że punktem wzrostu komórki wegetatywnej jest punkt na krzywej wzrostu,
zaczynający się od 108 przetrwalników/ml, odpowiadający OD około 0,2-0,3 do czasu, w którym wartość OD
wzrosła (ze względu na wzrost komórek wegetatywnych) w sposób ciągły i osiągnęła OD 0,4. Jest to zgodne
z tym, jak specjalista zrozumiałby taki punkt wzrostu komórki wegetatywnej, a opierając się na krzywej wzrostu, specjalista może rutynowo go określać w granicach zmienności, wynoszącej około ± 30 minut, jak niniejszym wyjaśniono.
[0063] Niniejszy roboczy przykład 1 dostarcza szczegółowego opisu oznaczenia oporności na żółć, odpowiedniego do selekcji pod kątem szybkiej germinacji i wzrostu w obecności soli żółciowej. Szczegółowe warunki z tego przykładu 1 oznaczają niniejszym korzystne oznaczenie w celu określania, czy komórka przetrwalnikowa Bacillus, będąca przedmiotem zainteresowania, spełnia kryteria z punktu (i) z pierwszego
aspektu.
[0064] Wyrażenie "sól żółciowa" dotyczy soli kwasów żółciowych. Kwasy żółciowe są kwasami steroidowymi,
znajdowanymi głównie w żółci ssaków. Są one wytwarzane w wątrobie przez utlenianie cholesterolu, a przechowywane w pęcherzyku żółciowym i wydzielane do jelita w postaci soli. Działają one jako środki powierzchniowo czynne, emulgując tłuszcze i pomagając w ich absorpcji i trawieniu. Sole żółciowe stosowane
w przykładzie 1 wytworzono naśladując fizjologiczne stężenia i kompozycje soli żółciowych świni. Jak wiadomo specjaliście, kompozycje soli żółciowych świni można niniejszym uważać za stosunkowo "ostre" warunki w porównaniu do kompozycji soli żółciowych ptaków.
[0065] Wyrażenie "pożywka z solą żółciową" dotyczy pożywki, zawierającej istotne składniki wzrostowe Bacillus, takie jak istotne substancje odżywcze i sól żółciową.
Punkt wzrostu komórki wegetatywnej - w oznaczaniu z solą żółciową - punkt (i) z pierwszego aspektu
[0066] Jak wspomniano powyżej, w odniesieniu do punktu (i) z pierwszego aspektu, komórki przetrwalników
Bacillus, jak niniejszym opisano, mają germinację i wzrost od przetrwalnika do komórki wegetatywnej, które
są tak szybkie, że osiągają one punkt wzrostu komórki wegetatywnej, wynoszący 0,4 OD, w ciągu mniej niż
18 i 19 godzin w 4 i 6 mM solach żółciowych, odpowiednio.
Jak wspomniano powyżej, nowy szczep DSM 19467 osiąga punkt wzrostu komórki wegetatywnej po 14 i 15
godzinach inkubacji w 4 i 6 mM soli żółciowej, odpowiednio.
[0067] Odpowiednio, w korzystnym wykonaniu, przetrwalniki Bacillus osiągają punkt wzrostu komórki wegetatywnej po 17 i 18 godzinach inkubacji w 4 i 6 mM soli żółciowej w warunkach z punktu (i) z pierwszego
aspektu, korzystniej przetrwalniki Bacillus osiągają punkt wzrostu komórki wegetatywnej po 15 i 16 godzinach inkubacji w 4 i 6 mM soli żółciowej w warunkach z punktu (i) z pierwszego aspektu.
[0068] Jak wyjaśniono powyżej i przedstawiono schematycznie na opisanej tu figurze, nowy szczep DSM
19467 wyselekcjonowano stosując handlowo dostępny GalliPro® jako szczep wyjściowy do mutagenezy i
selekcji pod kątem szybkiego wzrostu w obecności soli żółciowej, jak tu opisano.
GalliPro® jest kompozycją zawierającą komórki Bacillus subtilis, a Bacillus subtilis zdeponowano dla celów
patentowych jako DSM 17231. Odpowiednio, GalliPro® można niniejszym postrzegać jako szczep referencyjny.
