Markery epigenetyczne w diagnostyce: Metody oceny metylacji DNA

Markery epigenetyczne w diagnostyce: Metody oceny metylacji DNA

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2009 • Volume 45 • Number 2 • 167-173
Praca poglądowa • Review Article
Markery epigenetyczne w diagnostyce: Metody oceny
metylacji DNA
Aleksandra Majchrzak, Wanda Baer-Dubowska
Katedra Biochemii Farmaceutycznej Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Streszczenie
Mechanizmy epigenetyczne odgrywają kluczową rolę w prawidłowym rozwoju, starzeniu się i patogenezie wielu chorób. Wykazano, że zmieniona metylacja DNA jest zjawiskiem dosyć powszechnym w przypadku wielu schorzeń, w tym nowotworów.
Metylacja cytozyny w pozycji 5’ w obrębie wysp CpG nie ma wpływu na sekwencję DNA jako taką, ale ma istotne znaczenie
dla regulacji ekspresji genu. Zmieniona metylacja może więc być potencjalnym markerem diagnostycznym. Stało się to przyczyną opracowania wielu technik do oceny metylacji DNA od poziomu genomu do pojedynczych wysp CpG. Ograniczenia każdej z tych technik utrudniają w dużym stopniu interpretację uzyskanych danych. W niniejszym artykule przedstawiono niektóre
z aktualnie dostępnych metod oceny metylacji DNA i perspektywę ich zastosowania w laboratorium diagnostycznym.
Epigenetic markers in diagnostics: Methods of DNA methylation analysis
Summary
Epigenetic mechanisms play important roles during normal development, aging and a variety of disease conditions. Numerous studies have implicated aberrant methylation in the etiology of common human disease, including cancer. Methylation
of the 5’ carbon of cytosine is a form of epigenetic modification that does not affect the primary DNA sequence, but affects
secondary interactions that play a critical role in the regulation of gene expression. The possibility of using DNA methylation
as a marker for disease has created a strong need for methods to detect and measure DNA methylation. Different techniques
provide information on DNA methylation at different levels from genome-wide methylation to single CpG island methylation in
specific gene. The limitations of individual techniques strongly affect interpretation of data. This review describes the principle
of selected DNA methylation techniques currently in use and perspective of their application to laboratory diagnostics.
Słowa kluczowe:epigenetyka, metylacja DNA, MSP, pirosekwencjonowanie, MS-MLPA, metylom, mikromacierze
Key words:epigenom, DNA methylation, pyrosequencing, MSP, MS-MLPA, methylome, microarray
Wprowadzenie
Badania ostatnich lat dostarczyły przekonujących dowodów,
że obok zmian genetycznych w patogenezie wielu chorób
istotną rolę odgrywają także mechanizmy związane z epigenetyczną kontrolą ekspresji genów. Epigenetyczna kontrola
transkrypcji związana jest z metylacją DNA i kowalencyjnymi
modyfikacjami histonów, obejmującymi przede wszystkim
ich acetylację i metylację. Ocenia się, że 5-metylocytozyna
stanowi ok 1% genomu człowieka i w przeciwieństwie do
pozostałych czterech zasad nie występuje w stanie wolnym.
Rozmieszczenie 5-metylocytozyny w genomie nie jest przypadkowe. Zasadniczo tylko cytozyny poprzedzające guaniny,
czyli w tzw. wyspach CpG, mogą być metylowane. Metylacja
jest uważana za dominującą modyfikację „epigenetyczną”
DNA w genomie ssaków. Termin ten określa sytuację, w któ-
rej metylacja może modyfikować informację zawartą w DNA
bez zmiany sekwencji nukleotydów. Metylacja nie zmienia
struktury i funkcji genów, ale dostarcza informacji gdzie
i kiedy gen ulegnie ekspresji [4]. W procesie nowotworzenia
zmiany epigenetyczne zachodzą już na najwcześniejszych
jego etapach. W komórkach nowotworowych/rakowych obserwuje się obniżenie poziomu metylacji wszystkich cytozyn
(genomowa hipometylacja), której towarzyszy hipermetylacja lokalnych wysp CpG. Genomowa hipometylacja może
prowadzić zarówno do ogólnej niestabilności genomu, jak
i hipometylacji protoonkogenów, czego skutkiem jest ich
zwiększona ekspresja/aktywacja. Z drugiej strony metylacja
w obrębie wysp CpG promotorów genów supresorowych
indukuje ich funkcjonalne wyciszenie naśladujące mutację
genetyczną [7, 12].
