pobierz

Acta Haematologica Polonica 2008, 39, Nr 1, str. 99–110
PRACA ORYGINALNA – Original Article
BARBARA PIEŃKOWSKA-GRELA1, RENATA WORONIECKA1, KAROLINA DOROSZUK1, JOLANTA RYGIER1, ANNA PASTWIŃSKA1, BEATA
GRYGALEWICZ1, WITOLD PREJZNER2, ANDRZEJ HELLMANN2
Częstość delecji submikroskopowego obszaru fuzji ABL/BCR
w badaniu rutynowym i przy uŜyciu sond specyficznych
u pacjentów z przewlekłą białaczką szpikową
Frequency of submicroscopic deletion in fused ABL/BCR region by
routine diagnostic method and with specific FISH probes in patients
with chronic myeloid leukemia
1
Samodzielna Pracownia Cytogenetyki, Centrum Onkologii im. M. Skłodowskiej-Curie,
Warszawa
2
Katedra i Klinika Hematologii i Transplantologii Akademii Medycznej, Gdańsk
STRESZCZENIE
Standard diagnostyczny w CML obejmuje klasyczne badanie kariotypu wykonywane łącznie
z badaniem FISH. W pracy porównano skuteczność metody FISH z uŜyciem rutynowo stosowanej sondy D-FISH BCR/ABL i sondy hybrydyzującej do genu ASS dla detekcji delecji submikroskopowego regionu w obszarze fuzji BCR/ABL. Stwierdzono, Ŝe rutynowa technika FISH przy
uŜyciu sondy D-FISH BCR/ABL, stosowana równolegle z badaniem kariotypu jest wystarczająco czuła dla wykrycia tej zmiany.
SŁOWA KLUCZOWE: Przewlekła białaczka szpikowa – Analiza cytogenetyczna – FISH
SUMMARY
Diagnostic standard for chronic myeloid leukemia includes both karyotype and FISH analysis.
We connected the efficiency of FISH method with the use of standard D-FISH BCR/ABL and
ASS gene probes for selection of CML cases with submicroscopic deletion in fused ABL/BCR
region. Our data indicate that routine FISH examination with simultaneous karyotype analysis is
sufficient for detection of submicroscopic deletion in fused ABL/BCR region.
KEY WORDS: Chronic myeloid leukemia – Cytogenetic analysis – FISH
WSTĘP
Przewlekła białaczka szpikowa (chronic myeloid leukemia – CML) charakteryzuje
się obecnością aberracji chromosomowej w postaci translokacji t(9;22)(q34;q11). Rezultatem pęknięć w regionach 9q34 (locus genu ABL) i 22q11 (locus genu BCR) jest
powstanie fuzyjnego genu BCR/ABL, którego produktem jest białko o aktywności kinazy tyrozynowej. Stwierdzenie obecności translokacji t(9;22) lub fuzji BCR/ABL ma
100 B. PIEŃKOWSKA-GRELA i wsp.
zasadnicze znaczenie diagnostyczne, a ich brak – wyklucza diagnozę przewlekłej białaczki szpikowej.
W obrazie cytogenetycznym translokacja t(9;22) manifestuje się obecnością wydłuŜonego chromosomu 9 [der(9)] oraz chromosomu Philadelphia (Ph), będącego pochodną chromosomu 22 [der(22)]. W klasycznej postaci taka translokacja wzajemna
występuje u 90% chorych (1, 2). Do niedawna najczęściej stosowaną metodą wykrywania obecności tej aberracji była technika klasycznej analizy prąŜkowej, a w ostatnich
latach do rutynowej diagnostyki CML wprowadzona została technika fluorescencyjnej
hybrydyzacji in situ (FISH), co jest obecnie obowiązującym standardem (3). Początkowo stosowane sondy starszej generacji (S-FISH , od ang. single fusion signal) zostały zastąpione bardziej czułymi sondami D-FISH (ang. double fusion signal) bądź ESFISH (ang. extra signal).
