Ćwiczenie 3 ANALIZA JAKOŚCIOWA CUKRÓW

Ćwiczenie 3
ANALIZA JAKOŚCIOWA CUKRÓW
Część doświadczalna obejmuje:
− wykonanie wybranych reakcji identyfikujących cukry
− analizę jakościową niektórych cukrów na podstawie sposobu krystalizacji ich osazonów
WPROWADZENIE
Cukrowce (cukry), nazywane też węglowodanami lub sacharydami, są, poza białkami,
kwasami nukleinowymi i lipidami, jedną z najważniejszych klas cząsteczek biologicznych. W
przyrodzie występują bardzo obficie – ponad 50% węgla organicznego na Ziemi jest przechowywana w postaci skrobi i celulozy. Są to polisacharydy roślinne zbudowane z glukozy
różniące się jedynie sposobem jej połączenia. Zawartość węglowodanów w tkankach roślinnych jest dużo wyższa (80% suchej masy) niż w tkankach zwierzęcych (poniżej 2% suchej
masy), także formy ich występowania są bardziej różnorodne u roślin niż u zwierząt.
Węglowodany pełnią wielorakie funkcje w organizmach żywych. Podstawowe znaczenie
biologiczne tych składników polega na ich wykorzystaniu jako głównego źródła energii
uwalnianej w procesach oksydacyjnych (glikoliza). Cukrowce mogą być też przetwarzane w
inne metabolity wykorzystywane w różnych szlakach przemian, stanowią materiał zapasowy (skrobia u roślin, glikogen u zwierząt), a także służą jako materiał budulcowy pełniący
funkcje strukturalne i nadający komórkom, narządom i całym organizmom odpowiednią stabilność mechaniczną. Na przykład, celuloza stanowi około 40-50% masy ścian komórkowych
roślin, mureina występuje w ścianach komórkowych bakterii, a chityna wchodzi w skład ścian
komórkowych grzybów oraz pancerzy owadów i skorupiaków. Ponadto, połączenia węglowodanów z białkami i lipidami pełnią kluczową rolę w procesach rozpoznania komórkowego pośrednicząc w oddziaływaniach między komórkami oraz w interakcjach między komórkami i składnikami środowiska komórkowego.
Budowa i podział cukrowców
Cukry są grupą związków karbonylowych (aldehydów lub ketonów) zawierających kilka
grup hydroksylowych. Dzielimy je na cukry proste (jednocukry), nazywane monosachary-
1
dami i cukry złożone (wielocukry) nazywane polisacharydami. Monosacharydy są to związki drobnocząsteczkowe, niedające się rozłożyć na inne składniki cukrowe, natomiast polisacharydy są związkami wielkocząsteczkowymi, zbudowanymi z kilkuset do kilkudziesięciu
tysięcy cząsteczek cukrów prostych. Wśród cukrów złożonych wyróżnia się oligosacharydy,
które zbudowane są z kilku (2 – 6) cząsteczek cukrów prostych.
Monosacharydy
Większości monosacharydów odpowiada wzór sumaryczny CnH2nOn. W zależności od
liczby atomów węgla w cząsteczce dzieli się je na triozy, tetrozy, pentozy i heksozy. Monosacharydy zawierające więcej niż 6 atomów węgla, np. heptozy czy oktozy, występują w przyrodzie bardzo rzadko. Ze względu na obecność grupy aldehydowej bądź ketonowej, cukry
proste mogą być aldozami lub ketozami. Końcówka -oza jest charakterystyczna dla cukrów.
Najprostszymi monosacharydami są cukry zawierające trzy atomy węgla w cząsteczce,
czyli triozy: aldehyd glicerynowy (aldoza) i dihydroksyaceton (ketoza). Aldozy zawierające
co najmniej trzy atomy węgla, a ketozy zbudowane co najmniej z czterech atomów węgla,
posiadają w swojej cząsteczce centra chiralne wynikające z obecności węgla asymetrycznego, tj. atomu węgla, którego 4 wartościowości są wysycone różnymi podstawnikami. Takie
związki wykazują czynność optyczną, tzn. zdolność do skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego, którą można mierzyć w polarymetrze. Obecność węgla asymetrycznego powoduje asymetrię danej cząsteczki oraz istnienie dwóch wzorów przestrzennych tej cząsteczki,
które są wzajemnymi odbiciami lustrzanymi. Są one nazywane izomerami optycznymi lub
enancjomerami. Tak więc aldehyd D- i L-glicerynowy (Ryc. 1) to enancjomery lub para
enancjomerów.
Aldehyd
L-glicerynowy
Aldehyd
D-glicerynowy
Dihydroksyaceton
Ryc. 1. Wzory rzutowe Fischera trioz
2
W przypadku monosacharydów zawierających więcej niż 1 asymetryczny atom węgla, symbole D i L odnoszą się do konfiguracji asymetrycznego atomu węgla najbardziej oddalonego
od grupy aldehydowej lub ketonowej, jak pokazano to na przykładzie D- i L-fruktozy (Ryc.2).
