FULL TEXT - Polski Przegląd Otorynolaryngologiczny

244
Występowanie i rola aktywnej infekcji wirusem brodawczaka
ludzkiego (HPV) w rakach płaskonabłonkowych głowy i szyi
Pevalence of active HPV infection in head and neck cancer patients
Paweł Golusiński1, Katarzyna Lamperska 2, Boudewijn JM Braakhuis3, Peter JF Snijders 4,
Jakub Pazdrowski1, Piotr Pieńkowski1, Łukasz Łuczewski1, Wojciech Golusiński1
Pol. Przegląd
Otorynolaryngol 2012;
3 (1): 244-251
SUMMARY
HPV, mainly HPV type 16 and to a lesser extent type 18, is a newly
identified causal factor for SCCHN. The association between HPV and
SCCHN is strongest for cancers of the tonsil, intermediate for the rest of
the oropharynx, and weakest for the oral cavity and larynx. However, The
prevalence of HPV in SCCHN in Poland reported in the literature varies
from 0 –72% One of the reasons of such a different results may be in our
opinion method-related false positive results. The aim of the study, was
the assessment of HPV prevalence in the head and neck cancer patients in
polish population of SCCHN patients.
The material comprised of tumor tissue obtained from 50 HNSCC patients
with a primary tumor in the oral cavity, oropharynx or larynx, who were
scheduled for surgical treatment. For all cases algorithm was performed:
First p16 immunostaining was conducted and secondly the HPV DNA has
been detected with the use of HPV DNA general primer (GP)5+/6+ PCR,
followed by RLB hybridization.
In 8% of cases the staining was observed in 50% of cancer cells or more.
There was no HPV DNA detected in any case.
There was no HPV DNA detected in any case, which may indicate the lower
HPV prevalence in polish population than in Western Europe and US and
smoking and drinking associated carcinogenesis. The p16 expression has
been found in 8% of the patients and supplementary (GP)5+/6+ PCR did
not detect the presence of HPV DNA. Thus, the p16 immunostaining is of
limited use as a sole method of HPV detection and needs to be complemented
by other techniques.
©by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów
– Chirurgów Głowy i Szyi
Otrzymano/Received:
10.07.2012
Zaakceptowano do druku/Accepted:
03.08.2012
1
Oddział Chirurgii Głowy i Szyi i Onkologii
Laryngologicznej, Wielkopolskie Centrum
Onkologii Poznań
Ordynator: Prof. Wojciech Golusiński
2
Zakład Immunologii Nowotworów,
Wielkopolskie Centrum Onkologii Poznań
3
Department of Otolaryngology/Head-Neck
Surgery, VU University Medical Center,
Amsterdam, The Netherlands
4
Department of Pathology, VU University
Medical Center, Amsterdam, The Netherlands
Wkład pracy autorów/Authors contribution:
Wg kolejności
Konflikt interesu/Conflicts of interest:
Autorzy pracy nie zgłaszają konfliktu interesów.
Adres do korespondencji/
Address for correspondence:
imię i nazwisko: dr n. med. Paweł Golusinski
adres pocztowy:
Wielkopolskie Centrum Onkologii
Oddział Chirurgii Głowy i Szyi i Onkologii
Laryngologicznej
ul. Garbary 15
61-866 Poznań
e-mail [email protected]
Hasła indeksowe: rak płaskonabłonkowy głowy i szyi, wirus brodawczaka ludzkiego, czynniki ryzyka
Key words: Head and neck cancer, Human papilloma virus, Casual risk factors
Wykaz skrótów:
Białko E (early) – białko wczesne
Białko L (late) – białko późne
CTRL (control) – kontrola
DNA (Deoxyribonucleic Acid) – kwas deoksyrybonukleinowy
DNA PK (DNA Protein Kinase) – kinaza białkowa DNA
E2F (eucariotic factor) – eukariotyczny czynnik
transkrypcyjny
EIA (enzyme immuno assay) – enzymatyczny test
immunologiczny
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) – test
immunoenzymosorbcyjny
GP5+/6+PCR (general primer PCR) – PCR z zastosowaniem uniwersalnych starterów
HNSCC (Head Neck Squamous Cell Carcinoma) – rak
płaskonabłonkowy głowy i szyi
HPV (Human Papilloma Virus) – wirus brodawczaka
ludzkiego
IGG – immunoglobulina G
ISH (In Situ Hybrydisation) – hybrydyzacja in situ
LCR (Long Control Region) – region regulatorowy
mRNA (Messenger RNA) – matrycowy RNA
OD (Optical Density) – gęstość optyczna
PCR (Polymorphism chain reaction) – reakcja łańcuchowa polimerazy
RNA (Ribonucleic Acid) – kwas rybonukleinowy
RLB (Reverse Line Blot) – hybrydyzacja typu reverse
line
RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) – PCR odwrotnej
transkryptazy
SPF PCR (short fragment PCR) – PCR krótkich
fragmentów
P o l s k i P r z e g l ą d O t o r y n o l a r y n g o l o g i c z n y t o m 1, n r 3 , l i p i e c - w r z e s i e ń 2 0 12
245
Tabela I. Rozpoznanie histopatologiczne i stopień dojrzałości nowotworu
Table I. Histopathological diagnosis of cancer and degree of maturity
Stopień dojrzałości G
N
G1
G2
G3
Carcinoma planoepitheliale keratodes
26
7
19
2
Carcinoma planoepitheliale akeratodes
13
1
7
5
Carcinoma planoepitheliale partim keratodes
11
1
8
0
Razem
50
9
34
7
Rozpoznanie
Tabela II. Klasyfikacja TNM
Table II. TNM clasyfication
Lokalizacja
TNM
T
N
M
N
T1
T2
T3
T4
N0
N1
N2
M
Jama ustna
31
2
15
5
0
10
17
4
0
Gardło środkowe
10
10
6
2
0
3
6
1
1
Krtań
9
2
4
1
3
5
4
0
0
RAZEM
50
14
25
8
3
18
27
5
1
Wstęp
Raki płaskonabłonkowe głowy i szyi stanowią heterogenną grupę nowotworów. Rozwijają się w różnych lokalizacjach pierwotnych, ale związane są ze
wspólnymi czynnikami ryzyka i wykazują podobne
cechy patologiczne.
