Starzenie limfocytów CD8+ in vivo i in vitro – charakterystyka

Starzenie limfocytów CD8+ in vivo i in vitro – charakterystyka

Wpływ inhibitorów na wartości
kinetycznych efektów izotopowych
w reakcji katalizowanej przez enzym
fenololiazę tyrozynową
Wojciech Augustyniak, Marianna Kańska
Pracownia Peptydów, Wydział Chemii Uniwersytetu Warszawskiego
IV Krajowa Konferencja „Radiochemia i Chemia Jądrowa”
Kraków – Przegorzały, 9-11 maja 2005
Plan wystąpienia
1. Wstęp:
- ogólna charakterystyka fenololiazy tyrozynowej
- mechanizm działania enzymu
2. Metody wyznaczania KIE w badanej reakcji za pomocą metody
konkurencyjnej (radiochemia) i niekonkurencyjnej (pomiary kinetyki)
3. Wyniki badań nad wpływem rozpuszczalnika (H2O vs D2O), inhibitorów
(fenol, L-fenyloalanina, S-metylo-L-cysteina) i kwasu Lewisa (AlCl3) na
wartości kinetycznych efektów izotopowych w enzymatycznym
rozkładzie tyrozyny
4. Podsumowanie i dyskusja wyników w kontekście mechanizmu reakcji
katalizowanej przez fenololiazę tyrozynową
Fenololiaza tyrozynowa
COOH
HO




NH
+
2
TPL
H2O
PLP
+
HO
O
+
NH3
COOH
podczas reakcji ulega rozerwaniu wiązanie pomiędzy alifatycznym
i aromatycznym atomem węgla
proton z pozycji α jest częściowo przenoszony na atom węgla 1’ reszty aromatycznej
katalizuje także reakcję syntezy L-tyrozyny z pochodnych fenolu i pirogronianu,
racemizację alaniny, wymianę atomu wodoru α w kilku L-aminokwasach
oraz deaminację atomu węgla α
do aktywności katalitycznej konieczne są kationy jednowartościowe
(K+, Rb+, Cs+ lub NH4+); jony Na+ i Li+ to inhibitory TPL
Fenololiaza tyrozynowa

inaczej: β-tyrozynaza, TPL, E.C. 4.1.99.2

występowanie: Gram-ujemne
Enterobacteriaceae i niektóre stawonogi

budowa: białko α/β
wymiary 135Å x 60Å x 144Å
4 podjednostki po 51kDa
znana struktura krystalograficzna

zastosowanie:
biotechnologiczne otrzymywanie dopy
oznaczanie PLP w materiale biologicznym
utylizacja odpadów fenolowych
Mechanizm działania TPL
O-O
P
O
O
O-
HO
K 257
- O P
N
O
N
HO
- OOC
+
COO +NH
HO
O O
P
O
O
- OOC
-O
NH
+
N
H
- O
O
NH
3
O-O P
O
OH
N
- OOC
COOH
O
+
N
H
O
+
- O
- O P
O
HO
O
+
NH3
+
N
H
-O
O
O P
O
O
O
- OOC
NH
OH
+
N
H
-O
NH
O
Wyznaczanie KIE metodą niekonkurencyjną
COOH
HO
NH
+
2
H2O
1U/ml TPL
50μM PLP
pH 8.3
0.1M KPi
0.2M KCl
1mM DTT
O
+
HO
COOH
+
NH3
20U/ml LDH
0.4mM NADH
OH
COOH
v

Dodatek NADH i dużego nadmiaru LDH czyni
reakcję nieodwracalną i umożliwia bezpośredni
pomiar kinetyki poprzez spektrofotometryczny
pomiar spadku absorpcji przy 340nm
Vmax
0.5 Vmax