Jeśli konfiguracja jest taka jak w aldehydzie D-glicerynowym, cukier należy do szeregu konfiguracyjnego D, jeśli natomiast jest taka jak w aldehydzie L-glicerynowym – do szeregu L.
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
D-fruktoza
L-fruktoza
Ryc. 2. Wzory rzutowe Fischera enancjomerów (odbicia lustrzane) fruktozy
Ilość możliwych, dla określonego monosacharydu, enancjomerów zależy od liczby atomów
węgla asymetrycznego. Ogólnie, dla cząsteczki zawierającej n węgli asymetrycznych można
utworzyć 2n izomerów optycznych, z których połowę będą stanowić izomery D, a drugą połowę izomery L.
Ze względu na to, że struktury stereochemiczne z tetraedrycznym centrum węglowym są
kłopotliwe do rysowania, powszechnie przedstawia się je stosując wzory rzutowe Fischera
(projekcja Fischera), które dają jasny i prosty stereochemiczny obraz przestrzenny przy każdym centrum asymetrycznym. We wzorach Fischera wiązania łączące atomy podstawników z
centralnym atomem węgla są przedstawione jako linie poziome (umownie – skierowane na
zewnątrz płaszczyzny kartki) i pionowe (umownie – skierowane w głąb kartki) (Ryc. 3).
wzór rzutowy
Fischera
wzór
stereochemiczny
Ryc. 3. Sposoby zapisu struktury z tetraedrycznym
centrum węglowym
3
Zależności stereochemiczne dla aldoz i ketoz zawierających 3 – 6 atomów węgla w cząsteczce i należących do szeregu D przedstawione są odpowiednio, na Ryc. 4 i Ryc. 5.
Ryc. 4. Szereg konfiguracyjny D aldoz zawierających 3 – 6 atomów węgla (Berg i wsp. 2005)
Ryc. 5. Szereg konfiguracyjny D ketoz zawierających 4 – 6 atomów węgla (Berg i wsp. 2005)
4
W roztworach wodnych otwarte formy łańcuchowe cukrów ulegają w stopniu niemal całkowitym cyklizacji i przyjmują strukturę pierścieniową, w której grupa karbonylowa jest zablokowana wskutek utworzenia wewnątrzcząsteczkowego wiązania hemiacetalowego (półacetalowego) w aldozach lub hemiketalowego (półketalowego) w ketozach. W przypadku
aldoheksozy, np. glukozy, grupa hydroksylowa przy C-5 atakuje atom tlenu przy C-1 grupy
aldehydowej tworząc wewnątrzcząsteczkowy 6-członowy pierścień hemiacetalu. W rezultacie mogą powstać dwie formy anomeryczne, oznaczane jako α i β. Ze względu na podobieństwo pierścienia do piranu powstający cukier nazywany jest piranozą (Ryc. 6). W przypadku
ketozy, np. fruktozy, w podobnej reakcji grupa hydroksylowa przy C-5 łączy się z grupą ketonową przy C-2 i powstaje wewnątrzcząsteczkowy 5-członowy pierścień hemiketalu podobny do furanu. Taki cukier nazywany jest furanozą i podobnie jak przy powstawaniu hemiacetalu mogą powstać jego dwie formy anomeryczne – α i β (Ryc. 7).
Ryc. 6. Powstawanie piranozy (wg Garrett i Grischam 1999)
Do przedstawienia cukrów w formie pierścieniowej używa się najczęściej wzoru Hawortha (projekcja Hawortha), w którym widok pierścienia z góry jest przedstawiany perspektywicznie i na ogół nie pokazuje atomów węgla w pierścieniu. W zależności od konfiguracji podstawniki przy asymetrycznych atomach węgla znajdują się pod lub nad płaszczyzną
pierścienia (Ryc. 6 i 7). Grupy OH, które w projekcji Fischera leżą po prawej stronie łańcu-
5
cha, w projekcji Hawortha znajdują się pod płaszczyzną pierścienia, natomiast te, które występują po lewej stronie, znajdują się nad nią.
Ryc. 7. Powstawanie furanozy (wg Garrett i Grischam 1999)
Podczas cyklizacji i tworzenia pierścienia powstaje dodatkowe centrum asymetrii, odpowiednio przy C-1 w hemiacetalu lub C-2 w hemiketalu (Ryc. 6 i 7). W związku z tym mogą powstawać dwie struktury pierścieniowe nazywane anomerami i oznaczane jako α (grupa OH
przy C-1 lub C-2 występuje pod płaszczyzną pierścienia) i β (grupa OH przy C-1 lub C-2
znajduje się nad płaszczyzną pierścienia), np. glukoza występuje w postaci dwóch anomerycznych struktur pierścieniowych nazywanych α-D-glukopiranozą oraz β-D-glukopiranozą
(Ryc. 6).
Wzory Hawortha nie uwzględniają tego, że pierścienie piranozowe i furanozowe nie
są płaskie ze względu na tetraedryczne ułożenie podstawników przy asymetrycznych atomach
węgla. Pierścienie piranozowe przyjmują 2 rodzaje konformacji: krzesełkową i łódkową
(Ryc. 8), natomiast konformacja pierścieni furanozowych nazywana jest formą kopertową.
