Diagnostyka laboratoryjna zakażenia parvowirusem B19 u kobiet w

Diagnostyka laboratoryjna zakażenia parvowirusem B19 u kobiet w

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
Diagn Lab 2015; 51(2): 157-168
Rekomendacje • Recommendations
Diagnostyka laboratoryjna zakażenia parvowirusem B19 u kobiet w ciąży
Zalecenia polskiej grupy ekspertów, 2014
Laboratory diagnostics of parvovirus B19 in pregnant women.
Recommendations of Polish group of experts, 2014
Piotr Grabarczyk1
Aleksandra Kalińska1
Bogumiła Litwińska2
Marzena Dębska3
Zbigniew Celewicz4
Dorota Nowakowska5
Elżbieta Puacz6
Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie
Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny w Warszawie
3
II Klinika Położnictwa i Ginekologii Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego,
Pracownia Diagnostyki Prenatalnej Szpitala Bielańskiego w Warszawie
4
Klinika Medycyny Matczyno-Płodowej i Ginekologii Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie
5
Klinika Medycyny Matczyno-Płodowej i Ginekologii Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi,
III Katedra Ginekologii i Położnictwa Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
6
Krajowa Izba Diagnostów Laboratoryjnych
1
2
Zalecenia są owocem wieloletniej współpracy naukowej zespołu
polskich diagnostów laboratoryjnych i lekarzy oraz analizy aktualnego piśmiennictwa. Uwzględniają one obowiązujące przepisy
prawa. Analiza wyników badań epidemiologicznych zakażeń B19V,
ryzyka powikłań w kontekście dostępu do właściwej diagnostyki
oraz liczby zlecanych badań wskazuje, że zakażenie B19V jest
problemem mało znanym i często nierozpoznawanym. Niniejsze opracowanie jest oparte na pierwotnym dokumencie Rekomendacji stworzonym z inicjatywy Krajowej Izby Diagnostów
Laboratoryjnych (KIDL) [1] i kierowanym przede wszystkim do
diagnostów laboratoryjnych. W obecnej wersji został on opatrzony
obszernym wstępem przedstawiającym najważniejsze informacje
dotyczące B19V, które są istotne dla zrozumienia znaczenia klinicznego wirusa oraz prowadzenia w sposób prawidłowy diagnostyki
laboratoryjnej. W oparciu o aktualne piśmiennictwo przedstawiono również merytoryczne uzasadnienie zlecania badań oraz więcej szczegółów praktycznych dotyczących ich realizacji. Dlatego
autorzy mają nadzieję, że niniejsze opracowanie będzie przydatne
w lepszym zrozumieniu wskazań do diagnostyki zakażenia B19V
oraz znaczenia uzyskanych wyników badań.
W opracowaniu zwrócono uwagę na te parametry testów diagnostycznych, które mają kluczowe znaczenie dla wiarygodności uzyskiwanych wyników i które są istotne zarówno dla laboratorium
jak i zleceniodawcy. W zaleceniach szczegółowo przedstawiono
sposób zlecania badań, pobierania, transportu i przyjmowania
materiału biologicznego. Szczegółowo opisano wymagania doty-
czące stosowanej aparatury i testów diagnostycznych oraz sposób
zapewnienia jakości badań laboratoryjnych, formułowania, interpretowania i wydawania wyników. W artykule przedyskutowano
przyczyny występowania wyników fałszywych oraz zaproponowano sposoby ich unikania.
Centralnym elementem rekomendacji jest algorytm postępowania diagnostycznego oraz ogólne zasady interpretacji wyników
badań. Dotychczasowe doświadczenia pokazują, że diagnostyka
zakażenia parvowirusem B19 u kobiet w ciąży winna łączyć badania swoistych przeciwciał, zarówno klasy IgG jak i IgM, metodami
immunoenzymatycznymi oraz DNA B19V metodami biologii molekularnej, najlepiej ilościowymi. Postępowanie diagnostyczne
u płodów z podejrzeniem zakażenia B19V należy opierać na badaniu real-time PCR. Autorzy zalecają, aby w przypadku stwierdzenia zakażenia B19V na sprawozdaniu z badań laboratoryjnych
umieszczać komentarz wskazujący na konieczność wykonania
dalszej specjalistycznej diagnostyki i objęcia kobiety w ciąży odpowiednią opieką medyczną.
Diagnostyka zakażeń parvowirusem B19 została szczegółowo
omówiona w odniesieniu do kobiet w ciąży, ponieważ konsekwencje zakażenia mogą być poważne i stanowić zagrożenie dla
zdrowia a nawet życia płodu. Przedstawione zasady prowadzenia
badań diagnostycznych B19V i interpretacji wyników mogą być
stosowane również w przypadku innych grup chorych z prawidłową odpornością. Diagnostyka laboratoryjna zakażeń parvowirusem B19 u chorych z obniżoną odpornością nie powinna
157
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
opierać się na ocenie odpowiedzi immunologicznej metodami
immunoenzymatycznymi, ponieważ istnieje możliwość otrzymania nieadekwatnych wyników badań. W takich przypadkach
postępowanie diagnostyczne powinno opierać się przede wszystkim na wykrywaniu DNA wirusa. Zasady rozpoznawania zakażeń
B19V u chorych z obniżoną odpornością będą przedmiotem oddzielnego opracowania.
1. Biologia parvowirusa B19 (B19V)
Parvowirus B19 (B19V) należy do rodziny Parvoviridae, rodzaju Erythrovirus [2]. Replikacja B19V zachodzi w prekursorowych
komórkach erytroidalnych w szpiku. Receptorem jest antygen
P (globozyd) erytrocytów. Wirus wykazuje powinowactwo również do innych komórek, np. megakariocytów, miocytów mięśnia
sercowego, fibroblastów, endothelium, hepatocytów czy błony
maziowej stawów. Bezosłonkowy B19V – jeden z najmniejszych
wirusów wywołujących zakażenia u ludzi – jest oporny na termiczne i chemiczne metody inaktywacji stosowane przy produkcji
preparatów krwi. W transfuzjologii do najskuteczniejszych sposobów eliminacji tego patogenu z osocza zaliczana jest metoda
nanofiltracji [4, 10, 28].
Jednoniciowy DNA parvowirusa B19 koduje białka kapsydu – VP1
i VP2 oraz niestrukturalne NS1. Białko VP1 odgrywa kluczową
rolę w odpowiedzi immunologicznej, tropizm wirusa determinuje białko VP2, natomiast białko NS1 jest odpowiedzialne za
śmierć zakażonej komórki [4]. Do chwili obecnej wyróżniono trzy
główne formy polimorficzne B19V – genotypy 1, 2, 3. Najbardziej
rozpowszechniony jest genotyp 1 występujący na całym świecie.
Genotyp 2 jest sporadycznie wykrywany w Europie, natomiast
Afryka Zachodnia to miejsce endemicznego występowania genotypu 3 [5]. Zdiagnozowane dwa przypadki genotypu 2 w Polsce
u osób z obniżoną odpornością wskazują na krążenie tej formy
polimorficznej w naszym kraju [6].
U osób z prawidłową odpornością zazwyczaj nie obserwuje się
objawów klinicznych w przebiegu zakażenia B19V. U dzieci może
wystąpić rumień zakaźny („choroba piąta” czy objawy infekcji
wirusowej z towarzyszącą wysypką), natomiast u dorosłych powiększenie węzłów chłonnych, złe samopoczucie, gorączka, bóle
stawów oraz w rzadkich przypadkach objawy zapalenia mięśnia
sercowego [3].
Kobiety nie posiadające przeciwciał anty-B19V są narażone na zakażenie parvowirusem B19 w okresie ciąży, które w konsekwencji
może prowadzić do poronienia czy nieimmunologicznego obrzęku płodu (szczególnie w I i II trymestrze ciąży) oraz do niedokrwistości płodu czy noworodka. Zakażenie płodu parvowirusem B19
może być także przyczyną zapalenia mięśnia sercowego, zapalenia
wątroby oraz uszkodzenia łożyska. W większości przypadków
rokowania długoterminowe u dzieci, które przeżyją wewnątrzmaciczną infekcję B19V są dobre [7, 8, 13, 25, 29].
Szczególną grupę chorych, u których mogą wystąpić istotne
problemy kliniczne w przebiegu zakażenia parvowirusem B19
stanowią osoby z niedoborem odporności (np. zakażone wirusem
HIV, chorzy otrzymujący leki immunosupresyjne, chemioterapię).
W wyniku reaktywacji B19V bądź infekcji de novo może dojść
u nich np. do przewlekłej niedokrwistości. U pacjentów z pobu158
dzonym układem czerwonokrwinkowym w szpiku może wystąpić
przejściowy przełom aplastyczny [4, 10, 28].
