pobierz

PRACA ORYGINALNA
Original Article
Acta Haematologica Polonica
2006, 37, Nr 3 str. 361–371
KRZYSZTOF ILNICKI1, ELŻBIETA URBANOWSKA2
Występowanie zjawiska spontanicznej agregacji w preparatach
kriokonserwowanych komórek jądrowych krwi pępowinowej
Occurence of spontaneous aggregation in the preparations of the cryopreserved
nuclear cells obtained from the cord blood
1
Z Zakładu Genetyki, Centrum Zdrowia Dziecka w Warszawie,
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Małgorzata Krajewska-Walasek
2
Z Katedry i Kliniki Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych A.M. w Warszawie
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Wiesław Wiktor Jędrzejczak
SŁOWA KLUCZOWE: Krew pępowinowa – Agregacja komórek jądrowych – Kriokonserwacja
KEY WORDS:
Cord blood – Nuclear cells aggregation – Cryopreservation
STRESZCZENIE: Zjawisko nieswoistej agregacji komórek („cell clumping”) występuje
w kriokonserwowanych preparatach komórek jądrowych uzyskiwanych z krwi pępowinowej,
szpiku i krwi obwodowej po ich rozmrożeniu. W celu oceny zjawiska nieswoistej agregacji badano wpływ wzrastającej gęstości zawiesiny wypreparowanych z krwi pępowinowej komórek jądrowych, poddawanych następnie kriokonserwacji. Oceniono również wpływ dwu wybranych
metod rozmrażania kriokonserwowanych komórek na nasilenie tego zjawiska. Intensywność
agregacji komórek wzrastała wraz ze wzrostem gęstości zawiesiny: od ok. 15% zagregowanych
komórek występujących w stężeniach 5 i 10 mln/ml do ok. 43% w stężeniu 50 mln/ml podczas
rozmrażania metodą klasyczną. Zastosowanie do rozcieńczenia komórek płynu zawierającego
dekstran (metoda rozmrażania wg Rubinsteina) w znacznym stopniu ograniczyło zjawisko agregacji. Niezależnie od intensywności procesu agregacji i zastosowanej metody rozmrażania, liczba komórek tworzących kolonie krwiotwórcze na 100 000 komórek, które nie uległy agregacji,
utrzymywała się na bardzo zbliżonym poziomie tj. ok. 70 % w stosunku do liczby tych komórek
przed mrożeniem. Proces nieswoistej agregacji nie ma charakteru wybiórczego i dotyka w równym stopniu wczesne komórki krwiotwórcze jak i komórki dojrzałe a substancje takie jak dekstran w znacznym stopniu hamują nieswoistą agregację komórek.
SUMMARY: The phenomenon of nonspecific cell aggregation (cell clumping) appears after
thawing in the nucleated cell preparations obtained from the Bone Marrow, Peripheral Blood and
the Umbilical Cord Blood (UCB). To evaluate the cell clumping phenomenon, the influence of
an increasing density of the nucleated cell suspension, extracted from the UCB and freezed, was
examined. The two selected techniques of thawing were also evaluated for their influence on cell
clumping.
The intensity of the cell clumping increased simultaneously with the growing density of the cell
suspension. It rose from app. 15% in the 5 and 10 mln/ml groups to app. 43% in the 50 mln/ml
groups, when thawed accordingly to the „classic” technique. If the solution containing dextran
106
K. ILNICKI, E. URBANOWSKA
(Rubinstein’s technique) was applied post thaw to dilute the cell suspension, the clumping phenomenon was markedly inhibited. Regardless of the intensity of the aggregation process, the
number of the CFC in the whole pool that remained suspended after thawing (per 100 000 cells),
remained on a quite stable level of app. 70% of the prefreezing value. This phenomenon does not
appear to be selective, it affects both the early haematopoietic cells (CFC) and the mature cells,
independently of the initial density of the freezed suspension, and the substances like dextran
may markedly inhibit the process.