[0069] Jak wspomniano powyżej, punkt wzrostu komórki wegetatywnej dla GalliPro® występuje po 20 godzinach inkubacji w 4 i 6 mM solach żółciowych w warunkach z punktu (i) z pierwszego aspektu. Odpowiednio,
w przykładzie wykonania przetrwalniki Bacillus osiągają punkt wzrostu komórki wegetatywnej co najmniej 3
godziny wcześniej niż referencyjne komórki przetrwalnikowe Bacillus subtilis, zdeponowane jako DSM 17231
®
("GalliPro ") w warunkach z punktu (i) z pierwszego aspektu, korzystniej przetrwalniki Bacillus osiągają
9
EP 2 379 704 B1
punkt wzrostu komórki wegetatywnej co najmniej 4 godziny wcześniej niż referencyjne komórki przetrwalni®
kowe Bacillus subtilis, zdeponowane jako DSM 17231 ("GalliPro ") w warunkach z punktu (i) z pierwszego
aspektu, a najkorzystniej przetrwalniki Bacillus osiągają punkt wzrostu komórki wegetatywnej co najmniej 5
godzin wcześniej niż referencyjne komórki przetrwalnikowe Bacillus subtilis, zdeponowane jako DSM 17231
("GalliPro®") w warunkach z punktu (i) z pierwszego aspektu.
Niezbędne aminokwasy
[0070] Jak wiadomo specjaliście, niezbędny aminokwas może być niezbędnym aminokwasem wybranym z
grupy składającej się z: fenyloalaniny, waliny, treoniny, tryptofanu, izoleucyny, metioniny, leucyny, lizyny,
cysteiny, tyrozyny, histydyny i argininy.
[0071] W korzystnym wykonaniu niezbędny aminokwas jest co najmniej jednym niezbędnym aminokwasem
wybieranym z grupy składającej się z: fenyloalaniny, waliny, treoniny, tryptofanu, izoleucyny, metioniny, leucyny i lizyny.
[0072] W korzystniejszym wykonaniu niezbędnym aminokwasem jest co najmniej jeden niezbędny aminokwas wybrany z grupy składającej się z: waliny, izoleucyny i leucyny.
[0073] Niniejszym, bardzo istotnym niezbędnym aminokwasem jest leucyna.
[0074] W rozumieniu specjalisty komórki wegetatywne Bacillus mogą wytwarzać większe ilości więcej niż
jednego niezbędnego aminokwasu, tak jak np. większe ilości dwóch lub trzech lub więcej niezbędnych aminokwasów.
Oznaczenie aminokwasów
[0075] Jak omówiono powyżej, oznaczenie aminokwasu z punktu (ii) z pierwszego aspektu oparte jest na
znanych, dostępnych handlowo elementach standardowych (takich jak np. standardowe pożywki, standardowy test).
[0076] Odpowiednio, opierając się na niniejszym, szczegółowym opisie oznaczenia (patrz, np. niniejszy
przykład 2), specjalista jest zdolny powtórzyć rutynowo to oznaczenie, aby obiektywnie określić, czy konkretna komórka wegetatywna Bacillus, będąca przedmiotem zainteresowania, odpowiada ilości wytwarzanego niezbędnego aminokwasu, jak opisano w punkcie (ii).
[0077] Niniejszy roboczy przykład 2 dostarcza szczegółowego opisu oznaczenia niezbędnego aminokwasu.
Szczegółowe warunki z tego przykładu 2 oznaczają niniejszym korzystne oznaczenie niezbędnego aminokwasu dla określania, czy komórka wegetatywna Bacillus, będąca przedmiotem zainteresowania, spełnia
kryteria z punktu (ii) z pierwszego aspektu.
Wytwarzana ilość niezbędnego aminokwasu - punkt (ii) z pierwszego aspektu
[0078] W stosunku do punktu (ii) z pierwszego aspektu, wegetatywne komórki Bacillus wytwarzają korzystnie co najmniej jeden niezbędny aminokwas w ilości co najmniej 2 razy większej niż komórka referencyjna
Bacillus DSM 19467, w warunkach z punktu (ii) z pierwszego aspektu.
[0079] W korzystniejszym wykonaniu, w stosunku do punktu (ii) z pierwszego aspektu, wegetatywne komórki
Bacillus wytwarzają korzystnie co najmniej jeden niezbędny aminokwas w ilości co najmniej 4 razy większej
niż referencyjna komórka Bacillus DSM 19467 w warunkach z punktu (ii) z pierwszego aspektu.
Sposób karmienia/podawania przetrwalników Bacillus zwierzęciu
[0080] Jak wspomniano powyżej, drugi aspekt wynalazku dotyczy sposobu karmienia zwierzęcia, obejmującego podawanie zwierzęciu kompozycji Bacillus z pierwszego aspektu i opisanych niniejszym, pokrewnych
wykonań, w połączeniu z innymi składnikami paszy zwierzęcej.