Model przebiegu zakażenia u osób z prawidłową odpornością
został opisany na podstawie analizy eksperymentalnego zakażenia zdrowych ochotników. W pierwszej fazie, kiedy przeciwciała
anty-B19V nie są jeszcze wykrywane (okienko serologiczne) DNA-emia B19V we krwi obwodowej osiąga najwyższy poziom i może
dochodzić nawet do 1014 IU/ml. W tym okresie mogą pojawić się
niespecyficzne objawy kliniczne, np. gorączka, ból głowy, dreszcze
czy niewielki spadek parametrów hematologicznych. Po około
2 tygodniach od wniknięcia wirusa do organizmu zaczynają być
produkowane przeciwciała klasy IgM. Ich pojawienie się rozpoczyna drugą fazę infekcji i koreluje z redukcją DNA-emii. W części
przypadków wraz ze wzrostem stężenia swoistych przeciwciał
obserwowany jest kolejny rzut objawów chorobowych: wysypka,
świąd, bóle stawów oraz nieistotny klinicznie spadek stężenia
hemoglobiny. Do serokonwersji dochodzi po około tygodniu od
pojawienia się przeciwciał klasy IgM. Wtedy zaczynają być produkowane anty-B19V klasy IgG, natomiast anty-B19V klasy IgM
zanikają. Przeciwciała klasy IgG skierowane do białka NS1 są markerem świadczącym o przebytym bądź przewlekłym zakażeniu.
Przeciwciała klasy IgM są zwykle obecne w surowicy przez około
3 miesiące, ale mogą być wykrywane znacznie dłużej. Takie przedłużające się występowanie anty-B19V klasy IgM nawet powyżej
roku obserwowano u polskich dawców krwi [9]. Przyjmuje się, że
swoiste przeciwciała klasy IgG utrzymują się w organizmie do końca życia i skutecznie chronią przed kolejnymi infekcjami. Badania
z zastosowaniem bardzo czułych metod molekularnych wykazały,
że wirus może pozostać w organizmie przez wiele lat, nie dając
objawów klinicznych. W takim przypadku mówi się o przewlekłym
zakażeniu parvowirusem B19 [4,10,11]. Przykładowo u jednego
z polskich dawców krwi udokumentowano utrzymywanie się
DNA-emii B19V we krwi obwodowej przez ponad 3 lata. Przez
większość tego czasu stężenie DNA wirusa utrzymywało się na
poziomie 103 IU/ml [12].
2. Przenoszenie zakażenia B19V, jego ograniczanie oraz
epidemiologia
Zakażenie parvowirusem B19 następuje zazwyczaj przez drogi oddechowe. Do transmisji wirusa może również dojść przez łożysko
od matki do płodu, z przeszczepionymi tkankami (np. szpikiem),
narządami (np. nerką) czy poprzez przetoczenie krwi i jej składników oraz produktów krwiopochodnych [4, 10, 13]. Zakres badań
czynników zakaźnych przy produkcji preparatów osoczopochodnych, w tym wirusa B19, określają zapisy Farmakopei Europejskiej
(European Pharmacopoeia 2004), zgodnie z którymi stężenie DNA
B19V w puli osocza do produkcji immunoglobuliny anty-D nie
może przekroczyć poziomu 104 IU/ml. Preparaty immunoglobulin
anty-D podawane są pacjentkom w trakcie ciąży lub zaraz po porodzie w celu zapobiegania w kolejnej ciąży konfliktowi matczyno-płodowemu w zakresie układu Rh. Dopuszczalną wartość wiremii
DNA B19V w puli osocza określono na podstawie obserwacji ilości
przeciwciał neutralizujących anty-B19V w puli osocza pochodzących od dawców krwi po przebytej infekcji. Stwierdzono, że ich
stężenie pozwala zneutralizować wiremię DNA B19V na poziomie
Diagn Lab 2015; 51(2): 157-168
poniżej 104 IU/ml i tym samym skutecznie ograniczy infekcyjność
wirusa. Szacuje się, iż średnio u około 60% dawców krwi są obecne
anty-B19V. W pulach osocza wykrywa się przeciętnie 60 IU anty-B19V/ml. W Polsce badaniom w kierunku DNA B19V poddawane
jest także osocze do produkcji immunoglobuliny anty-HBs [14].
Większość producentów składników leczniczych uzyskiwanych
z osocza (czynniki krzepnięcia itp.) obecnie wymaga badania DNA
B19V przed rozpoczęciem procesu produkcyjnego.
Zakażenie B19V jest powszechne na całym świecie i ma charakter
sezonowy. Zwiększoną liczbę zachorowań głównie wśród dzieci
i młodzieży szkolnej obserwuje się późną zimą lub wczesną wiosną. Co 3-4 lata odnotowuje się epidemie B19V. Odsetek osób
z przeciwciałami klasy IgG wzrasta wraz z wiekiem. Częstość występowania swoistych przeciwciał klasy IgG wynosi 2-15% u dzieci
w wieku 1-5 lat, 30-40% wśród młodzieży (do 15 lat), 40-60%
u osób do 20 roku życia, a w populacji dorosłych może przekroczyć
nawet 90% [4, 15, 16].
Badania markerów serologicznych w populacji polskiej były dotychczas prowadzone w różnych grupach. W niewielkiej liczbowo
populacji dawców krwi częstość anty-B19V klasy IgG wynosiła
blisko 35% [17]. Częstość wykrywania markerów serologicznych
B19V jest wyższa w niektórych grupach chorych, np. wśród chorych na hemofilię, co związane jest z leczeniem w przeszłości krwią
i produktami krwiopochodnymi. W tej grupie chorych, która niegdyś otrzymywała wiele transfuzji nie poddawanych inaktywacji
(mediana wieku – 29 lat) przeciwciała występują w blisko 82% [17].
W trakcie badań dawców krwi częstość DNA-emii wynosiła 0,6
– 0,003% [3, 10, 18-24]. W Polsce w latach 2004-2010 DNA B19V
wykryto w 0,1% donacji przeznaczonych do frakcjonowania [12].
Na podstawie dotychczasowych obserwacji uważa się, że nawet
u 50% zakażonych kobiet ciężarnych następuje transmisja wirusa
od matki na płód, a u blisko 10% z nich obserwuje się poważne
powikłania, np. poronienie, nieimmunologiczny obrzęk płodu
czy niedokrwistość płodu [8, 13, 25, 26]. Trudna jest do oszacowania liczba powikłań mających wpływ na zdrowie i rozwój dzieci
urodzonych z zakażeniem B19V. Szacuje się, iż około 40% kobiet
w wieku rozrodczym w Polsce jest narażona na zakażenie B19V,
a u 1-2% dochodzi do infekcji [27].
Przyjmując, że w Polsce co roku rejestrowanych jest 400 tysięcy
kobiet w ciąży należy szacunkowo uznać, że u 6000 dochodzi do
zakażenia parvowirusem B19, a u 3000 ma miejsce transmisja
wirusa na płód i wówczas u około 300 płodów należy spodziewać
się istotnych powikłań klinicznych.
3. Diagnostyka laboratoryjna zakażenia parvowirusem B19
u kobiet w ciąży
Przeprowadzenie diagnostyki laboratoryjnej zakażenia parvowirusem B19 u kobiety w ciąży rozważone jest w trzech sytuacjach:
a) gdy istnieje podejrzenie infekcji B19V w następstwie ekspozycji na zakażenie (kontakt kobiety w ciąży lub przed poczęciem
z osobą, u której zdiagnozowano zakażenie),
b) gdy istnieje podejrzenie objawowego zakażenia B19V u kobiety w ciąży w sytuacji stwierdzenia objawów klinicznych
u ciężarnej lub u płodu,
c) w przypadku poronienia o nieznanej przyczynie.
Objawy kliniczne spotykane w trakcie infekcji B19V nie mają
charakteru swoistego. Mogą być wywołane innymi przyczynami
o charakterze nieinfekcyjnym, jak również mogą towarzyszyć
innym zakażeniom wirusowym (np. różyczce, grypie). Dlatego
w sytuacji uzasadnionej klinicznie należy wykonać badania diagnostyczne pozwalające na zróżnicowanie zakażenia parvowirusem B19 od innych infekcji wirusowych [16].
Należy zauważyć, że potwierdzenie aktywnego zakażenia B19V
pozwala podjąć odpowiednie działania polegające na odizolowaniu zakażonej osoby. Szczególnie ważna jest izolacja takiej osoby
od chorych z innych grup zwiększonego ryzyka wystąpienia istotnych powikłań klinicznych w następstwie zakażenia B19V, w tym
od innych kobiet w ciąży. Tego typu działania mogą wymagać
czasowej zmiany organizacji oddziału szpitalnego lub przychodni
w przypadku przyjmowania pacjentki z potwierdzonym zakażeniem B19V. W sytuacji zdiagnozowania ostrej infekcji u kobiety
ciężarnej zasadne jest zapewnienie jej oddzielnego pokoju w przypadku koniecznej hospitalizacji, szczególnie jeżeli została przyjęta
na oddział, na którym przebywają pacjentki w ciąży. W ten sposób
chroni się przed zakażeniem i potencjalnymi powikłaniami kobiety
seronegatywne należące do grupy wysokiego ryzyka powikłań
klinicznych ze względu na brak przeciwciał anty-B19V klasy IgG.