Rocznie na świecie rozpoznaje się około 650 000
nowych zachorowań na nowotwory głowy i szyi, co
stanowi ok. 6% wszystkich nowotworów złośliwych.
W ciągu ostatnich dwudziestu lat odnotowano nieznaczny spadek ogólnej liczby zachorowań na raka
głowy i szyi, w szczególności raka krtani [1]. Jednocześnie w Europie i Stanach Zjednoczonych obserwuje
się stały wzrost zachorowań na raka zlokalizowanego
w obrębie jamy ustnej i gardła środkowego. Dotyczy to
przede wszystkim chorych poniżej 40. roku życia [2, 3].
Spożywanie wysokoprocentowych napojów alkoholowych oraz palenie tytoniu uważa się za podstawowe
czynniki ryzyka rozwoju raka głowy i szyi. Około 75%
wszystkich raków tego regionu związanych jest z występowaniem obu tych czynników.
W ostatnich latach podkreśla się znaczącą rolę
ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV) w patogenezie
raka płaskonabłonkowego głowy i szyi [4]. Około 25%
przypadków zachorowań na te nowotwory zawiera genomowe DNA onkogennych podtypów HPV, a zwłaszcza
HPV16 oraz w mniejszym stopniu HPV18 [5]. Najsilniejszy związek z wirusem HPV wykazują raki zlokalizowane w obrębie gardła środkowego, a zwłaszcza
migdałka podniebiennego. W jamie ustnej oraz krtani
onkogenne HPV występują ze zdecydowanie mniejszą
częstotliwością [6]. Raki związane z występowaniem
wirusa HPV obserwuje się częściej u osób niepalących
tytoniu i nienadużywających alkoholu. Histologicznie
charakteryzują się one niskim stopniem dojrzałości
oraz utkaniem przypominającym typ carcinoma basaloides [7].
W literaturze oraz w praktyce klinicznej terminem
rak płaskonabłonkowy głowy i szyi określa się grupę
nowotworów o różnej lokalizacji. Podobne utkanie histologiczne, lokalizacja guza oraz stopień zaawansowania
klinicznego stanowią najczęściej stosowane kryteria dla
celów zarówno projektowania badań klinicznych, jak
i opracowywania standardowych strategii leczenia czy
też prognozowania przeżywalności. Badania ostatnich
lat dowodzą jednak, iż w obrębie grupy guzów, jednorodnej pod względem wszystkich wyżej wymienionych
cech, najważniejszym kryterium zdaje się być czynnik
etiologiczny, prowadzący do inicjacji procesu nowotworzenia. Jest to bardzo istotny problem, ponieważ
grupy nowotworów o różnej etiologii są heterogenne
również pod względem epidemiologicznym, klinicznym,
a nawet prognostycznym.
Proces kancerogenezy wywołany poprzez infekcję
onkogennym wirusem HPV różni się znacząco od spowodowanego paleniem tytoniu i spożywaniem napojów
alkoholowych. Niektórzy autorzy mówią nawet o istnieniu alternatywnego modelu kancerogenezy [8, 9].
P o l s k i P r z e g l ą d O t o r y n o l a r y n g o l o g i c z n y t o m 1, n r 3 , l i p i e c - w r z e s i e ń 2 0 12
246
W rakach głowy i szyi wywoływanych przez infekcję
HPV dochodzi do zakłócania mechanizmów komórkowych związanych z białkami p53 i pRB należących
do najważniejszych regulatorów cyklu komórkowego.
Raki płaskonabłonkowe, w których stwierdzono
związek z onkogennymi typami wirusa HPV, wydają
się występować częściej u młodszych chorych, głównie
płci męskiej. Gardło środkowe, gdzie raki HPV-zależne
stanowią 40–60% wszystkich nowotworów, jest najbardziej uprzywilejowaną lokalizacją. Mimo iż w większości przypadków są to nowotwory o niskim stopniu
dojrzałości, wydają się one lepiej poddawać leczeniu,
przez co charakteryzują się lepszym rokowaniem niż
raki niezwiązane z HPV [10].
