Wykorzystanie widm dyfrakcyjnych Fresnela w diagnostyce

Transkrypt

Application of Fresnel diffraction patterns
in microbiological diagnosis
Igor Buzalewicz1, Alina Wieliczko2, Halina Podbielska1
1
Grupa Bio-Optyki, Instytut Inżynierii Biomedycznej i Pomiarowej, Politechnika Wrocławska, Wybrzeże Wyspiańskiego 27, 50-370 Wrocław
2
Katedra Epizootiologii z Kliniką Ptaków i Zwierząt Egzotycznych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Wrocławski Uniwersytet Przyrodniczy,
Plac Grunwaldzki 45, 50-366 Wrocław, [email protected]
Streszczenie
Zaproponowano nową technikę pomiarową opartą na
analizie zjawiska dyfrakcji światła na koloniach bakterii hodowanych na podłożach stałych w układzie
optycznym ze zbieżną sferyczną wiązką oświetlającą.
Hodowla bakterii na podłożach stałych należy do najpopularniejszych procedur laboratoryjnych wykorzystywanych w mikrobiologii. Zaproponowana konfiguracja układu optycznego daje możliwość rejestracji
widm dyfrakcyjnych zarówno Fresnela, jak i Fraunhofera w tym samym układzie i w skończonym obszarze
przestrzeni obserwacji, możliwość regulacji rozmiarów
poprzecznych widm dyfrakcyjnych, łatwy sposób kalibracji układu oraz niski poziom zniekształcenia widm
przez aberracje optyczne. Zaproponowany model fizyczny oparty na skalarnej teorii dyfrakcji pozwolił na wyjaśnienie transformacji światła przez kolonie bakterii
w rozważanym układzie optycznym. Uzyskane wyniki
badań eksperymentalnych przeprowadzonych na bakteriach: Escherichia coli (0119), Citrobacter freundii,
Proteus mirabilis oraz Staphylococcus aureus wykazały, iż kolonie tych bakterii generują widma dyfrakcyjne
Fresnela o unikalnej strukturze przestrzennej, co może
być wykorzystane w celu ich klasyfikacji. Ponadto wykazano związek pomiędzy zmianami strukturalnymi
kolonii bakterii wywołanymi warunkami inkubacji
kolonii a ich widmami dyfrakcyjnymi. Uzyskane wyniki wskazują na możliwość zastosowania zaproponowanej techniki pomiarowej w laboratoriach diagnostyki
mikrobiologicznej.
Słowa kluczowe: skaterometria, dyfrakcja światła, rozpraszanie światła, widma Fresnela, bakterie, kolonie bakterii,
identyfikacja bakterii
Abstract
The novel measurement method based on analysis of
the light diffraction on bacterial colonies grown on solid
Acta Bio-Optica et Informatica Medica 3/2012, vol. 18
nutrient media in optical system with converging spherical wave illumination, is proposed. Proposed configuration of optical system enables recording of both Fresnel
and Fraunhofer diffraction patterns in the same setup in
the finite region of observation space, lateral scaling of
diffraction patterns, simple adjusting and low level of
optical aberration and coherent noises. Moreover, proposed physical model based on scalar theory of diffraction enables the explanation of light transformation on
bacterial colonies in analyzed optical system. Obtained
results of experimental examination performed on bacterial colonies of Escherichia coli, Citrobacter freundii,
Proteus mirabilis and Staphylococcus aureus species
indicated that their colonies generate unique Fresnel
diffraction patterns, which can be used for their species
classification. Moreover, they the significant correlation
between spatial changes of diffraction patterns and the
morphological changes of bacterial colonies structure
caused by their incubation conditions, is observed. The
proposed method has a high application potential for
microbiological studies.
Key words: scatterometry, light diffraction, light scattering, Fresnel patterns, bacteria, bacterial colonies, bacteria
identification
Wprowadzenie
Problem szybkiej detekcji i rozpoznania bakterii jest jednym z najważniejszych zagadnień medycznych, okołomedycznych oraz biologicznych w wielu dziedzinach
współczesnego życia. Spowodowane jest to powszechnym występowaniem bakterii w naszym otoczeniu, jak
również ich zwiększającą się odpornością na dotychczas
stosowane środki antybakteryjne. W pracy przedstawiono problematykę związaną z powszechnymi technikami
wykorzystywanymi w mikrobiologii do identyfikacji bakterii ze szczególnym uwzględnieniem metod biochemicznych oraz optycznych. Zasygnalizowano również główne
niedogodności tych metod, które sprawiają, iż istnieje ko-
213
inżynieria biomedyczna / biomedical engineering
Wykorzystanie widm
dyfrakcyjnych Fresnela
w diagnostyce mikrobiologicznej
nieczność opracowania nowych technik detekcji i identyfikacji bakterii.