WSTĘP
Krwiotwórcze komórki macierzyste są wykorzystywane do leczenia wielu śmiertelnych dawniej chorób, w tym nowotworów układu krwiotwórczego i odpornościowego. Stosuje się je u chorych poddanych masywnej chemioterapii lub radioterapii mającej na celu zniszczenie komórek nowotworowych. Zniszczeniu ulegają wtedy również
zdrowe komórki macierzyste występujące w szpiku. Dla skorygowania tego niedoboru
dokonuje się przeszczepienia komórek krwiotwórczych, które po różnicowaniu i proliferacji wytworzą wszystkie elementy morfotyczne krwi funkcjonujące przez pozostały
czas życia chorego (7).
Komórki krwiotwórcze tj. komórki macierzyste i ukierunkowane krwi pępowinowej stanowią niejednorodną populację z przewagą mniej dojrzałych komórek, których
potencjał proliferacyjny jest znacznie większy niż w szpiku (18). Ta cenna właściwość
krwi pępowinowej pozwala na przeszczepienie mniejszej liczby komórek krwiotwórczych niż przy zastosowaniu przeszczepu szpiku lub komórek krwiotwórczych z krwi
obwodowej. Komórki te muszą występować w odpowiedniej liczbie i jakości zapewniającej pełną odnowę hematologiczną biorcy przeszczepu (8, 19). W chwili obecnej
krew pępowinowa może być stosowana do leczenia, gdy niedostępne są inne źródła
tych komórek, tj. szpik kostny i krew obwodowa (19).
Podstawową niedogodnością związaną z wykorzystaniem krwi pępowinowej do
przeszczepienia u biorców dorosłych jest jej ograniczona i stosunkowo niewielka objętość, w której zawarta jest ograniczona liczba komórek krwiotwórczych nawet wtedy,
gdy krew pobierana jest przez fachowy, przeszkolony personel medyczny (6). Liczba
komórek krwiotwórczych, która występuje w krwi pępowinowej wystarcza do przeszczepienia u dzieci o masie ciała ok. 30 kg, ale jest niewystarczająca do wykonywania
tego typu zabiegów u biorców dorosłych, mimo że zamrażane są tylko wyselekcjonowane jednostki krwi, spełniające kryteria pozyskania określonej liczby komórek
krwiotwórczych (16). Stwarza to konieczność zastosowania na tyle wydajnych metod
preparatyki, aby odzysk komórek przeznaczonych do przeszczepienia był jak najwyższy (2, 9).
Spontaniczna i nieswoista agregacja komórek jądrowych – tzw. „cell clumping”
stanowi jedno ze zjawisk ograniczających liczbę izolowanych komórek efektywnie dostępnych do przeszczepienia (8). Występuje ono w przechowywanych przez dłuższy
czas w temperaturze 4˚C nie poddawanych żadnej preparatyce jednostkach krwi obwodowej, szpiku jak też i krwi pępowinowej. Zachodzi również bardzo intensywnie i czę-
Występowanie zjawiska spontanicznej agregacji
107
sto gwałtownie w rozmrożonych preparatach wyizolowanych komórek jądrowych poddawanych uprzednio kriokonserwacji (11).
Celem pracy było zbadanie nasilenia zjawiska agregacji komórek jądrowych krwi
pępowinowej w zależności od gęstości zawiesiny tych komórek poddawanych zamrażaniu. Ponadto, oceniano wpływ wybranych podłóż hodowlanych na zjawisko agregacji występujące w rozmrażanej próbce.
MATERIAŁ I METODY
Pracę wykonano na 89 porcjach krwi pępowinowej pobieranej w trakcie porodów
rozwiązywanych siłami natury. Metodą grawitacyjną pozyskiwano krew pępowinową
do butelki zawierającej podłoże Iscove’a (Gibco Ltd) z dodatkiem 1500 IU heparyny
(Biochemie GmBH). Wiek rodzących wahał się w przedziale od 18 do 34 lat, były
zdrowe, a porody odbywały się bez komplikacji.