Celem pracy było poszukiwanie aktywnej infekcji
wirusem HPV16 w rakach głowy i szyi z zastosowaniem
algorytmu: badanie immunohistochemiczne dla p16
z następowym badaniem GP5+/6+-PCR.
Materiał i metody
Przedmiotem badań była tkanka nowotworowa pochodząca od 50 chorych na raka płaskonabłonkowego
regionu głowy i szyi leczonych na Oddziale Chirurgii
Głowy i Szyi i Onkologii Laryngologicznej Wielkopolskiego Centrum Onkologii w Poznaniu w latach 2007–
2009. Wszyscy chorzy poddani zostali pierwotnemu
leczeniu chirurgicznemu bądź leczeniu chirurgicznemu
uzupełnionemu o radioterapię.
Wiek chorych mieścił się w przedziale od 36 do
80 lat w chwili rozpoznania choroby. Średnio wynosił
60,06 roku (SD 12,4; mediana 58,5).W badanej grupie
chorych było 36 mężczyzn (75%) i 12 kobiet (25%).
Jako kryteria wyłączające z badania przyjęto wznowy nowotworu, ogniska będące drugimi pierwotnymi
nowotworami, a także guzy leczone pierwotną radioterapią. Chorzy, u których zabieg operacyjny stanowił
uzupełnienie nieradykalnego zabiegu pierwotnego, cytoredukcję guza lub zabiegi chirurgii ratującej również
nie kwalifikowali się do niniejszej analizy.
Rozpoznanie histopatologiczne, stopień dojrzałości nowotworu oraz TNM przedstawiają odpowiednio
tabele I i II.
Materiał tkankowy bezpośrednio po wykonaniu
zabiegu operacyjnego dzielono na dwie części. Jedną,
przeznaczoną do oceny histopatologicznej oraz badań
immunohistochemicznych, utrwalano w buforowanej
0,1 M buforem fosforanowym o pH 7,4 4% formalinie.
Drugą część materiału, przeznaczoną do badań genetycznych, niezwłocznie zamrażano i przechowywano
w temperaturze -80°.
Ekspresja p16 w tkankach nowotworowych
Do oznaczenia p16INK4a w skrócie p16 użyto zestawu
CINtecTM Histology Kit (DakoCytomation), postępując
kolejno zgodnie z zaleceniami producenta. Kontrolę
negatywną stanowił skrawek wybarwiony z zastosowaniem mysich przeciwciał IgG. Za kontrolę pozytywną
służył skrawek z raka szyjki macicy z ekspresją p16.
Preparaty oceniano pod względem ilości wybarwionych
komórek i intensywności wybarwienia. Za pozytywne
uznawano przypadki, w których ciemno brązowe wybarwienie wykazywało co najmniej 50% komórek nowotworowych. Brano pod uwagę zarówno wybarwienie
w obrębie jądra komórkowego, jak i cytoplazmy (Ryc. 1).
DNA izolowano z mrożonej tkanki nowotworowej
przy użyciu zestawu Wizard Genomic Purification Kit
(Promega).
W celu oceny jakości i ilości DNA izolowanego
z tkanki guza przeprowadzano amplifikację DNA
b-globiny, stosując swoisty PCR oraz elektroforezę
w żelu agarozowym.
Poszukiwanie infekcji onkogennymi typami wirusa
HPV
Obecność DNA wirusowego w tkankach badano z zastosowaniem techniki general primer GP5+/6+ PCR
z użyciem 50 ng DNA (ilość określona w stosunku do
zestawu Picogreen dsDNA assay kit Invitrogen, Breda,
Holandia). Za kontrole pozytywne służyły10 ng, 1 ng,
100 pg roztworu DNA pochodzące z linii komórkowych
raka szyjki macicy SiHa (zawierające od 1 do 2 kopii
HPV16 na komórkę), a za negatywne, reakcje przeprowadzone równolegle bez DNA. Produkty PCR poddawano
następnie hybrydyzacji z dwoma koktajlami znaczników
oligonukleotydowych specyficznych dla wirusów HPV
wysokiego ryzyka: HPV typ 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39,
45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82 oraz niskiego
ryzyka: 6, 11, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 57, 61, 70, 71,
72, 81, 83, 84. Detekcję hybryd przeprowadzono przy
zastosowaniu techniki immunoenzymatycznej EIA (enzyme immunoassay) opisanej poprzednio [11].
Wyniki
Ekspresja p16 w tkankach nowotworowych
Badania immunohistochemiczne 50 guzów wykazały
w 16 przypadkach (8%) intensywne wybarwienie powyżej 50% komórek nowotworowych. W 8 przypadkach
(4%) stwierdzono średnio intensywne wybarwienie
do 10% komórek nowotworowych, które zgodnie z zaleceniami dostępnymi w piśmiennictwie uznano za
wynik negatywny. W pozostałych przypadkach nie
odnotowano ekspresji p16.
Wyniki EIA
Interpretacja wyników EIA i kalkulacja poziomu odcięcia wartości OD – wyniki GP5+/6+ EIA można uznać
za prawidłowe i miarodajne, jeśli spełnione są następujące warunki:
1. Wszystkie kontrole negatywne wykazują wartości
OD405nm<0,1.