Zastosowanie sond o wysokiej czułości pozwoliło wykryć obecność nietypowego
znakowania FISH ujawnianego, zaleŜnie od laboratorium, u 9–30% pacjentów. W znakowaniu tym, obraz uzyskany w wyniku hybrydyzacji komórek Ph+ z sondą D-FISH,
wykazuje brak jednego bądź dwóch sygnałów pochodzących z regionów BCR i/albo
ABL na chromosomie 9, zaangaŜowanym w translokację [der(9)]. Analiza metafaz
wykazała, Ŝe w takich przypadkach fuzji BCR/ABL na zmienionym chromosomie 22
[der(22)] towarzyszą delecje regionów, leŜących w pobliŜu punktu pęknięcia na der(9)
(4–7). Szczegółowe badania molekularne wykazały, Ŝe wielkość regionów ulegających
delecji moŜe wahać się od kilku kpz do kilku mpz. Minimalny region delecji na der(9),
obejmuje gen ASS, leŜący w pobliŜu genu ABL lub/i gen IGLL1 przenoszony
z chromosomu 22 wraz z regionem BCR (8). Zmiana taka jest aberracją submikroskopową tj. niewykrywalną technikami cytogenetyki klasycznej (G-banding, GTG). Bardzo rzadko obserwowane są przypadki, gdzie następuje utrata tak duŜych fragmentów
chromosomu (powyŜej 10mpz), Ŝe aberracje te widoczne są w obrazie prąŜkowym
chromosomu (9).
Analiza danych klinicznych wykazała, Ŝe pacjenci będący nosicielami delecji w regionie fuzyjnym ABL/BCR są oporni na leczenie interferonem α i cechuje ich krótszy
czas przeŜycia (4–7, 10). Ocena znaczenia delecji w leczeniu imatinibem nie jest jednoznaczna. Obecność tej zmiany wydaje się nie wpływać na uzyskanie remisji cytogenetycznej w pierwszym okresie leczenia, jednak późniejsze obserwacje korelują tę
cechę z pojawianiem się progresji choroby czy oporności wtórnej (11, 12). Ze względu
na stosunkowo krótki, dotychczasowy czas obserwacji pacjentów leczonych imatinibem nie moŜna definitywnie wypowiadać się w kwestii ewentualnego wpływu delecji
na całkowity czas przeŜycia u tych pacjentów. W oparciu o dotychczas zgromadzone
dane obecność delecji w regionie ABL/BCR została uznana za czynnik zagroŜenia
w aktualnych wytycznych European Leukemia Net (13).
Rutynowo stosowana do diagnostyki cytogenetycznej sonda D-FISH BCR/ABL,
pozwala zaobserwować delecje obejmujące regiony o stosunkowo duŜej wielkości.
Z tego względu załoŜono, Ŝe mogą istnieć przypadki z delecjami ograniczającymi się
wyłącznie do genu ASS i pozostawiające fragment regionu genu ABL, o wielkości wystarczającej do uzyskania widocznego sygnału hybrydyzacyjnego. Takie zmiany mo-
Częstość delecji submikroskopowego obszaru fuzji ABL/BCR
101
głyby pozostać niewykrywalne w trakcie rutynowej analizy diagnostycznej. Dla wykazania częstości delecji w CML wykonano analizę FISH u 26 pacjentów z przewlekłą
białaczka szpikową, stosując równolegle sondę D- FISH BCR/ABL i sondę znakującą
gen ASS.
MATERIAŁ I METODY
Badanie cytogenetyczne przeprowadzono w grupie 26 pacjentów z potwierdzoną
diagnozą przewlekłej białaczki szpikowej, w tym u trzech pacjentów - w trakcie podjętego leczenia. W badaniu wykorzystano materiał pochodzący z krótkotrwałej hodowli
in vitro komórek uzyskanych z biopsji szpiku od 10 pacjentów oraz rozmazy szpiku
pochodzące od 16 pacjentów.
Komórki uzyskane w wyniku standardowej hodowli in vitro a takŜe rozmazy szpiku utrwalone zostały mieszaniną Carnoy’a (metanol : kwas octowy lodowaty w stosunku 3:1). Klasyczną analizę prąŜkową (GTG) przeprowadzono na materiale otrzymanym w wyniku hodowli in vitro. Metafazy uzyskane w 9/10 przypadkach poddane
zostały róŜnicowemu barwieniu metodą Wright’a dla uzyskania wzoru prąŜkowego
chromosomów. Analizowano 20–25 metafaz od kaŜdego pacjenta. Kariotypy opisano
zgodnie z ISCN 2005 (14).
Fluorescencyjną hybrydyzację in situ przeprowadzono na materiale z hodowli in
vitro komórek szpiku (10 pacjentów) i na rozmazach szpiku (16 pacjentów). We
wszystkich 26 przypadkach równolegle zastosowano dwie sondy: LSI BCR/ABL Dual
Colour Dual Fusion Probe (Vysis) i LSI 9q34 Spectrum Aqua, znakującą gen ASS (Vysis) (Ryc.1). Analizowano co najmniej 200 jąder interfazowych w kaŜdym przypadku
dla kaŜdej z sond.