W każdej pozyskanej jednostce krwi pępowinowej określano jej objętość, bezwzględną liczbę komórek jądrowych (za pomocą analizatora hematologicznego Cell
Dyna 1700 firmy Abbott) w populacji, których zawarte są krwiotwórcze komórki macierzyste i ukierunkowane oraz oceniano ich żywotność metodą wchłaniania błękitu
trypanu.
W dalszym etapie badań krew pępowinową poddawano separacji na 3% roztworze
skrobi hydroksyetylowanej (Fresenius AG) w celu uzyskania frakcji komórek jądrowych. Po procedurze sedymentacji i dalszej preparatyce doprowadzano zawiesinę komórek jądrowych do gęstości wyjściowej wynoszącej 10,9 mln komórek w 1 ml.
Z uzyskanej w taki sposób zawiesiny komórek przygotowano próbki przeznaczone do
zamrożenia. Zmiany liczby komórek jądrowych po rozmrożeniu próbki i dalszej preparatyce odnoszono do tej wyjściowej wartości.
Dla określenia liczby komórek krwiotwórczych i ich zdolności do tworzenia kolonii hematopoetycznych zakładano hodowlę w podłożu z metylcelulozą (17). W wyjściowej liczbie komórek jądrowych wynoszącej 10,9 mln komórek w 1 ml, liczba komórek tworzących kolonie krwiotwórcze wynosiła 15042 ± 8393 w 1 ml (142 ± 85 na
100 000 komórek jądrowych). Zmiany liczby komórek tworzących kolonie krwiotwórcze po rozmrożeniu próbki i dalszej preparatyce odnoszono do tych wyjściowych wartości.
W celu określenia optymalnych warunków mrożenia komórek krwiotwórczych
uprzednio wyizolowane komórki jądrowe zawieszano w płodowej surowicy cielęcej.
Doprowadzano gęstość komórek do stężenia 50; 20; 10 i 5 mln komórek w 1 ml.
Tak przygotowany 1 ml zawiesiny komórek przenoszono do fiolek krioprezerwacyjnych (Nalge Nunc Int.) i dodawano do niej po 0,25 ml podłoża Iscove’a z dodatkiem
DMSO (końcowe stężenie DMSO wynosiło 7%). Zamrażanie prowadzono według klasycznej procedury kriokonserwacji komórek limfoidalnych. Fiolki przechowywano w
temperaturze –1960C. W celu oceny wydajności odzysku kriokonserwowanych komórek krwiotwórczych i wpływu podłoży hodowlanych na występowanie agregacji komórek do rozmrażania próbek zastosowano 2 wybrane metody, tj. metodę „klasyczną”
108
K. ILNICKI, E. URBANOWSKA
oraz opisaną przez Rubinsteina (14). Po 3 miesiącach przechowywania w ciekłym
azocie (MESSER System) próbki rozmrażano w łaźni wodnej w temperaturze 37°C
nieustannie mieszając. Po całkowitym rozmrożeniu badanej próbki dodawano kroplami
podłoże Iscove’a z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej (metoda klasyczna) lub
płyn do rozmrażania komórek zawierający dekstran (metoda Rubinstein’a). W rozmrożonej próbce określano liczbę komórek jądrowych oraz ich żywotność metodą
wchłaniania błękitu trypanu. Zawiesinę uzupełniano płynem Iscove’a lub płynem przygotowanym wg metody Rubinsteina. W celu określenia liczby komórek tworzących In
vitro kolonie krwiotwórcze zakładano hodowle w metylcelulozie. (Stem Cell Tech)
(10).
Otrzymane wartości przedstawiano jako średnie ± odchylenie standardowe. Porównania między grupami były przeprowadzane z użyciem testu t Studenta, a wartości p
poniżej 0,05 uznawano za statystycznie znamienne.