10
EP 2 379 704 B1
[0081] Zwierzęciem może być jakiekolwiek zwierzę, będące przedmiotem zainteresowania. Korzystnie, zwierzęciem jest zwierzę wybrane z grupy składającej się z drobiu, przeżuwaczy, cieląt, świń, królików, koni, ryb i
zwierząt domowych.
1
[0082] Gdy GalliPro® podaje się według tej dziedziny, robi się to normalnie w dawce od około 10 -10
8
GFU/g paszy, zwykle 105-106 CFU/g paszy lub w dawkach odpowiadających normalnemu spożywaniu paszy/kg wagi żywego zwierzęcia.
[0083] Alternatywnie, przetrwalniki Bacillus można podawać zwierzęciu w jeden z następujących sposobów:
(1): przez dodanie do wody pitnej dla zwierząt;
(2): przez opryskanie zwierząt; lub
(3): przez stosowanie za pośrednictwem pasty, żelu lub bolusa.
[0084] Sposób badania przesiewowego i izolowania nowej komórki Bacillus
[0085] Jak wspomniano powyżej, trzeci aspekt dotyczy sposobu badania przesiewowego i izolowania nowej
komórki Bacillus.
[0086] W sposobie według trzeciego aspektu selekcjonuje się komórkę Bacillus zdolną do spełnienia warunków z punktu (i) i (ii) z pierwszego aspektu.
W rozumieniu specjalisty niniejszym specyficznie, szczegółowo opisane oznaczenie oporności na żółć i ilości
niezbędnego aminokwasu (patrz np. niniejszy przykład 1 dla oznaczenia oporności na żółć i niniejszy przykład 2 dla oznaczenia niezbędnego aminokwasu) można zmieniać, aby przeprowadzić alternatywny sposób
badania przesiewowego, w którym wciąż uzyskuje główne cele, jak opisano niniejszym, tj. komórkę Bacillus,
która zdolna jest do spełniania warunków z punktu (i) i (ii) z pierwszego aspektu.
[0087] W korzystnym wykonaniu, oznaczenie oporności na żółć z przykładu 1 stosuje się w etapie (a) sposobu badania przesiewowego z trzeciego aspektu, a oznaczenie niezbędnego aminokwasu z przykładu 2
stosuje się w etapie (c) sposobu badania przesiewowego z trzeciego aspektu.
[0088] W etapie (d) sposobu badania przesiewowego z trzeciego aspektu izoluje się wegetatywną komórkę
Bacillus. Tę wegetatywną komórkę Bacillus można wykorzystać do wytworzenia postaci przetrwalnikowych
Bacillus.
[0089] Odpowiednio, w przykładzie wykonania, po sposobie badania przesiewowego z trzeciego aspektu
następuje dodatkowy etap (e), w którym wyizolowana komórka wegetatywna Bacillus z etapu (d) bierze
udział w fermentacji z wytworzeniem od 105 do 1012 wegetatywnych komórek Bacillus, a te od 105 do 1012
wegetatywnych komórek Bacillus stosuje się do wytworzenia od 105 do 1012 komórek przetrwalnikowych
5
12
Bacillus, które izoluje się dla uzyskania kompozycji Bacillus, która zawiera od 10 do 10
CFU/g komórek
przetrwalnikowych Bacillus.
[0090] Wynikiem końcowym z etapu (e) jest nowa kompozycja Bacillus, która zawiera od 105 do 1012 CFU/g
komórek przetrwalnikowych Bacillus i w której komórki Bacillus są zdolne do spełniania warunków z punktu
(i) i (ii) z pierwszego aspektu.
[0091] Odpowiednio, osobny aspekt wynalazku dotyczy kompozycji Bacillus, która zawiera od 105 do 1012
CFU/g komórek przetrwalnikowych Bacillus i w której komórki Bacillus zdolne są do spełniania warunków z
punktu (i) i (ii) z pierwszego aspektu, uzyskiwanej dzięki sposobowi badania przesiewowego z trzeciego
aspektu, po którym następuje dodatkowy etap (f), opisany powyżej.
[0092] W etapie (b) sposobu badania przesiewowego z trzeciego aspektu wytwarza się mutacje wyselekcjonowanych wcześniej komórek Bacillus opornych na żółć do selekcji pod kątem komórek wytwarzających
dużo niezbędnego aminokwasu w etapie (c). W rozumieniu specjalisty, może to być np. klasyczna mutacja
11
EP 2 379 704 B1
(np. przez traktowanie chemiczne lub UV) specyficzną wymianę genów w celu wytworzenia tak zwanego
organizmu modyfikowanego genetycznie (GMO, ang.).