Efekt hybrydyzacji z sondą BCR/ABL, widoczny jest w typowej komórce z tą fuzją w postaci dwóch Ŝółtych sygnałów fuzyjnych (Y, ang. yellow), pochodzących ze
zrearanŜowanych chromosomów 9 i 22, jednego sygnału czerwonego pochodzącego
z prawidłowego chromosomu 9 (R, ang. red) oraz jednego sygnału zielonego pochodzącego z prawidłowego chromosomu 22 (G, ang. green). Tak więc wzór znakowania
w przypadku typowej fuzji określany jest jako 2Y1R1G (Ryc.1).
Znakowanie sondą ASS w prawidłowych komórkach ujawnia obecność dwu sygnałów niebieskich (Aq, ang. aqua), odpowiadajacym dwum kopiom genu ASS. Utrata
jednego sygnału wskazuje na delecję jednej z kopii badanego genu.
WYNIKI
Wyniki analizy cytogenetycznej materiału szpiku, uzyskanego od 26 pacjentów zestawiono w Tabeli 1. Analizę kariotypu przeprowadzono u 9 pacjentów, u których
uzyskano figury podziałowe w wyniku hodowli in vitro (HG 277, 276, 108, 135, 136,
185, 186, 281 i 282). U 8 z tych pacjentów stwierdzono obecność typowej translokacji
t(9;22)(q34;q11), która w 6 przypadkach była zmianą izolowaną. U pacjenta HG 135,
translokacji t(9;22) towarzyszyła aberracja dodatkowa, t(2;12)(q31;q13), zaś w HG
102 B. PIEŃKOWSKA-GRELA i wsp.
108 – dodatkową zmianą była delecja fragmentu długiego ramienia chromosomu 18.
W komórkach pacjenta HG 276 wykazano w kariotypie obecność translokacji wariantowej t(7;9;22)(q32;q34;q11).
Tabela 1. Wyniki analizy kariotypowej i analizy FISH, przeprowadzonej przy uŜyciu dwu sond specyficznych: LSI BCR/ABL Dual Colour Dual Fusion Probe i LSI 9q34
Table 1. Spectrum Aqua (Vysis) na komórkach szpiku 26 pacjentów z CML. Znakowanie Y – sygnał
fuzyjny, R – sygnał czerwony (ABL), G – sygnał zielony (BCR), Aq – sygnał jasnoniebieski (ASS).
Lp
Nr pacjenta
1.
HG 277
2.
HG302/1*$
3.
HG 305*$
4.
HG 438*
5.
HG 263*$
6.
HG 469*
7.
HG 276
Lp
Nr pacjenta
8.
HG 108
9.
HG 135
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
HG 136
HG 185
HG 186
HG 281
HG 282
HG 304*
HG 307*
HG 335*
HG336/1*
HG 431*
HG 432*
A. Pacjenci z nietypowym wzorem znakowania
FISH
Kariotyp
sonda BCR/ABL
sonda ASS
Wzór znakowania
Wzór znakowania
(%)
(%)
46,XX,t(9;22) [20]
1Y1R1G (82%)
1Aq (78%)
2R2G (18%)
2Aq (22%)
n.t.
1Y1R1G (17%)
1Aq (18%)
2R2G (83%)
2Aq (82%)
n.t.
1Y1R1G (30%)
1Aq (23%)
2R2G (70%)
2Aq (77%)
n.t.
1Y1R1G (95%)
1Aq (88%)
2R2G (5%)
2Aq (12%)
n.t.
1Y1R2G (41%)
1Aq (49%)
2R2G (59%)
2Aq (51%)
n.t.
1Y1R2G (83%)
1Aq (86%)
2R2G (17%)
2Aq (14%)
46,XX,t(7;9;22)(q32;q34;q11)
1Y2R2G (42%);
2Aq (100%)
[19]/ 46,XX[1]
1Y1R2G (31%);
1Y2R1G (9%)
2R2G (18%)
B. Pacjenci z typowym wzorem znakowania
FISH
Kariotyp
sonda BCR/ABL
sonda ASS
Wzór znakowania
Wzór znakowania
46,XX, t(9;22),del(18)(q2?1)
2Y1R1G
2Aq
[17]/ 46,XX[3]
46,XY,t(2;12)(q31;q1?3),
2Y1R1G
2Aq
t(9;22)[20]
46,XY,t(9;22) [14] /46,XY [6]
2Y1R1G
2Aq
46,XY,t(9;22) [17]/ 46,XY[3]
2Y1R1G
2Aq
46,XX,t(9;22) [20]
2Y1R1G
2Aq
46,XX,t(9;22) [20]
2Y1R1G
2Aq
46,XX,t(9;22) [25]
2Y1R1G
2Aq
n.t.