WYNIKI
Wpływ stężenia komórek jądrowych przechowywanych w ciekłym azocie na żywotność, wydajność odzysku tych komórek oraz komórek tworzących kolonie krwiotwórcze.
a. Żywotność komórek jądrowych
Po przechowaniu materiału w ciekłym azocie i rozmrożeniu żywotność komórek
jądrowych wynosiła 83 %.
b. Wydajność odzysku komórek jądrowych.
Po rozmrożeniu fiolki z badaną próbką, liczba komórek jądrowych w zawiesinie
była mniejsza niż przed zamrożeniem (Ryc. 1). Odzysk komórek rozmrażanych metodą Rubinsteina wynosił ok. 85% we wszystkich badanych grupach. Podobny odsetek
odzysku zaobserwowano w grupie zawierającej próbki o niższych stężeniach komórek,
tj. 5 i 10 mln w 1 ml zawiesiny rozmrażanych metodą klasyczną. W grupach zawierających komórki występujące w wyższych stężeniach, tj. 20 i 50 mln komórek w 1 ml
zawiesiny odzysk komórek jądrowych rozmrażanych metodą klasyczną wyraźnie się
zmniejszał osiągając wartość ok. 57%. W tej grupie występowała również duża
zmienność, większa niż w grupie materiału rozmrażanego metodą Rubinsteina. Nie
stwierdzono istotnej statystycznie różnicy (p < 0.05) pomiędzy wpływem stężenia 5
i 10 mln oraz 10 i 20 mln komórek jądrowych w 1 ml zawiesiny a odsetkiem odzysku
tych komórek rozmrażanych metodą klasyczną. Natomiast, występowała statystycznie znamienna różnica (p < 0.05) pomiędzy wpływem stężenia 20 i 50 mln oraz 10
i 50 mln komórek jądrowych w 1ml zawiesiny a odsetkiem odzysku tych komórek
rozmrażanych metoda klasyczną. Ponadto, nie występowała znamiennie statystyczna
różnica (p<0.05) pomiędzy wpływem stężenia 5, 10, 20 i 50 mln komórek jądrowych
rozmrażanych metodą Rubinstein’a a odsetkiem odzysku tych komórek po ich rozmrożeniu. Te dane mogą jednak być mylące gdyż nie wszystkie komórki jądrowe były
żywe. W związku z powyższym w Tab. 1 zestawiono wartości dokonując korekty
w oparciu o dane dotyczące żywotności komórek jądrowych.
Występowanie zjawiska spontanicznej agregacji
109
110
K. ILNICKI, E. URBANOWSKA
Występowanie zjawiska spontanicznej agregacji
111
c. Wydajność odzysku komórek tworzących kolonie krwiotwórcze.
Populacje komórek jądrowych pozostających w zawiesinie po rozmrożeniu próbki
metodą klasyczną i wg Rubinsteina prezentują zbliżone wartości odsetka odzysku komórek tworzących kolonie krwiotwórcze, w przeliczeniu na 100 000 hodowanych komórek, które nie uległy agregacji, niezależnie od ich stężenia w próbce poddawanej
kriokonserwacji. (Ryc. 2). Nie stwierdzono statystycznie znamiennej różnicy (p<0,05)
Tabela 1. Zmiany liczby żywych komórek jądrowych po krioprezerwacji i przechowywaniu w temperaturze –196°C materiału zamrożonego w różnych stężeniach oraz rozmrażanego metodą klasyczną lub
metodą Rubinsteina
Table 1. Changes in the number of living, nucleated cells after cryopreservation and storage of the material in different concentrations in –196º C, and thawing by classic and Rubinstein’s methods
Gęstość zawiesiny komórek jądrowych podczas
przechowywania
Względna i bezwzględna liczba odzyskanych komórek jądrowych
w zależności od zastosowanej metody rozmrażania
Metoda Klasyczna
Metoda wg Rubinsteina
Odsetek liczby
wyjściowej
Liczba bezwzględna
Odsetek liczby
wyjściowej
Liczba bezwzględna
5 x 106/ml
67 %
7,3 x 106
72,5 %
7,9 x 106
10 x 106/ml
69 %
7,5 x 106
71,5 %
7,8 x 106
20 x 106/ml
61,5 %
6,7 x 106
71,5 %
7,8 x 106
50 x 106/ml
47 %
5,1 x 106
69 %
7,5 x 106
Tabela 2. Zmiany liczby komórek tworzących kolonie krwiotwórcze po krioprezerwacji w temperaturze
–196°C i przechowywaniu zamrożonego materiału w różnych stężeniach oraz rozmrażanego metodą klasyczną lub wg Rubinsteina.