P o l s k i P r z e g l ą d O t o r y n o l a r y n g o l o g i c z n y t o m 1, n r 3 , l i p i e c - w r z e s i e ń 2 0 12
247
2. Kontrole pozytywne PCR o niskim stężeniu (np.
SiHa 100 pg) wykazują wartości równe lub nieznacznie wyższe od poziomu odcięcia, a kontrole o wysokim
stężeniu (np. SiHa 1 ng) wartości wyraźnie wyższe.
3. Wartość OD405nm dla kontroli pozytywnej EIA jest
większa od 0,5.
Kalkulację wartości poziomu odcięcia (cut-off level),
przeprowadzono w oparciu o poniższy algorytm:
Wartość
ctrl1+ctrl2+ctrl3+ctrl4
poziomu = 3x
odcięcia
4
Poziom odcięcia wartości OD dla badanego materiału ustalono na poziomie 0,1965.
W badanym materiale wartość OD w żadnym z przypadków nie osiągnęła poziomu równego lub większego
od 0,1965, co stanowi konieczny warunek pozwalający
uznać daną próbę za pozytywną w kierunku nosicielstwa DNA onkogennego typu wirusa HPV.
Omówienie
Udowodniono, że obecność DNA onkogennych typów
wirusa HPV jest związana z pewną określoną grupą
raków płaskonabłonkowych regionu głowy i szyi. Hobbs
i wsp. [6] w swojej metaanalizie w sposób kompleksowy
analizują dostępnych w piśmiennictwie 20 różnych
doniesień dotyczących występowania wirusa HPV
w rakach płaskonabłonkowych głowy i szyi. Wyniki
uzyskiwane przez różnych badaczy wynosiły od 0%
do 86% HPV-pozytywnych prób. Badania dotyczyły
jednak różnych lokalizacji charakteryzujących się różnym stopniem predyspozycji do występowania wirusa.
Wśród chorych na raka płaskonabłonkowego krtani
najniższy odsetek raków związanych z występowaniem
wirusowego DNA – 3% opisał na materiale 37 chorych
Dillner i wsp. [12], natomiast najwyższy, bo aż 36%,
Dahlstrom i wsp. [13]. W obu przypadkach celem detekcji wirusa zastosowano technikę ELISA specyficzną
dla L1 HPV16, a materiałem do badań była surowica
krwi. Chen i wsp. [14] przy zastosowaniu PGMY09/
MY11 PCR wykazali obecność wirusa w komórkach nowotworowych u 86% chorych na raka jamy ustnej. Zdecydowanie najczęściej jednak opisuje się występowanie
wirusa DNA w obrębie gardła środkowego. Większość
autorów wskazuje tutaj występowanie wirusa w około
50% badanych guzów [15–17]. W badanym materiale
nie odnotowano obecności aktywnego transkrypcyjnie
wirusowego DNA w żadnym przypadku. Nowotwory
gardła środkowego stanowiły jednak zaledwie 20%
materiału o stosunkowo niewielkiej liczebności.
Porównywanie wielu badań ma jednak zasadniczą
wadę. Istnieje duża różnorodność zastosowanych
Ryc. 1. Ekspresja p16 w co najmniej 50% komórek nowotworowych
Fig. 1. p16 expression more than 50% cells positive
P o l s k i P r z e g l ą d O t o r y n o l a r y n g o l o g i c z n y t o m 1, n r 3 , l i p i e c - w r z e s i e ń 2 0 12
248
technik charakteryzujących się określoną czułością
i specyficznością. Obecnie stosuje się szereg technik
pozwalających na wykrywanie infekcji w badanym
materiale. Techniki oparte na PCR różnią się od siebie
czułością i specyficznością [18]. Większość z nich, przy
zastosowaniu zaprojektowanych zestawów starterów,
pozwala na identyfikację różnych genotypów wirusowych. Do systemów o najwyższej czułości należą
Amplicor [19] oraz SPF10 [20]. GP5+/6+ [21] i PGMY
[22] cechuje nieco mniejsza czułość. Według Gravitt i wsp. [22], GP5+/6+ charakteryzuje się jednak
większą heterogennością niż SPF10 i PGMY09/11,
co pozwala na wykrywanie infekcji wirusami HPV
różnych typów zachodzącej jednocześnie. Innym popularnym sposobem detekcji wirusowego DNA są
techniki oparte na hybrydyzacji DNA z odpowiednio
wyznakowanymi znacznikami RNA. Należą tu techniki, takie jak Hybrid Capture I i Hybrid Capture II
[23]. Przewaga technik ISH (in situ hybrydization)
nad technikami opartymi na metodach PCR wiąże się z biologicznym mechanizmem kancerogenezy
wywołanej przez wirusa. Odsetek wirusowego DNA,
wykrywany u chorych na raka płaskonabłonkowego
szyi technikami PCR, waha się w przedziale od 0% do
100%. Według Westra i wsp [24]. spowodowane jest
to wykrywaniem DNA wirusowego zarówno w formie aktywnej, jak i w formie nieistotnej biologicznie.