2Y1R1G
2Aq
n.t.
2Y1R1G
2Aq
n.t.
2Y1R1G
2Aq
n.t.
2Y1R1G
2Aq
n.t.
2Y1R1G
2Aq
n.t.
2Y1R1G
2Aq
Częstość delecji submikroskopowego obszaru fuzji ABL/BCR
21.
22.
23.
24.
25.
26.
HG 433*
HG 434*
HG 439*
HG 470*
HG 471*
HG 472*
n.t.
n.t.
n.t.
n.t.
n.t.
n.t.
2Y1R1G
2Y1R1G
2Y1R1G
2Y1R1G
2Y1R1G
2Y1R1G
103
2Aq
2Aq
2Aq
2Aq
2Aq
2Aq
* badanym materiałem był rozmaz szpiku
$ pacjent w trakcie leczenia
n.t. nie testowano
Badanie FISH z wykorzystaniem sondy BCR/ABL potwierdziło obecność fuzji
BCR/ABL u wszystkich 26 pacjentów, wykazując jednocześnie róŜnice znakowania
pomiędzy poszczególnymi przypadkami.
ABL (sygnał czerwony)
BCR (sygnał zielony)
BCR/ABL i ABL/BCR (sygnały fuzyjne – Ŝółte, na der(9) i der(22) czyli Ph)
9 9
22
22
9
der(9)
Komórka prawidłowa
2R2G
22 Ph
Ph
Komórka z typową fuzją
BCR/ABL
2Y1R1G
Ryc. 1. Wynik hybrydyzacji z sondą D-FISH BCR/ABL.
W komórce prawidłowej widoczne są po dwa sygnały zielone i czerwone pochodzące z prawidłowych
chromosomów 9 i 22 (2R2G). W komórce z typową fuzją BCR/ABL widoczny jest jeden sygnał czerwony
i jeden zielony pochodzące z prawidłowych chromosomów 9 i 22 oraz dwa Ŝółte sygnały fuzyjne pochodzące ze zmienionego chromosomu 9 i z chromosomu Ph (2Y1R1G).
W 7 przypadkach ujawniony wzór znakowania odbiegał od typowego 2Y1R1G.
W analizowanych komórkach przypadków HG 277, 302, 305, 438, 263, 468 i 276 widoczny był tylko jeden sygnał fuzyjny. Wykazanie ubytku drugiego z sygnałów fuzyjnych, wskazuje na zajście delecji w obszarze fuzji badanych genów. U chorych z nietypowym obrazem fuzji w jądrach interfazowych występowały róŜne wzory znakowania: 1Y1R1G, 1Y1R2G i 1Y2R2G.
W 4 przypadkach (HG 277, 302, 305, 438) ujawniły się komórki ze wzorem hybrydyzacyjnym 1Y1R1G (Ryc. 2A, Tab. 1A). Analiza jąder interfazowych wykazała
występowanie znakowania odpowiadającego jednemu sygnałowi fuzyjnemu (1Y, kolokalizacja sygnału czerwonego i zielonego), jednemu sygnałowi czerwonemu (1R,
104 B. PIEŃKOWSKA-GRELA i wsp.
Częstość delecji submikroskopowego obszaru fuzji ABL/BCR
105
106 B. PIEŃKOWSKA-GRELA i wsp.
gen ABL) i jednemu sygnałowi zielonemu (1G, gen BCR) (Rycina 2A). Równoległa
analiza znakowanych sondą metafaz u pacjenta HG 277 potwierdziła obecność sygnału
fuzyjnego na chromosomie Ph [der(22)] i brak sygnałów na zmienionym chromosomie
9 [der(9)]. Oznacza to utratę całego fragmentu fuzyjnego ABL/BCR ze zmienionego
chromosomu 9, z zachowaniem fuzji BCR/ABL na chromosomie der(22). Kariotyp tej
białaczki wykazywał obecność translokacji t(9;22) jako jedynej zmiany. W tych 4
przypadkach komórki ze znakowaniem nietypowym obserwowane były w 17% - 82%
komórek badanej populacji. Pozostałe jądra interfazowe wykazywały wzór 2R2G,
odpowiadający obecności dwu niezmienionych kopii genów ABL i BCR.
Drugi typ znakowania 1Y1R2G zaobserwowano u dwóch kolejnych chorych: HG
263 i HG 469. Analiza jąder interfazowych wykazała występowanie tu jednego sygnału fuzyjnego, jednego sygnału czerwonego i dwu sygnałów zielonych (Rycina 2B).