Table 2. Changes in the number of hematopoietic colony forming cells after cryopreservation and storage
of the material in different concentrations in –1960 C, and thawing by classic and Rubinstein’s methods
Metoda klasyczna
Metoda Rubinsteina
Gęstość za- Liczba ko- Liczba ko- Odsetek odzy- Liczba koLiczba ko- Odsetek odzywiesiny komórek
mórek two- sku liczby ko- mórek two- mórek two- sku liczby komórek jądro- tworzących rzących ko- mórek tworzą- rzących ko- rzących ko- mórek tworząwych
kolonie
lonie krwio- cych kolonie lonie krwio- lonie krwiocych kolonie
krwiotwór- twórcze na 1 krwiotwórcze
twórcze na twórcze na 1 krwiotwórcze
cze na 105
ml
na 1 ml w
105 komórek
ml.
na 1 ml w odkomórek
odniesieniu do jądrowych
niesieniu do
jądrowych
liczby wyjścioliczby wyjściowej
wej
5 x 106/ml
101 ± 30
7373 ± 2190
49,1%
100 ± 30
7900 ± 2370
52,7%
6
101 ± 30
7575 ± 2250
49.2%
102 ± 26
7956 ± 2028
53,0%
6
95 ± 30
6365 ± 2010
42,4%
96 ± 30
7488 ± 2340
49,9%
10 x 10 /ml
20 x 10 /ml
112
K. ILNICKI, E. URBANOWSKA
50 x 106 /ml
98 ± 25
4998 ± 1275
33,3%
98 ± 23
7350 ± 1725
48,9%
pomiędzy wpływem stężenia komórek jądrowych w próbkach przechowywanych
w ciekłym azocie rozmrażanych metodą klasyczną i Rubinstein’a a odzyskiem komórek tworzących kolonie krwiotwórcze (na 100 000 komórek, które pozostały w zawiesinie). W tabeli 2 przedstawiono zmiany liczby komórek tworzących kolonie
krwiotwórcze z uwzględnieniem spadku żywotności komórek jądrowych i wpływu
przechowywania w zamrożeniu różnych gęstości zawiesin tych komórek. Na liczbę komórek tworzących kolonie krwiotwórcze, w przeliczeniu na 100 000 rozmrożonych
komórek jądrowych, które nie uległy agregacji, nie ma wpływu ani początkowa liczba
tych komórek w zamrażanej próbce ani metoda jej rozmrażania. Całkowita liczba komórek tworzących kolonie w 1 ml rozmrożonej próbki zmniejszała się wraz ze wzrostem gęstości zawiesiny komórek. Zmniejszenie liczby tych komórek jest znaczniejsze
w przypadku rozmrażania metodą klasyczną (o ok. 66% w stosunku do liczby wyjściowej) niż w przypadku rozmrażania metodą wg Rubinstein’a (o ok. 51%).
OMÓWIENIE WYNIKÓW
Bardzo istotnym zjawiskiem, które występuje podczas procesu zamrażania komórek jądrowych z krwi pępowinowej, szpiku i krwi obwodowej jest nieswoista agregacja („cell clumping”). Powoduje ono zmniejszenie liczby komórek krwiotwórczych
efektywnie dostępnych do przeszczepienia. Jest to o tyle istotne w odniesieniu do krwi
pępowinowej, ponieważ zwykle pobiera się jej niewielką objętość i uzyskanie jak
największej liczby komórek krwiotwórczych stanowi istotny problem techniczny.