167
Markery epigenetyczne w diagnostyce: Metody oceny metylacji DNA
Kluczowa rola metylacji w utrzymaniu funkcji komórek
i stwierdzenie, że zmiany profilu metylacji DNA mogą mieć
szerokie implikacje dla zdrowia człowieka stworzyły potrzebę opracowania technik umożliwiających detekcję i pomiar
metylacji w DNA pochodzącym z różnych źródeł. Dotyczy to
zarówno całego genomu, jak i pojedynczych genów.
Metylacja DNA jest chemicznie stosunkowo stabilna, a źródłem DNA do oceny może być nie tylko materiał operacyjny,
czy pochodzący z biopsji, ale także ślina, plwocina, popłuczyny oskrzelowe, a także osocze, ponieważ u pacjentów
z nowotworami obserwuje się podwyższony poziom krążącego DNA pochodzącego prawdopodobnie z apoptotycznych i nekrotycznych komórek rakowych.
Celem tego artykułu jest omówienie i krytyczna ocena niektórych aktualnie dostępnych metod analizy metylacji DNA
i perspektywy ich wykorzystania w laboratorium diagnostycznym.
Badanie całkowitej metylacji genomowego DNA
Całkowitą metylację genomu ocenia się zwykle poprzez
określenie stosunku 5-metylocytozyny do cytozyny w analizowanej próbce DNA. Najdłużej do tych celów jest wykorzystywana wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)
[4, 9], w której przeprowadza się rozdział deoksyrybonukleotydów uzyskanych w wyniku enzymatycznej hydrolizy
DNA, a 5-metylocytozynę identyfikuje się za pomocą zewnętrznych standardów. Prostszą i szybszą metodą analizy
zawartości 5-metylocytozyn w hydrolizatach DNA jest zastosowana w tym celu po raz pierwszy w 2002 roku wysokosprawna elektroforeza kapilarna (HPCE). Czułość obydwu
metod można zwiększyć przez połączenie obydwu technik
ze spektrometrią masową [5]. W laboratoriach nie posiadających odpowiedniego wyposażenia alternatywą dla HPLC
i HPCE może być chromatografia cienkowarstwowa (TLC)
po zastosowaniu enzymu restrykcyjnego MspI rozpoznającego miejsca CCGG i znakowania fosforem 32P [17].
Innym sposobem na uzyskanie informacji o genomowym
poziomie metylacji jest użycie bakteryjnej metylotransferazy SssI, która w obecności znakowanej trytem[3H]
S-adenozylometioniny (SAM) metyluje wszystkie niezmetylowane cytozyny. Następnie dokonuje się pomiaru radioaktywności pochodzącej od wyznakowanych cytozyn, co
umożliwia ocenę niezmetylowanych wysp CpG w całej puli
DNA [10]. Problemem w tej metodzie jest jednak stosunkowo duża niestabilność tak SAM, jak i metylotransferazy
SssI.
Ocena metylacji na poziomie genu
Ocena metylacji całego genomu może dostarczyć wstępnej informacji na temat zmian epigenetycznych związanych
z metylacją cytozyn w wyspach CpG. Do ostatecznej diagnozy konieczna jest jednak ocena metylacji promotorów
specyficznych genów lub ich panelu. W ostatnich latach
wraz z rozwojem technik mikromacierzy możliwa stała się
analiza metylomu.
168
Badanie stopnia metylacji poszczególnych genów wymaga amplifikacji sekwencji docelowej. Ponieważ polimerazy DNA stosowane w reakcji polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) nie odróżniają cytozyny od metylocytozyny,
bezpośrednia amplifikacja nie jest możliwa. Konieczne jest
więc zastosowanie enzymów restrykcyjnych, specyficznych
względem zmetylowanych cytozyn (MSRE) lub związków
chemicznych przekształcających niezmetylowane cytozyny
np. wodorosiarczanu IV (HSO3), hydrazyny (N2H4) lub nadmanganianu (MnO4) w pochodne umożliwiające ich rozróżnienie.