Obraz taki wskazywał obecność fuzji BCR/ABL na der(22), widocznej jako jeden sygnał kolokalizacyjny. Obserwowane dwa sygnały zielone odpowiadają: prawidłowemu
genowi BCR (chromosom 22) i dystalnemu fragmentowi genu BCR, przeniesionemu
na der(9) w rezultacie translokacji. Jeden sygnał czerwony odpowiada genowi ABL na
prawidłowym chromosomie 9. Brak drugiego sygnału fuzyjnego jest efektem utraty
proksymalnego obszaru regionu genu ABL (znakowanie czerwone) ze zmienionego
chromosomu 9. Znakowanie takie wystąpiło w 41% (HG 263) i 83% (HG 469) badanych populacji szpiku, zaś pozostałe komórki wykazywały znakowanie 2R2G odpowiadające komórkom nieobciąŜonym fuzją BCR/ABL.
W przypadku HG 276 badanie FISH wykazało przewagę (42%) komórek niosących wzór znakowania 1Y2G2R (Ryc. 2C). Komórki pozbawione fuzji (2G2R) stanowiły 18%, zaś pozostałe 40% komórek wykazywało 1–2 sygnałów czerwonych i zielonych, przy zachowaniu jednego sygnału fuzyjnego. Analiza metafaz tego przypadku
wykazała, Ŝe występujące tu odstępstwo od typowego obrazu znakowania FISH nie
wynika ze zmniejszenia liczby sygnałów pochodzących z poszczególnych genów,
a z rozdzielenia jednego z sygnałów fuzyjnych na jego składowe (1G i 1R). Stwierdzony jeden sygnał kolokalizacyjny (1Y) zlokalizowany był na der(22) i odpowiadał fuzyjnemu genowi BCR/ABL. Drugi sygnał fuzyjny ABL/BCR uległ rozdzieleniu tak, Ŝe
translokowany fragment genu BCR został przeniesiony na zmieniony chromosom
7 [der(7)], a sygnał czerwony genu ABL zaangaŜowanego w translokację pozostał na
der(9). Obraz taki wynika z obecności translokacji złoŜonej pomiędzy trzema chromosomami t(7;9;22), stwierdzonej w badaniu kariotypowym (Ryc. 3). Sumaryczna liczba
sygnałów BCR i ABL w komórce nie uległa w tym przypadku zmianie (po trzy zielone
i czerwone), co wskazuje na brak utrat obszarów znakowanych, a co za tym idzie brak
submikroskopowych delecji.
W pozostałych 19 badanych przypadkach (Tab. 1B) wykazano obecność typowego
wzoru znakowania (2Y1R1G), co wskazuje na fuzję BCR/ABL na chromosomie
der(22), z zachowaniem fuzji ABL/BCR na zmienionym chromosomie 9, a więc bez
delecji w obszarze fuzji ABL/BCR.
Równolegle u wszystkich chorych przeprowadzona została analiza FISH z zastosowaniem sondy znakującej gen ASS (Tab. 1). W 6 przypadkach (pozycje 1–6) wystą-
Częstość delecji submikroskopowego obszaru fuzji ABL/BCR
107
piła utrata jednego sygnału sondy ASS, równoznaczna z delecją tego regionu. Odsetek
komórek z delecją ASS stwierdzony w tym doświadczeniu, odpowiadał odsetkowi komórek z fuzją BCR/ABL, wykazanemu w badaniu sondą BCR/ABL na tym samym
materiale.
W przypadku HG 276 analiza jąder interfazowych, znakowanych sondą ASS wykazała obecność obydwu sygnałów tego genu we wszystkich ocenianych jądrach
i potwierdziła brak delecji ABL/BCR w tym przypadku. Obecność dwu sygnałów z
genu ASS, a więc brak delecji tego obszaru wykazano równieŜ u pozostałych 19 pacjentów (Tab. 1B), gdzie znakowanie sondą BCR/ABL wykazało typowy wzór fuzyjny
2Y1G1R.
DYSKUSJA
Równoległe zastosowanie sondy znakującej szeroki obszar fuzyjny BCR/ABL,
z sondą znakującą minimalny obszar delecji, gen ASS, wykonane w niniejszej pracy,
miało na celu zweryfikowanie danych dotyczących częstości i typu delecji submikroskopowych w regionie fuzji ABL/BCR w przewlekłej białaczce szpikowej.