Zjawisko nieswoistej agregacji komórek obserwowane jest w przechowywanym
przez dłuższy czas materiale świeżym, podczas gdy w materiale poddawanym zamrażaniu jego intensywność jest znacząco wyższa a skutki są widoczne po minutach lub
nawet sekundach po rozmrożeniu. Stwarza to niejednokrotnie dramatyczne sytuacje
(11) i wymusza stosowanie metody zamrażania materiału transplantacyjnego w niewielkich porcjach tj. w probówkach (czasami ponad 300 porcji na jeden zabieg przeszczepienia), po to by uniknąć ewentualnych strat komórek. Jednakże wykonywanie
wielu dodatkowych czynności w zastosowanym w ten sposób tzw. układzie otwartym
preparatyki może grozić zakażeniem materiału poddawanego preparatyce.
W obecnej pracy zastosowano dwie metody rozmrażania krioprezerwowanych komórek jądrowych krwi pępowinowej. Metoda „klasyczna” polegała na rozcieńczeniu
rozmrożonej zawartości fiolki podłożem hodowlanym z dodatkiem płodowej surowicy
cielęcej, natomiast metoda „Rubinsteina” polegała na rozcieńczeniu zawartości fiolki
płynem zawierającym dekstran (10). Zadaniem składników zawartych w tym płynie
było zapobieżenie spontanicznej agregacji komórek. Niezależnie od zastosowanej metody rozmrażania, jak i gęstości zawiesiny zamrażanych komórek, liczba komórek
tworzących kolonie krwiotwórcze (w przeliczeniu na 100 000 hodowanych komórek
jądrowych, które nie uległy agregacji) pozostawała taka sama. Wynika z tego, że proces agregacji komórek pozostających w zawiesinie nie jest procesem wybiórczym i dotyka zarówno komórki ukierunkowane tworzące kolonie krwiotwórcze, jak i już bar-
Występowanie zjawiska spontanicznej agregacji
113
dziej dojrzałe komórki, niezależnie od nasilenia w/w procesu, które następuje wraz ze
wzrostem gęstości zawiesiny komórek jądrowych w próbce.
Prezentowane wyniki zgodne są z wynikami przedstawionymi przez Schlebaka
i wsp. (15), Armitage i wsp (12), Alcorna i wsp. (1) oraz Perez-Oteyza i wsp. (13),
którzy nie stosowali procedury zapobiegającej agregacji i wykazali, że wartość odzysku komórek jądrowych zamrożonych w stężeniu 70 mln komórek w 1 ml zawiesiny
wynosi 54%. Wartość ta jest zbliżona do wartości uzyskanej w niniejszej pracy (57%),
gdy zawiesinę o gęstości 50 mln komórek w 1 ml rozmrażano metodą klasyczną. Powstające w wyniku procesu spontanicznej agregacji komórek struktury są trudne do
rozbicia i próby wykonania tego wiążą się z obniżeniem żywotności komórek. Beaujean i wsp. (3) donoszą o udanych próbach rozbijania agregatów komórek poprzez ich
energiczne wytrząsanie, lecz wyniki przedstawione w obecnej pracy nie potwierdzają
tych danych.
Wydaje się, że w zjawisku spontanicznej agregacji bierze udział szereg procesów
i czynników zachodzących równolegle, lecz nie koniecznie ze sobą powiązanych. Są
to między innymi: uwalniająca się w wyniku degradacji granulocytów i płytek krwi
tromboplastyna i enzymy proteolityczne, czynnik antyheparynowy, obecny w surowicy C-zależny czynnik powodujący selektywną adhezję granulocytów i monocytów
oraz obecność nici DNA ze zdegradowanych komórek. W trakcie procesu obserwowana jest nasilona degradacja granulocytów i płytek krwi. Komórki te są dużo bardziej
wrażliwe na proces kriokonserwacji niż limfocyty, a ponadto optymalny dla nich jest
inny schemat mrożenia. Podczas zamrażania limfocytów, obecne dodatkowo w zawiesinie, prawie wszystkie granulocyty i płytki krwi ulegają destrukcji. Można założyć, że powstała w wyniku ich destrukcji tromboplastyna uczestniczy w powstawaniu
fibrynogenu co prowadzi do zlepiania komórek jądrowych, a wśród nich komórek tworzących kolonie krwiotwórcze. Uwolnione enzymy proteolityczne oddziaływują na
inne, jeszcze nie zdegradowane komórki powodując dalsze narastanie poziomu tromboplastyny i wzmożoną agregację komórek. Nici DNA pochodzące z już zdegradowanych komórek sprzyjają zlepianiu tych komórek, które jeszcze pozostają w zawiesinie.