Braakhuis i wsp. [25], badając 143 chorych na raka
płaskonabłonkowego głowy i szyi, stwierdzili obecność
wirusowego DNA u około 17% badanych. Jednak zaledwie u połowy z nich stwierdzono obecność E6/E7
mRNA stanowiącego o aktywności transkrypcyjnej
wirusa, a więc jego faktycznym udziale w procesie
kancerogenezy. W niniejszej pracy jednym z celów
było określenie obecności wirusowego DNA w populacji 50 chorych na raka płaskonabłonkowego głowy
i szyi, pochodzącego z różnych lokalizacji. W tym celu
zastosowano protokół opisany przez Snijdersa i wsp.
[26]. Najpierw stosowano technikę GP5+/GP6+ PCR,
następnie hybrydyzację produktów DNA z dwoma koktajlami oligonukleotydowych znaczników. Do odczytu
wyników użyta była metoda immunoenzymatyczna
EIA. Ten etap nie nastąpił w przedstawianej pracy ze
względu na brak uzyskania produktów PCR. Technika
wymaga zestawu starterów zaprojektowanych celem
amplifikacji otwartej ramki odczytu w obrębie genu
L1. Metoda ta pozwala wykryć za pomocą jednego
badania 44 typy wirusa. Ponadto, ze względu na zastosowanie hybrydyzacji, pozwala wykazać faktycznie
aktywną infekcję będącą bezpośrednią przyczyną
choroby nowotworowej.
Z punktu widzenia klinicznego najważniejsze jest
zastosowanie technik diagnostycznych, które w sposób
szybki, wydajny, a także uzasadniony ekonomicznie
pozwolą stwierdzić obecność aktywnej infekcji onkogennym typem wirusa HPV, uruchamiającej proces kan-
cerogenezy. Metoda taka powinna wykrywać obecność
genomu onkogennego wirusa w jądrze komórkowym
komórki nabłonka lub wykazać ekspresję onkoprotein
wirusowych E6/E7 [27]. Badanie immunohistochemiczne ekspresji białka p16 spełnia powyższe kryteria,
a ponadto umożliwia analizę materiału utrwalonego
w parafinie. Wybarwienie komórek nowotworowych
z zastosowaniem odpowiednich przeciwciał anty-p16
może stanowić marker ekspresji onkoproteiny wirusowej
E7 [28]. Jest to możliwe, gdyż E7, inaktywując produkt
genu Rb, jednocześnie zwiększa poziom p16, co pozwala
na jego wykrycie technikami immunohistochemicznymi. W badanym materiale stwierdzono wybarwienie
p16 przynajmniej 50% komórek nowotworowych w 8%
(u 4 chorych). W 4% wybarwienie dotyczyło mniej niż
10% komórek nowotworowych i było mało intensywne.
Westra i wsp. [24] oraz Klaes i wsp. [29] uważają, że tylko
intensywne wybarwienie większości komórek nowotworowych może świadczyć o ekspresji onkoproteiny E7
i aktywnej infekcji HPV. W badanym materiale podane
kryteria spełnia wyłącznie 4 chorych, co w zestawieniu
z informacją o braku infekcji HPV uzyskaną techniką
PCR potwierdza wysoką czułość techniki immunohistochemicznej jako metody przesiewowej. Smeets i wsp.
[30] potwierdzili, że technika ta charakteryzuje się 100%
czułością, ze względu jednak na specyficzność na poziomie 79% wymaga ona uzupełnienia. W ostatnich latach
wiele badań zostało poświęconych różnicom w rozpowszechnieniu wirusa HPV jako czynnika ryzyka rozwoju
raka płaskonabłonkowego głowy i szyi w zależności od
lokalizacji geograficznej. Kreimer i wsp. [5] przeanalizowali pozycje dostępne w piśmiennictwie dotyczące
rozpowszechnienia onkogennych typów wirusa HPV na
świecie, opublikowane w latach 1990–2003. Udowodniono, że migdałek podniebienny oraz nasada języka,
znajdujące się w obrębie gardła środkowego, są lokalizacjami anatomicznymi, gdzie odsetek guzów związanych
z infekcją HPV jest największy [5, 6] i wynosi 35,6%.
Herrero i wsp. [31] na podstawie międzynarodowego,
wieloośrodkowego badania porównawczego przypadków podają, że udział ten jest mniejszy i wynosi 18,3%.
Parkin i Bray [32], którzy jako dodatkowe kryterium
postawili obecność przeciwciał przeciwko onkoproteinom
wirusowym E6/E7 w surowicy, dowodzą natomiast,
że wśród raków gardła środkowego nie więcej niż 12%
ma potencjalnie związek z infekcją wirusową. Zupełnie
inne dane przedstwiają Fakhry i wsp., jako wyniki
wieloośrodkowego prospektywnego programu badawczego przeprowadzonego w Stanach Zjednoczonych [33].