Pomimo iż część bakterii może koegzystować z człowiekiem, zwierzętami lub też roślinami we wzajemnie korzystnych relacjach, jak np. w przypadku naturalnej flory
bakteryjnej w naszym organizmie, to jednak istnieją również patogeny bezwzględnie chorobotwórcze. Obserwuje
się rosnącą odporność bakterii na konwencjonalnie stosowane środki przeciwbakteryjne [1-5], czego ewidentnym
przykładem mogą być lekooporne, szpitalne szczepy bakterii np. Staphylococcus aureus, tzw. MRSA (Methicillin-Resistant Staphylococcus ureus). Dlatego też problem szybkiej
identyfikacji bakterii, która umożliwia wybór odpowiedniej terapii antybiotykowej, jest istotnym zagadnieniem
współczesnych technik sensorycznych.
Powszechnie stosowane w laboratoriach mikrobiologicznych biochemiczne metody identyfikacji bakterii bazują głównie na analizie łańcucha DNA za pomocą PCR
(Polymerase Chain Reaction) – reakcji łańcuchowej polimerazy DNA, detekcji biochemicznej (np. barwienie metodą
Grama), na analizie z wykorzystaniem różnego rodzaju
odczynników, np. enzymów restrykcyjnych, jak również
znaczników immunologicznych w postaci przeciwciał
o wysoce selektywnym działaniu, lub też hodowli bakterii
na podłożach różnicujących, które umożliwiają ich rozróżnienie na podstawie specyficznych procesów metabolicznych bakterii. Jak wiadomo, analiza łańcucha DNA należy
do najskuteczniejszych metod wykorzystywanych w identyfikacji próbek biologicznych, w tym bakterii, jednak jej
istotnym ograniczeniem jest konieczność przygotowania
wysokiej jakości próbek, gdyż obecność jakiegokolwiek
innego materiału genetycznego może istotnie wpłynąć
na uzyskane wyniki, a tym samym zakwalifikowanie
bakterii do danego taksonu patologicznego. Jednocześnie
pojedynczy test genowy pozwala jednorazowo zidentyfikować tylko jeden gatunek bakterii, co może prowadzić do
znacznego zwiększenia kosztów badania, gdy konieczne
jest przebadanie dużej ilości próbek oraz identyfikacja różnych bakterii. Z kolei w przypadku barwienia metodą Grama, do głównych wad tej techniki zaliczyć możemy m.in.
konieczność wstępnego przygotowania badanych próbek,
wysokie koszty oraz długi czas identyfikacji. Dodatkowo
obserwujemy brak jednoznaczności w klasyfikacji mykobakterii oraz krętków, jak również wpływ dodatkowych
czynników, np. penicyliny, lizozymu, które mogą powodować zmiany w ścianach komórkowych bakterii. Również
klasyfikacja bakterii na podstawie procesów metabolicznych zachodzących w koloniach bakterii hodowanych na
podłożach różnicujących i powodujących ich wybarwianie
się, może być w niektórych przypadkach niejednoznaczna.
Przykładem mogą tu być bakterie Citrobacter freundii, które
stanowią florę jelitową zdrowych ludzi. Są one laktozododatnie, jednakże w pewnych przypadkach mogą fermentować cukier z opóźnieniem, co sprawia, że bywają fałszywie
mylone z bakterią Salmonelli, która jest laktozoujemna.
Problem rozpoznawania bakterii nie jest nowym zagadnieniem, jednakże z uwagi na sygnalizowaną już niedoskonałość dotychczas stosowanych technik oraz zwiększającą się adaptacyjną odporność bakterii na konwencjonalne
214
środki, jest on w dalszym ciągu jednym z najistotniejszych
problemów współczesnego społeczeństwa.
Konieczna jest dalsza praca nad nowymi technikami,
które pozwoliłyby na wyeliminowanie zasygnalizowanych niedogodności oraz pomogłyby zoptymalizować
proces klasyfikacji gatunku bakterii. Szczególną pozycję
wśród proponowanych technik sensorycznych stosowanych w mikrobiologii zajmują metody optyczne. Wśród
nich wyróżnić możemy techniki opierające się na chemiluminescencji [6, 7], pośredniej i bezpośredniej fluorescencji
[8-16], spektroskopii w podczerwieni [17-20], rezonansie
plazmonów powierzchniowych (SPR – Surface Plasmons
Resonance) [21-23] oraz rozpraszaniu światła [24-30]. Jednakże wszystkie te metody analizują transformację światła
na pojedynczych komórkach bakteryjnych, ich wodnych
zawiesinach oraz aerozolach, co wiąże się z przygotowaniem wysokiej jakości próbek oraz zastosowaniem wysoce
czułej aparatury pomiarowej. Prowadzi to tym samym do
zwiększenia czasochłonności prowadzonych pomiarów
oraz ich kosztów. Jednocześnie niewielka różnica współczynników załamania komórek bakterii oraz ośrodka,
w którym się one znajdują, powoduje, że modulacja światła przez próbkę jest mało efektywna, tzn. ogranicza się do
wąskiego kąta bryłowego. Dodatkowo zastosowanie tych
metod w laboratoriach mikrobiologicznych wymaga odpowiedniego przeszkolenia personelu pod kątem specyfiki
i odpowiedniego przygotowania próbek biologicznych, jak
również analizy otrzymanych wyników.