Z przedstawionych danych wynika, że w trakcie rozmrażania materiału kriokonserwowanego komórki, które tworzą kolonie krwiotwórcze nie uczestniczą czynnie
w procesie agregacji. Natomiast właśnie komórki dodatkowe są czynnikiem sprawczym między innymi procesu agregacji, a co za tym idzie – strat komórek krwiotwórczych odpowiedzialnych za rekonstytucję hematopoezy u biorcy przeszczepu.
Przeciwdziałanie procesowi agregacji prowadzone jest różnymi metodami. Bock
i wsp. (5) helatują przy użyciu EDTA jony Ca++ niezbędne do aktywacji fibrynogenu.
Dodawane są także ACD i heparyna do podłoża do mrożenia oraz do podłoża do rozcieńczania rozmrażanych komórek. Li i wsp.(10) inaktywują uwolnione w wyniku degradacji granulocytów enzymy proteolityczne leupeptyną a Beck i wsp.(4) twierdzą,
że istnieje możliwość rozbijania już powstałych agregatów za pomocą DNA-zy I. Jednak, Nicol i wsp. (12) negują przydatność DNA-zy.
Uzyskane wyniki wskazują, że zastosowanie podłoża z dodatkiem dekstranu i albuminy ludzkiej w znacznym stopniu hamuje zjawisko spontanicznej agregacji.
114
K. ILNICKI, E. URBANOWSKA
W praktyce klinicznej materiał komórkowy stosowany do przeszczepień krwiotwórczych zwykle nie podlega rozcieńczeniu, dlatego należałoby rozważyć wstępne zawieszenie takiego materiału jeszcze przed mrożeniem, w ,,podłożu Rubinsteina” z dodatkiem krioprotektora. To z kolei, wymaga przeprowadzenia dodatkowych badań nad
zachowaniem komórek tworzących kolonie krwiotwórcze w tak odmiennym środowisku, a także reakcji biorcy przeszczepu na to środowisko.
PIŚMIENNICTWO
1. Alcorn MJ, Holyoake TL, Richmond LJ, Pearson C, Farrell E, Green R, Dunlop DJ, Franklin IM.
CD34+ cells can be selected efficiently from cryopreserved peripheral blood progenitor cells and can
retain their proliferative potential. J. Hematotherapy 1997; 6: 501–510.
2. Armitage S, Fehily D, Dickinson A, Chapman C, Navarrete C, Contreras M. Cord blood banking:
volume reduction of cord blood units using a semiautomated closed system. Bone Marrow Transplantation
1999, 23: 505–509.
3. Beaujean F, Bourhis J-H, Bayle C, Jouault H, Divine M, Rieux C, Janvier M, Le Forestier C, Pico
JL. Successful cryopreservation of purified autologous CD34+ cells: influence of freezing parameters on
cell recovery and engraftment. Bone Marrow Transplantation 1998; 22: 1091–1096.
4. Beck C, Nguyen X.D, Kluter H, Eichler H. Effect of recombinant human deoxyribonyclease on the
expression of cell adhesion molecules oof thawed and processed cord blood hematopoietic progenitors.
Eur. J. Hæmatol. 2003; 70: 136–42.
5. Bock GN, Chess L, Mardiney MR. Prevention of clumping of frozen-stored leukocyte populations
by EDTA. Cryobiology 1972; 9: 216–218.
