Trójwymiarowe obrazowanie komórek metodą mikroskopii konfokalnej

Trójwymiarowe obrazowanie komórek
metodą mikroskopii konfokalnej
Mirosław Zarębski
Praktikum z Biologii Komórki
(BT 231)
Mikroskop konfokalny, który jest typem mikroskopu świetlnego (fluorescencyjnego),
umożliwia rejestrowanie fluorescencji pochodzącej jedynie z wybranej płaszczyzny preparatu.
Pozwala to na zwiększenie rozdzielczości w płaszczyźnie prostopadłej do osi optycznej
mikroskopu, co powoduje polepszenie stosunku sygnału do szumów, a w efekcie daje obraz lepszej
jakości, oraz umożliwia dokonanie rekonstrukcji trójwymiarowych obrazów preparatu. Na rycinie
poniżej przedstawiono uproszczony schemat biegu promieni światła w mikroskopie konfokalnym.
Uproszczony schemat biegu promieni świetlnych w skaningowym mikroskopie konfokalnym.
Źródło światła (Z) jest punktowe. Światło odbija się od lustra dichroicznego (ZD) i jest skupiane w punkcie P próbki przez układ optyczny
mikroskopu (OB). Światło wzbudzające oświetla w obrębie próbki obszar o kształcie klepsydry, o najwęższym przekroju w płaszczyźnie
konfokalnej. W wyniku wzbudzenia światło emitowane jest przez fluorofory na całym oświetlonym obszarze (we wszystkich kierunkach
jednocześnie), a zatem do detektora dociera światło nie tylko z punktu P, ale i z pobliskich mu P’ i P’’ znajdujących się w oświetlonej
objętości. Dzięki przesłonie konfokalnej (A) zostaje odcięte światło z płaszczyzn innych niż ta, do której należy punkt P i detektor
rejestruje tylko sygnał pochodzący z tej płaszczyzny. W zależności od średnicy otworu w przesłonie konfokalnej obszar, z którego
światło jest rejestrowane, może mieć różną grubość. Zarówno źródło światła, jak i oświetlany punkt w preparacie
(P) leżą w
ogniskowych obiektywu, co dało początek nazwie „mikroskop konfokalny” (współogniskowy) [Dobrucki 1996].
W skaningowej mikroskopii konfokalnej jako źródło światła wykorzystywany jest
zazwyczaj laser. Wiązka światła oświetla próbkę punkt po punkcie, a intensywność fluorescencji
pochodzącej ze wzbudzanych punktów jest mierzona przez fotopowielacz i rejestrowana przez
komputer. Czas życia fluorescencji jest wielokrotnie krótszy niż czas konieczny na przesunięcie
wiązki i oświetlenie kolejnego punktu. Z tego powodu intensywność fluorescencji pochodzącej z
każdego punku jest rejestrowana osobno, dzięki czemu udaje się znacznie polepszyć jakość obrazu.
Dzieje się tak dlatego, iż rozproszenie oraz odbicia światła pochodzące z sąsiednich struktur są o
wiele mniejsze, niż przy jednoczesnym oświetleniu dużego obszaru próbki.
Cel ćwiczenia:
Część teoretyczna ćwiczenia ma na celu zapoznanie studentów z podstawami teoretycznymi
techniki rejestracji obrazów żywych i utrwalonych komórek przy pomocy mikroskopii konfokalnej,
oraz z rodzajami barwników które są wykorzystywane w mikroskopii fluorescencyjnej i
konfokalnej.
W części praktycznej studenci mają dokonać obserwacji obrazu komórki żywej i utrwalonej,
wybarwionej przy pomocy barwnika fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
szerokiego pola i mikroskopii konfokalnej. Następnie dokonać rejestracji serii przekrojów
optycznych płytki metafazowej, trójwymiarowej rekonstrukcji takiej płytki i postarać się
uwidocznić jej powierzchnię.