Zdeponowane szczepy
[0093] Próbkę szczepu Bacillus subtilis zdeponowano w DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zeilkulturen GmbH, Maschroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig) pod numerem dostępu DSM 19467 z
datą złożenia 27 czerwca 2007. Deponowanie przeprowadzono zgodnie z warunkami Traktatu Budapesztańskiego o międzynarodowym uznawaniu depozytu mikroorganizmów dla celów postępowania patentowego.
PRZYKŁADY
PRZYKŁAD 1: Oznaczenie oporności na żółć
Pożywka:
[0094] Pożywką była standardowa, nieselektywna, handlowo dostępna pożywka z bulionem infuzyjnym cielęcym (Veal Infusion Broth; VIB) (Difco, 234426).
W dacie złożenia niniejszego zgłoszenia w katalogu produktu ("Difco™/BBL™ Manual) od dostawcy BD
Diagnostic Systems (www.bd.com) napisano, w odniesieniu do bulionu infuzyjnego cielęcego:
"Wywar z chudej cielęciny i pepton dostarczają azotu, witamin, węgla i aminokwasów w pożywce z wywaru
cielęcego. Chlorek sodu utrzymuje równowagę osmotyczną formulacji".
[0095] Pożywkę wytworzono według instrukcji producenta, zawieszając 25 g proszku bulionu infuzyjnego
cielęcego w 1 l oczyszczonej wody (roztwór 2,5%) oraz ogrzewano z częstym mieszaniem i gotowano przez
1 minutę do całkowitego rozpuszczenia proszku. 2,5% roztwór bulionu infuzyjnego cielęcego zawierał na litr:
Wywar z chudej cielęciny: 10 g
Pepton proteozowy: 10 g
Chlorek sodu: 5 g
[0096] Pożywkę rozdzielono do sterylnych butelek i autoklawowano przez 15 min. w 121°C.
Roztwory soli żólciowych/pożywka:
[0097] Mieszaniny soli żółciowych wytworzono naśladując fizjologiczną kompozycję i stężenie soli żółciowych w żółci świni, a sole żółciowe rozpuszczono w pożywce z bulionem infuzyjnym cięlęcym, jak wytworzona powyżej, co dawało końcowe stężenie soli żółciowej 8 mM.
Skoniugowanymi solami żółciowymi były taurodeoksycholan (Sigma T-0875, USA) i glikodeoksycholan
(Sigma G-9910, USA), a nieskoniugowaną solą żółciową deoksycholan (Sigma D-5670 USA), a końcowy
roztwór 8 mM mieszaniny soli żółciowej zawierał 60% taurodeoksycholanu, 30% glikodeoksycholanu i 10%
deoksycholanu. Przed autoklawowaniem przez 15 minut w 121°C, roztwory doprowadzano do pH 7,4 stosując wodorotlenek sodu. Wytworzoną pożywkę z 8 mM solą żółciową rozcieńczono dla uzyskania stężeń soli
żółciowej wynoszących 0, 1, 2, 4, 6 i 8 mM.
[0098] Sole żółciowe dodano do pożywki z bulionem infuzyjnym cielęcym w postaci stężonej. Odpowiednio,
końcowa ilość wywaru z chudej cielęciny, peptonu proteozowego i chlorku sodu były zasadniczo jak dla
pożywki z 2,5% bulionu infuzyjnego cielęcego przed dodaniem soli żółciowych.
Zawiesiny przetrwalników
[0099] Dla rozróżnienia między komórkami wegetatywnymi i przetrwalnikami oraz dla zapewnienia czystych
produktów przetrwalników do inokulacji, liczbę przetrwalników z produktu Bacillus określono stosując +/12
EP 2 379 704 B1
obróbkę cieplną w 80°C przez 10 min. Po obróbce cieplnej i dalszym schładzaniu do temperatury pokojowej,
przeprowadzono seryjne rozcieńczenia 10-krotne w wodzie peptonowej z solą fizjologiczną. Płytki Tryptose
Blood Agar (Difco 0232-01) w dwóch egzemplarzach zaszczepiano 0,1 ml z odpowiednich rozcieńczeń dziesiętnych. Płytki inkubowano w 37°C do następnego dnia. Opierając się na wcześniejszych określeniach liczby przetrwalników z produktów wytworzono zawiesiny przetrwalników w sterylnej wodzie destylowanej, dla
8
uzyskania końcowego, wyliczonego stężenia przetrwalników wynoszącego 10 CFU/ml. Liczby komórek
wegetatywnych i przetrwalników w końcowym inokulum określono stosując sposób opisany powyżej. Końcowe stężenie 108 CFU/ml odpowiadało wyjściowemu OD630 przy 0,2-0,3.