Zastosowanie metylospecyficznych restryktaz, jak np. HpaII,
powoduje hydrolizę niezmetylowanych sekwencji i uniemożliwia ich amplifikację w reakcji PCR, podczas gdy sekwencje
zmetylowane mogą ulec powieleniu. Aby reakcja była wiarygodna i nie dawała fałszywie pozytywnych wyników, warunki
reakcji muszą być tak dobrane, by wszystkie niezmetylowane sekwencje uległy degradacji. Użycie metylospecyficznych enzymów restrykcyjnych jest celowe jedynie wtedy, gdy
spodziewać się można dużego udziału zmetylowanych alleli
w badanym DNA. Z tego też względu restryktazy mogą być
przydatne np. w ocenie metylacji na wyciszonym chromosomie X, a już w mniejszym stopniu przy badaniu hipermetylacji promotorów genów supresorowych, w których zawartość
zmetylowanych sekwencji jest zwykle mniejsza [19].
Reakcja z użyciem wodorosiarczanu IV sodu, należąca do
najczęściej stosowanych, polega na konwersji niezmetylowanych cytozyn do uracylu, podczas gdy zmetylowana
cytozyna pozostaje w tej reakcji niezmieniona. Zastosowanie wodorosiarczanu IV ma przewagę nad zastosowaniem
restryktaz, gdyż pozwala na konwersję dowolnej sekwencji DNA, podczas gdy restryktazy rozpoznają i trawią tylko
konkretne sekwencje nukleotydowe. Warunkiem uzyskania
wiarygodnych wyników jest konwersja wszystkich wysp CpG
w DNA, co nie zawsze jest osiągane. Ponadto w trakcie reakcji DNA może ulec częściowej degradacji.
Inną możliwością wzbogacenia frakcji DNA w zmetylowane
sekwencje jest immunoprecypitacja z zastosowaniem specyficznego wobec 5-metylocytozyny przeciwciała (MeDIP)
lub wykorzystaniem białek z domeną wiążącą grupę metylową [6].
Metylo-specyficzny PCR- MSP
MSP jest obecnie najczęściej stosowaną techniką służącą
do badania stanu metylacji. Metoda ta jest szybka, tania,
a jej wykonanie jest stosunkowo proste. Reakcję polimerazową poprzedza konwersja niezmetylowanych cytozyn do
uracylu, przy użyciu wodorosiarczanu IV sodu, co przedstawione jest na rycinie 1. Następnie przeprowadza się reakcję
PCR przy pomocy dwóch par starterów, odpowiednio dla sekwencji zmetylowanych i niezmetylowanych (ryc. 2). Po amplifikacji sekwencji docelowych przeprowadza się ich analizę
na drodze elektroforezy na żelu agarozowym zawierającym
bromek etydyny, który interkalując z DNA, pozwala na ich
uwidocznienie w świetle UV. Jak i w innych metodach, rów-
A. Majchrzak i W. Baer-Dubowska
nież w MSP, uzyskane wyniki porównuje się z DNA całkowicie zmetylowanym (kontrola pozytywna) oraz DNA niezmetylowanym (kontrola negatywna). Interpretacja wyników jest
dość prosta, umożliwia jednak jedynie ocenę jakościową.
W ostatnich latach pojawiła się możliwość zastąpienia do
tych celów „klasycznej” polimerazowej reakcji łańcuchowej
techniką PCR w czasie rzeczywistym (R-T PCR), co pozwala na ocenę ilościową (Q-MSP) [3].
Rycina 1
Modyfikacja DNA przy pomocy wodorosiarczanu IV
sodu.
Reakcja z wodorosiarczanem IV sodu polega na oksydatywnej deaminacji niezmetylowanych cytozyn, w konsekwencji czego w miejsce cytozyn powstają cząsteczki uracylu. Cytozyny zmetylowane
nie ulegają reakcji z NaHSO3, w związku z czym pozostają po tej
reakcji niezmienione. Tak zmodyfikowane DNA może być następnie
poddane dalszej analizie przy pomocy MSP czy pirosekwencjonowania.