Uzasadnione jest również takie organizowanie przyjmowania
kobiet z infekcją B19V w przychodniach, aby chronić przed ekspozycją innych potencjalnie B19V – seronegatywnych pacjentów
z grup ryzyka, a w szczególności kobiety ciężarne.
Należy rozważyć wykonanie badania przeciwciał anty-B19V u kobiety w ciąży, która z racji wykonywanego zawodu (np. nauczyciel,
pracownik służby zdrowia) czy sytuacji rodzinnej (małe dzieci w gospodarstwie domowym) może być szczególnie narażona na infekcję B19V. Takie postępowanie pozwoli określić status serologiczny
B19V kobiety ciężarnej i w konsekwencji ocenić ryzyko zakażenia.
Swoista diagnostyka laboratoryjna zakażenia parvowirusem B19
oparta jest na metodach immunoenzymatycznych oraz biologii
molekularnej. W pierwszym przypadku wykrywane są przeciwciała anty-B19V, natomiast w drugim DNA wirusa. Badaniem pomocniczym w diagnozowaniu zakażenia B19V jest ocena cytologiczna
szpiku [28, 29, 30, 31].
3.1.Badania diagnostyczne metodami serologicznymi
Metody serologiczne mają zastosowanie w badaniach przeciwciał
anty-B19V klasy IgM oraz IgG, ich stężenia i typów konformacyjnych. Na rynku dostępne są testy immunoenzymatyczne (ELISA)
oraz testy Western blot.
W teście ELISA, dzięki zastosowaniu płytek opłaszczonych antygenami białek strukturalnych VP1 i VP2 wirusa, które tworzą
kompleksy immunologiczne z właściwymi przeciwciałami anty-B19V klasy IgM i IgG, można ocenić stężenie przeciwciał obecnych
we krwi chorego.
W niektórych przypadkach wskazana jest ocena przebiegu infekcji
B19V przez badanie przeciwciał w kolejnych próbkach. Analiza
wyników pozwala ocenić dynamikę zmian ich stężenia oraz dostrzec serokonwersję.
Z punktu widzenia diagnostycznego badania serologiczne są
przydatne szczególnie u osób immunokompetentnych (np. w dia159
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
gnozowaniu rumienia zakaźnego, objawów poliartralgii, u kobiet
w ciąży).
3.2. Badania diagnostyczne metodami biologii molekularnej
Metody molekularne oparte na wykrywaniu kwasu nukleinowego
wirusa stanowią nowoczesne i czułe narzędzie w diagnozowaniu
zakażenia parvowirusem B19. Obecnie stosowane testy oparte na
amplifikacji kwasów nukleinowych generują wyniki jakościowe
bądź ilościowe. Nowoczesną metodą, współcześnie najczęściej
stosowaną, jest reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (real-time PCR), która wykrywa pojedyncze kopie wirusa
w różnym materiale, np. pełnej krwi, osoczu, surowicy, płynie
owodniowym, tkankach. Metoda ta przy wykorzystaniu technik
fluorescencyjnych pozwala ocenić ilość zamplifikowanego produktu w trakcie trwania reakcji PCR. Jej zastosowanie umożliwia
ilościową analizę DNA B19V oraz monitorowanie przebiegu zakażenia w czasie. Dzięki temu możliwe jest rozgraniczenie infekcji
istotnych (zazwyczaj w ostrej fazie zakażenia, manifestujące się
wysoką wiremią oraz powiązane z objawami klinicznymi) i nieistotnych klinicznie (przeważnie charakteryzujące się niską DNA-emią oraz niezwiązane z objawami klinicznymi). W przypadku
zastosowanego postępowania ograniczającego infekcję ilościowe
metody molekularne pozwalają ocenić jego skuteczność.
3.3. Inne metody diagnostyczne
Test Western blot może być uzupełnieniem testu ELISA. Pozwala
on zróżnicować odpowiedź immunologiczną chorego wobec
białek VP1, VP2 i NS1 parvowirusa B19. Dzięki temu można ocenić
fazę zakażenia, a więc czy jest to zakażenie ostre, przewlekłe czy
reinfekcja.
Dodatkowym, pomocniczym badaniem szacującym czas trwania
zakażenia jest test do oznaczania awidności przeciwciał klasy IgG.
Badanie jest przydatne w sytuacji, gdy w surowicy chorego nie są
obecne przeciwciała klasy IgM. Wysoka awidność przeciwciał pozwala wykluczyć infekcję w ostatnich kilku tygodniach i wskazuje
na fazę przewlekłą infekcji.
Badanie cytologiczne szpiku stanowi cenne poszerzenie diagnostyki zakażenia parvowirusem B19, w szczególności w przypadku
pacjentów w klinikach i poradniach hematologicznych. U osób
zakażonych B19V w obrazie mikroskopowym szpiku można zaobserwować olbrzymie pronormoblasty. Jednakże należy pamiętać,
iż badanie to nie może być jedynym kryterium rozstrzygającym,
bowiem komórki te są często nieobecne, np. u pacjentów z HIV czy
z innymi przewlekłymi infekcjami. Stwierdzenie wspomnianego
typu komórek jest wskazaniem do przeprowadzenia diagnostyki
wirusologicznej. Badanie polimorfizmu genomu parvowirusa B19
z zastosowaniem metod sekwencjonowania pełni ważną rolę
poznawczą, szczególnie w trakcie analiz epidemiologicznych,
ustalaniu dróg przenoszenia zakażenia czy modyfikacji istniejących testów diagnostycznych o nowo wykrywane warianty wirusa
[4, 10, 28].
4. Trudności i ograniczenia diagnostyki laboratoryjnej
Posługiwanie się zarówno badaniami metodami serologicznymi
jak i molekularnymi niosie ze sobą trudności i ograniczenia.
160
Badania immunoenzymatyczne obarczone są błędem związanym z istniejącym prawdopodobieństwem uzyskania wyników
ujemnych oraz fałszywie dodatnich.
Przeciwciała anty-B19V nie są wykrywane w pierwszej fazie zakażenia – podczas gwałtownej replikacji wirusa, która prowadzi
do osiągnięcia maksymalnego stężenia DNA B19V. Szacuje się,
że okres okienka serologicznego trwa nie dłużej niż 14 dni i jest
to parametr specyficzny dla testów różnych producentów.
W niektórych sytuacjach, zwłaszcza gdy stężenie wirusa jest bardzo wysokie, okres, w którym nie są wykrywane swoiste przeciwciała ulega wydłużeniu. Zjawisko to ma miejsce np. w początkowej
fazie zakażenia, kiedy dochodzi do całkowitego związania przeciwciał neutralizujących z wirionami parvowirusa B19. Aktywne
domeny przeciwciał, które determinują ich swoistość mogą być
w takiej sytuacji trudno dostępne i w rutynowym badaniu można
uzyskać wynik fałszywie ujemny [32].
Zaobserwowanie serokonwersji umożliwia rozpoznanie zakończenia wczesnej fazy infekcji oraz może wskazywać na rozpoczęcie
przewlekłej fazy zakażenia B19V. Wykrycie wyłącznie przeciwciał
klasy IgG nie zawsze pozwala zróżnicować aktualną infekcję od
zakażenia przebytego. Badania anty-B19V nie są wystarczającym
narzędziem diagnostycznym u osób z upośledzoną odpornością,
leczonych immunosupresją czy w diagnozowaniu zakażenia B19V
u płodu [6, 33].
Diagnostyka zakażenia parvowirusem B19 oparta na technikach biologii molekularnej również niesie ze sobą pewne
trudności. Niektóre testy zarówno komercyjne jak i tzw. home-made charakteryzują się obniżoną czułością kliniczną wykrywania
niektórych form polimorficznych, w szczególności genotypu 2 i 3
lub w ogóle ich nie wykrywają. Dlatego też, podejmując decyzje
o zastosowaniu danego testu, należy mieć pewność, że wykrywa wszystkie formy polimorficzne B19V z taką samą czułością
[33 – 37].
Istotne trudności diagnostyczne związane są także z ryzykiem otrzymania wyników fałszywie ujemnych w próbkach
z wysoką wiremią. Z taką sytuacją możemy mieć do czynienia
we wczesnej fazie zakażenia lub u osób z osłabioną odpornością,
gdy wiremia może osiągnąć poziom 1014 IU/ml. Wówczas w trakcie badań metodą real-time PCR, aby uniknąć wydania wyniku
fałszywie ujemnego konieczna jest wnikliwa analiza wykresu fluorescencji. Należy podejrzewać, że mamy do czynienia z wynikiem
fałszywie ujemnym, gdy cała linia krzywej fluorescencji w próbce
badanej przebiega powyżej tzw. linii odcięcia (ang. treshold). Taka
sytuacja może mieć miejsce wówczas, gdy stężenie wirusowego
DNA jest skrajnie wysokie (m.in. powyżej zakresu liniowości testu).