Pomiar szybkości reakcji dla różnych stężeń
L-tyrozyny umożliwia wyznaczenie Vmax i Km
z równania Michaelisa-Menten
v=
Km
Vmax ∗ [S]
(K m + [S])
[S]
Wyznaczanie KIE metodą konkurencyjną
COOH
HO
NH
+
2
H2O
1U/ml TPL
50μM PLP
pH 8.3
0.1M KPi
0.2M KCl
1mM DTT
O
+
COOH
HO
+
NH3
20U/ml LDH
2eq NADH
OH
COOH



Po rozdziale produktów i substratów za pomocą chromatografii jonowymiennej
wyznaczano radioaktywność właściwą wyjściowych substratów (R0), produktów (Rp)
i stopień konwersji (f); KIE obliczano używając równanie Yankwicha-Tonga:
R
ln(1− f ∗ 0 )
Rp
α=
ln(1 − f)
Metoda podwójnego znakowania, 1-14C jako standard wewnętrzny
NADH i LDH przekształcają nietrwały pirogronian w trwały L-mleczan
Efekty izotopowe w pozycji 2
Kinetyczny
efekt izotopowy H/D
αV
αV/K
Obserwowany kinetyczny efekt izotopowy H/T
4,00
3.28
2.24
± 0.13 ± 0.61
3,00
Rozpuszczalnikowy
efekt izotopowy H/D
αV
αV/K
1.49
± 0.06
1.81
± 0.25
[2- H]-L1.46
tyrozyna ± 0.11
1.67
± 0.31
L-tyrozyna
2
Obs. KIE
D2O
HO
 Atom wodoru α i cząsteczka wody biorą udział w tym samym
stanie przejściowym
 Oderwanie protonu α ma większe znaczenie dla szybkości reakcji,
niż jego następcza wymiana z rozpuszczalnikiem
3.34
2.42
± 0.25 ± 0.29
H2O
COOH
H
NH 2
2,00
H2O
D2O
1,00
-
0,10
0,20
0,30
f
0,40
0,50
Badania NMR
1
H-NMR
C D
B
AB+F
D
C
A
COOH
start
NH 2
HO
15’
D2 O
PLP
TPL
E
COOH
+
45’
+
NH 3
O
HO
F
90’
E
180’
 Wymiana protonów w pozycji 3 nie zachodzi
w widoczny sposób po dodaniu do układu
dehydrogenazy mleczanowej i LDH
Efekty izotopowe w pozycji 3
H
COOH
H H
COOH
NH 2
D
αV = 1.09 ± 0.04
D
αV/K = 0.98 ± 0.10
H
COOH
HO
HO
NH 2
T
αV/K = 1.09 ± 0.03
2
5,00
4,00
Obs. KIE
HO
NH
3,00
2,00
H2O
D2O
1,00
-
0,10
0,20
f
0,30
0,40
Wpływ produktów reakcji na KIE H/T
H
COOH
2,00
5,00
1,50
4,00
1,00
bez fenolu
0,50
f
3,00
2,00
bez fenolu
0,10
2
1,00
z fenolem
-
NH
HO
Obs. KIE
Obs. KIE
HO
COOH
H
NH 2
0,20
z fenolem
-
0,10
0,20
0,30
f
 Obserwowany KIE H/T w pozycjach 2 i 3S nie zależy od obecności:
- pozostałych produktów reakcji (kwas pirogronowy, amoniak)
- produktu ubocznego reakcji (kwas p-hydroksyfenylopirogronowy)
0,40
Stałe inhibicji fenolem
L-tyrozyna
Ki (Vmax)
[μM]
67 ± 6
Ki (Vmax/Km)
[μM]
64 ± 8
[2-2H]-L-tyrozyna
131 ± 13
83 ± 7
[3-2H2]-L-tyrozyna
97 ± 6
59 ± 6
E +S
k1
k-1
EQ
Vmax =
k 3 ∗ k 2 ∗ [E]
k 2 + k 3 + k − 2 ∗ [PhOH]
k ∗ k 3 ∗ [E]
Początkowe szybkości
Vmax = 2
reakcji:
k2 + k3
Stałe inhibicji:
V
[PhOH]
= 1+
Vi
Ki
K i ( Vmax) =
k2 + k3
k−2
PhOH
EA
k-2
PhOH
k3
E+ P
Vmax/Km
Vmax
Szybkości reakcji:
k2
Vmax / K m =
k 3 ∗ k 2 ∗ k 1 ∗ [ E]
k 3 ∗ k 2 + k 3 ∗ k −1 + k −1 ∗ k −2 ∗ [PhOH ]