Pirosekwencjonowanie
Analiza sekwencji produktów PCR otrzymanych z DNA poddanego reakcji konwersji z udziałem wodorosiarczanu IV
jest uważana za ostateczny cel oceny genowo-specyficznej
metylacji. W ostatnich latach coraz częściej do tego celu
wykorzystuje się pirosekwencjonowanie. Pirosekwencjonowanie jest metodą sekwencjonowania w czasie rzeczywistym, co oznacza, że pozwala na uzyskanie wyników nie
tylko jakościowych, ale także ilościowych (procentowy udział
poszczególnych wariantów sekwencji). W metodzie wykorzystuje się jednoczesne działanie czterech enzymów – polimerazy DNA, sulfurylazy, lucyferazy i apirazy. Główną zasadą metody jest wykorzystanie pirofosforanu uwalnianego
podczas syntezy DNA. Proces jest wydajny (podczas jednej
analizy możliwa jest ocena 96 próbek), a wyniki uzyskiwane
są w krótkim czasie (czas analizy 96 próbek to ok.10 min).
Analiza jest w dużym stopniu zautomatyzowana [2, 15], co
można jednocześnie ocenić jako ograniczenie, bo wymaga
specjalistycznego sprzętu.
Metylo-specyficzna amplifikacja multiplex zależna od ligacji
sond molekularnych – MS-MLPA
Amplifikacja multipleks zależna od ligacji sond molekularnych
Rycina 2
Przebieg reakcji MSP.
Metylo-specyficzny PCR, zwany również MSP, polega na amplifikacji DNA w dwóch równoległych reakcjach, które różnią się rodzajem zastosowanych primerów, tj. w jednej reakcji używany jest primer dla sekwencji zmetylowanej, w drugiej dla sekwencji niezmetylowanej. Produkt
amplifikacji uwidaczniany jest na żelu agarozowym, zawierającym bromek etydyny.
169
Markery epigenetyczne w diagnostyce: Metody oceny metylacji DNA
(MLPA, ang. Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification) jest techniką opisaną po raz pierwszy w 2002 roku,
a MS-MLPA jest jej metylo-specyficzną odmianą. Do analizy 45 różnych sekwencji docelowych potrzebne jest jedynie
20 ng DNA, wyekstrahowanego z krwi, guza, płynu owodniowego lub innego materiału biologicznego. Jest to oparta na
reakcji PCR metoda polegająca na amplifikacji sond kom-
plementarnych do odpowiednich sekwencji docelowych. Zestaw sond pozwala na wykrycie 45 różnych sekwencji. Schemat analizy przedstawiono na rycinie 3. Reakcja MS-MLPA
rozpoczyna się od denaturacji genomowego DNA, po czym
do jednoniciowego DNA dodawany jest zestaw sond molekularnych. Każda sonda składa się z dwóch fragmentów. Po
odszukaniu przez poszczególne sondy komplementarnych
Rycina 3
Analiza metylacji przy pomocy MS-MLPA.
Odpowiednio zaprojektowane sondy oligonukleotydowe wykrywają i hybrydyzują z sekwencją docelową. Każda z sond składa się z dwóch
fragmentów, które są następnie łączone za pomocą ligazy. Na tym etapie analiza biegnie dwutorowo, tzn. połowa mieszaniny reakcyjnej poddawana jest działaniu ligazy, natomiast druga połowa ligazy i restryktazy. Enzym restrykcyjny użyty w doświadczeniu rozpoznaje sondy, które
zhybrydyzowały do niezmetylowanych sekwencji, i trawi je. Kolejno następująca reakcja PCR amplifikuje: wszystkie sondy (część I) i tylko te
sondy, które były przyłączone do sekwencji zmetylowanych (część II). Detekcja sond i porównanie produktów amlifikacji w obu mieszaninach
reakcyjnych daje ilościowy i jakościowy obraz metylacji w poszczególnych dinukleotydach CpG.