W związku z tym nie można wyznaczyć wartości Ct. W przypadku
podejrzenia zakażenia B19V ze skrajnie wysoką wiremią ostateczną interpretację wyniku należy oprzeć na analizie rozcieńczonej
próbki [38, 39].
Ze względu na możliwość wystąpienia wysokiej wiremii szczególnie ważne jest zachowanie procedur ograniczających możliwość
kontaminacji. Wygenerowanie wyniku fałszywie dodatniego może
nastąpić nie tylko na skutek zanieczyszczenia ujemnej próbki
Diagn Lab 2015; 51(2): 157-168
produktem amplifikacji, ale także cząsteczkami wirusa obecnymi
w badanym materiale. Do kontaminacji może dojść zarówno w fazie przedanalitycznej, jak i podczas izolacji DNA czy nastawiania
reakcji real-time PCR.
Samo wykrycie DNA B19V nie zawsze wskazuje na wczesną fazę
infekcji. Niska DNA-emia może utrzymywać się miesiącami, a nawet latami przy braku jakichkolwiek objawów klinicznych [11, 40,
41]. Analiza markerów B19V u 19 zakażonych dawców krwi bez
jakichkolwiek objawów klinicznych wykazała utrzymywanie się
DNA B19V na niskim poziomie (średnio 400 IU/ml) przez okres
powyżej 1 roku (dane IHiT, 2014 r.). Dlatego badanie ilościowe
pozwala na zróżnicowanie zakażenia ostrego o potencjalnym znaczeniu klinicznym i przewlekłego, do którego mogło dojść nawet
wiele lat wcześniej. W pierwszej fazie zakażenia liczba cząsteczek
wirusa B19 jest bardzo wysoka, a następnie spada. Należy przy
tym pamiętać, iż u osób z obniżoną odpornością wysoka wiremia
B19V może utrzymywać się dłużej niż u osób immunokompetentnych. Zmniejszenie ilości wirusa może nastąpić w wyniku
terapii mającej na celu podniesienie odporności chorego, zwłaszcza odpowiedzi immunologicznej typu humoralnego, poprzez
zmniejszenie immunosupresji czy podanie immunoglobulin. Do
oceny przebiegu zakażenia, w tym skuteczności postępowania
terapeutycznego, zaleca się monitorowanie stężenia DNA B19V
[6, 33].
REKOMENDACJE DOTYCZĄCE PROWADZENIA DIAGNOSTYKI
LABORATORYJNEJ ZAKAŻENIA PARVOWIRUSEM B19 U KOBIET W CIĄŻY
1. ZLECANIE BADANIA LABORATORYJNEGO
1.1. Laboratorium diagnostyczne opracowuje, wdraża i stosuje
procedurę zlecania badań laboratoryjnych oraz udostępnia formularz zlecenia badania laboratoryjnego zgodnie
z rozporządzeniem Ministra Zdrowia o standardach jakości
w medycznym laboratorium diagnostycznym. Laboratorium
diagnostyczne wykonujące badania dostarcza zleceniodawcy formularz zlecenia badania laboratoryjnego oraz przekazuje informacje dotyczące sposobu pobierania materiału
do badań, jego przechowywania i transportu, a następnie
zleceniodawca potwierdza pisemnie zapoznanie się z nimi.
1.2. Laboratorium diagnostyczne prowadzi dokumentację medyczną (w tym zlecenia badań laboratoryjnych), przechowuje
i przetwarza zgodnie z przepisami dotyczącymi dokumentacji
medycznej.
2. POBIERANIE I PRZYGOTOWANIE MATERIAŁU DO BADAŃ
LABORATORYJNYCH
2.1. Należy ściśle przestrzegać zaleceń producentów odczynników, probówek i systemów pobrań stosowanych do pozyskania materiału do badań (stosowanych antykoagulantów)
oraz parametrów wirowania. Systemy służące do pobierania
próbek pochodzące od różnych producentów różnią się między sobą, dlatego przestrzeganie warunków postępowania
z materiałem biologicznym może mieć istotny wpływ na
uzyskane wyniki.
2.2. W przypadku badań serologicznych należy pobierać krew
na skrzep (najlepiej do probówki próżniowej z żelem separującym, którą trzeba odwirować) i przesłać do laboratorium
wykonującego badanie. Laboratorium diagnostyczne informuje, jaka objętość próbki jest wymagana, uwzględniając: 1/
wymagania producenta stosowanego testu, 2/ potencjalne
powtórzenie badania w przypadku uzyskania nieważnego
wyniku badania oraz 3/ dostępność materiału (objętość krwi
pobranej od dziecka/płodu powinna być mniejsza niż od osoby dorosłej). W przypadku braku dostępu do próbki surowicy
dopuszcza się wykonanie badania w osoczu (krew pobrana
na EDTA w systemie zamkniętym).
2.3. Krew na badania molekularne należy pobierać na skrzep
wyłącznie do probówek próżniowych z żelem separującym
w systemie zamkniętym i przesłać po odwirowaniu. Otwarcie
probówek powinno nastąpić dopiero w laboratorium diagnostycznym wykonującym badanie z zachowaniem najwyższych procedur chroniących próbki przed zanieczyszczeniem. Takie postępowanie zmniejsza ryzyko kontaminacji na
etapie przedanalitycznym i ogranicza prawdopodobieństwo
otrzymania wyników fałszywie dodatnich. Dopuszcza się wykonanie badania w osoczu, przy czym należy stosować probówki z antykoagulantem – EDTA. Nie wolno pobierać krwi
do probówek z antykoagulantami będącymi inhibitorami
PCR (np. heparyną). Objętość pobranego materiału powinna
uwzględniać czynniki podane w pkt. 2.2.
W przypadku zlecenia na wykonanie badania serologicznego
i molekularnego w jednej próbce pacjenta należy wyłącznie
pobierać krew (na skrzep lub EDTA) do probówek próżniowych.
2.4. Probówka z pobranym materiałem powinna zawierać następujące dane pacjenta:
1) imię i nazwisko
2)PESEL
3) datę pobrania lub
4) kod paskowy.
3. TRANSPORT MATERIAŁU DO BADAŃ
3.1. Informacje dotyczące pobierania materiału do badań, jego
przechowywania i transportu.
Należy pamiętać, iż rodzaj badanego materiału (surowica
lub osocze), system pobierania i transport muszą być zawsze zwalidowane ze stosowanym testem diagnostycznym
w celu uniknięcia błędów przedanalitycznych oraz zapewnienia wiarygodnych wyników zgodnie z rozporządzeniem
Ministra Zdrowia z dnia 23.03.2006 w sprawie standardów
jakości dla medycznych laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych [Dz.U. nr 61 poz. 435 z późn. zm.]. Warunki
i czas transportu pobranej krwi muszą spełniać zalecenia
laboratorium diagnostycznego wykonującego badania.
3.2. Materiał do badań laboratoryjnych jest traktowany jako
potencjalnie zakaźny i musi być przesłany do laboratorium
zgodnie z zasadami transportu tego typu materiału. W skrócie – szczelny pojemnik z materiałem biologicznym powinien
być umieszczony w większym pojemniku zabezpieczającym
przed zgnieceniem i zawierającym absorbent wchłaniający
161
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
materiał biologiczny w przypadku ewentualnego uszkodzenia probówki. Ten pojemnik należy następnie umieścić
w opakowaniu oznakowanym „materiał zakaźny” z odpowiednimi wkładami chłodzącymi umożliwiającymi zachowanie
wymaganej temperatury w czasie transportu.
4. PRZYJMOWANIE MATERIAŁU DO BADAŃ
4.1. Laboratorium opracowuje, wdraża i stosuje procedury przyjmowania, rejestrowania i oznakowania materiału do badań.
4.2. Laboratorium sprawdza zgodność danych ze zlecenia z oznakowaniem materiału oraz przydatność materiału do badania.
4.3. W przypadku stwierdzenia przez laboratorium niezgodności
otrzymanego materiału z wymaganiami dotyczącymi pobierania, transportu lub innych nieprawidłowości powodujących, że materiał nie może być wykorzystany do badania
pracownik zgłasza ten fakt kierownikowi laboratorium lub
osobie przez niego upoważnionej, którzy w razie potwierdzenia niezgodności mogą zakwalifikować materiał jako niezdatny do badania i odmówić wykonania badania. Odmowę
wykonania badania odnotowuje się w dokumentacji. Dalsze
postępowanie laboratorium uzgadnia ze zleceniodawcą.
4.4. Laboratorium prowadzi dokumentację dotyczącą sposobu
postępowania z materiałem biologicznym przed i po wykonaniu badania. W przypadku archiwizacji próbek uwzględnia
się miejsce, czas oraz temperaturę ich przechowywania.