Obecność produktu chimerycznego genu BCR/ABL, zlokalizowanego na zmienionym chromosomie 22, jest kluczową przyczyną powstania przewlekłej białaczki szpikowej, a jego obecność jest stwierdzana w komórkach szpiku wszystkich pacjentów
z CML. Funkcja drugiego produktu fuzyjnego, genu ABL/BCR powstającego na zmienionym chromosomie 9, nie jest ostatecznie wyjaśniona, jednak uwaŜa się, Ŝe jego
znaczenie w procesie karcinogenezy jest niewielkie (15). Submikroskopowe delecje
w regionie fuzji ABL/BCR są zjawiskiem towarzyszącym fuzji BCR/ABL w części
przypadków przewlekłej białaczki szpikowej. Dotyczą one fragmentów o wielkości od
kilku kpz do kilku mpz (5, 8).
Dotychczas publikowane dane, wykazują dość duŜe rozbieŜności w ocenie częstości występowania tej cechy. W róŜnych laboratoriach światowych określono odsetek
przypadków z delecją ABL/BCR w zakresie od 9% do 30% wszystkich zdiagnozowanych CML (4–6, 10, 15–17). Wyniki prac wielu autorów wskazują, Ŝe delecje w regionie fuzyjnym ABL/BCR powstają równocześnie z zajściem translokacji t(9;22). Delecja
taka nie jest więc zmianą wtórną, pojawiającą się w trakcie progresji, a częstość jej
występowania nie jest zaleŜna od stadium choroby. Wiarygodność tej tezy wynika
z licznych obserwacji, ujawniających jednorodność populacji komórek Ph+ pod względem statusu delecji obszaru ABL/BCR. Nie stwierdza się u jednego pacjenta jednoczesnego występowania metafaz Ph+ z delecjami i metafaz Ph+ bez delecji (5–8). Pojedyncze doniesienia o przypadkach, gdzie delecje w obrębie regionu fuzji ABL/BCR są
wykrywane w trakcie progresji choroby, nie są dostatecznie udokumentowane i wskazują raczej na niedostatki techniczne metody we wcześniejszej fazie badań (9, 16).
W 77% przypadków badanej grupy 26 chorych nie stwierdzono cech delecji w obszarze fuzji, znakowanej sondami dla genów ABL i BCR. Jednocześnie wykazano
u tych pacjentów obecność dwu kopii genu ASS . Podobne wyniki wykazujące brak
108 B. PIEŃKOWSKA-GRELA i wsp.
delecji genu ASS u chorych z typową fuzją zanotowała Aoun i in. w grupie 152 chorych na przewlekłą białaczkę szpikową (17).
W badanej przez nas grupie pacjentów 27% wykazało nietypowy wzór znakowania
w odczycie z sondy BCR/ABL. U jednego chorego równoległa analiza metafaz znakowanych sondami i ujawniających prąŜki G wykazała, Ŝe brak drugiego sygnału fuzyjnego (ABL/BCR) wynika z obecności translokacji złoŜonej. W rezultacie translokacji t(7;9;22), materiał niosący dystalny fragment regionu genu BCR, translokowany w
warunkach typowych na der(9), został tu przeniesiony na chromosom 7, na der(9) pozostał zaś proksymalny fragment genu ABL. W tym przypadku nietypowe znakowanie
nie było związane z utratą sekwencji obszaru ABL/BCR i nie stwierdzono tam utraty
genu ASS.
W 23% przypadków analiza jakości i liczby sygnałów genów ABL i BCR wykazała
obecność submikroskopowej delecji z obszaru fuzji ABL/BCR. We wszystkich tych
przypadkach utracie jednego sygnału fuzyjnego, towarzyszyła równoczesna utrata
jednej kopii genu ASS. W 67% przypadków z obecnością submikroskopowej delecji
obserwowano znakowanie 1Y1R1G, wskazujące na utratę całego genu fuzyjnego
ABL/BCR z chromosomu der(9). Znacznie rzadziej (33%) notowano wzór znakowania
1Y1R2G, wynikający z utraty fragmentu regionu genu ABL, z zachowaniem przeniesionego na der(9) dystalnego regionu genu BCR.
Populacji komórek Ph+ z submikroskopową delecją towarzyszyły komórki prawidłowe w obszarze badanych genów, to jest wykazujące obecność dwu kopii genów
ABL, BCR i ASS. Takie komórki stanowiły od 5% do 83% badanej populacji. Wysoki
odsetek komórek prawidłowych stwierdzono u pacjentów, którzy w trakcie leczenia
uzyskali częściową remisję cytogenetyczną.