6. Ilnicki K. Efficacy of the umbilical cord blood collection in the conditions of the delivery room’s
staff routine work. Evaluation using some selected physiological parameters. Acta Haematol. Pol. 1986;
27: 139–143.
7. Ilnicki K, Jędrzejczak WW. Przeszczepianie komórek krwiotwórczych krwi pępowinowej u człowieka alternatywą dla przeszczepień szpiku kostnego. Post. Biol. Kom. 994; 21: 461–478.
8. Jędrzejczak WW. Komórki macierzyste krwiotworzenia. w Ultrastruktura i Funkcja Komórki – red
J. Kawiak i Z. Osuchowska P W N 1989; 3: 31–76
9. Jędrzejczak WW, Urbanowska E. Isolation and cryopreservation of haematopoietic stem and progenitor cells from peripheral blood and cord blood. w Advances in Tissue Banking. World Scientific
Publishing 2002; 201–231.
10. Li ML, Panterne B, Levesque J-P, Hatzfeld A, Hatzfeld J. Cryopreservative effect of leupeptin on
early human BM progenitors. In Vitro Cellular and Developemental Biology 1992; 28A: 459–460.
11. Mandanas RA, Kratochvil A, Garner T, Selby GB. Formation of fibrin clots in cryopreserved
stem cell bags during thawing procedure: lack of impact on engraftment in autologous stem cell transplantation. Bone Marrow Transplantation 1999; 23: 303–305.
12. Nicol A, Nieda M, Donaldson C, Denning-Kendall P. Analysis of cord blood CD34+ cells after
cryopreservation. Exp. Hematol. 1995; 23: 1589–1594.
13. Perez-Oteyza J, Bornstein R, Corral M, Hermosa V, Alegre A, Torrabadella M, Ramos P, Garcia
J., Odriozola J., Navarro J.L. Controlled- versus uncontrolled-rate cryopreservation of peripheral blood
progenitor cells: a prospective multicenter study. Haematologica 1998; 83: 1001–1005.
14. Rubinstein P, Dobrila L, Rosenfeld RE, Adamson JW, Migliaccio G, Migliaccio AR, Taylor PE,
Stevens CE. Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution. Proc Nat Acad Sci, 1995; 92: 10119–10122.
15. Schlebak AA, Marley SB, Roberts IAG, Goldman JM, Gordon MY. Optimal timing for processing and cryopreservation of umbilical cord
hematopoietic stem cells for clinical transplantation.
Bone Marrow Transplantation 1999; 23: 131–136.
Występowanie zjawiska spontanicznej agregacji
115
16. Solves P, Perales A, Mirabet V, Blasco J, Blanquer A, Planelless D, Larrea L, Monleon J, Carbonell-Ubreros F. Angeles Soler M. Optimizing Donor selection in a Cord Blood Bank. Eur. J. Hæmatol.
2004; 72: 10 –12.
17. Sutherland HJ, Eaves AC, Eaves CJ.: Quantitative assays for human hematopoietic progenitor
cells. w Bone Marrow Processing and Purging: a Practical Guide. Ed, A.P.Gee CRC Press Inc. Boca
Raton PP 1991; 155–171
18. Tanavade VM, Malehorn MT, Lumkul R, Gao Z, Wingard J, Garrett ES, Civin CI. Human Stem
Progenitor cells from neonatal Cord Blood have greater hematopoietic expansion capacity then those from
mobilised adult blood. Exp. Hematol. 2002; 30: 816–23.
19. Urbanowska E, Jędrzejczak WW. Krew pępowinowa jako źródło komórek krwiotwórczych do
przeszczepienia. Acta Haematol. Pol. 2004; 35: 87–95.
Praca wpłynęła do Redakcji 19.12.2005 r. i została zakwalifikowana do druku 24.08.2006 r.
Adres Autora:
Krzysztof Ilnicki
ul. Bukowskiego 7/23
03-982 Warszawa