Pomiar wzrostu: pomiary gęstości optycznej
[0100] Stosowano sterylne płaskodenne płytki 96-studzienkowe do mikromiareczkowania (Greiner Bio-one
GmbH, Niemcy). Każdą studzienkę wypełniano 0,150 ml VIB zaszczepionego przetrwalnikami (~1x108 przetrwalników na ml równoważne/odpowiadające wyjściowemu OD630 ~ 0,2-0,3), a płytki inkubowano przez 20
godz. w 37°C z 1-minutowym cyklem wytrząsania o intensywności 4 (wysokiej) przed każdym odczytem.
[0101] Dla uniknięcia kondensacji na wnętrzu pokrywy płytki, wieczka eksponowano na rozcieńczony roztwór Triton X-100.
[0102] Kinetykę germinacji i wzrostu szczepów Bacillus mierzono stosując spektrofotometr przy długości fali
630nm (OD630) (Bio-tek Instruments, Inc. VE). Odczyty przeprowadzano z 10-minutowymi przerwami i analizowano stosując oprogramowanie KC4™ (Bio-tek Instruments, Inc., USA). Po 20 godz. dane wyeksportowano do arkuszy Excel® do dalszej analizy, zaimportowano do SAS wersja 9.0 i analizowano statystycznie.
PRZYKŁAD 2: Oznaczenie aminokwasów
[0103] Sposobem pomiaru i określania ilościowego aminokwasów wytwarzanych przez komórki Bacillus,
stosowanym w tym badaniu, jest standardowy sposób GC-MS dla próbek wodnych, z zastosowaniem chloromrówczanu metylu jako środka derywatyzującego.
Hodowanie komórek Bacillus
[0104] Komórki Bacillus zaszczepia się i hoduje w pożywce wzrostowej z minimalnymi solami w 37°C, 150
rpm oraz hoduje przez 2 dni, a następnie mierzy się ilość aminokwasu w supernatancie, jak opisano poniżej.
[0105] Komórki Bacillus namnaża się pożywce z minimalnymi solami według Chapmana (1972) o następującym składzie:
(NH4)2SO4 (Merck 1.01217.1000)
1 g/l
K2HPO4 (Merck 1.05101.1000)
7 g/l
KH2PO4 (Merck 1.04873.1000)
3 g/l
MgSO4·7H2O (Merck 1.05886.1000)
0,1 g/l
Autoklawowano przez 15 min. w 121°C i dodano autoklawowaną glukozę do końcowego stężenia 0,5%.
[0106] Inkubację przeprowadza się w probówkach z 10 ml pożywki przez 2 dni w 37°C i 150 rpm.
Oznaczenie aminokwasów
[0107] Oznaczenie aminokwasów przeprowadza się na supernatantach komórek, ponieważ aminokwasy są
wydzielane do pożywki. Próbki filtruje się sterylnie i przechowuje w -20°C aż do analizy.
Odczynniki:
[0108]
Odczynnik 1: roztwór wzorca wewnętrznego: norwalina 1 mM: 0,0172 g norwaliny + 100 ml MQW
Odczynnik 2: metanol/pirydyna 32/8 (obj./obj.) (katalizator)
13
EP 2 379 704 B1
Odczynnik 3: chloromrówczan metylu p.a. (MCF) (środek derywatyzujący)
Odczynnik 4: 1% MCF/CHCl3 (obj./obj.) (ekstrakcja): 1 ml chloromrówczanu metylu p.a. + chloroform
do 1000 ml.
Wytworzenie próbki:
[0109]
● Odpipetować 150 µl próbkę (25 µl + 125 µ MQW) do 2 ml fiolki.
● Dodać 150 µl IS
● Dodać 200 µl 1-metanol/pirydyna 32/8% (obj./obj.). Dobrze wymieszać.
● Dodać 25 µl MCF (chloromrówczanu metylu). Dobrze wymieszać do wydzielania się gazu.
● Dodać 500 µl 1% MCF/CHCl3 (obj./obj.), zakapslować i mieszać energicznie. Rozdział faz zachodzi
w ciągu minut. Jeśli rozdział faz jest zbyt wolny, zwirować fiolkę (500 rpm/10 min.).