W ostatnich latach zaproponowano całkiem nowe podejście do powyższego zagadnienia [31-33] polegające na
analizowaniu rozpraszania światła na makroskopowych
obiektach w postaci kolonii bakterii hodowanych na podłożach stałych. Ten sposób przygotowania próbek należy
do standardowych procedur laboratoriów mikrobiologicznych, dlatego też znacznie zwiększa potencjał wdrożeniowy proponowanego rozwiązania w laboratoriach diagnostycznych. Jednocześnie należy zauważyć, iż zgodnie
z procedurami mikrobiologicznymi kolonia bakterii powstaje z pojedynczej komórki bakterii, przy czym komórki
różnych gatunków bakterii tworzą osobne kolonie. Tym
samym możliwa jest analiza próbek zawierających różne
bakterie, co jest niemożliwe w przypadku innych technik
optycznych dotąd stosowanych.
Istotną zaletą tej metody jest możliwość identyfikacji
bakterii poprzez charakteryzację światła rozproszonego
przez kolonie bakterii hodowanych na stałym podłożu,
które w znaczny sposób wzmacnia efektywność modulacji
światła przez badane obiekty w porównaniu z dotąd stosowanymi próbkami bakterii w roztworach, gdyż różnica
współczynników załamania kolonii bakterii i podłoża jest
znacznie większa niż w przypadku bakterii znajdujących
się w płynnych zawiesinach lub też w aerozolach. Analiza
dyfrakcji światła na koloniach bakterii prowadzi do zakodowania licznych informacji w obserwowanych widmach
dyfrakcyjnych. Przeprowadzone w naszej grupie badania
wykazały, iż widmo Fouriera zbioru kolonii bakterii, które
może być traktowane jako uogólniony przypadek widma
dyfrakcyjnego Fraunhofera, zawiera informację na temat
liczebności kolonii bakterii, czyli obiektów amplitudoActa Bio-Optica et Informatica Medica 3/2012, vol. 18
Konfiguracja układu optycznego
i jego własności
Zaproponowany układ optyczny do analizy dyfrakcji
światła na koloniach bakterii opiera się na zastosowaniu
zbieżnej sferycznej wiązki oświetlającej kolonię bakterii.
Układ ten (patrz rys. 1) składa się ze źródła światła (LS)
generującego skolimowaną wiązkę laserową, filtra amplitudowego (F), polaryzatora liniowego (P), oszerzacza
wiązki (BE) tworzącego wiązkę równoległą o zwiększonej
średnicy poprzecznej, przesłony irysowej (D) regulującej
średnicę wiązki, soczewki transformującej (L) tworzącej
zbieżną sferyczną wiązkę oświetlającą pojedynczą kolonię
bakterii (S), która została umieszczona na szalce Petriego
na stoliku XYZ. Generowane przez kolonię bakterii widma
dyfrakcyjne rejestrowane są za pomocą kamery CCD (C)
i archiwizowane na komputerze (K).
jest zarejestrowanie powyższych widm dyfrakcyjnych.
Na podstawie skalarnej teorii dyfrakcji widmo Fresnela
w płaszczyźnie obserwacji (x2;y2) może być opisane następującą zależnością:
 fA 
U ( x2 , y2 ) = C ( λ , Z1 , Z 2 ) 
ψ ( x2 , y2 , Z 2 ) ⋅
 f − z1 
⋅ ℑ t ( x , y )ψ x , y , Z
{
b
1
1
(
1
1
)}
fx =
(1)
x2 Z 2
y Z
; fy= 2 2
λ
λ
gdzie (x1; y1) – odnosi się do płaszczyzny przedmiotowej,
w której zlokalizowana jest kolonia bakterii o transmitancji amplitudowej tb(x1; y1), f x, f y – oznaczają częstości przestrzenne wyrażone w m-1, ℑ{...} – dwuwymiarową transformację Fouriera, λ – długość fali stosowanego światła,
f – odległość ogniskową soczewki transformującej, z1 – odległość płaszczy przedmiotowej od tylnej powierzchni
soczewki transformującej, Z2=1/z2, C(…) jest pewną stałą
charakterystyczną dla przekształceń dyfrakcyjnych, a parametr Z jest wyrażony w następujący sposób:
ZF
Z = Z 2 − 1
Z1 − F
(2)
Z kolei funkcja w postaci Ψ(x, y, p) przedstawia funkcję
Gaussa:
 iπp 2
(3)
ψ ( x, y, p ) = exp 
( x + y 2 )
 λ
Widzimy zatem, iż przy ustalonym położeniu próbki,
widma Fresnela kolonii bakterii możemy zarejestrować
w płaszczyznach obserwacji, dla których Z > 0. W celu
obserwacji widma Fraunhofera należy wyeliminować
człon fazy kwadratowej wyrażonej przez funkcję Gaussa
ψ x1 , y1 , Z , gdyż tylko w tym przypadku uzyskamy przekształcenie
Fouriera samej transmitancji amplitudowej kolonii bakterii, co oznacza,
że Z = 0. Warunek ten spełniony jest