Vmax / K m =
k 2 ∗ k 1 ∗[ E]
k 2 + k −1
K i (Vmax/K m ) =
k 3 ∗ (k 2 + k −1 )
k − 2 ∗ k −1
Wpływ aminokwasów na KIE H/T w pozycji 2
S
COOH
H
NH 2
COOH
HO
NH 2
2,00
 Ulega α-deprotonacji
 Ulega β-eliminacji
Obs. KIE
COOH
1,50
1,00
bez dodatku
0,50
z Phe
NH2
z S-metylo-Cys
-
 Ulega α-deprotonacji
 Nie ulega β-eliminacji
-
0,10
f
0,20
Wpływ kwasów Lewisa na wartości KIE H/T
Kwasy Lewisa przyspieszają tworzenie zasady Schiffa pomiędzy tyrozyną a PLP w roztworze
2,00
3,00
2,00
COOH
H
NH 2
1,00
HO
0,50
bez dodatku
z AlCl3
-
0,10
f
0,20
H
Obs. KIE
Obs. KIE
1,50
COOH
NH
HO
1,00
2
bez dodatku
z AlCl3
-
0,10
0,20
f
 Pomiar parametrów kinetycznych reakcji w obecności Al3+ okazał się niemożliwy.
Początkowo reakcja biegnie z szybkością zbliżoną do procesu bez dodatku soli glinu. Później
następuje maksymalnie 2.5-krotne spowolnienie procesu (przy 2mM AlCl3), prawdopodobnie
wskutek wytworzenia się zasady Schiffa.
Podsumowanie
Reakcja hydrolitycznego rozkładu tyrozyny katalizowana przez fenololiazę tyrozynową:
 zachodzi z wymianą protonów α i β z wodą
 biegnie przez etapy których względne szybkości zmieniają się w miarę trwania procesu;
np. szybkość oderwania α- i β-protonów maleje drastycznie w trakcie reakcji
 jest reakcją w której podstawienie protonów wody deuteronami nie powoduje dużej
zmiany względnej szybkości deprotonacji względem eliminacji fenolu na atomie węgla α.
Odmienna sytuacja ma miejsce podczas deprotonacji w pozycji β, gdzie woda
deuterowana zdecydowanie bardziej promuje proces deprotonacji niż to ma miejsce dla
zwykłej wody
 różnicuje diastereotopowe atomy wodoru w pozycji β, które zachowują się odmiennie
podczas całego procesu
 jest reakcją w której zmiany względnych szybkości poszczególnych etapów nie są
powodowane pojawianiem się produktów oddysocjowujących od enzymu
 może być warunkowana tworzącym się przejściowo poczas reakcji α-aminoakrylanem
związanym z PLP
 zachodzi wolniej w obecności kwasów Lewisa, ale względne szybkości poszczególnych
etapów pozostają bez istotnych zmian w obecności takich kwasów
Podziękowania
 dla dra Ryszarda Kańskiego (Pracownia Radiochemii na Wydziale Chemii
UW) – za umożliwenie wykonania eksperymentów radiochemicznych i pomoc w
ich realizacji
 dla prof. Roberta Phillipsa (University of Georgia, Athens, USA) – za
dostarczenie TPL i cenne dyskusje
 dla koleżanek z zespołu – za tworzenie dobrej atmosfery w grupie
 dla organizatorów IV Krajowej Konferencji „Radiochemia i Chemia Jądrowa” –
za umożliwienie nam zaprezentowania wyników badań
Dziękuję za uwagę!