Materiały:
–
–
–
–
–
komórki HeLa 21-4 wysiane na 2 szkiełka
komórki HeLa z histonem H2B połączonym z GFP wysiane na 2 szkiełka
białe medium DMEM/F-12 przystosowane do atmosferycznego poziomu dwutlenku węgla
roztwór oranżu akrydyny 1mg/ml
roztwór TMRE
Przebieg ćwiczenia (część czynności będzie wykonywał prowadzący, ze względu na ograniczenia
sprzętowe):
1. Czynności wstępne, przygotowanie układu:
a) uruchomienie mikroskopu konfokalnego, lasera argonowego i mikroinkubatora i lampy
fluorescencyjnej
b) przygotowanie próbki:
• umieszczenie szkiełka podstawowego z komórkami HeLa w demontowalnej
komorze, uszczelnienie jej, dodanie białej pożywki
c) umieszczenie próbki w mikroinkubatorze, ustawienie ostrości
d) na podstawie widma fluorescencji i absorpcji AO ustalenie optymalnego dla obserwacji
układu bloków filtrowych i poszczególnych filtrów dla każdego z używanych
fotopowielaczy.
2. Obserwacja obrazów żywych komórek wybarwionych AO
a) dodanie AO do żywych komórek do finalnego stężenia 8 ug/ml.
b) Obserwacja pod lampą fluorescencyjną obrazu komórek
c) Ustawienie optymalnych warunków obrazowania mikroskopu konfokalnego
• zakresu dynamicznego fotopowielaczy
• mocy lasera wzbudzającego
• rozdzielczości i rozmiaru piksela rejestrowanego obrazu
• opcjonalnie wykorzystanie makr akumulacji lub filtru uśredniającego Kalman.
d) Rejestracja obrazu komórek wybarwionych oranżem akrydyny w optymalnych
warunkach
e) porównanie tego obrazu z obrazem widzianym przy pomocy mikroskopu szerokiego
pola
3. Obserwacja obrazów utrwalonych komórek wybarwionych AO
a) odciągnięcie roztworu AO i utrwalenie komórek za pomocą 70% etanolu (-20 st C)
przez 30 sekund
b) ponowne dodanie roztworu AO
c) - e) jw z uwzględnieniem różnic barwienia wynikających z powinowactwa AO do DNA
4. Rejestracja serii przekrojów optycznych
a) znalezienie na szkiełku komórki w fazie mitozy, nadającej się do rejestracji obrazu
trójwymiarowego
b) ustawienie parametrów potrzebnych do rejestracji takiego obrazu
• parametry zbierania pojedynczej płaszczyzny
• skok przesuwu obiektywu
• rozdzielczość
c) rejestracja serii przekrojów optycznych
d) powtórzenie powyższych czynności na komórkach HeLa z histonem H2B-GFP
5. Rekonstrukcja obrazów trójwymiarowych
a) dobranie parametrów wykonania pojedynczego rzutu (sumy wszystkich przekrojów) i
utworzenie takiego obrazu dla obu zarejestrowanych serii przekrojów
b) dobranie parametrów utworzenia serii przekrojów (bryły obrotowej) dla obu
zarejestrowanych serii przekrojów
• wypróbowanie rożnych typów tworzenia rzutów (maksimum, minimum, średnia,
najbliższy punkt spełniający narzucony warunek)
• uzyskanie filmu prezentującego bryłę obrotową i złożenie kolorowego obrazu
c) wykonanie powyższych czynności wykorzystując technikę two-pass w celu uzyskania
nieprzeźroczystej bryły obrotowej – uwidocznienie powierzchni chromosomów
*Poniższy punkt jest opcjonalny
6. Rejestracja filmu poklatkowego przedstawiającego ruch mitochondriów wybarwionych za
pomocą TMRE
Zakres Materiału: Podstawy mikroskopii optycznej, fluorescencyjnej i konfokalnej
Literatura:
– Dobrucki J. Skaningowa, fluorescencyjna mikroskopia konfokalna. Mikrobiologia
Medycyna 1996, 1(6) 34-38 ( http://db.tt/qDjGy6K )
– Handbook of Biological Confocal Microscopy James Pawley (Editor) dowolne wydanie
– http://www.microscopyu.com/articles/confocal/index.html
– http://www.olympusfluoview.com/theory/index.html
– http://www2.olympus.pl/microscopy/4427_7436.htm
Tytuły referatu:
1. Sposób tworzenia obrazu w mikroskopie konfokalnym
2. Barwniki wykorzystywane w mikroskopii fluorescencyjnej