jedynie dla płaszczyzny obserwacji
zlokalizowanej w tylnej płaszczyźnie ogniskowej soczewki transformującej. Konwencjonalnie układ ten
był dotychczas stosowany w optycznym przetwarzaniu informacji do
analizy płaskich przezroczy, jednak
Rys. 1 Schemat układu optycznego do analizy dyfrakcji światła na koloniach bakterii (objaśnienia należy zauważyć, iż w przypadku
w tekście)
kolonii bakterii, ich profil ma pewien promień lub też promienie krzywizny, co prowadzi
Do głównych zalet zaproponowanej konfiguracji układu
do dodatkowej modulacji fazowej wejściowej fali świetlnej
optycznego zaliczyć należy możliwość obserwacji zarówprzez kolonię bakterii. Modulacja jest zależna do promieno widm dyfrakcyjnych Fresnela oraz widm Fraunhofera,
nia krzywizny rb kolonii bakterii, jak również od współjak również możliwość płynnej zmiany rozmiarów przeczynnika załamania nb światła kolonii bakterii i prowadzi
strzennych – skali rejestrowanych widm dyfrakcyjnych,
ona do przesunięcia płaszczyzny obserwacji widm Fraunktóre odróżniają go od uprzednio zastosowanego układu
hofera w stosunku do płaszczyzny ogniskowej soczewki
skaterometryczego [31-33]. Widma Fraunhofera są obsertransformującej.
wowane jedynie w płaszczyźnie ogniskowej obrazowej
W tym przypadku parametr opisany równaniem (2)
soczewki transformującej w tzw. płaszczyźnie przekształprzybiera następującą postać:
cenia Fouriera, natomiast widma Fresnela we wszystkich
płaszczyznach obserwacji położonych pomiędzy badanym
ZF
Z ′ = Z 2 − 1 − R
(4)
obiektem a płaszczyzną ogniskową obrazową soczewki
Z1 − F
transformującej. Przesuwając kamerę wzdłuż osi optyczgdzie R = ( nb − 1) ( r∞−1 − rb−1 ).
nej, przy ustalonym położeniu badanej próbki, możliwe
(
)
215
wo-fazowych modulujących wejściową wiązkę świetlną. Opracowana technika analizy informacji obrazowej
w oparciu o przekształcenia optyki dyfrakcyjnej została
wykorzystana do oceny efektywności działania nanomateriałów o właściwościach antybakteryjnych [34-36].
Obecnie prowadzone badania związane są z zaproponowaniem nowej konfiguracji układu skateromterycznego do
analizy dyfrakcji światła na koloniach bakterii, który opiera się na układzie optycznym ze zbieżną sferyczną wiązką
oświetlającą [37, 38, 39] w celu optymalizacji procesu klasyfikacji bakterii na podstawie widm dyfrakcyjnych ich
kolonii.
Widzimy zatem, iż w przypadku analizy widm dyfrakcyjnych Fraunhofera kolonii bakterii, konieczna jest
znajomość profilu kolonii bakterii, który w zależności od
warunków inkubacji może się różnić nawet w obrębie tej
samej próbki. Z tego też powodu zdecydowano się na analizę widm Fresnela kolonii bakterii.
Należy również wspomnieć, iż w zaproponowanym
układzie optycznym przy ustalonym i stałym położeniu płaszczyzny obserwacji – położeniu kamery, osiowa
zmiana położenia badanego obiektu prowadzi do zmiany
rozmiarów poprzecznych generowanego widma dyfrakcyjnego. Wraz ze wzrostem odległości pomiędzy obiektem
a płaszczyzną obserwacji uzyskujemy powiększenie widma dyfrakcyjnego, natomiast odwrotna zmiana tej odległości prowadzi do zmniejszenia rozmiarów poprzecznych
widm dyfrakcyjnych. Ostatnia cecha jest szczególnie istotna, gdyż umożliwia rejestrację widm za pomocą kamery
o znacznie mniejszych rozmiarach matrycy detektora bez
utraty informacji zawartej w analizowanych widmach, co
w znaczny sposób zmniejsza koszt badania.
Oprócz opisanych powyżej zalet omawianego układu
należy wspomnieć, iż zastosowanie zbieżnej, sferycznej
wiązki oświetlającej prowadzi do znacznego ograniczenia
aberracji optycznych, które muszą być skorygowane jedynie dla punktów zlokalizowanych na osi optycznej. Fakt
ten dodatkowo wpływa na ograniczenie kosztów konfiguracji układu, gdyż wiąże się z wykorzystaniem mniejszej liczby elementów optycznych. Prowadzi to również
do ograniczenia szumów związanych z odbiciami oraz
ugięciem światła na rozważanych elementach optycznych,
co jest szczególnie istotne ze względu na wysoki stopień
koherencji wykorzystywanych źródeł światła.
