Bioreaktor membranowy Produkcja alkoholu przez drożdże
Transkrypt
Bioreaktor membranowy Produkcja alkoholu przez drożdże
Wrocław, 4.01.17 Bioreaktor membranowy Produkcja alkoholu przez drożdże Saccharomyces cerevisiae z permeatu serwatki (zajęcia odbywać się będą w sali nr 32 – C6) 1. Wstęp Reaktor membranowy jest rodzajem reaktora działającego w trybie ciągłym, który ma na celu immobilizację objętościową katalizatora. W bioreaktorze membranowym za sprawą filtra membranowego miejsce ma zatrzymanie komórek, a więc ich recyrkulacja. W procesach okresowych komórki rozmnażają się do momentu wystąpienia: 1) Krytycznego stężenia czynnika ograniczającego; zwykle zużycia C lub rozpuszczonego O2 2) Krytycznego stężenia hamującego wzrost (np. stężenia etanolu w fermentacji alkoholowej lub kwasu mlekowego w fermentacji mlekowej) Komórki są głównym źródłem przemian biochemicznych, dlatego szybkość procesu fermentacji uzależniona jest od koncentracji komórek (maks. 50 – 80 g. s.m./l). Ograniczenie koncentracji biomasy w bioreaktorze zmniejsza szybkość fermentacji. Stan ten spowodował podjęcie próby przełamania tych barier przez wprowadzenie tzw. kultur o wysokiej koncentracji komórek oraz unieruchomienie komórek na różnego rodzaju nośnikach. Osiągnięcie bardzo wysokich stężeń komórek (wielokrotnie przewyższających ich naturalne stężenie) pozawala na znaczne przyspieszenie procesów fermentacyjnych i zmniejszenie pojemności bioreaktorów, częściowe oczyszczenie metabolitów na membranie lub z innej strony pozyskiwanie z nich produktów. Bioreaktory połączone z zewnętrznym filtrem membranowym nazywane są bioreaktorami membranowymi. Separacja membranowa ma wiele zalet: niskie koszty inwestycyjne i eksploatacyjne, wysoką selektywność rozdziału, łagodne oddziaływanie mechaniczne na komórki, neutralność chemiczna względem pożywek i możliwość pracy ciągłej. Filtr membranowy o przepływie stycznym do przegrody filtracyjnej zatrzymuje cząstki zawiesiny o rozmiarach 0.02 do 10 μ, a więc o wielkości typowych komórek. Przepływ z dużą prędkością styczną do powierzchni membrany zapobiega zjawisku jej polaryzacji i osadzaniu się na jej powierzchni komórek. Najczęściej stosowane membrany zbudowane są z octanu celulozy, polimerów syntetycznych (polisulfonu, polipropylenu) oraz ceramiczne. Te ostatnie wykazują największą wytrzymałość mechaniczną oraz możliwość wielokrotnej sterylizacji. W procesach biotechnologicznych związek między koncentracją biomasy komórkowej i ilością produkowanych przez nią metabolitów może przedstawić się następująco: 1) Metabolity tworzone są w czasie wzrostu biomasy a i ich ilość jest proporcjonalna do stężenia biomasy (matabolity I – rzędowe) 2) Metabolity tworzone są równolegle ze wzrostem komórek oraz po zatrzymaniu ich wzrostu w fazie stacjonarnej (metabolizm mieszany) 3) Metabolity tworzone są tylko w fazie stacjonarnej (metabolity II – rzędowe). Ważnym czynnikiem jest czas trwania hodowli i wynikające stąd konsekwencje, objawiające się śmiercią komórek zamkniętych w pętli fermentacyjnej. W rzeczywistości w pożywce mamy mieszaną populację komórek żywych i martwych, co zmniejsza efektywność bioreaktora, utrudniając jednocześnie ciągłą separację komórek. Stan ten wymusza stosowanie częściowego odbioru biomasy komórkowej (ang. bleeding), aby stworzyć miejsce dla nowych komórek. Odbioru dokonuje się pomiędzy bioreaktorem a modułem membranowych. Wielkość strumienia odbioru wynosi zwykle około 2 – 10% w stosunku do objętości świeżej pożywki wprowadzonej do bioreaktora. Problem związanym ze szybkim przepływem komórek przez układ aparaturowy są mechaniczne oddziaływania, mogące uszkodzić ściany komórkowe mikroorganizmów i w konsekwencji spowodować ich lizę i uwalnianie substancji wewnątrzkomórkowych. Mechaniczne oddziaływania, nazywane siłami ścinającymi, występują tam, gdzie stosuje się intensywne mieszanie lub przetłaczanie cieczy w rurach i innych elementach aparatury. Głównym źródłem takich uszkodzeń są mieszadła mechaniczne (łopatkowe), szczeliny zaworów, elementy pomp, a także wysokie