Wzór znakowania FISH w przypadkach z delecją nie jest jednolity. U większości
pacjentów dochodzi do utraty sekwencji po obydwu stronach punktu pęknięcia na
der(9), tj. zarówno sekwencji pochodzącej z chromosomu 9, jak i przeniesionej z chromosomu 22 (wzór 1Y1R1G). DuŜo rzadziej tracony jest wyłącznie fragment chromosomu 9 (znakowanie 1Y1R2G), a w pojedynczych tylko przypadkach notowane są
delecje obejmujące tylko region pochodzący z chromosomu 22 (5, 6, 8, 17). Tak zróŜnicowany obraz powoduje trudności z jednoznaczną oceną. RozbieŜność publikowanych wyników moŜna korelować z trudnościami detekcji bądź interpretacji uzyskanych
sygnałów FISH lub/i stosowania róŜnego typu sond dla oceny delecji. Cytowane powyŜej badania opierają się w większości na analizie wyników znakowania przy uŜyciu
translokacyjnych sond D-FISH BCR/ABL, stosowanych rutynowo w diagnostyce
CML. Definicja utraty sygnału jest w tych przypadkach wypadkową jakości preparatu,
czułości stosowanych systemów detekcji i parametrów technicznych systemów analizy
obrazu, a takŜe od doświadczenia oceniającego badacza. Tak więc zastosowanie sondy
ASS w przypadkach wątpliwych bądź trudnych do interpretacji jest, w świetle uzyskanych przez nas wyników, dobra technika uzupełniającą.
Dotychczasowe dostępne dane wskazują na istotną rolę rokowniczą delecji w obrębie fuzji ABL/BCR u chorych z CML leczonych interferonem alfa, natomiast dane dotyczące znaczenia tego parametru w terapii imatinibem nie są w pełni zgodne. Pacjenci
Częstość delecji submikroskopowego obszaru fuzji ABL/BCR
109
z obecnością delecji w regionie ABL/BCR są bardziej oporni na chemioterapię i leczenie interferonem, co skutkuje krótszym czasem przeŜycia (4–7, 10). Natomiast terapia
inhibitorami kinaz tyrozynowych częściowo znosi niekorzystny wpływ rokowniczy
tego parametru. Niektóre obserwacje korelują jednak tę cechę z pojawianiem się progresji choroby czy oporności wtórnej (10, 11). Mimo nierozstrzygniętych wątpliwości
European Leukemia Net uznał obecność delecji za czynnik zagroŜenia, dlatego teŜ
wskazano oznaczanie obecności lub braku tej aberracji u wszystkich pacjentów z CML
za istotne przed podjęciem leczenia.
Wydaje się, Ŝe zastosowanie sondy D-FISH BCR/ABL jest wystarczające, aby taką
delecję wykryć. Równoczesne zastosowanie sond znakujących geny BCR, ABL i ASS
w badanej grupie nie wykazało dalszych przypadków z delecją, nie wykrytych rutynowo stosowaną sondą D-FISH. Na podstawie przeprowadzonego badania moŜna sądzić,
Ŝe standardowo wykorzystywana technika D-FISH w pełni wykrywa przypadki obciąŜone źle rokującą delecją w obszarze chimerycznego genu ABL/BCR. Zastosowanie
dodatkowego znakowania sondą ASS jest wskazane jedynie w przypadkach wątpliwych, przy zmiennej liczbie sygnałów i braku analizy prąŜkowej, a takŜe w trakcie
monitorowania pacjentów ze stwierdzoną delecją w obszarze fuzji ABL/BCR.
PIŚMIENNICTWO
1. Bentz M, Cabot G, Moos M, Speicher MR, Ganser A, Lichter P, Dohner H. Detection of chimeric
myeloid and acute lymphoblastic leukemia by in situ hybridization. Blood, 1994; 8: 1922-1928.
2. Hagemeijer A, Bartram CR, Smit EME, van Agthoven AJ, Bootsma D. Is the chromosomal region
9q34 always involved in variants of the Ph1 translocation? Cancer Genet Cytogenet, 1984; 13: 1-16.
3. Preizner W, Sacha T, Salamanczuk Z, Pienkowska-Grela, Haus O, Hellmann A. Standard postępowania diagnostycznego i terapeutycznego u chorych z przewlekłą białaczką szpikową w Polsce w roku
2007. Acta Hematologica Polonica, 2007; 30: 107-122.
4. Sinclair PB, Nacheva ER, Leversha M, Telford N, Chang J, Reid A, Bench A, Champion K, Huntly
B, Green AR. Large deletions at the t(9;22) breakpoint are common and may identify a poor-prognosis
subgroup of patients with chronic myeloid leukemia. Blood, 1999, 95(3): 738-744.