170
A. Majchrzak i W. Baer-Dubowska
sekwencji następuje hybrydyzacja. W kolejnym etapie mieszanina reakcyjna rozdzielana na dwie części: do pierwszej
dodawana jest ligaza, a do drugiej ligaza i enzym restrykcyjny (HhaI lub HhaII). Ligaza ma za zadanie połączyć
fragmenty sond w jedną całość, natomiast enzym restrykcyjny hydrolizuje sondy, które przyłączyły się do niezmetylowanych sekwencji. W trakcie następującej po tym etapie
reakcji PCR następuje amplifikacja wszystkich sond (część
I), bądź tylko tych, które przyłączyły się do zmetylowanych
dinukleotydów CpG (część II). Produkty PCR są rozdzielane
i identyfikowane na drodze elektroforezy kapilarnej. Opracowanie danych przy pomocy jednego z dostępnych programów komputerowych (np. Coffalyser) umożliwia ilościową
ocenę stopnia zmetylowania konkretnego dinukleotydu CpG
[8]. Zaletą tej techniki w odniesieniu do materiału operacyjnego jest możliwość wykorzystania DNA wyizolowanego nie
tylko z zamrożonej tkanki, ale także zatopionej w parafinie.
Ponadto MS-MLPA nie wymaga, w odróżnieniu od wielu innych, powszechnie stosowanych technik (MSP, pirosekwencjonowanie), przeprowadzenia reakcji z wodorosiarczanem
IV. Dodatkowym atutem tej metody jest możliwość jednoczesnej analizy wielu różnych dinukleotydów CpG, podczas
gdy większość alternatywnych metod dostarcza informację
tylko o jednym lub kilku wybranych dinukleotydach CpG. Zaletą MS-MLPA jest jej stosunkowo niski koszt (ok. 4000 zł
za jeden zestaw umożliwiający badanie 100 próbek DNA).
Laboratoria, które nie dysponują aparatem do elektroforezy
kapilarnej mogą dokonać rozdziału sond metodą elektroforezy żelowej; dotyczy to jednak wybranych, specjalnie przygotowanych zestawów zawierających tylko 10-14 sond.
Aktualnie MRC-Holland, firma, która opracowała MLPA, oferuje ponad 200 różnych zestawów do badań genetycznych
i epigenetycznych. Są wśród nich zestawy do badania niewielkich rearanżacji w genach, takich jak BRCA1, BRCA2,
MSH2, SMA czy DMD, jak również dużych chromosomowych aberracji, np. w zespole Cri du Chat czy syndromie
DiGeorge. Istnieją również zestawy do wykrywania poliploidii autosomów: 13, 18, 21 oraz chromosomów płciowych.
Diagnostyka nowotworowa obejmuje mutacje charakterystyczne dla takich schorzeń jak skąpodrzewiak, czerniak
czy nowotwory głowy i szyi. Zestawy do MS-MLPA obejmują
badanie stopnia metylacji różnych genów supersorowych
oraz genów naprawczych, np MGMT, MSH2, MLH1, MLH3
i innych [www.mlpa.com]. Warto również wspomnieć, że istnieje możliwość złożenia zamówienia na konkretny zestaw
sond przygotowany na indywidualne zamówienie. Do chwili
obecnej opublikowano ponad 100 doniesień naukowych potwierdzających wiarygodność tej metody [11, 13], co rokuje
jej coraz szersze wykorzystanie.
Badania własne autorów (dane niepublikowane) metylacji promotora metylotransferazy O6metyloguaniny w materiale operacyjnym u pacjentów z glejakiem wykazały, że
MS-MLPA jest metodą, która ma szansę być wykorzystana
w diagnostyce klinicznej. Wyniki uzyskane tą metodą były
zasadniczo porównywalne z uzyskanymi metodą MSP i pi-
rosekwencjonowania, ale w odróżnieniu od tej ostatniej były
łatwiejsze do uzyskania. Z drugiej strony badania te ujawniły,
że każda z tych technik ocenia inne wyspy CpG, co musi być
brane pod uwagę przy interpretacji wyników.