5. WYMAGANIA DOTYCZĄCE STOSOWANEJ APARATURY
I TESTÓW DIAGNOSTYCZNYCH
5.1. Do diagnostyki medycznej in vitro należy stosować wyroby
medyczne, tj. aparaturę i testy diagnostyczne spełniające
wymagania określone w ustawie o wyrobach medycznych.
W związku z powyższym aparatura i odczynniki muszą posiadać deklarację zgodności z dyrektywą 98/79/EC. Tego rodzaju certyfikat, jak również inne certyfikaty renomowanych
instytucji zajmujących się ochroną zdrowia (np. FDA) służą
potwierdzeniu jakości produktu przeznaczonego do laboratoryjnych badań markerów zakażenia B19V.
5.2. Stosowane testy diagnostyczne powinny spełniać wymagania zasadnicze określone przez Ministra Zdrowia. Powyższe
musi być potwierdzone wpisem do bazy danych o wyrobach
medycznych przeznaczonych do używania w Rzeczpospolitej Polskiej prowadzonej przez Urząd Rejestracji Produktów
Leczniczych, Wyrobów Medycznych i Produktów Biobójczych.
Prezes tego urzędu udziela informacji publicznej o zawartości
bazy na wniosek producenta lub laboratorium, stąd zaleca
się weryfikację czy usługodawca spełnia wymagania gwarantujące jakość oferowanego produktu.
5.3. Stosowanie testów PCR wytworzonych przez laboratorium
(typu home-made) jest możliwe wyłącznie po przeprowadzeniu pełnej walidacji metody ze szczególnym uwzględnieniem
czułości i swoistości.
5.4. Wyroby medyczne (aparaty i/lub odczynniki) powinny być
właściwie dostarczone, prawidłowo zainstalowane i utrzymywane oraz używane zgodnie z przewidzianym zastosowaniem, a użytkownik jest obowiązany do przestrzegania
162
instrukcji użytkowania. Badania należy wykonywać i interpretować ich wyniki zgodnie z instrukcją producenta testów
diagnostycznych.
5.5. Wymagania dotyczące testów wykrywających DNA parvowirusa B19
Badania metodami biologii molekularnej charakteryzują się
bardzo wysoką czułością i wykorzystywane są do wykrywania
DNA parvowirusa B19 w surowicy lub osoczu. Niektóre testy są
dopuszczone do wykonywania badań w pełnej krwi oraz płynie
owodniowym.
• Do wykrywania DNA B19V zaleca się stosowanie metody ilościowej. Ten rodzaj badania umożliwia odróżnienie
przewlekłego zakażenia relatywnie częstego w populacji,
zazwyczaj charakteryzującego się niską DNA-emią (<104 IU/
ml), któremu nie towarzyszą objawy kliniczne od zakażenia
w ostrej fazie z wysoką DNA-emią i współwystępującymi objawami chorobowymi.
• Czułość analityczna testu oraz wynik badania powinny być
wyrażane w jednostkach międzynarodowych na mililitr (IU/
ml). Taki sposób charakteryzowania testu oraz wyrażania wyniku umożliwia zarówno porównywanie testów, jak i wyników
uzyskiwanych różnymi testami w różnych laboratoriach.
• Test stosowany do wykrywania DNA B19V musi wykrywać
wszystkie znane genotypy wirusa (1-3) z taką samą czułością. Czułość analityczna wykrywania form polimorficznych
wyrażona w 95% LOD (limit of detection – granica wykrywalności) w IU/ml musi być potwierdzona przez producenta testu
odpowiednimi dokumentami. Ocena czułości analitycznej
i określenie wykrywalności genotypów 1-3 parvowirusa B19
dokonywane są poprzez badanie specjalnie zaprojektowanego panelu rozcieńczeń standardu międzynarodowego o ściśle określonym stężeniu DNA parvowirusa B19 wyrażonym
w jednostkach międzynarodowych [42, 43].
• W przypadku monitorowania DNA-emii B19V konieczne jest
analizowanie tego samego rodzaju materiału biologicznego (np. tylko surowicy lub tylko pełnej krwi) ze względu
na różnice stężenia B19V w różnych materiałach klinicznych.
• Stężenie DNA B19V jest najwyższe w pełnej krwi, niższe
w surowicy i osoczu [40]. Porównanie wyników uzyskanych
w próbkach jednocześnie pobranych od zakażonej matki
i płodu wykazuje większą DNA-emię o kilka rzędów wielkości,
we krwi zakażonego płodu aniżeli we krwi matki.
• Należy stosować wyłącznie testy wyposażone w kontrolę
wewnętrzną (IC – internal control). W przypadku uzyskania
wyniku negatywnego IC konieczne jest wdrożenie postępowania wskazanego przez producenta testu.
• Analiza wyników kontroli wewnętrznej pozwala na ocenę prawidłowości wykonania całego badania – od ekstrakcji kwasów
nukleinowych po uzyskanie wyniku reakcji real-time PCR. Taka
procedura umożliwia wykluczenie obecności w badanej próbce
inhibitorów reakcji enzymatycznych zachodzących w trakcie
procedury diagnostycznej. Wykonanie badania rozcieńczonej
próbki (eluatu otrzymanego w procesie ekstrakcji kwasów
nukleinowych) umożliwia identyfikację zakażenia i określenie
Diagn Lab 2015; 51(2): 157-168
•
•
•
rzeczywistego poziomu DNA-emii w przypadku otrzymania
wyniku fałszywie ujemnego B19V przy równocześnie uzyskanym wyniku ujemnym IC. Takie wyniki spowodowane są wysoką wiremią B19V.
W przypadku każdego wyniku, a zwłaszcza ujemnego należy
przeprowadzać analizę krzywej fluorescencji. Takie działanie umożliwia identyfikację wyników fałszywie ujemnych
będących następstwem wiremii przekraczającej górny próg
liniowości testu ilościowego [38].
Laboratorium jest zobowiązane do wykonywania minimum
100 badań ilościowych DNA B19V na rok w celu zapewnienia
wymaganej jakości wykonywanych badań molekularnych.
Należy ściśle zachować procedury ograniczające kontaminację. Zalecenie to podyktowane jest specyfiką metody PCR,
która polega na namnażaniu fragmentów genomu wirusa.
Dodatkowo, w przypadku B19V istnieje znaczące prawdopodobieństwo badania próbek ze skrajnie wysoką wiremią.
W szczególności wskazane jest wykonywanie ekstrakcji
kwasów nukleinowych i przygotowywanie reakcji real-time
PCR oraz jej przeprowadzanie w termocyklerze w różnych
pomieszczeniach (oddzielenie w części preamplifikacyjnej
i postamplifikacyjnej). Również ważne jest stosowanie rękawiczek beztalkowych (talk zwiększa ryzyko przeniesienia
amplikonów), a także dekontaminacja powierzchni przy
pomocy roztworów podchlorynu sodu (bielinki) lub preparatów typu DNA-away oraz naświetlanie pomieszczeń
lampami UV. Należy stosować wyłącznie drobny sprzęt
jednorazowego użytku (m.in. końcówki z filtrem do pipet,
probówki, pipetki).
5.6. Wymagania dotyczące testów wykrywających przeciwciała skierowane przeciwko parvowirusowi B19
W przypadku badań serologicznych bardzo istotna jest jakość
stosowanych testów diagnostycznych. Polskie doświadczenia
wykazały, że używanie nieodpowiednich testów prowadzi do
otrzymywania większej liczby wyników fałszywych/nieinformatywnych. W doborze odpowiednich testów pomocne jest
śledzenie aktualnego piśmiennictwa naukowego, w którym na
podstawie badań prowadzonych w niezależnych ośrodkach
naukowych publikowane są analizy dotyczące charakterystyki/
porównania dostępnych na rynku zestawów do oznaczania przeciwciał anty-B19V [44].
• Przy wyborze testu należy brać pod uwagę swoistość, czułość oraz powtarzalność i odtwarzalność uzyskiwanych
wyników. Jest to bardzo istotne w badaniu przeciwciał klasy
IgM, które są markerem ostrego zakażenia.
• W przypadku badania przeciwciał klasy IgG, wynik ilościowy
pomaga w różnicowaniu zakażenia przewlekłego i niedawno
przebytego.
6. ZAPEWNIENIE JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH
6.1. Laboratorium diagnostyczne prowadzi wewnętrzną kontrolę
jakości badań i uczestniczy w zewnętrznej kontroli jakości
zgodnie z rozporządzeniem Ministra Zdrowia co najmniej
raz w roku.
6.2. Kierownik laboratorium lub wyznaczony przez niego pracownik odpowiada za prowadzenie wewnętrznej kontroli jakości
oraz uczestnictwo w programach zewnętrznej oceny jakości
laboratorium diagnostycznego.
6.3. Dokumentacja kontroli jakości badań jest przechowywana
20 lat zgodnie z przepisami dotyczącymi dokumentacji medycznej.