Eksperymentalne widma
Fresela kolonii bakterii
Analizowane próbki bakterii Escherichia coli (PCM 011),
Citrobacter freundii (PCM 531), Proteus mirabilis (PCM 547)
oraz Staphylococcus aureus (PCM 2267) uzyskane z hodowli
Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN zostały przygotowane w laboratorium mikrobiologicznym
w Instytucie Epizootiologii oraz Administracji Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu według standardowych procedur mikrobiologicznych.
Zawiesiny bakterii były wstępnie inkubowane w temperaturze 37°C przez 24 godziny. Następnie bakterie zostały
naniesione na podłoże hodowlane (Columbia agar, producent: Oxoid) i były dalej inkubowane w temperaturze 37°C
przez kolejne 16 godzin. Następnie zostały one umieszczone w zaprojektowanym układzie optycznym. Pojedyncze
kolonie bakterii były oświetlone zbieżną, sferyczną wiązką świetlną, a ich widma Fresnela zostały zarejestrowane
(patrz rys. 2). Widzimy zatem, iż widma Fresnela kolonii
różnych gatunków bakterii w istotny sposób różnią się
między sobą. Okrągły kształt tych widm dyfrakcyjnych,
podobnie jak w przypadku znanego w optyce dysku
Airy’ego, jest spowodowany okrągłym kształtem przekroju poprzecznego kolonii bakterii. Widzimy zatem, iż
dyfrakcję światła na kolonii bakterii możemy rozpatrywać
216
Rys. 2 Przykładowe widma Fresnela kolonii bakterii Escherichia
coli (PCM 011), Citrobacter freundii (PCM 531), Proteus mirabilis
(PCM 547) oraz Staphylococcus aureus (PCM 2267)
w kontekście dyfrakcji światła na nieprzepuszczalnym lub
też częściowo przepuszczalnym obiekcie o symetrii kołowej, przy czym właściwości transmisyjne kolonii bakterii
odgrywają tu szczególnie istotną rolę i wpływają na wyjściową strukturę przestrzenną obserwowanego widma
dyfrakcyjnego.
Widmo dyfrakcyjne kolonii bakterii Staphylococcus aureus ma postać koncentrycznych pierścieni o regularnym
kształcie, które w wyraźny sposób odróżniają się od pozostałych widm dyfrakcyjnych innych gatunków bakterii.
Z kolei widmo dyfrakcyjne kolonii Escherichia coli posiada
jedno centralne maksimum dyfrakcyjne w postaci pierścienia, od którego odchodzą liczne boczne promieniste
maksima boczne. Widmo Fresnela kolonii bakterii Proteus
mirabilis charakteryzuje się silnym pierścieniowym maksimum otaczającym centralny dysk, którego nieregularna
struktura oraz modulacja wywołane są przez silne efekty interferencyjne. Spowodowane jest to w głównej mierze tym, iż komórki tych bakterii są silnie orzęsione, co
w znaczny sposób zwiększa ich ruchliwość na podłożach
hodowlanych i w konsekwencji prowadzi do powstawania
kolonii o nieregularnym kształcie. Ostatnie widmo dyfrakcyjne kolonii bakterii Citrobacter freundii ma postać silnie
modulowanego dysku centralnego z charakterystyczną
siateczkowatą strukturą oraz promieniście odchodzącymi
od niego maksimami bocznymi.
Zarejestrowane widma Fresnela analizowanych kolonii
bakterii w istotny sposób różnią się między sobą rozkładem przestrzennym, zatem istnieje możliwość ich wykorzystania w procesie klasyfikacji oraz identyfikacji gatunku kolonii bakterii. Należy jednak pamiętać, iż struktura
morfologiczna kolonii bakterii jest uzależniona od warunków inkubacji kolonii, a ich zmiana może prowadzić do
powstania kolonii tego samego szczepu o diametralnie
różniącej się strukturze oraz właściwościach transmisyjnych. Tym samym, aby możliwe było zastosowanie analizy
widm Fresnela kolonii bakterii w ich identyfikacji, należy
dokonać standaryzacji warunków inkubacji, szczególnie
Przykładowy wpływ warunków
inkubacji na widma Fresnela
kolonii bakterii na przykładzie
Proteus mirabilis
W celu przeanalizowania wpływu niektórych warunków
inkubacji, m.in. rodzaju podłoża oraz jego zwilżalności na
widma Fresnela kolonii bakterii, przedstawione zostaną
przykładowe wyniki badań eksperymentalnych dla kolonii bakterii Proteus mirabilis. Jak już wspomniano wyżej,
bakterie te są silnie orzęsione, co wpływa decydująco na
ruchliwość tych bakterii na powierzchni podłoża hodowlanego. W konsekwencji tego zjawiska kolonie tego gatunku bakterii mają rozmyte nieregularne kształty, dlatego też
w praktyce mikrobiologicznej określa się je mianem kolonii
mgławicowych (patrz rys. 3). Granice pomiędzy koloniami
są nieregularne i w zasadzie wszystkie kolonie łączą się ze
sobą, tworząc losową strukturę o niejednorodnym kształcie. Wyraźnie wyróżnione są jedynie obszary, w których
zlokalizowane są najstarsze komórki tworzące „jądro” kolonii bakterii, co związane jest z dużym nagromadzeniem
produktów ich przemiany materii. Ta struktura „makrokolonii” jest w naszym przypadku dalece niepożądana,
gdyż podczas analizy dyfrakcji światła na niej powoduje
powstanie widm dyfrakcyjnych o nieregularnym oraz losowym rozkładzie przestrzennym (patrz rys. 4).