wartości sił ścinających na membranie. Mamy więc do czynienia z „konfliktem interesów’, gdyż dążenie do dużych wartości strumienia wzdłuż membrany skutkuje ograniczeniem negatywnego zjawiska osadzania się komórek na membranie i jednocześnie powoduje ich niszczenie. Ulokowanie membrany na wylocie z bioreaktora ma głownie na celu zatrzymanie aktywnej biomasy. Do tego celu stosuje się membrany mikrofiltracyjne. Jeśli natomiast, mamy na celu zatrzymanie jeszcze nieprzereagowanego substratu musimy zastosować membranę o mniejszej porowatości, np. ultra- lub nanofiltracyjną. By jednak ograniczyć fouling separacja powinna być dwustopniowa: 1) Separacja mikroorganizmów – mikrofiltracja 2) Separacja permeatu uzyskanego z mikrofiltracji w celu odzyskania substratu – nanofiltracja Prowadzenia hodowli w reaktorach membranowych może mieć na celu: 1) Obniżenie zawartości pewnych składników (biodegradacja), a więc interesuje nas stężenie strumienia wylotowego z reaktora (permeatu) względem wlotowego – generalnie powinno być niższe 2) Produkcja pewnych składników przez mikroorganizmy, a więc interesuje nas obecność i stężenie produktu w permeacie. Reaktor membranowy jest rodzajem reaktora pracującego w systemie ciągłym, a więc w celu jego opracowania należy wcześniej rozpoznać proces podstawowy jakim jest reaktor ciągły. Wydajność takiego procesu jest zazwyczaj wyższa niż hodowli okresowej, a nawet może być korzystny proces półciągły, w którym unika się wysokich częstotliwości mutacji mikrobiologicznych. W procesach półciągłych można również uniknąć trudności związanych z utrzymaniem jałowości procesu. Istota hodowli ciągłej polega na tym, że po wstępnym okresie namnażania drobnoustrojów rozpoczyna się stałe zasilanie hodowli strumieniem świeżego podłoża, połączone z ciągłym odbiorem, przy zachowaniu stałej objętości. Postępowanie takie umożliwia przedłużenie na stosunkowo długi czas logarytmicznej fazy rozwoju drobnoustrojów. Bioreaktory przeznaczone do hodowli drobnoustrojów metodą ciągłą pracują na zasadzie turbidostatu – utrzymywania stałego zmętnienia pożywki lub gęstości optycznej bakterii, albo chemostatu, tj. utrzymywania stałego stężenia określonego substratu na stałym poziomie. W hodowli ciągłej ustala się równowaga pomiędzy szybkością zużywania substratu S na syntezę biomasy X a szybkością jej dostarczania: dX dS Y dt dt gdzie: Y – współczynnik wydajności ze zużytego substratu Najprostszy model kinetyki zaproponował Monod: max CS K M CS gdzie: μmax – maksymalna właściwa szybkość wzrostu w warunkach nielimitowanych, KS – stała Monoda, CS – stężenie substratu limitującego w równowadze. W przypadku reaktora działającego w trybie ciągłym operuje się pojęciem czasu przebywania czyli: V V gdzie: V – objętość reaktora, V - strumień pożywki (=strumień płynu pohodowlanego) Reaktor membranowy jest modyfikacją reaktora ciągłego i polega ona na umieszczeniu membrany na strumieniu wylotowym, by zwiększyć stężenie komórek i tym samym wydajność procesu. 2. Wykonanie eksperymentu Hodowla ciągła Przeprowadzenie fermentacji permeatu serwatki w bioreaktorze membranowym jest skomplikowanym i wieloetapowym procesem. W pierwszej kolejności należy opracować kinetykę dobranego szczepu biodegradującego. W tym celu należy prowadzić hodowle w reaktorze działającym w trybie ciągłym (stały odbiór płynu pohodowlanego przy jednoczesnym dozowaniu pożywki, jaką jest roztwór laktozy) dla różnych stężeń równowagowych laktozy w podłożu (nie dozowaniu!), ponieważ w stanie ustalonym i dla odpowiednio dobranego czasu przebywania, stężenie laktozy w strumieniu wylotowym powinno być stałe. Z racji braku możliwości przeprowadzenia hodowli dla różnych stężeń (różnych wartości τ), podczas laboratorium ograniczymy się do jednego czasu wynoszącego 5h i określimy czy jest wystarczający by zredukować zawartość laktozy w strumieniu wlotowym. Do tego celu należy podłączyć do reaktora (Rys.1) zbiornik (Z1) ze sterylnym r-rem laktozy (2gL-1) (stężenie zostanie podane w czasie zajęć) i ustawić obroty pompy P1, tak by strumień był