Uważają oni, że nawet 63% wszystkich guzów gardła
środkowego jest związanych z HPV. Tak odmienne dane
w piśmiennictwie, nawet po uwzględnieniu pewnych różnic metodologicznych, wydają się być dowodem na różne
rozpowszechnienie wirusa w określonych lokalizacjach
geograficznych. Z analizy Kreimera i wsp. wynika, że
w Ameryce Północnej 47% raków gardła środkowego ma
P o l s k i P r z e g l ą d O t o r y n o l a r y n g o l o g i c z n y t o m 1, n r 3 , l i p i e c - w r z e s i e ń 2 0 12
249
związek z wirusem, w Azji 46%, w Ameryce Środkowej,
Południowej, Afryce i Australii 36%, a w Europie 26%.
W samej tylko Europie również obserwuje się bardzo
zróżnicowane wyniki. Badacze ze Skandynawii [34]
odnotowali obecność wirusa u 66% badanych chorych
pochodzących z Norwegii, Szwecji i Finlandii. Zespół
z Finlandii, Koskinen i wsp. [35] wykazali nawet 100%
odsetek HPV-pozytywnych guzów. Analizowany przez
nich materiał był jednak niewielki, bo obejmował tylko
12 chorych. Nieco niższy odsetek przedstawiają badacze niemieccy 25–60% [36, 37], którzy poddali analizie
ponad 100 chorych. Van Houten [38] i Snijders [39],
analizując materiał holenderski, podają odpowiednio
występowanie wirusa w 23,3% i 28,6%. Ich wyniki
obejmują jednak wyłącznie przypadki, w których potwierdzono aktywny proces infekcji, a nie wyłącznie
obecności wirusowego DNA.
Co ciekawe, w badaniach przeprowadzonych w Polsce, obejmujących bardzo niewielki materiał, udział
infekcji wirusowej w etiopatogenezie raka płaskonabłonkowego głowy i szyi zdaje się odgrywać mniejszą rolę. Szkaradkiewicz i wsp. [40], badając grupę
28 chorych obejmującą 14 chorych na raka migdałka podniebiennego oraz 14 chorych na raka nasady języka, stwierdzili obecność wirusowego DNA
wyłącznie w 3 przypadkach, co stanowiło 10,7%.
Wyniki tej pracy są więc zdecydowanie bardziej zbliżone do obserwacji zaprezentowanych w niniejszej
analizie, aniżeli dane z Europy zachodniej. Morshed
i wsp. [41], przeprowadzając kompleksową analizę 93
chorych leczonych z powodu raka krtani w klinice
lubelskiej, zastosowali technikę PCR z wykorzystaniem zaprojektowanego zestawu starterów (SPF10),
pozwalającego na wykrywanie wielu typów wirusa.
Technika ta należy do najczulszych metod detekcji
wirusowego DNA [42]. W badanym materiale Morshed
i wsp. zaobserwowali obecność wirusowego DNA w 33
przypadkach, co stanowiło 35,5%. Biorąc pod uwagę
lokalizację mniej charakterystyczną dla występowania onkogennych HPV oraz inne dane z piśmiennictwa [5, 6], uważa się ten wynik za wysoki. Jednakże
może mieć na to wpływ fakt, iż bardzo czuła technika
PCR nieuzupełniona o techniki hybrydyzacji in situ
wskazuje jedynie na występowanie wirusa, a nie
na jego faktyczną integrację do genomowego DNA
komórek nabłonka.
Tak duże rozbieżności w rozpowszechnieniu onkogennych typów wirusa HPV, jako czynnika biorącego
udział w etiopatogenezie raków płaskonabłonkowych,
mają niewątpliwie związek z czynnikami ryzyka infekcji wirusem.
Obecnie wiadomo, że chorzy, u których rak wywołany został przez wirusa HPV, charakteryzują się
określonymi cechami. Są generalnie młodsi, palą papierosy w zdecydowanie mniejszym odsetku oraz charakteryzują się zdecydowanie większą liczbą partnerów
seksualnych w porównaniu z chorymi, u których nie
stwierdzono obecności wirusa. Istnieją również doniesienia mówiące o paleniu konopi indyjskich [43] oraz
o infekcji wirusem HIV [44] jako czynnikach sprzyjających infekcji i powstawania nowotworu.
Wnioski
W żadnym z badanych przypadków nie stwierdzono
obecności wirusa, co może świadczyć o stosunkowo
niskim udziale raków związanych z HPV w Polsce.
Klasyczna ścieżka kancerogenezy, związana ze środowiskowymi czynnikami ryzyka, zdaje się odgrywać
najistotniejszą rolę.
Badanie immunohistochemiczne dla p16 stanowi
dobry test przesiewowy dla poszukiwania aktywnej
infekcji HPV. Ze względu na pewną ilość wyników
fałszywie dodatnich, pozytywne wyniki wymagają
jednak uzupełnienia o techniki PCR, np. GP5+/6+-PCR.
P i ś miennictwo
1. Ries LAG, Melbert D, Krapcho M. et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975–2004. Bethesda, MD: National Cancer
Institute, 2006.
2. Annertz K, Anderson H, Biorklund A. et al. Incidence and
survival of squamous cell carcinoma of the tongue in Scandinavia, with special reference to young adults. Int J Cancer
2002;101:95–99.
