1.2. interpretacja obrazów mikr.oskopowych
Transkrypt
1.2. interpretacja obrazów mikr.oskopowych
1.2. INTERPRETACJA OBRAZÓW MIKR.OSKOPOWYCH Komórki są trójwymiarowe. W mikroskopie widzimy je w postaci obrazu płaskiego. Do obserwacji w mikroskopie zwykle przygotowuje się z komórek cienkie skrawki, które są jedynie wycinkiem komórki. Naw~t wtedy, gdy oglą damy całe komórki w mikroskopie świetlnym, w miarę zwiększania powiększenia zmniejsza się głębia ostrości i oglądamy wyrainie równiet jedynie określoną płaszczyznę w obrębie komórki, tak zwany przekrój optyczny. Pod mikroskopem widzimy wobec tego obraz płaski, dwuwymiarowy z reguły ,pewnego wycinka komórki. Gdy grubość wycinka zbl;2a się do zera~ oglądamy przek~ój ' komórki. Z tych przekrojów wnioskujemy o trójwymiarowym wyglądzie komórki. Przy pomiarach przekrojów struktur dokładność wzrasta, gdy grubość skraw~ ka maleje. Zmniejszenie grubości skrawków ograniczone jest przyczynami tech~ nicznymi. Z jednej strony ograniczeni jesteśmy m02liwością mikrotomu, a z drugiej - maleją c ym kontrastem między tłem a strukturą w zbyt cienkich skrawkach . W pra ktyce wybiera się opt y malną grubo ść skrawków, różną w badaniach różnych obiektów różnymi metodami. Wa ż ną strukturą komórki j est błona, stanowiąca i st otny składnik różnych organelli komór kowych . W mikroskopie świetlnym jest ona widoczna jedynie jako granica między różnym i optycznie prze strzeniami . W mikroskopie elektronowym, przy standardowej obróbce preparatu (utrwalanie' aldehydem glutarowym i czterotlenkiem osmu, kontrastowanie solami ołowiu i ,uranylu) , ,bl-ona,' priekrojona prostopadle do powierZChni daje obraz w postaci dwóch równoleg łych warstw elektronowo gęstych ziarni s toś c i przedzielony c h warstwą o mniej szej gęstości (ryc. 6) . Gru~ość całości wynosi około 7 , 5 nm . ~ nie~tóryc~ błonach jedna lub obie warstwy elektron owo gęste mogą być pogrubi~ ne : Na obrazach mniej powiększonych warstwy te ziewaję się 'w j' edną ele ktrOri"ó'w'o " gę- ' stą o • •• Ss o., .::- ::;: ',. .... :..: ~.'.' warstwę . '.' ,. • ..., ...".... .~.:~~~}. ' .~ , ... '"~'P.fP:"" ·. ..' ... .'' ........ ., .' . ..'." ... . '. . . . .. .. .." . • ~~ • ~~ ' .· .. .,... " ~. ... • • 2 ; • , 1I nm 3,5 '. . " ' ~4:f.:;;P.'Jff!łf~~ł\lji • " • ········Wł~(f'···· ·~X • "II• ,, " 2 • Ryc.6. Schematyczny obraz poprzecznego przekrOju błony oglądanej w mikroskopie elektronowym po utrwaleniu czterotlenkiem osmu Obraz błony przeds~awia się 'r ó żnie w zależno ś ci od kąta nachylen i a powierzchni błony do powierzchni pr zekroju. Ilu s tracją tego j est r yc ina 7 . Na przekroju prostopadłym do powi e rz c hni błona tworzy ostro ograniczoną linię gęsto uło ż ony c h ziarni s tośc i . Na prz e krojach sko ś nych tworz y zna c znie s zerszą, mniej ostro zaznaczoną linię bardZiej rozproszonych ziarnistości . , Wreszcie na przekroju równoległ y m widać rzadko rozpros zone ziarnisto ś ci i błona staje się niewidoczna. Ta różnorodnoś ć obrazów błon w mikrOSKopie e lektronowym powoduje pewien błąd w ich oc enie. Nawet gdy błona jes t dobrze widoczna, trudno czasami wnioskować o kształcie bryły otoczonej błoną.Obraz w posta c i pierścienia może dać za~ ówno przekrój przez pęcherzy k , jak i przekrój przez cewkę. , Do k ładny obraz konkr e tnej stru ktury uz ys kuje się wted y , gdy wy kona się s erię \skrawków ~bej;ującę 7~łę-;t;;:kt~;ę:- 'zt;kiC-h- -;k'r;;'wkÓ~ o ż na--;-yk~;;a'ć-' model ~.t tukt;:;;;~OdPOWi;dniOpoW i ęks'z'óne· obr a zy skrawków przenosi się na ' PłYtk1-"Z-'wo-s'k u modelowego tyle razy grubs ze od skrawków, ile wyn os i po- Ryc.7. Schematyczny obraz błony oglądanej w mikroskopie elektronowym w zależno ści od kąta nachylenia powierzchni błony; u góry - przekrój, ' u dołu - iilidQk skrawka i błony z boku większenie obrazu . W płytkach wycina się zarysy struktur i odpowiednio ze s tawia wycinki . W ten sposób powstaje powiększony model struktury . Przedstawiony wyżej