[0110] Jeśli norwalinę stosuje się jako antymetabolit, w zamian należy zastosować wzorzec zewnętrzny lub
inny odpowiedni wzorzec wewnętrzny, a 150 µl IS zastąpić albo MQW albo próbką.
[0111] Próbki przeprowadza się na GC-MS ze standardową kolumną aminokwasową i protokołem.
PRZYKŁAD 3: Selekcja komórki Bacillus subtilis DSM 19467 opornej na żółć
[0112] Wyjściową komórką Bacillus była komórka Bacillus subtilis GalliPro®.
[0113] GalliPro® zmutagenizowano dla uzyskania puli nowych, pojedynczych komórek Bacillus. Wytworzono
i wyselekcjonowano przetrwalniki pod kątem szybkiej germinacji i wzrostu od przetrwalnika do komórki wegetatywnej w obecności pożywki z solą żółci, zawierającej 4 i 6 mM soli żółci, jak opisano w przykładzie 1
powyżej.
[0114] Wybrano komórkę Bacillus subtilis DSM 19467.
[0115] Tabela 1 poniżej przedstawia dane z germinacji i wzrostu.
[0116] Czas (godziny) od 108 CFU/ml, odpowiadające OD 0,2-0,3, do osiągnięcia OD 0,4 (średnia z 3 powtórzeń).
B. subtilis
żółć 4 mM
żółć 6mM
>20
>20
Tolerancja żółci (DSM 19467)
13 godz. 40 min.
15 godz.
Produkt handlowy: Calsporin
>20
>20
Istniejący produkt GalliPro® (DSM 17231)
[0117] Niektóre z danych z tego przykładu utworzono testując DSM 19489 nadwyrażające fitazę. Ale dla
technicznego wyniku z tego przykładu jest to tu stosunkowo nieistotne, ponieważ DSM 19467 ma germinację
i wzrost, w przybliżeniu, jak DSM 19489. W celu zapoznania się z dodatkowymi szczegółami, patrz
PCT/EP2008/057296.
Wniosek
®
[0118] DSM 19467 jest szczepem opornym na żółć i kiełkuje i wzrasta wyraźnie szybciej niż GalliPro .
PRZYKŁAD 4: Selekcja nadprodukujących aminokwas komórek Bacillus z DSM 19467
[0119] Wyjściową komórką Bacillus była komórka Bacillus subtilis DSM 19467, wyselekcjonowana w przykładzie 3.
[0120] DSM 19467, typu dzikiego lub mutanty wytworzone np. przez mutagenezę UV, hodowano na agarze
z pożyką z minimalnymi solami, opisanym w przykładzie 2B, powyżej i dodawano 1,5% agaru zawierającego
analogi aminokwasów w odpowiednich, hamujących ilościach. W zależności od aminokwasu mającego być
14
EP 2 379 704 B1
nadwyrażanym, stosować można różne analogi aminokwasów, np. norwalinę lub 4-azo-DL-leucynę do nadprodukcji leucyny (Bardos, 1974, Topics in Current Chemistry 52, 63-98). Kolonie oporne na analog aminokwasu pobierano, hodowano w pożywce z minimalnymi solami i badano pod kątem wytwarzania aminokwasu. Komórki wegetatywne selekcjonowano pod kątem wytwarzania dużej ilości aminokwasu, stosując sposób GC-MS, opisany w przykładzie 2B, powyżej.
Wybrano komórki Bacillus subtilis wytwarzające dużo aminokwasu.
Wyniki pomiarów aminokwasów
[0121] Wybrano liczne szczepy wytwarzające niezbędny aminokwas, leucynę w ilości, która była znacząco
wyższa niż referencyjnej komórki Bacillus, DSM 19467.
[0122] Liczne wybrane szczepy wytwarzały co najmniej 5 razy więcej leucyny niż DSM 19467.
Wnioski
[0123] Przykład ten pokazuje, że można rutynowo - opierając się na niniejszych instrukcjach - badać przesiewowo i identyfikować szczep, który wytwarza co najmniej jeden niezbędny aminokwas (niniejszym zilustrowany przykładowo przez leucynę) w ilości, która jest znacząco większa niż referencyjnej komórki Bacillus
DSM 19467.
[0124] DSM 19467 pochodzi z GalliPro® i nie jest wybrany pod kątem dużej produkcji niezbędnego aminokwasu. Odpowiednio uważa się, że GalliPro® wytwarza w przybliżeniu taką samą ilość niezbędnego aminokwasu jak DSM 19467.