3. Shiboski CH, Schmidt BL, Jordan RC. Tongue and tonsil
carcinoma: increasing trends in the U.S. population ages
20–44 years. Cancer 2005;103:1843–49.
4. D’Souza G, Kreimer AR, Viscidi R. et al. Case-control study
of human papillomavirus and oropharyngeal cancer. N Engl
J Med 2007;356:1944–56.
5. Kreimer AR, Clifford GM, Boyle P, Franceschi S. Human
papillomavirus types in head and neck squamous cell carcinomas worldwide: a systematic review. Cancer Epidemiol
Biomarkers Prev 2005;14:467–75.
6. Hobbs CG, Sterne JA, Bailey M, et al. Human papillomavirus
and head and neck cancer: a systematic review and metaanalysis. Clin Otolaryngol 2006;31:259–66.
7. Wilczynski SP, Lin BT, Xie Y, Paz IB. Detection of human papillomavirus DNA and oncoprotein overexpression are associated with distinct morphological patterns of tonsillar squamous cell carcinoma. Am J Pathol
1998;152:145–156.
8. Gillison ML, Koch WM, Capone RB, et al. Evidence for a causal
association between human papillomavirus and a subset of
head and neck cancers. J Natl Cancer Inst 2000;92:709–20.
9. Herrero R. Castellsagué X, Pawlita M, et al. Human papillomavirus and oral cancer: the International Agency for
Research on Cancer multicenter study. J Natl Cancer Inst
2003;95:1772–83.
10. Adelstein DJ. Ridge JA, Gillison ML, et al. Head and neck
squamous cell cancer and the human papillomavirus: summary of a National Cancer Institute State of the Science
P o l s k i P r z e g l ą d O t o r y n o l a r y n g o l o g i c z n y t o m 1, n r 3 , l i p i e c - w r z e s i e ń 2 0 12
250
Meeting, November 9-10, 2008, Washington, D.C. Head
Neck 2009;31:1393–422.
24. Westra WH, Taube JM, Poeta ML, et al. Inverse relationship
between human papillomavirus-16 infection and disrup-
11. van den Brule AJ, Pol R, Fransen-Daalmeijer N, et al.
GP51/61 PCR followed by reverse line blot analysis enables
rapid and high-throughput identification of human papillomavirus genotypes. J Clin Microbiol 2002;40:779–87.
12. Dillner J, Knekt P, Schiller JT. Et al. Prospective seroepidemiological evidence that human papillomavirus type 16
infection is a risk factor for oesophageal squamous cell carcinoma. BMJ 1995;311:1346.
tive p53 gene mutations in squamous cell carcinoma of the
head and neck. Clin Cancer Res. 2008;14:366–9.
25. Braakhuis BJ, Snijders PJ, Keune WJ, et al. Genetic Patterns in Head and Neck Cancers That Contain or Lack
Transcriptionally Active Human Papillomavirus. J Natl
Cancer Inst. 2004;96:998–1006.
26. Snijders PJ, van den Brule AJ, Jacobs MV, et al. HPV DNA
detection and typing in cervical scrapes. Methods Mol Med.
13. Dahlstrom KR, Adler-Storthz K, Etzel CJ. Et al. Human
2005;119:101–14.
papillomavirus type 16 infection and squamous cell
27. Gillison ML, Shah KV. Chapter 9: Role of mucosal human
carcinoma of the head and neck in never-smokers:
papillomavirus in nongenital cancers. J Natl Cancer Inst
a matched pair analysis. Clin Cancer Res. 2003;9:2620–
2626.
Monogr 2003:57–65.
28. Begum S, Cao D, Gillison ML, et al. Tissue distribution of
14. Chen PC, Kuo C, Pan CC. et al. Risk of oral cancer associ-
HPV 16 DNA integration in patients with tonsillar carcinoma
ated with human papillomavirus infection, betel quidwith
as visualized by HPV16 in situ hybridization and p16 im-
human papillomavirus infection, betel quid chewing, and
munohistochemistry. Clin Cancer Res 2005;11:5694–5699.
cigarette smoking in Taiwan – an integrated molecular
29. Klaes R, Friedrich T, Spitkovsky D. et al. Overexpression
and epidemiological study of 58 cases. J. Oral Pathol Med.
of p16 (INK4A) as a specific marker for dysplastic and
2002;31:317–322.
neoplastic epithelial cells of the cervix uteri. Int J Cancer
15. Snijders PJ, Cromme FV, van den Brule AJ. et al. Preva-
2001;92:276–284.
lence and expression of human papillomavirus in tonsillar
30. Smeets SJ, Hesselink AT, Speel EJ. et al. A novel algorithm
carcinomas, indicating a possible viral etiology. Int. J. Can-
for reliable detection of human papillomavirus in paraffin
cer 1992;51:845–850.
embedded head and neck cancer specimen. Int J Cancer
16. Lewensohn-Fuchs I, Munck-Wikland E, Berke Z. et al. In-
2007;121:2465–2472.
volvement of aberrant p53 expression and human papillo-
31. Herrero R., Castellsague X., Pawlita M. et al. Human pap-
mavirus in carcinoma of the head, neck and esophagus.
illomavirus and oral cancer: the International Agency for
Anticancer Res. 1994;14:1281–1285.