7. ALGORYTM POSTĘPOWANIA DIAGNOSTYCZNEGO ORAZ
OGÓLNE ZASADY INTERPRETACJI WYNIKÓW
7.1. Diagnostyka zakażenia parvowirusem B19 u kobiet w ciąży winna łączyć badania:
• swoistych przeciwciał, zarówno klasy IgG jak i IgM, metodami immunoezymatycznymi oraz
• DNA B19V metodami biologii molekularnej.
7.2. Sposób prowadzenia laboratoryjnej diagnostyki zakażenia
B19V u kobiet w ciąży został przedstawiony na Schemacie 1.
Schemat 1. Algorytm postępowania diagnostycznego u kobiet w ciąży z podejrzeniem zakażenia parvowirusem B19
•
•
W sytuacji, kiedy przeciwciała anty-B19V nie są wykrywane
w surowicy kobiety ciężarnej jedynym instrumentem diagnostycznym potwierdzającym infekcję jest badanie metodą
molekularną. Ma to szczególne znaczenie u kobiet krótko po
ekspozycji na zakażenie – w okienku serologicznym. Badanie
przeciwciał anty-B19V należy wykonywać nie wcześniej niż
2 tygodnie po kontakcie z osobą zakażoną, np. z rumieniem
zakaźnym.
W przypadku wykrycia przeciwciał anty-B19V klasy IgM
bądź jednocześnie IgM i IgG badanie real-time PCR pozwala potwierdzić aktualną infekcję, a tym samym może być
pomocne w podjęciu decyzji co do dalszego postępowania
terapeutycznego. Swoistość pierwotnego wyniku dodat163
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
niego w klasie IgM musi być potwierdzona wykryciem DNA
B19V lub/i udokumentowaniem serokonwersji.
Wobec wykrytych przeciwciał anty-B19V klasy IgG u kobiety ciężarnej aktualną infekcję można wykluczyć wykonując
badanie metodą molekularną. W przypadku potwierdzenia
obecności DNA B19V wynik badania ilościowego pomaga
rozstrzygnąć czy mamy do czynienia z zakażeniem, do którego doszło w ciągu ostatnich kilku miesięcy czy też z zakażeniem przewlekłym.
•
Tabela I. Markery wirusologiczne u kobiet ciężarnych w momencie zdiagnozowania zakażenia B19V (IHiT, 2014 r.)
Markery serologiczne
IgM (-) IgG (-)
IgM (+) IgG (-)
IgM (+) IgG (+)
IgM (-) IgG (+)
N
(%)
2 (6,7)
1 (3,3)
20 (66,7)
7 (23,3)
Średnie stężenie DNA B19V
[IU/ml]
7,2x108
5,8x107
7,9x105
9,6x103
W tabeli I przedstawiono charakterystykę markerów wirusologicznych B19V u kobiet w ciąży zakażonych parvowirusem B19 (dane
IHiT, 2014 r.). Wśród 30 ciężarnych największy odsetek stanowiły
pacjentki z jednocześnie wykrytymi przeciwciałami klasy IgM i IgG,
mniejszy ze specyficznymi przeciwciałami jednej lub drugiej klasy.
W przedstawionych przypadkach badanie metodą molekularną
potwierdziło zakażenie, a ilościowy wynik był pomocny w ocenie
przebiegu/fazy infekcji. Dwa przypadki (6,7%), gdzie jedynym
markerem zakażenia było DNA wirusa ilustrują znaczenie metod
biologii molekularnej w diagnostyce zakażenia u kobiet ciężarnych bez wykrywalnych przeciwciał.
Zarówno obserwacje dotyczące pacjentów, jak i zdrowych dawców krwi wykazują, że DNA B19V po okresie bardzo wysokiej
wiremii może utrzymywać się na niskim, jednak wciąż wykrywalnym poziomie we krwi przez wiele lat. Takiej przewlekłej infekcji
z niską DNA-emią, która jest w pełni kontrolowana przez układ
odpornościowy zazwyczaj nie towarzyszą objawy kliniczne i nie
wymaga ona leczenia [11, 12, 18, 41].
7.3. Postępowanie diagnostyczne u płodów z podejrzeniem
zakażenia parvowirusem B19 powinno opierać się na
badaniu real-time PCR.
Wiremię u płodu można określić jedynie na podstawie badania
krwi płodu uzyskanej drogą kordocentezy (nakłucie żyły pępowinowej pod kontrolą USG). Zabieg kordocentezy jest działaniem
Tabela II. Potwierdzenie przeniesienia zakażenia B19V od matki na płód metodą
real-time PCR oraz porównanie statusu serologicznych markerów diagnostycznych u kobiet ciężarnych i płodów (IHiT, 2014 r.)
Numer
przypadku
IgG
1
2
3
(+)
(+)
(+)
164
Matka
IgM DNA B19V
[IU/ml]
(-)
2,1x107
(+)
4,3x104
(+)
8,6x106
IgG
(-)
(-)
(-)
Płód
IgM DNA B19V
[IU/ml]
(-)
2,3x109
(-)
1,7x108
(-)
3,9x108
inwazyjnym i jest obarczony około 1% ryzykiem powikłań. Wskazaniem do kordocentezy może być podejrzenie niedokrwistości
u płodu, ale zabieg ten jest również wykonywany z innych wskazań, na przykład w celu oceny kariotypu płodu. Po potwierdzeniu
niedokrwistości rozpoczyna się leczenie transfuzjami dopłodowymi specjalnie do tego celu przygotowanych KKCZ (krwinki O Rh
minus, niereagujące z surowicą matki, filtrowane, napromieniane).
Ze względu na niedojrzałość układu immunologicznego płodu,
zwłaszcza w pierwszej połowie ciąży, podstawą diagnostyki zakażenia u płodu nie jest ocena przeciwciał, ale bezpośrednie wykrywanie wirusa. W przypadku wykrycia przeciwciał klasy IgG u płodu
nie ma możliwości potwierdzenia czy zostały one wytworzone
przez płód czy ich obecność jest wynikiem biernego przeniesienia przeciwciał matki przez barierę łożyskową. Wykryte we krwi
matki przeciwciała anty-B19V nie zawsze są wykrywane we krwi
płodu, co świadczy o wybiórczym transporcie przeciwciał neutralizujących przez łożysko. W tabeli II przedstawiono trzy przypadki
zdiagnozowania przeniesienia zakażenia B19V od matki na płód
za pomocą metody real-time PCR. Porównano status markerów
serologicznych zakażenia B19V u kobiety ciężarnej i płodu. We
wszystkich przypadkach u płodu obserwowano wiremię wyższą
o przynajmniej dwa rzędy wielkości w porównaniu do matki.
7.4. W sytuacji wystąpienia powikłań u płodu monitorowanie
DNA-emii B19V może być pomocne w podjęciu decyzji o postępowaniu leczniczym, np. podaniu transfuzji dopłodowej
czy immunoglobulin [45].
8. FORMUŁOWANIE, INTERPRETACJA I WYDAWANIE WYNIKÓW
8.1. Formularz sprawozdania z badań parvowirusa B19 musi być
zgodny z rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dnia 21 grudnia 2010 r. w sprawie dokumentacji medycznej.
8.2. Wyniki badania markerów zakażenia B19V muszą być autoryzowane przez diagnostę laboratoryjnego posiadającego odpowiednią specjalizację lub/i co najmniej dwuletnie
doświadczenie w tej dziedzinie diagnostyki lub lekarza będącego jednocześnie diagnostą laboratoryjnym czy też posiadającego wiedzę i umiejętności w zakresie wykonywania
czynności diagnostyki laboratoryjnej uzyskanych w ramach
specjalizacji zgodnie z rozporządzeniem Ministra Zdrowia
z dnia 11.12.2012 roku w sprawie wykazu specjalizacji uprawniających lekarza do samodzielnego wykonywania czynności
diagnostyki laboratoryjnej w medycznym laboratorium diagnostycznym [Dz.U. 2012 poz. 1420] i posiadającego co najmniej dwuletnie doświadczenie w tej dziedzinie diagnostyki.
W przypadku badań DNA B19V osoba autoryzująca wynik
powinna legitymować się doświadczeniem w diagnostyce
molekularnej wirusów.
8.3. Interpretacja uzyskanych wyników badań przeciwciał anty-B19V klasy IgM i IgG oraz formułowanie wyniku na sprawozdaniu muszą być zgodne z zaleceniami producenta dostępnymi w ulotce załączonej do testu. Wyniki mają format
jakościowy lub ilościowy (wyrażane są w jednostkach na
mililitr [U/ml]) i interpretowane są w następujący sposób:
Diagn Lab 2015; 51(2): 157-168
dodatni (+) (odpowiednio w klasie IgM lub IgG) – co oznacza:
stwierdzono obecność przeciwciał (odpowiednio w klasie
IgM lub IgG),
• ujemny (-) – nie stwierdzono obecności przeciwciał (odpowiednio w klasie IgM lub IgG),
• wątpliwy (+/-) (odpowiednio w klasie IgM lub IgG) – przeciwciała na granicy wartości wyniku dodatniego i ujemnego
(odpowiednio w klasie IgM lub IgG).