Mikromacierze – badanie metylomu
Odkąd w 1995 roku zespół naukowców ze Stanford University opublikował pracę zatytułowaną Quantitative monitoring
of gene expression patterns with a complementary DNA
microarray [16] technologia mikromacierzy rozwinęła się na
tyle, by znaleźć zastosowanie w badaniach nad ekspresją
genów, badaniach polimorfizmów pojedynczego nukleotydu
jak również w badaniach epigenetycznych. Istotą technologii produkcji mikromacierzy jest wykorzystanie możliwości
umieszczenia na błonach nylonowych albo silikonowych lub
szklanych płytkach bardzo wielu fragmentów oligonukleotydowych lub cDNA. Zestaw sond przytwierdzony jest do płytki
w ściśle określonej lokalizacji. Sondy te syntetyzowane są
najczęściej in situ (bezpośrednio na płytce), co zapewnia
wysoką gęstość mikromacierzy i umożliwia umieszczenie na
niewielkiej powierzchni nawet kilkudziesięciu tysięcy sond.
W mikromacierzach przeznaczonych do analizy metylomu
dla każdego dinukleotydu CpG tworzone są dwie sondy oligonukleotydowe – jedna specyficzna dla sekwencji zmetylowanej, druga – niezmetylowanej. Oligonukleotydy są tak
skonstruowane, aby były komplementarne do sekwencji
DNA po reakcji z wodorosiarczanem IV bądź fragmentów
uzyskanych w wyniku trawienia metylospecyficznymi enzymami restrykcyjnymi lub immunoprecypitacji.
Analizowany materiał po wyznakowaniu znacznikiem fluorescencyjnym hybrydyzuje z sondami mikromacierzy, a uzyskane sygnały są opracowane przy pomocy specjalistycznych programów bioinformatycznych [18].
Analiza metylomu możliwa jest dzięki zastosowaniu mikromacierzy oferowanych m.in przez firmy Panomics i Illumina.
Mikromacierze firmy Panomics (ryc. 4) wykorzystują enzymy
restrykcyjne do trawienia genomowego DNA w celu otrzymania fragmentów zawierających wyspy CpG. Do lepkich
końców otrzymanych w ten sposób fragmentów dołączane
są fragmenty DNA o znanej sekwencji zwane adaptorami.
W kolejnym etapie DNA inkubuje się z białkami wiążącymi grupę metylową np. MIRA [14] w wyniku czego tworzone są kompleksy zmetylowane DNA-białko. Po usunięciu białek w kolejnym etapie DNA znakuje się znacznikiem fluorescencyjnym
przy pomocy biotynylowanych dCTP w reakcji PCR, po czym
dokonuje się hybrydyzacji powstałych fragmentów z sondami
umieszczonymi na płytce mikromacierzowej. Nieco inna technologia oferowana jest przez firmę Illumina, która do badania
metylacji oferuje trzy różne rodzaje mikromacierzy, tj. Infinium
Methylation, Goldengate Methylation i Veracode Methylation.
We wszystkich DNA poddaje się reakcji z wodorosiarczanem
IV. Stopień metylacji poszczególnych wysp CpG, oceniany
jest jako stosunek sygnałów fluorescencyjnych pochodzących
od zmetylowanych cytozyn, do sumy sygnałów cytozyn zmetylowanych i niezmetylowanych po amplifikacji techniką PCR
171
Markery epigenetyczne w diagnostyce: Metody oceny metylacji DNA
Rycina 4.
Analiza metylacji techniką mikromacierzy.
Genomowe DNA jest trawione przy użyciu enzymów restrykcyjnych rozpoznających sekwencję TTAA. Frakcję wzbogaconą w zmetylowane
wyspy CpG uzyskuje się na drodze immunoprecypitacji z białkami MBD (methyl binding domains). Po oddzieleniu białek z kompleksu, DNA
hybrydyzuje z płytką mikromacierzową. Detekcja i analiza sygnałów od poszczególnych sond użytych do stworzenia mikromacierzy daje
informację o metylacji badanego DNA.
i hybrydyzacji do tzw. macierzy koralikowej (ang. bead array).