Rys. 3 Przykładowe zdjęcia: a – makroskopowe kolonii, b – mikroskopowe
(obiektyw 10x, mikroskop Nikon Eclipse 2000) bakterii Proteus mirabilis
i zmniejszenia jego zwilżalności, a tym samym ograniczenia ruchliwości komórek bakteryjnych na powierzchni podłoża hodowlanego. Bakterie naniesiono dopiero po odparowaniu alkoholu z powierzchni podłoża. W konsekwencji na
podłożach hodowlanych powstają odseparowane kolonie
bakterii o bardziej regularnych kształtach, co wpływa na
powtarzalność uzyskiwanych widm Fresnela (patrz rys. 5),
które wykazują zbliżone cechy charakterystyczne.
Rys. 5 Przykładowe widma Fresnela kolonii bakterii Proteus mirabilis
Różne stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej podłoża hodowlane posiadają różnorodny skład chemiczny, który
wpływa na metabolizm komórek bakterii i wytwarzanych
przez nie produktów przemiany materii, a tym samym
struktury ich kolonii, które generować będą różne widma
dyfrakcyjne. Dlatego też w przypadku stosowania analizy
widm dyfrakcyjnych w procesie identyfikacji bakterii konieczne jest uwzględnienie tych czynników. Pokazano to
na przykładzie bakterii Proteus mirabilis hodowanych zgodnie z przedstawioną powyżej metodologią laboratoryjną
na dwóch różnych podłożach: Columbia agar (Oxoid) oraz
MacConkey (Oxoid). Przed naniesieniem zawiesiny bakterii
na powierzchnię podłoża, zostało ono zmodyfikowane we
wspomniany powyżej sposób w celu ograniczenia ruchliwości komórek bakterii. W obu przypadkach uzyskano widma
Fresnela o różnej strukturze przestrzennej (patrz rys. 6).
Rys. 4 Przykładowe widma Fresnela nieregularnych kolonii bakterii Proteus mirabilis o losowej strukturze przestrzennej
Analizowane kolonie bakterii należą do grupy kolonii
powierzchniowych, tzn. że struktura kolonii tworzy się na
powierzchni podłoża hodowlanego, a nie jak to jest w przypadku niektórych bakterii, które tworzą kolonie zlokalizowane wewnątrz warstwy podłoża. Na powierzchnię podłoża hodowlanego naniesiono, tuż przed wysianiem bakterii,
alkohol metylowy w celu wysuszenia powierzchni podłoża
Rys. 6 Przykładowe widma Fresnela kolonii bakterii Proteus mirabilis hodowanych na podłożu: a – MacConkeya, b – Columbia agar
217
temperatury, rodzaju podłoża czy też zwilżalności podłoża w przypadku silnie ruchliwych bakterii.
Podsumowanie
9. R.G. Pinnick, S.C. Hills, S. Niels, N.F. Fell, Y.L. Pan, J. Bottiger,
B.V. Bronk, S. Holler, R.K. Chang: Fluorescence from airborne micropar-
Zaproponowany układ optyczny do analizy dyfrakcji
światła na koloniach bakterii ze zbieżną sferyczną wiązką
oświetlającą posiada unikalne właściwości. Możliwa jest
rejestracja widm Fresnela, jak również widm Fraunhofera
w tej samej konfiguracji układu optycznego. Jednak z uwagi
na strukturę przestrzenną kolonii bakterii, w celu obserwacji widm Fraunhofera, konieczne jest dokładne określenie
profilu kolonii. Zaproponowany układ umożliwia regulację
rozmiarów przestrzennych rejestrowanych widm dyfrakcyjnych, co prowadzić może do ograniczenia rozmiarów
matryc światłoczułych stosowanych kamer, a tym samym
ogranicza koszty badania. Widma Fresnela kolonii różnych
gatunków bakterii charakteryzują się osobniczymi cechami,
które mogą zostać wykorzystane w procesie ich identyfikacji, jednakże konieczne jest opracowanie procedur standaryzujących proces inkubacji kolonii bakterii. Stworzenie baz
referencyjnych widm Fresnela kolonii wzorcowych gatunków bakterii, uzyskanych w ustalonych warunkach inkubacji, prowadzić może do opracowania metody identyfikacji
bakterii, która mogłaby znaleźć powszechne zastosowanie
w laboratoriach mikrobiologicznych. Dotychczas przeprowadzone badania nad analizą widm dyfrakcyjnych Fresnela kolonii bakterii z wykorzystaniem metod statystycznych
wykazały, iż możliwa jest klasyfikacja ich gatunku z 92%
skutecznością [40], jednakże zastosowanie bardziej zaawansowanych metod analizy informacji obrazowej pozwala na
uzyskanie skuteczności na poziomie 98%. n
Podziękowania
ticles: dependence on size, concentration of fluorophores, and illumination
intensity, Applied Optics, 40 (18), p. 3005-3013, 1995.