obraz błony oglądanej w mikroskopie elektronowym jest typowy dla kaŻdej błony komórki, ale niewiele mówi o jej funkcjonowaniu. tym dowiadujemy się między innymi z właściwości składników , błony. W skład błon wchodzą polarne lipidy i białka . Wyekstrahowane lipidy błon, gdy rozdzielają dwa roztwory wodne, układają się samorzutnie w podwójną warstewkę cząstecze k zwróconych grupami polarnymi na zewnątrz do roztworów wodnych, jest a ł ańcuchami hydrofobowymi do środka. Taka dwucząsteczkowa warstewka termodynamicznie stabilna i może być zrębem strukturowym błony. Tak samo układają się cząsteczki lipidów w błonach komórk~ (ryc. BA). Część białek przylega do powierzchni błony lipidowej . Są to białka powierzchni~we, zwią zane siłami jonowymi. Inne białka zagłębiają się w błonę, sięgając z jednej strony błony na drugą . Są to białka integralne,wiązane siłami hydrofobowymi. Wiele informacji o budowie błony uzyskano dzięki technice łamania zamrożonych preparatów. Kroplę zawiesiny komórek lub wyizolowanych błon zamraża się gwałtownie na miedzianym stoliku i uderzeniem noża odłamuje jej część ( ryc. 9A). Powierz c hnię łamania części kropli pozostającej na stoliku napyla się rozproszonym atomowo węgl e m i pod ,kątem 45 0 platyną. Węgiel tworzy trwałą warstewkę przylegającą szczelnie do powierzchni łamania. Warstewk~ ° A B ~d" " i. i " I Yc .12. Siatki pOl1liarowe do pomiarów stereologicznych: A - siatka równoległych linii biegę c ych w odległości d w dwóch prostopadłych do siebie kierunkach, B - układ linii o - długo ści d rOzrzuconych losowo I l i teratura e i b e l E.R . , 1973, Stereological techniques for electron microscopic morphometry, w: Principles and techniques of electron microscopy ( red. M.A . Hayat) . Van Nostrand Reinhold Co., New York. e i b e l E.R., 1980, Stereological methods. ; 01. l, Practical methods for bi ological morphometry. Vol. 2, Theoretical foundations . Academic Press. London. POMIAR OBJĘTOŚCI WZGLĘDNEJ BRYŁ W celu zmierzenia przekrojów brył wykonuje się na przezroczystej płytce dwóch grup równoległych linii ustawionych względem siebie prostoJadle . Linie rozmieszczone sę w identycznych odległościach - równych d ~ ryc. 12 ). Miejsca przecięć linii siatki twortę system równomiernie rozlieszczonych punktów . Najmniejsza odległość między punktafT!,i d jest równa Jdległości między liniami. Każdy punkt siatki reprezentuje identycznę po,ierzchnię równę d 2 . Siatk~ nakłada się na zdjęcia przekroju komórki li; zy liczbę punktów Pi w obrębie interesujęcej nas struktury i ~raz liczbę Junktów P w obrębie całego przekroju, np. komórki. Objętość względną strukt u~y określa równanie i iatkę (6) gdzie: Vv jest objętością względną struktury i, Pi - sumaryczną liczbą punktów iznajdującYCh się w obrębie przekrojów struktury i, P - sumaryczną liczbą punktów znajdujących się w obrębie całego przekroju. Powie.kszenie ~djęcia i Odległoścllinii siatki -·~·~ optymalnie dobrane, gdy w przekrój pOjedynciej struktury trafia nie więcej nit jeden punkt. • s POMIAR POWIERZCHNI WZGLĘDNEJ BŁON W pomiarach wykorzystuje się liniową zale2ność długości linii przekrobłon od powierzchni błon . Długość linii przekrojów można określić za omocą kwadratowej siatki pomiarowej przedstawionej na rycinie 12A . ~a ~rze~ roj ac h mierzy się sumaryczną długość wszystkich linit" siafki pomiar'dW'ej "w brębi e przekroju badanej struktury (tkanki, komórki, cytoplazmy itp.) oraz iczbę p~zecięć linii siatki pomiarowej z przekrojami błon. Przy obliczaiu wyników korzysta się z następującego wzoru: ów sV = łl (7) L dzi e: Sv to powierzchnia względna błon w danym obiekcie (tkance, komórc e, ytoplazmie itp.), I - liczba przecięć linii siatki pomiarowej z przekroami błon, L - sumaryczna długość linii pomiarowych w obrębie przekroju dalego obiektu. W praktyce nie liczy się przecięć na przekroja c h, lecz na powiększon yc h ,brazach tych przekrojów. Wobec tego długość linii należy po~zielić przez l