5. Cohen N, Rozenfeld-Granot G, Hardan I, Brok-Simoni F, Amariglio N, Rechavi G, Trakhtenbrot
L. Subgroup of patients Philadelphia-positive chronic myelogenous leukemia characterized by a deletion
of 9q proximal to ABL gene: expression profiling, resistance to interferon therapy, and poor prognosis.
Cancer Genet Cytogenet, 2001; 128: 114-119
6. Huntly BJP, Reid AG, Bench AJ, Campbell LJ, Telford N, Shepherd P, Szer J, Prince M, Turner P,
Grace C, Nacheva EP, Green AR. Deletions of the derivative 9 occur at the time of the Philadelphia translocation and provide a powerful and independent prognostic indicator in chronic myeloid leukemia. Blood,
2001; 98(6): 1732-1738.
7. Kolomietz E, Al-Maghrabi J, Brennan S, Karaskowa J, Minkin S, lepton J, Squire JA. Primary
chromosomal rearrangements of leukemia are frequently accompanied by extensive submicroscopic deletions and may lead to altered prognosis. Blood, 2001; 97(11): 3581-3588.
8. Storlazzi CT, Giorgina S, Anelli L, Albano F, Pastore D, Zagaria A, Rocchi M, Liso V. Breakpoint
characterization of der(9) deletions in chronic myeloid leukemia patients. Genes Chromosomes Cancer,
2002; 35: 271-276.
110 B. PIEŃKOWSKA-GRELA i wsp.
9. Xinth PT, Vu HA, Nghia H, Binh NT, Be TV, Binh TV, Tokunaga K, Sato Y. Coexintence of
Philadelphia chromosome positive cells with and without der(9) deletion in a patient with chronic myelogenous leukemia. Cancer Genet Cytogenet, 2006; 164: 122-127
10. Lee YK, Kim YR, Min HC, Oh BR, Kim TY, Kim YS, Cho HI, Kim HC, Lee YS, Lee DS. Deletions of any part of the BCR or ABL gene on the derivative chromosome 9 is a poor prognostic marker in
chronic myeligenous leukemia. Cancer Genet Cytogene,t 2006; 166: 65-73.
11. Huntly BJP, Guilhot F, Reid AG, Vassiliou G, Hennig E, Franke C, Byrne J, Brizard A, Niederwieser D, Freeman- Edward J, Cuthbert G, Bown N, Clark RE, Nachewa EP, Green AR, Deininger MWN.
Imatinib improves but not fully reverse the poor prognosis of patients with CML with derivative chromosome 9 deletions. Blood, 2003; 102(6): 2205-2212.
12.Quintas-Cardama A, Kantarjian H, Talpaz M, O’Brien S, Garcia-Manero G, Verstovsek S, Rios
MB, Hayes K, Glassman A, Bekele BN, Zhou X, Cortes J. Imatinib mesylate therapy may overcome the
poor prognosis significance of deletions of derivative chromosome 9 in patients with chronic myelogenous
leukemia. Blood, 2005; 105(6): 2281-2285.
13.Hehlman R, Hochhaus A, Baccarani M. Chronic myeloid leukaemia. Lancet, 2007; 370: 342-350.
14.ISCN 2005:An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Shaffer L.G., Tommerup N. (eds);S. Karger, Basel 2005
15. Loncarevic IF, Römer J, Starke H, Heller A, Bleck C, Ziegler M, Fiedler W, Liehr T, Clement JH,
Claussen U. Heterogenic molecular basis for loss of ABL1-BCR transcription: deletions in der(9)t(9;22)
and variants of standard t(9;22) in BCR-ABL1-positive chronic myeloid leukemia. Genes Chromosomes
Cancer, 2002; 34: 193-200.
16. Lee DS, Lee YS, Yun YS, Kim YR, Jeong SS, Lee YK, She CJ, Yoon SS, Shin HR, Kim Y, Cho
HI. A study of the incidence of ABL gene deletions on derivative chromosome 9 in chronic myelogenous
leukemia by interphase in situ hybridization and its association with desease progression. Genes Chromosomes Cancer, 2003; 37: 291-299.
17. Aoun P, Wiggins M, Pickering D, Foran J, Rasheed H, Pavletic SZ, Sanger W. Interphase fluorescence in situ hybridization studies for the detection of 9q34 deletions in chronic myelogenous leukemia: a
practical approach to clinical diagnosis. Cancer Genet Cytogenet, 2004; 154: 138-143.
Praca wpłynęła do Redakcji 25.05.2007 r. i została zakwalifikowana do druku 16.01.2008 r.
Adres Autora:
Samodzielna Pracownia Cytogenetyki
Centrum Onkologii im M. Skłodowskiej-Curie
ul. Roentgena 5
02-781 Warszawa
[email protected]