10. R.G. Pinnick, S.C. Hill: Real – time measurement of fluorescence spectra from single airborne biological particles, Field Analytical Chemistry and Technology, 3, p. 221-239, 1999.
11. A. Maninien, M. Putkiranta et al.: Instrumentation for measuring
fluorescence cross sections from airborne microsized particle, Applied
Optics, 47(7), p. 110-115, 2008.
12. L.J. Rodziemski: From LASER to LIBS, the path of technology development, Spectrochim. Acta Part B, 57, p. 1109-1113, 2002.
13. S. Morel, N. Leone, P. Adam et al.: Detection of bacteria by time-resolved laser-induced breakdown spectroscopy, Applied Optics 42(30),
p. 6184-6191, 2003.
14. D.L. Rosen: Bacterial endospore detection using photoluminescence
from terbium dipicolinate, Rev. Anal. Chem. 18, p. 1-21, 1999.
15. S. Santra, K. Wang et al.: Development of novel dye – doped silica nanoparticles for biomarker application, J. Biomed. Opt. 6, p. 160-166, 2001.
16. W. Lian, S.A. Litherland et al.: Ultrasensitive detection of biomolecules with dye – doped nanoparticles, Analytical Biochemistry 334,
p. 135-144, 2004.
17. S.F. Al-Khaldi, M.M. Mossoba, A.A. Ismail, F.S. Fry: Accelerating
bacterial identification by infrared spectroscopy by employing microarray deposition of microorganisms, Foodborne pathogens and disease
1(3), p. 172-177, 2004.
18. D.Y. Duygu, T. Baykal, I. Acikgoz, K. Yildiz: Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy for biological studies, G.U. Journal of Science, 22( 3), p. 117-121, 2009.
19. O. Preisner, J. Lopes, R. Guimar, J. Machado, J. Menezes: Fourier
transform infrared (FT-IR) spectroscopy in bacteriology: towards a reference method for bacteria discrimination, Analytical and Bioanalyti-
Opisane badania stanowią podstawę projektu badawczego
MNiSW N N505 557739.
Bibliografia
cal Chemistry 387(5), p. 1739-1748, 2007.
20. G. Naja, P. Bouvrette, S. Hrapovic, J.H.T. Luong: Raman-based detection of bacteria using silver nanoparticles conjugated with antibodies,
Analyst. 132, p. 679-686, 2007.
21. J. Homola: Spectral surface plasmon resonance biosensor for detection
1. S.G.B. Amyes: The rise in bacterial resistance, BMJ, 320, p. 199-200,
2000.
of staphylococcal enterotoxin B in milk, International Journal of Food
Microbiology, 75(1-2), p. 61-69, 2002.
2. A.S. Colsky, R.S. Kirsner, F.A. Kedrel: Analysis of antibiotic suscep-
22. P. Leonard, S. Hearty, J. Quinn, R. O’Kennedy: A generic approach
tibilities of skin wound flora in hospitalized dermatology patients: The
for the detection of whole Listeria monocytogenes cells in contaminated
crisis of antibiotic resistance has been come to the surface, Arch Derma-
samples using surface plasmon resonance, Biosensors and Bioelectro-
tol, 134, p. 1006-1009, 1998.
nics 19(10), p. 1331-1335, 2004.
3. R.P. Leclercq, P. Courvalin: Bacterial resistance to macrolide, linosa-
23. A. Subramanian, J. Irudayaraj, T. Ryan: A mixed self-assembled mo-
mide and streptogramin antibiotics by target modification, Antibacte-
nolayer-based surface plasmon immunosensor for detection of E. coli
rial Agents and Chemotherapy 35(7), p. 1267-1272, 1991.
4. S.B. Levy: The challenge of antibiotic resistance, Scientific American,
278, p. 46-53, 2008.
5. S.B. Levy: Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and
responses, Nature Medicine Supplement, Vol. 10, p. 122-129, 2008.
6. A.C. Samuels, A.P. Snyder et al.: Classification of Select Category
A and B Bacteria by Fourier Transform Infrared Spectroscopy, Applied
Spectroscopy 63(1), p. 14-24, 2009.