Waha się on w granicach od 0 (brak metylacji) do 1 (pełna metylacja). Zestaw Infinium Methylation umożliwia analizę ponad
27 000 wysp CpG rozlokowanych w obrębie całego genomu,
w 12 próbkach jednocześnie. Niewątpliwie imponująca ilość
analizowanych loci daje ogrom informacji o badanych próbkach, jednak analiza i interpretacja wyników nie należą do najłatwiejszych i wymagają zastosowania odpowiednich algorytmów do hierarchizacji danych. Zestaw Goldengate Methylation
pozwala na analizę ponad 1 500 wysp CpG, zlokalizowanych w
obrębie 807 genów, w tym onkogenów, genów supresorowych,
genów naprawczych, kontrolujących podziały komórkowe czy
apoptozę. Zasada, którą wykorzystuje Illumina Goldengate
172
oparta jest na ukierunkowanej amplifikacji wysp CpG metodą
PCR przy zastosowaniu starterów odróżniających uracyl od
5-metylocytozyn. Przy jej zastosowaniu możliwa jest ilościowa
ocena metylacji stanowiącej zaledwie 2,5% danej sekwencji
[1]. Możliwe jest również zamówienie mikromacierzy ze specjalnie dobranymi sondami. Z kolei zestaw Veracode umożliwia
analizę większej ilości próbek, ale dla mniejszej (od kilkudziesięciu do kilkuset) ilości wysp CpG.
Jak wszystkie mikromacierze, tak i te umożliwiające analizę
metylomu, są przede wszystkim narzędziem, które pozwala
wyselekcjonować geny, które z powodu zmienionej metylacji
mogą być przydatne jako epigenetyczne markery określonych procesów chorobowych.
A. Majchrzak i W. Baer-Dubowska
Perspektywy zastosowania analizy metylacji DNA w diagnostyce
Analiza metylacji DNA stała się ważnym narzędziem w badaniu molekularnego podłoża wielu chorób, szczególnie
nowotworów i zrozumienia tkankowo-specyficznej ekspresji
genów. Jednak uzyskanie wiarygodnych danych w odniesieniu do metylacji DNA nie jest zadaniem prostym. Wiąże
się to z jednej strony z heterogennością większości tkanek,
co sprawia, że trudno jest przypisać sygnał metylacji specyficznemu typowi komórek, z drugiej zaś z faktu, że żadna
z coraz szerszego zestawu metod nie spełnia wszystkich
kryteriów pozwalających na uzyskanie jednoznacznych danych na temat metylacji DNA.
Jakość i ilość wyjściowego DNA jest czynnikiem ograniczającym analizę. Większość metod wymaga >1 µg wysokiej
jakości DNA. Z tego powodu DNA pozyskiwany z bloków
parafinowych może dostarczyć raczej tylko ograniczonej
informacji. Należy też brać pod uwagę możliwość dalszej
degradacji DNA w trakcie najczęściej stosowanej reakcji
z wodorosiarczanem IV. W przypadku analizy metylacji pojedynczych genów należy też brać pod uwagę fakt, że różne
metody analizy oceniają rożne wyspy CpG, co może utrudniać interpretację uzyskanych danych. Co więcej widać coraz wyraźniej, że poszerzony panel markerów hipermetylacji
promotorów genów pozwala na bardziej wiarygodną ocenę
zmian genetycznych związanych z określoną jednostką chorobową. Przykładem może być analiza porównawcza kombinacji hipermetylowanych genów w ślinie i surowicy pacjentów z rakami głowy i szyi i osób zdrowych, która wykazała,
że analiza pojedynczych genów uniemożliwia prawidłową interpretację różnic obserwowanych w obydwu grupach m.in.
dlatego, że profil metylacji niektórych genów komórek prawidłowych i nowotworowych pokrywał się. Ponadto badania
te potwierdziły, że markery epigenetyczne mogą być wykrywane w tych płynach ustrojowych [3]. Wydaje się również,
że metylację DNA powinno się interpretować w kontekście
innych cech epigenetycznych, szczególnie transkrypcji, aby
lepiej ocenić skutki jej zakłócenia.
Obserwowany w tempie logarytmicznym wzrost nowych technologii pozwala mieć nadzieję, że w niedalekiej przyszłości
dostępne będą handlowe mikromacierze/ testy pozwalające
na kompleksową analizę markerów epigenetycznych po stosunkowo niskich kosztach. Zanim to jednak nastąpi, jak przy
każdej innej analizie, wybierając metodę do oceny metylacji,
trzeba wziąć pod uwagę typ, ilość i jakość analizowanego
materiału biologicznego, warunków laboratorium i posiadanego specjalistycznego wyposażenia.