Wynik ilościowy najlepiej wyrażać w jednostkach międzynarodowych, gdyż wówczas możliwe jest porównanie rezultatów badań
różnymi testami oraz interpretowanie ich w oparciu o piśmiennictwo światowe posługujące się tymi samymi jednostkami. W przypadkach stosowania innych jednostek te same wartości mogą
być nieporównywalne.
8.4. Wyniki badań ilościowych DNA B19V muszą zawierać informację o rodzaju badanego materiału, a także muszą być
podawane w jednostkach międzynarodowych [IU/ml]. Są
one interpretowane w następujący sposób:
• wykryto DNA B19V – parvowirus B19 we krwi kobiety ciężarnej – wartość stężenia podana w IU/ml (aktualne zakażenie
B19V – poziom DNA-emii pomaga w rozstrzygnięciu czy
mamy do czynienia z zakażeniem toczącym się od niedawna
czy ma ono charakter przewlekły),
• nie wykryto DNA B19V – brak parvowirusa B19 we krwi kobiety ciężarnej (brak aktualnego zakażenia B19V).
8.5. Formularz sprawozdania z badania laboratoryjnego może
być przekazany w formie elektronicznej z zachowaniem wymagań prawnych.
8.6. Medyczne laboratorium diagnostyczne archiwizuje wyniki
przez czas określony w przepisach dotyczących dokumentacji medycznej [rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 21
grudnia 2010 r. w sprawie dokumentacji medycznej].
W tabeli III dodatkowo przedstawiono postępowanie diagnostyczne w sytuacji szczególnej – gdy badanie DNA B19V nie jest
dostępne.
•
9. POSTĘPOWANIE W PRZYPADKU STWIERDZENIA ZAKAŻENIA B19V U KOBIETY W CIĄŻY
9.1. W przypadku stwierdzenia zakażenia (patrz schemat 1,
tabela III) na sprawozdaniu z badania należy umieścić
komentarz ”Pacjentka w ciąży, u której potwierdzono
zakażenie powinna zostać skierowana do ośrodka położniczego na III poziomie referencyjności w celu przeprowadzenia dalszej specjalistycznej diagnostyki oraz monitorowania dobrostanu płodu”. W ośrodku położniczym
na III poziomie referencyjności płód będzie monitorowany
w kierunku objawów niedokrwistości poprzez wykonanie
badania ultrasonograficznego, w tym MCA-PSV (zazwyczaj
1 raz w tygodniu aż do 20 tygodnia po ekspozycji).
9.2. Prenatalne podejrzenie niedokrwistości u płodu postawione
na podstawie nieprawidłowych przepływów w tętnicy środkowej mózgu płodu (MCA PSV – wzrost MCA PSV > 1,5 krotności mediany – MoM) z towarzyszącym lub nie obrzękiem
płodu) jest wskazaniem do pobrania krwi płodu. U płodów
monitorowanych z powodu podejrzenia zakażenia/infekcji B19V pobiera się próbkę krwi w celu oznaczenia parametrów morfologicznych (stężenie hemoglobiny, liczba
płytek krwi oraz retikulocytów) oraz wykonania badania
DNA B19V i potwierdzenia przeniesienia zakażenia B19V
od matki na płód. Potwierdzenie przeniesienia zakażenia od
matki na płód oraz monitorowanie stężenia wirusa we krwi
płodu należy wykonywać jedynie w przypadku dostępu do
materiału pobranego w trakcie kordocentezy wykonanej
celem leczenia niedokrwistości u płodu (transfuzja dopłodowa), stosując wyłącznie metodę ilościowego oznaczania
DNA wirusa. Dalsze postępowanie uzależnione jest od stanu
płodu i wyników badań laboratoryjnych. Najczęściej, w przypadku niedokrwistości spowodowanej zakażeniem B19V
wystarczającym postępowaniem jest jedna – dwie transfuzje dopłodowe. Istotnym czynnikiem rokowniczym wydaje
się być liczba erytroblastów we krwi obwodowej, ponieważ
wysoka erytroblastoza wskazuje na możliwość samoistnej
regeneracji układu czerwonokrwinkowego. U płodów z ciężkim obrzękiem uogólnionym, kardiomegalią oraz z objawami
niewydolności serca można dodatkowo rozważyć leczenie
wspomagające digoksyną.
9.3. Kobiety ciężarne leczone z powodu poważnych następstw
parwowirozy u płodu powinny znajdować się pod ścisłym
nadzorem lekarskim, ponieważ obrzęk uogólniony płodu
może stanowić zagrożenie dla kobiety w ciąży w mechani-
Tabela III. Zasady interpretacji wyników badania markerów serologicznych zakażenia B19V u kobiet w ciąży oraz dalsze postępowanie diagnostyczne w przypadku braku
dostępu do badania DNA B19V (sytuacja szczególna)
IgM
IgG
Wstępna interpretacja wyniku
-
-
Brak zakażenia, pacjentka nie przechodziła zakażenia lub
wczesny etap zakażenia (okienko serologiczne)
+
-
Wczesny etap zakażenia
+
+
Wczesny etap zakażenia
-
+
Aktualne zakażenie lub zakażenie przebyte w przeszłości
Dalsze postępowanie diagnostyczne w przypadku braku
dostępu do badania DNA B19V
(sytuacja szczególna)
Wykluczenie/potwierdzenie zakażenia – powtórzenie
za 2 tygodnie badania swoistych IgM i IgG
Potwierdzenie zakażenia – powtórzenie za miesiąc badania
swoistych IgM i IgG (powinny pojawić się IgG)
Potwierdzenie zakażenia – powtórzenie za miesiąc badania
swoistych IgM i IgG w celu obserwacji serokonwersji
(zanik IgM przy wzroście stężenia IgG)
Brak możliwości wykluczenia/potwierdzenia zakażenia
bez wykonania badania DNA B19V
165
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
zmie rozwoju tzw. zespołu lustrzanego (ang. mirror syndrome)
[46]. Wystąpienie objawów tego zespołu u kobiety ciężarnej
przy utrzymywaniu się objawów u płodu (obrzęki uogólnione, w krańcowym stadium niewydolność oddechowo-krążeniowa) stanowi zagrożenie życia i jest uważane za wskazanie
do zakończenia ciąży niezależnie od okresu ciąży.
PODSUMOWANIE
12. Grabarczyk P, Korzeniowska J, Liszewski G i wsp. Parvovirus B19 DNA testing in
Polish blood donors, 2004-2010. Przegl Epidemiol 2012; 66(1): 7-12.
13. de Jong EP, Walther FJ, Kroes ACM et al. Parvovirus B19 infection in pregnancy:
new insights and management. Prenat Diagn 2011; 31: 419-425.
14. Łętowska M (red.). Medyczne zasady pobierania krwi, oddzielania jej składników
i wydawania obowiązujące w jednostkach organizacyjnych publicznej służby
krwi. III wydanie, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa, 2014.
15. Thomas I, Di Giambattista M, Gerard C et al. Prevalence of human erythrovirus
B19 DNA in healthy Belgian blood donors and correlation with specific antibodies against structural and non-structural viral proteins. Vox Sang 2003;
84(4): 300-307.
Parvowirus B19 jest patogenem, który u osób immunokompetentnych rzadko wywołuje groźne powikłania poinfekcyjne. Kobiety
w ciąży są narażone na ryzyko wystąpienia powikłań, które stanowią
istotne zagrożenie dla płodu. Prawidłowa diagnostyka zakażenia
parvowirusem B19 (metodami serologicznymi i molekularnymi)
polega na badaniu swoistych przeciwciał oraz na ilościowej ocenie
DNA wirusa we krwi. W sytuacji braku dostępu do metod biologii
molekularnej potwierdzenie ostrego zakażenia w przypadku wyniku
dodatniego w klasie IgM wymaga kolejnego oznaczenia metodami
immunoenzymatycznymi oraz udokumentowania serokonwersji.
Potwierdzenie przeniesienia zakażenia u płodu winno być oparte
na badaniu DNA parvowirusa B19. Również ważne jest monitorowanie zakażenia B19V metodą real-time PCR przy wskazaniach do
kontrolowania obrazu klinicznego czy skuteczności leczenia płodu.
Ze względu na ryzyko poważnych powikłań, włącznie z zagrożeniem dla życia płodu, ostateczny wynik potwierdzający zakażenie
zawsze powinien zawierać komentarz wskazujący na konieczność
wykonania dalszej specjalistycznej diagnostyki i objęcia kobiety
w ciąży odpowiednią opieką medyczną.