7. D. Ivnitski, I. Abdel-Hamid, P. Atanasov, E. Wilkins: Biosensors
for detection of pathogenic bacteria, Biosensors & Bioelectronics 14,
p. 599-624, 1999.
8. S. Holler, R.G. Pinnick et al.: Single – shot fluorescence spectra of indi-
O157:H7, Biosensors & Bioelectronics 21(7), p. 998-1006, 2006.
24. G.E. Fernandes, Y.G. Pan et al.: Simultaneous forward- and backwardhemisphere elastic- light- scattering patterns of respirable- size aerosols,
Optics Letters 31(20), p. 3034-3036, 2006.
25. P.J. Wyatt: Differential light scattering: a physical method for identifying
living bacterial cells, Applied Optics 7(10), p. 1879-1895, 1968.
26. P.H. Kaye, J.E. Barton et al.: Simultaneous light scattering and intrinsic fluorescence measurement for the classification of airborne particles,
Applied Optics 39(21), p. 3738-3745, 2000.
27. Y.L. Pan, K.B. Aptowicz et al.: Characterizing and monitoring respiratory
aerosols by light scattering, Optics Letters 28(8), p. 589-591, 2003.
28. S. Holler, S. Zomer et al.: Multivariate analysis and classification of
vidual micrometer – sized bioaerosols illuminated by a 351- or a 266 – nm
two-dimensional angular optical scattering patterns from aggregates,
ultraviolet laser, Optics Letters, 24(2), 1999, 116-118.
Applied Optics 43(33), p. 6198-6206, 2004.
218
36. I. Buzalewicz, K. Wysocka-Król, K. Kowal, H. Podbielska: Eva-
from aerosolized spores: Observations and calculations, Optics Letters
luation of antibacterial agents efficiency, Information Technologies
32(22), p. 3358-3360, 2007.
in Biomedicine 2, E. Pietka, J. Kawa ed., Springer-Verlag, Berlin,
30. Ch. Li, G.W. Kattawar et al.: Identification of aerosols by their backscattered Mueller images, Optics Letters 14(8), p. 3616-3621, 2006.
31. P.E. Bae, P.P. Banada, K. Huff, A.K. Bhunia, J.P. Robinson, E.D.
Hirleman: Biophysical modeling of forward scattering form bacterial
colonies using scalar diffraction theory, Applied Optics 46(7), p. 36393648, 2007.
32. E. Bae, P.P. Banada, K. Huff, A.K. Bhunia, J.P. Robinson, E.D. Hirleman: Analysis of time – resolved scattering from macroscale bacterial
colonies, Journal of Biomedical Optics 13(1), p. 014010 -1-8, 2008.
33. E. Bae, N. Bai, A. Aroonnual, J.P. Robinson, A.K. Bhunia, E.D.
2010.
37. I. Buzalewicz: Pomiary optyczne w mikrobiologii, Metrologia dziś
i jutro, J. Jakubiec, Z. Moroń, H. Juniewicz (Eds.), Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, p. 357-368, 2010.
38. I. Buzalewicz, A. Wieliczko, H. Podbielska: Novel optical sensor for
bacteria detection as the way to combat pathogenic microbes, Biomedical Engineering Acta 4, Podbielska H., Trziszka T. (Eds.), Indygo
Zahir Media Wrocław, p. 97-106, 2011.
39. I. Buzalewicz, A. Wieliczko, H. Podbielska: Influence of various growth conditions on Fresnel diffraction patterns of bacteria colonies exami-
Hirleman: Modeling light propagation through bacterial colonies
ned in the optical system with converging spherical wave illumination,
and its correlation with forward scattering, J. Biomed. Opt. 15(4),
Optics Express 19(22), p. 21768-21785, 2011.
p. 045001-1–10, 2010.
34. I. Buzalewicz, K. Wysocka-Król, H. Podbielska: Exploiting of
optical transforms for bacteria evaluation in vitro, Proc. SPIE 7371,
p. 73711H-73711H-6, 2009.
35. I. Buzalewicz, K. Wysocka-Król, H. Podbielska: Image processing
40. A. Suchwałko, I. Buzalewicz, H. Podbielska: Computer-based classification of bacteria species by analysis of their colonies Fresnel diffraction patterns, Proceedings of SPIE vol. 8212, p. 82120R-1-13, 2012.
otrzymano/received: 04.05.2012
zaakceptowano/accepted: 14.09.2012
guided analysis for estimation of bacteria colonies number by means of
optical transforms, Optics Express 18(12), p. 12992-13005, 2010.
219
29. J.C. Auger, K.B. Aptowicz et al.: Angularly resolved light scattering

Wykorzystanie widm dyfrakcyjnych Fresnela w diagnostyce

Transkrypt

Podobne dokumenty

Pytania do egzaminu licencjackiego 2012 1. Adaptacje związane z

Mechanizm niszczenia bakterii przy udziale nano