owiększenie, natomiast wzór 7 przyjmuje postać: 21 l J 'a wag a! W pomiarach powierzchn i (B) powiększenie błon należy zwrócić uwagę na trzy iród- błędu: M ier ząc powierzchnię błon należy pamiętać o założeniu, że przebieg jest losowy. Gdy błony w komórce są zorientowane w jednym kierunku, 1ależy kierunek linii siatki pomiarowej ustawiać na przekroju w sposób 10iOW y a lb o stosować si a tkę pomiarową o losowym układzie linii (ryc.12B). b) Błony przekrojone pod ostrym kątem mogą być niewidoczne, co powoduje ~aniżenie wyników. c) Badania stereologiczne oparte sę na założeniu, że pomiarów dokonuje ,ię na przekrojach dwuwymiarowych . W praktyce skrawki mają określoną gruIOŚĆ. Skutkiem tego błony drobnych struktur (siateczka śródplazmatyczna, jrzebienie mitochondrialne itp.) mogę być widoczne, mimo że wchodZą do należy 3krawka jedynie na małą głębokość (ryc. 13). W takich przypadkach .prowadzić Odpowiednią poprawkę do wyników (Weibel i Paumgartner, 1978). Jwagi przedstawione w punkcie b i c mogę spowodować równie2 błęd w ocenie a) )łDn Jbjętości brył. Ryc.13. Różne położenie pęcherzyków padłej - P w stosunku do skrawka - S. Widok od strony prostodo powierzchni ,skrawania ~ojów zewnętLznej błony mitochondLialnej oLaz sumaLyczną długość linii iatki w obLębie cytoplazmy hepatocytów z mitochondLiami włącznie. Obliczela i dalsze opLacowanie wyników pLzepLowadt jak w ćwiczeniu 21. ~as analizy 10 zdjęć: 70 minut. n M a t e L i a ł: z mikLoskopu elektLonowego fOLmatu 18 x 24 cm o powiększeniu koń lwym 15 000 x jak w ćwiczeniu 20, kwadLatowa siatka pomiaLowa o liniach od19łych o 15 mm, kalkulatoL. zdjęć POMIAR ŚREONICY STRUKTUR KULISTYCH Za pomocą steLeologii można określić pneciętną średnicę i inne wy~~i~ ,rX" :Luktur komóLkowych, jeżeli znany jest ich kształt. Stosunkowo prostym :zykładem są stLuktury kuliste. 5tLuktuLY innych kształtów wymagają z Fe- , Iły skomplikowanego matematycznego opLacowania wyników. 00 okLeślenia średnicy stLuktuL kulistych posługujemy się idealną kulą Iko modelem. Kula pokLojona na dużą liczbę skrawków równej gLubości daje ' zekroje o Lóżnej średnicy. Średnice uszeLegowane w klasy według wielko:i dają chaLakteLystyczny histogram (LYC. 14), z któLego wynika, że li: ebność pLzekLójów wzrasta w miarę zbliżania się do Lzeczywistej śLednicy IIi. Podobnie postępujemy z przekrojami komóLek . Mierzymy na nich średnice lżej liczby przekrojów kulistych stLuktur, np. jądeL' i układamy je w ,asy odpowiednich wielkości. Wyniki pLzedstawione gLaficzniedają histogram ' ~obny jak na Lycinie 14. Różnica polega głównie na tym, że po przekLocze, ~ najliczniej Leprezentowanej klasy wielkości otLzymujemy mniej liczne , ększe pLzekLoje. Odchylenie od waLtości teoretycznych przedstawionych na lądeL. 'cinie 14 jest skutkiem pewnych różnic w wielkości poszczególnych ' zeciętną śLednicą j,deL nie jest wobec tego średnica największa pLzekroiw jak w modelu, lecz śLodek najliczniejszej klasy. lICZENIE V Imiar przeciętnej średnicy kulistych jąder Do pomiaLów można wykoLzystać zdjęcia z ćwiczenia 18 lub dokonać pomiaiw bezpośLednio na prepaLatach w mikLoskopię z mikLometLem okulaLowym wy:alowanym według skali WzoLcowej (patLz ćw.17). PomieLz śLednice 750 losowo wybLanych przekrojÓW jądeL . Wyniki zestaw co najmniej dziesięciu, a najwyżej szesnastu klasach wielkości i pLzedstaw liczeb, histogLamie, tak jak na rycinie 14. ŚLodek klasy o największej Iści jest pLzeciętną śLednicą jąder. Dokładniejsze wyliczenie tej śLednicy okLeślenie błędu standaLdowego wymaga baLdziej skomplikowanych obliczeń . :as ćwiczenia: 120 minut. ° Ryc.14. HistogLam 0,2 średnic 0,4 0,6 1 0,8 seryjnych skLawków równej grubOŚCi z idealnej kuli; liczebność przekrojów w klasie n oznacza m a t e r i a ł: S P L Z ę t i WZOLMikroskop z mikrometLem okularowym,szkiełko podstawowe z podziałką cową, pLepaLaty mikLoskopowe z wątLoby szczura lub innej tkanki przygotowane jak' w ćwiczeniu 12 i 14, 'papier milimetrowy,.