Piśmiennictwo
1. Bibikova M, Lin Z, Zhou L i wsp. High-throughput DNA methylation profiling using bead arrays. Genome Res 2006; 16: 383293.
2. Broszkiewicz A, Szalata M, Bigos A i wsp. Analiza metylacji DNA
[w:] Analiza DNA teoria i praktyka. Red. R Słomski. Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu. Poznań 2008,
491-502.
3. Carvalho AL, Jeronimo C, Kim MM i wsp. Evaluation of promoter hypermethylation detection in body fluids as a screening/
diagnosis tool for head and neck squamous cell carcinoma. Clin
Cancer Res 2008; 14: 97-107.
4. Dahl C, Guldberg P. DNA metylation analysis techniques. Biogerontology 2003; 4: 233-250.
5. del Gaudio R, Di Giaimo R, Geraci G i wsp. Genome methylation of the marine annelid worm Chaetopterus variopedatus:
methylation of a CpG in an expressed H1 histone gene. FEBS
Lett 1997; 417: 48-52.
6. Down TA, Rakyan VK, Turner DJ i wsp. A bayesian deconvolution strategy for immunoprecipitation-based DNA methylome
analysis. Nature Biotech 2008; 26: 779-785.
7. Gargiulo G, Minucci S. Epigenomic profiling of cancer cells. Int
J Biochem Cell Biol 2009; 41:127-135.
8. Jeuken JW, Cornelissen SJ, Vriezen M i wsp. MS-MLPA: an
attractive alternative laboratory assay for robust, reliable, and
semiquantitative detection of MGMT promoter hypermethylation
in gliomas. Lab Invest 2007; 87: 1055-1066.
9. Kuo KC, McCune RA, Gehrke CW i wsp. Quantitative reversedphase high performance liquid chromatographic determination
of major and modified deoxyribonucleosides in DNA. Nucleic
Acids Res 1980, 8, 4763-4776.
10. Nephew KP, Balch C, Skalnik DG. Methyl group acceptance
assay for the determination of global DNA methylation levels.
Methods Mol Biol 2009; 507: 35-41.
11. Nygren AO, Ameziane N, Duarte HM i wsp. Methylation-Specific
MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation
and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids
Res 2005; 33:128-137.
12. Paluszczak J, Baer-Dubowska W. Epigenetic diagnostics of
cancer – the application of DNA methylation markers. J Appl
Genet 2006; 47: 365-375.
13. Priolo M, Sparago A, Mammi C i wsp. MS-MLPA is a specific
and sensitive technique for detecting all chromosome 11p15.5
imprinting defects of BWS and SRS in a single-tube experiment.
Eur J Hum Genet 2008; 16: 565-571.
14. Rauch T, Li H, Wu X i wsp. MIRA-assisted microarray analysis,
a new technology for determination of DNA methylation patterns
identifies frequent methylation of homeodomain-containing genes in lung cancer cells. Cancer Res 2006; 66: 7939-7947.
15. Shaw RJ, Hall GL, Lowe D i wsp. The role of pyrosequencing
in head and neck cancer epigenetics: correlation of quantitative
methylation data with gene expression. Arch Otolaryngol Head
Neck Surg 2008; 134: 251-256.
16. Schena M, Shalon D, Davis RW i wsp. Quantitative monitoring
of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 1995; 270: 467-470.
17. Schmitt F, Oakeley E, Jost JP. Antibiotics induce genome-wide
hypermethylation in cultured Nicotiana tabacum plants. J Biol
Chem 1997; 272: 1534-1540.
18. Schumacher A, Kapranov P, Kaminsky Z i wsp. Microarraybased DNA methylation profiling: technology and applications.
Nucleic Acids Res 2006; 34: 528-542.
19. Sulewska A, Niklińska W, Kozłowski M i wsp. Detection of DNA
methylation in eucariotic cells. Folia Histochem Cytobiol 2007;
45: 315-324.
Adres Autorów:
Katedra Biochemii Farmaceutycznej
Uniwersytet Medyczny w Poznaniu
ul. Święcickiego 4
60-781 Poznań
e-mail: [email protected]
(Praca wpłynęła do Redakcji: 2009-02-12)
(Praca przekazana do opublikowania: 2009-06-26)
173