PRZYKŁAD 5: "Sprawdzanie" komórek Bacillus wytwarzających dużo niezbędnego aminokwasu pod kątem
oporności na żółć
[0125] Korzystne komórki Bacillus, wytwarzające dużo niezbędnego aminokwasu, wybrane w przykładzie 4,
sprawdza się ponownie pod kątem ich zdolności do szybkiej germinacji i wzrostu od przetrwalnika do komórek wegetatywnych, jak opisano w przykładzie 1.
[0126] Wyniki są takie, że - jak oczekiwano - utrzymują one w przybliżeniu taką samą szybką germinację i
wzrost, jak wyjściowa komórka DSM 19467, zastosowana do ich uzyskania.
ODNIESIENIA
[0127]
1. Antonie Van Leeuwenhoek. sierpień 2006; 90(2):139-46. pub. elektron. 4 czerwca 2006
2. US2003/0124104A
3. US6255098
4. PCT/EP2008/057296
Zastrzeżenia patentowe
1.Kompozycja Bacillus, która zawiera od 105 do 1012 CFU/g komórek przetrwalnikowych Bacillus,
znamienna tym, że:
(i): przetrwalniki Bacillus mają szybką germinację i wzrost od przetrwalnika do komórki wegetatywnej w obecności pożywki z solą żółciową zawierającej 4 mM soli żółciowych, i w obecności
pożywki z solą żółciową zawierającej 6 mM soli żółciowych, określonej przez to, że przetrwalniki
Bacillus osiągają punkt wzrostu komórki wegetatywnej, wynoszący 0,4 OD630, w czasie mniejszym niż 18 i 19 godzin, odpowiednio, przy czym punkt wzrostu komórki wegetatywnej jest
15
EP 2 379 704 B1
punktem na krzywej wzrostu, w którym wartość OD zaczyna wzrastać (ze względu na wzrost
komórek wegetatywnych) w sposób ciągły i osiąga OD 630 wynoszące 0,4;
(I): przy czym pożywka z solą żółciową jest nieselektywną pożywką z bulionem infuzyjnym cielęcym (VIB), wzbogaconą mieszaniną soli żółciowej, zawierającą skoniugowane
sole żółciowe stanowiące taurodeoksycholan i glikodeoksycholan i dekoniugowaną sól
żółciową – deoksycholan, w proporcjach 60% taurodeoksycholanu, 30% glikodeoksycholanu i 10% deoksycholanu; oraz
a analizę oznaczenia OD prowadzi się stosując następujące etapy:
(a): wypełnianie studzienki płytki do mikromiareczkowania 0,150 ml pożywki z solą
żółciową, mającej 108 przetrwalników Bacillus na ml pożywki (tj. jest to czas zero); i
(b): inkubowanie płytki w 37°C w warunkach atmosferycznych i mierzenie wartości
OD630, z zastosowaniem spektrofotometru, i z wstrząsaniem przed każdym odczytem w celu uzyskania reprezentatywnej krzywej wzrostu w czasie;
i
(ii) komórki wegetatywne Bacillus wytwarzają co najmniej jeden niezbędny aminokwas w ilości,
która jest co najmniej 2 razy większa niż referencyjnej komórki Bacillus DSM 19467, przy czym
wytwarzana ilość niezbędnego aminokwasu mierzona jest w supernatancie za pomocą standardowego oznaczenia aminokwasów, opartego na sposobie GC-MS dla próbek wodnych, z
zastosowaniem chloromrówczanu metylu jako środka derywatyzującego, po dwóch dniach
wzrostu komórek Bacillus w 37°C i przy 150 rpm, inkubowanych w probówkach z 10 ml pożywki
w postaci pożywki wzrostowej z minimalnymi solami o następującym składzie:
(NH4)2SO4 (Merck 1.01217.1000)
1 g/l
K2HPO4 (Merck 1.05101.1000)
7 g/l
KH2PO4 (Merck 1.04873.1000)
3 g/l
MgSO4·7H2O (Merck 1.05886.1000)
0,1 g/l
którą autoklawowano przez 15 min. w 121°C i dodawano autoklawowaną glukozę do końcowego stężenia 0,5%.
2. Kompozycja Bacillus według zastrzeżenia 1, w której komórki przetrwalnikowe Bacillus z kompozycji obecne są jako wysuszone (np. wysuszone rozpyłowo) komórki przetrwalnikowe.
3. Kompozycja Bacillus według zastrzeżenia 1 albo 2, w której komórką Bacillus jest komórka B. subtilis.
4. Kompozycja Bacillus według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, w której przetrwalniki Bacillus
osiągają punkt wzrostu komórki wegetatywnej co najmniej 3 godziny wcześniej niż referencyjne komórki przetrwalnikowe Bacillus subtilis, zdeponowane jako DSM 17231, dla których czas ten w warunkach z punktu (i) z zastrzeżenia 1 wynosi co najmniej 20 godzin po inkubacji.