Research on Cancer multicenter study. J Natl Cancer Inst
17. Klussmann JP, Weissenborn SJ, Wieland U. et al. Prevalence,
distribution, and viral load of human papillomavirus 16 DNA
in tonsillar carcinomas. Cancer 2001;92:2875–2884.
18. Iftner T, Villa LL. Chapter 12: human papillomavirus technologies. J Natl Cancer Inst Monogr 2003;31:80–88.
19. van Ham MA, Bakkers JM, Harbers G.K. et al. Comparison
of two commercial assays for detection of human papilloma-
2003;95:1772–1783.
32. Parkin DM, Bray F. Chapter 2: the burden of HPVrelated
cancers. Vaccine 2006;24(Suppl 3):S11–S25.
33. Fakhry C, Westra WH, Li S. et al. Improved survival of patients with human papillomavirus-positive head and neck
squamous cell carcinoma in a prospective clinical trial. J
Natl Cancer Inst 2008;100:261–269.
virus (HPV) in cervical scrape specimens: validation of the
34. Mork J, Lie AK, Glattre E. et al. Human papillomavirus in-
Roche AMPLICOR HPV test as a means to screen for HPV
fection as a risk factor for squamous-cell carcinoma of the
genotypes associated with a higher risk of cervical disorders. J Clin Microbiol 2005;43:2662–2667.
head and neck. N Engl J Med 2001;344:1125–31.
35. Koskinen WJ, Chen RW, Leivo I. et al. Prevalence and physi-
20. Kleter B, van Doorn LJ, ter Schegget J. et al. Novel short-
cal status of human papillomavirus in squamous cell carci-
fragment PCR assay for highly sensitive broad-spectrum de-
nomas of the head and neck. Int J Cancer 2003;107:401–6.
tection of anogenital human papillomaviruses. Am J Pathol
36. Kleist B, Poetsch M, Bankau A, et al. First hints for a corre-
1998;153:1731–1739.
lation between amplification of the Int-2 gene and infection
21. Jacobs MV, Snijders PJ, van den Brule AJ. et al. A general
primer GP5+/GP6(+)-mediated PCR-enzyme immunoassay
with human papillomavirus in head and neck squamous
cell carcinomas. J Oral Pathol Med. 2000;29:432–7.
method for rapid detection of 14 high-risk and 6 low-risk
37. Klussmann JP, Weissenborn SJ, Wieland U, et al. Preva-
human papillomavirus genotypes in cervical scrapings. J
lence, distribution and viral load of human papillomavirus
Clin Microbiol 1997;35:791–795.
16 DNA in tonsillar carcinomas. Cancer 2001;92:2875–84.
22. Gravitt PE, Peyton CL, Alessi TQ. et al. Improved amplifi-
38. van Houten VM, Snijders PJ, van den Brekel MW, et al. Bio-
cation of genital human papillomaviruses. J Clin Microbiol
logical evidence that human papillomaviruses are etiologi-
2000;38:357–361.
cally involved in a subgroup of head and neck squamous
23. Clavel C, Masure M, Putaud I. et al. Hybrid capture II, a new
cell carcinomas. Int J Cancer 2001;15(93):232–5.
sensitive test for human papillomavirus detection. Com-
39. Snijders PJ, Scholes AG, Hart CA, et al. Prevalence of mu-
parison with hybrid capture I and PCR results in cervical
cosotropic human papillomaviruses in squamous-cell car-
lesions. J Clin Pathol 1998;51:737–740.
cinoma of the head and neck. Int J Cancer 1996;66:464–9.
P o l s k i P r z e g l ą d O t o r y n o l a r y n g o l o g i c z n y t o m 1, n r 3 , l i p i e c - w r z e s i e ń 2 0 12
251
40. Szkaradkiewicz A, Kruk-Zagajewska A, Wal M, et al. Epstein-Barr virus and human papillomavirus infections and
oropharyngeal squamous cell carcinomas. Clin Exp Med.
2002;2:137–41.
41. Morshed K, Polz-Dacewicz M., Szymański M, Polz D. Shortfragment PCR assay for highly sensitive broad-spectrum de-
42. Crum CP. Detecting every genital papilloma virus infection:
what does it mean? Am J Pathol. 1998;153:1667–71.
43. Braakhuis BJ, Brakenhoff RH, Meijer CJ, et al. Human
papilloma virus in head and neck cancer: the need for
a standardised assay to assess the full clinical importance.
Eur J Cancer. 2009;45:2935–9.
tection of human papillomaviruses in laryngeal squamous
44. Kreimer AR, Alberg AJ, Daniel R. et al. Oral human papil-
cell carcinoma and normal mucosa: clinico-pathological
lomavirus infection in adults is associated with sexual be-
evaluation. Eur Arch Otorhinolaryngol. 2008;265(Suppl
havior and HIV serostatus. J Infect Dis 2004;189:686–698.
1):S89–96.
P o l s k i P r z e g l ą d O t o r y n o l a r y n g o l o g i c z n y t o m 1, n r 3 , l i p i e c - w r z e s i e ń 2 0 12