odpowiedni dla czasu przebywania wynoszącego 5h (objętość reaktora 1L). W reaktorze znajduje się hodowla szczepu Saccharomyces cerevisiae na podłożu laktozowym. Odbiór nadmiaru płynu pohodowlanego ma miejsce po osiągnięciu wysokości h1, który jest wysokością przelewu. Rys. 1. Schemat reaktora ciągłego Każda z grup monitoruje stężenie laktozy (DNS) oraz biomasy w strumieniu wylotowym z reaktora. Stężenia laktozy obliczamy z krzywych standardowych zamieszczonych w instrukcji na temat mikrofiltracji, natomiast stężenie biomasy należy obliczyć na podstawie krzywej standardowej, wykonanej na podstawie oznaczenia zawartości suchej masy: Cbiomasy[g·L-1]=0.5·A550nm Należy również zbierać próbki, by wykonać analizę zawartości alkoholu przy pomocy chromatografu gazowego – zostanie wykonana po za zajęciach przez prowadzącego, a wyniki zostaną dostarczone na maila. Przyjmując, że stan ustalony następuje po 4 wymianach objętości reaktora, grupa realizująca zadanie laboratoryjne w piątek uzyska taki stan. Wszystkie spośród grup powinny wymienić się wynikami, ponieważ każda posiada inne dane: 1) Grupa czwartkowa – 815 – czas procesu od 0 do 4h – w trakcie pierwszej wymiany objętości 2) Grupa czwartkowa – 1315 – czas procesu od 5 od 9h – koniec pierwszej i początek drugiej wymiany objętości – uczestnicy pod koniec zajęć muszą podłączyć do reaktora zbiornik pożywki, który musi zasilać reaktor przez noc 3) Grupa piątkowa – 815 – czas procesu 25 – 29 – stan ustalony Hodowle okresowe W celu porównania szybkości fermentacji ciągłej z procesem okresowym, równolegle prowadzona będzie hodowla okresowa (zamknięta) w takich samych warunkach – próbki należy pobierać co godzinę i analizować tak samo jak dla hodowli w systemie ciągłym. Reaktor membranowy (realizowany w kolejnym tygodniu zajęciowym – 18-20.01.16) Kolejnym etapem fermentacji jest prowadzenie go w reaktorze membranowym. Za reaktorem działającym w sposób ciągły umieszcza się membranę mikrofiltracyjną (o średnicy porów 0.14μm), która w sposób ciągły zatrzymuje populację komórkową w reaktorze. Retentat z biomasą zawracany jest do bioreaktora, natomiast permeat, to płyn o zredukowanej zawartości laktozy. Podłączenie membrany do reaktora ma miejsce, gdy reaktor (ciągły) pracuje w stanie ustalonym. Warunki ulegną zmianie i ponownie należy poczekać, aż stan procesu się ustabilizuje, w związku z tym monitorujemy zawartość laktozy i białka w permeacie, mierząc te stężenia co 0.5h. Strumień dozowanej pożywki musi być identyczny, jak odbieranego permeatu. Jego wartość musi zostać ustawiona przy pomocy pompy nr (I). Rys. 1. Schemat reaktora membranowego W czasie eksperymentu nie odbieramy nadmiaru biomasy, więc mierzymy jej stężenie w bioreaktorze, pobierając próbkę zawartości reaktora przez specjalnie przygotowaną do tego rurkę, zapewniającą sterylność układu. 3. Wykonanie sprawozdania (całościowe – po drugiej części – po 20 stycznia) TRYB OKRESOWY: a) Obliczyć szybkość przekształcania laktozy (dc/dt) w hodowlach okresowych dla całego procesu (wszystkie trzy grupy – ok 27h) b) Obliczyć właściwą szybkość wzrostu biomasy dla danej hodowli okresowej c) Wykreślić zależność stężenia laktozy, alkoholu oraz biomasy w zależności od czasu dla hodowli okresowych d) Obliczyć współczynnik wydajności biomasy (hodowle okresowe) TRYB CIĄGŁY: e) Wykreślić zależność stężenia laktozy, alkoholu oraz biomasy w zależności od czasu dla reaktora ciągłego dążącego do stanu ustalonego f) Obliczyć szybkość biodegradowania laktozy i wzrostu biomasy i produkcji alkoholu dla czasu przebywania wynoszącego 5h g) Obliczyć współczynnik wydajności biomasy dla hodowli ciągłej i porównać jego wartość z uzyskaną z wyników dla hodowli okresowej h) Wykreślić zależność stężenia laktozy, alkoholu w strumieniu wylotowym w reaktorze membranowym w zależności od czasu i) Wykreślić zależność stężenia biomasy w reaktorze membranowym od czasu j) Policzyć i porównać wydajności produktu do zużytego substratu oraz powstającej biomasy dla hodowli okresowej i ciągłej (dla 27h) Opracowała: Dr inż. Magdalena Lech