5. Kompozycja Bacillus według któregokolwiek z zastrzeżenia od 1 do 4, w której niezbędnym aminokwasem jest niezbędny aminokwas wybierany z grupy składającej się z: fenyloalaniny, waliny, treoniny, tryptofanu, izoleucyny, metioniny, leucyny, lizyny, cysteiny, tyrozyny, histydyny i argininy.
6. Kompozycja Bacillus według zastrzeżenia 5, w której niezbędnym aminokwasem jest co najmniej
jeden niezbędny aminokwas, wybierany z grupy składającej się z: waliny, izoleucyny i leucyny.
7. Kompozycja Bacillus według zastrzeżenia 6, w której niezbędnym aminokwasem jest leucyna.
16
EP 2 379 704 B1
8. Kompozycja Bacillus według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 7, w której wegetatywne komórki
Bacillus wytwarzają co najmniej jeden niezbędny aminokwas w ilości co najmniej 4 razy większej niż
referencyjna komórka Bacillus DSM 19467 w warunkach z punktu (ii) z zastrz.1.
9. Sposób karmienia zwierząt, obejmujący podawanie kompozycji Bacillus według któregokolwiek z
zastrzeżeń 1 do 8 zwierzęciu w połączeniu z innymi składnikami paszy zwierzęcej.
10. Sposób karmienia zwierząt według zastrzeżenia 9, w którym zwierzęciem jest zwierzę wybrane z
grupy składającej się z drobiu, przeżuwaczy, cieląt, świń, królików, koni, ryb i zwierząt domowych.
11. Sposób badania przesiewowego i izolowania nowej komórki Bacillus, obejmujący następujące
etapy:
(a): selekcjonowanie i izolowanie z puli pojedynczych komórek przetrwalnikowych Bacillus nowej komórki przetrwalnikowej Bacillus, która zdolna jest do kiełkowania i wzrostu tak szybko, że
osiąga ona punkt wzrostu komórki wegetatywnej w ciągu mniej niż 18 i 19 godzin, w warunkach
z punktu (i) z zastrzeżenia 1;
(b): wytwarzanie wegetatywnej komórki Bacillus z wyizolowanej komórki przetrwalnikowej z etapu (a) i mutowanie nowej, wyselekcjonowanej i wyizolowanej komórki w celu uzyskania puli nowych, pojedynczych, wegetatywnych komórek Bacillus;
(c): selekcjonowanie i izolowanie z puli nowych pojedynczych wegetatywnych komórek Bacillus
z etapu (b) nowej wegetatywnej komórki Bacillus, która jest zdolna do wytwarzania co najmniej
jednego niezbędnego aminokwasu w ilości większej niż referencyjna komórka Bacillus DSM
19467 w warunkach z punktu (ii) z zastrzeżenia 1; oraz
(d): analizowanie wysokoproduktywnej, wegetatywnej komórki Bacillus z etapu (c) w celu potwierdzenia, że utrzymała ona szybką germinację i wzrost z etapu (a) oraz izolowanie wyselekcjonowanej komórki Bacillus.
12. Sposób badania przesiewowego i izolowania nowej komórki Bacillus według zastrzeżenia 11, w
którym komórką Bacillus jest komórka B. subtilis.
17
EP 2 379 704 B1
Figura 1: Szczepy B.subtilis
1) Selekcja odporności na żółć
na szybko kiełkujących/wzrastających
2) Mutageneza
niezbędnych aa
Klasyczna
18
EP 2 379 704 B1
Figura 2A i 2B
Krzywe wzrostu w 4mM solach żółciowych
Czas (min.) od inokulacji
Krzywe wzrostu w 6mM solach żółciowych
Czas (min.) od inokulacji
Figura 2A (4mM) i 2B (6mM). Czas (min.) od 108 przetrwalników/ml do osiągnięcia 0,4 OD630
19
EP 2 379 704 B1
ODNIESIENIA CYTOWANE W OPISIE
Lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma jedynie służyć wygodzie czytelnika. Nie stanowi ona
części europejskiego dokumentu patentowego. Mimo że wyboru odnośników dokonano z wielką starannością, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń, a EUP nie bierze żadnej odpowiedzialności w tym względzie.
Dokumenty patentowe cytowane w opisie
Literatura niepatentowa cytowana w opisie
20