16. Siennicka J, Stefanoff P, Trzcinska A i wsp. Przegląd serologiczny w kierunku
zakażenia parvowirusem B19 w Polsce. Przegl Epidemiol 2006; 60: 571-580.
17. Brojer E, Grabarczyk P, Lopaciuk S et al. Prevalence of human parvovirus B19 DNA
and IgG/IgM antibodies in Polish haemophilia patients. Vox Sang 1999; 77: 107.
18. Schmidt M, Themann A, Drexler C et al. Blood donor screening for parvovirus
B19 in Germany and Austria. Transfusion 2007; 47: 1775-1782.
19. Koppelman MHGM, van Swieten P, Cuijpers HTM. Real-time polymerase chain
reaction detection of parvovirus B19 DNA in blood donations using a commercial and an in-house assay. Transfusion 2011; 51(6): 1346-1354
20. Kooistra K, Mesman HJ, de Waal M et al. Epidemiology of high-level parvovirus
B19 viraemia among Dutch blood donors, 2003-2009. Vox Sang 2011; 100(3):
261-266.
21. Kleinman SH, Glynn SA, Lee T-H et al. Prevalence and quantitation of parvovirus
B19 DNA levels in blood donors with a sensitive polymerase chain reaction
screening assay. Transfusion 2007; 47: 1756-1764.
22. Ke L, He M, Li C et al. The prevalence of human parvovirus B19 DNA and antibodies in blood donors from four Chinese blood centers. Transfusion 2011;
51: 1909-1918.
23. Jordan J, Tiangco B, Kiss J et al. Human parvovirus B19: Prevalence of viral DNA
in volunteer blood donors and clinical outcomes of transfusion recipients. Vox
Sang 1998; 75: 97-102.
24. Gessoni G, Barin P, Marchiori G. Nucleic acids amplification technique (NAT)
screening for parvovirus B19: the first Italian routine experience. Transfus Med
2007; 17: 417-419.
25. Enders M, Klingel K, Weidner A et al. Risk of fetal hydrops and non-hydropic
Piśmiennictwo
1.
26. Marcinek P, Nowakowska D, Szaflik K i wsp. Analysis of complications during
komendacje polskiej grupy ekspertów, 2014, http://kidl.org.pl/uploads/reko-
pregnancy in women with serological features of acute toxoplasmosis or acute
27. Mossong J, Hens N, Friederichs V et al. Parvovirus B19 infection in five European
International Committee on Taxonomy of Viruses, Elsevier/ Academic Press,
countries: seroepidemiology, force of infection and maternal risk of infection.
Zaaijer HL, Koppelman M, Farrington CP. Parvovirus B19 viraemia in Dutch blood
donors. Epidemiol Infect 2004; 132(6): 1161-1166.
4.
Young NS, Brown KE. Mechanisms of disease – Parvovirus B19. N Engl J Med
2004; 350(6): 586-597.
5.
Ekman A, Hokynar K, Kakkola L et al. Biological and immunological relations
among human parvovirus B19 genotypes 1 to 3. J Virol 2007; 81(13): 6927-6935.
6.
Grabarczyk P, Kalinska A, Kara M et al. Identification and Characterization of
Acute Infection With Parvovirus B19 Genotype 2 in Immunocompromised Patients in Poland. J Med Virol 2011; 83: 142-149.
7.
Bonvicini F, Puccetti C, Salfi NCM et al. Gestational and fetal outcomes in B19 maternal infection: a problem of diagnosis. J Clin Microbiol 2011; 49(10): 3514-3518.
8.
485-505.
29. Enders M, Schalasta G, Baisch C et al. Soderlund-Venermo M. Human parvovirus
B19 infection during pregnancy – Value of modern molecular and serological
diagnostics. J Clin Virol 2006; 35: 400-406.
30. Lenkiewicz B, Zupanska B, Roszkowski T et al. Parvovirus B19 infection in nonimmune hydrops fetalis. Vox Sang 1998; 74: 1415.
31. Oszukowski P, Malafiej E, Pertynski T i wsp. Infection with parvovirus B19 in
pregnant women. Ginekol Pol 1996; 67(3): 114-116.
32. Bredl S, Plentz A, Wenzel JJ et al. False-negative serology in patients with acute
parvovirus B19 infection. J Clin Virol 2011; 51(2): 115-120.
33. Liefeldt L, Plentz A, Klempa B et al. Recurrent high level parvovirus B19/ge-
human parvovirus B19 infection in pregnancy: prospective evaluation of 1018
notype 2 viremia in a renal transplant recipient analyzed by real-time PCR for
simultaneous detection of genotypes 1 to 3. J Med Virol 2005; 75(1): 161-169.
Kalińska A. Parvowirus B19 (B19V) w: Brojer E, Grabarczyk P (red.). Czynniki
34. Baylis SA, Buchheit KH. A proficiency testing study to evaluate laboratory per-
zakaźne istotne w transfuzjologii. Fundacja Pro Farmacia Futura, Warszawa,
formance for the detection of different genotypes of parvovirus B19. Vox Sang
2015: 127-144.
10. Parsyan A, Candotti D. Human erythrovirus B19 and blood transfusion – an
update. Transfus Med 2007; 17(4): 263-278.
11. Lefrere JJ, Servant-Delmas A, Candotti D et al. Persistent B19 infection in immunocompetent individuals: implications for transfusion safety. Blood 2005;
106(8): 2890-2895.
166
Epidemiol Infect2008; 136(8): 1059-1068.
28. Heegaard ED, Brown KE. Human parvovirus B19. Clin Microbiol Rev 2002; 15(3):
Enders M, Weidner A, Zoellner I et al. Fetal morbidity and mortality after acute
cases. Prenat Diagn 2004; 24: 513-518.
9.
parvovirosis. Ginekol Pol 2008; 79(3): 186-191.
Fauquet CM, Mayo MA. Maniloff J et al. Virus Taxonomy: VIIIth Report of the
London, 2005.
3.
Virol 2010; 49: 163-168.
Diagnostyka laboratoryjna zakażenia parvowirusem B19 u kobiet w ciąży. Remendacje/06_ciaza%20z%20okladka.pdf
2.
late intrauterine fetal death after gestational parvovirus B19 infection. J Clin
2009; 97(1): 13-20.
35. Baylis SA, Fryer JF, Grabarczyk P. Effects of probe binding mutations in an assay
designed to detect parvovirus B19: Implications for the quantitation of different
virus genotypes. J Virol Methods 2007; 139(1): 97-99.
36. Baylis SA, Shah N, Minor PD. Evaluation of different assays for the detection
of parvovirus B19 DNA in human plasma. J Virol Methods 2004; 121(1): 7-16.
Diagn Lab 2015; 51(2): 157-168
37. Cohen BJ, Gandhi J, Clewley JP. Genetic variants of parvovirus B19 identified
in the United Kingdom: Implications for diagnostic testing. J Clin Virol 2006;
36(2): 152-155.
38. Grabarczyk P, Kalinska A, Sulkowska E et al. False Negative Results in High Viremia Parvovirus B19-Samples Tested with Real-Time PCR. Pol J Microbiol2010;
59(2): 129-132.
39. Koppelman MHGM, Cuijpers HTM, Wessberg S et al. Multicenter evaluation of
a commercial multiplex polymerase chain reaction test for screening plasma
donations for parvovirus B19 DNA and hepatitis A virus RNA. Transfusion 2012;
52(7): 1498-1508.
40. Lee T-H, Kleinman SH, Wen L et al. Distribution of parvovirus B19 DNA in blood
compartments and persistence of virus in blood donors. Transfusion 2011;
51(9): 1896-1908.
41. Matsukura H, Shibata S, Tani Y et al. Persistent infection by human parvovirus
B19 in qualified blood donors. Transfusion 2008; 48(5): 1036-1037.
42. Baylis SA, Ma L, Padley DJ et al. Collaborative study to establish a World Health
Organization International genotype panel for parvovirus B19 DNA nucleic acid
amplification technology (NAT)-based assays. Vox Sang 2012; 102(3): 204-211.
43. Baylis SA, Chudy M, Blümel J et al. Collaborative study to establish a replacement
World Health Organization International Standard for parvovirus B19 DNA nucleic acid amplification technology (NAT)-based assays. Vox Sang 2010; 98: 441-446.
44. Siennicka J, Trzcinska A. Comparison of three enzyme immunoassays used
to detect human parvovirus B19-specific IgM antibodies in sera of people suspected of measles. Med Sci Monitor 2010; 16(5): BR154-159.
45. Matsuda H, Sakaguchi K, Shibasaki T et al. Intrauterine therapy for parvovirus
B19 infected symptomatic fetus using B19 IgG-rich high titer gammaglobulin.
J Perinat Med 2005; 33: 561-563.
46. Mace G, Sauvan M, Castaigne V et al. Clinical presentation and outcome of 20
fetuses with parvovirus B19 infection complicated by severe anemia and/or
fetal hydrops. Prenat Diagn 2014; 34: 1023-1030.
167
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
168