6
Ryc. 8. (a) Krzesełkowa i łódkowa konformacja pierścienia piranozowego
(b) Dwie możliwe konformacje krzesełkowe β-D-glukozy
(Garrett i Grischam 1999)
Cukry złożone
Obecność wielu grup hydroksylowych w monosacharydach umożliwia łączenie się dwóch
lub więcej cząsteczek za pomocą wiązań O-glikozydowych i tworzenie połączeń typu acetali
lub ketali (Ryc. 9). Produkty przyłączania alkoholi do anomerycznego atomu węgla monosacharydów nazywa się ogólnie glikozydami.
Ryc. 9. Ogólne reakcje powstawanie acetali i ketali (wg Garrett i Grischam 1999)
Disacharydy
Disacharydy (dwucukry) powstają w wyniku utworzenia wiązania glikozydowego pomiędzy anomeryczną grupą hydroksylową jednego monosacharydu z jedną z grup hydroksylo-
7
wych innego monosacharydu. Przykłady powszechnie występujących disacharydów i ich nazewnictwo przedstawione są na Ryc. 10.
Maltoza
O-α-D-glukopiranozylo(1→4)-α-D-glukopiranoza
Laktoza
O-β-D-galaktopiranozylo(1→4)-β-D-glukopiranoza
Sacharoza
O-α-D-glukopiranozylo(1→2)-β-D-fruktofuranozyd
Trehaloza
O-α-D-glukopiranozylo(1→1)-α-D-glukopiranozyd
Celobioza
O-β-D-glukopiranozylo(1→4)-β-D-glukopiranoza
Ryc. 10. Przykłady i nazewnictwo disacharydów
8
Polisacharydy
Polisacharydy są polimerami monosacharydów połączonych wiązaniami glikozydowymi.
Mogą być zbudowane z jednego rodzaju monosacharydów (homoglikany) lub z różnych cukrów prostych (heteroglikany) (Tabela 1). Polisacharydy występują w postaci liniowych łańcuchów lub są rozgałęzione. Do najważniejszych polisacharydów należą polimery Dglukopiranozy (glukozy) nazywane też glukanami (nie mylić z glikanami, które jest pojęciem
szerszym). Są to 2 polisacharydy roślinne – skrobia i celuloza oraz występujący w komórkach
zwierząt glikogen. Skrobia jest szeroko rozpowszechnionym polisacharydem zapasowym
stanowiącym magazyn glukozy wykorzystywanej jako podstawowe paliwo energetyczne. Jest
mieszaniną dwóch glukanów: amylozy i amylopektyny, które występują w różnych stosunkach ilościowych w zależności od pochodzenia skrobi. Obydwie postacie zbudowane są z αD-glukopiranozy. Amyloza, nazywana „rozpuszczalną skrobią”, składa się z prostych nierozgałęzionych łańcuchów połączonych wiązaniami α1→4 (tak jak w maltozie), zawierających
200-300 reszt glukozowych (Ryc. 11A). Łańcuchy te są zwinięte w helisę, w której na 1 skręt
przypada 6-8 reszt glukozy (Ryc. 11B).
Tabela 1. Ważne polisacharydy (Koolman i Röhm 2005)
9
A
B
C
Cząsteczka jodu
Ryc. 11. Budowa skrobi: (A) Fragmenty wzorów amylozy i amylopektyny; (B) Struktury
amylozy i amylopektyny; (C) Kompleks skrobi z jodem – cząsteczki jodu układają się równolegle do długiej osi helisy amylozy (pokazane są 3 obroty helisy) (Garrett i Grischam 1999,
Koolman i Röhm 2005)
Niebieskie zabarwienie roztworu skrobi w reakcji z jodem jest spowodowane występowaniem
takich helis, ponieważ atomy jodu gromadzą się we wnętrzu helisy (Ryc. 11C) i w takim prawie bezwodnym otoczeniu barwią się na kolor ciemnoniebieski. Polisacharydy o strukturze
10
rozgałęzionej barwią się jedynie na brązowo lub czerwonobrązowo. Amylopektyna, w przeciwieństwie do amylozy praktycznie nierozpuszczalna, jest polisacharydem rozgałęzionym.
Przeciętnie, co 24-30 reszt glukozowych, występuje rozgałęzienie utworzone przez wiązanie
α1→6 (tak jak w izomaltozie), w wyniku czego powstaje rozległa struktura krzaczasta (Ryc.
12). Cząsteczki amylopektyny mogą mieć setki tysięcy reszt glukozowych.
Ryc. 12. Porównanie stopnia rozgałęzienia w amylopektynie i glikogenie
(Campbell 1999)
Celuloza (błonnik), najbardziej rozpowszechniony węglowodan roślinny, jest liniowym homoglikanem zbudowanym z 1500 – 2500 reszt β-D-glukopiranozy połączonych wiązaniami β1→4, tak jak w celobiozie, którą można otrzymać przez częściową hydrolizę tego
polisacharydu. Długie cząsteczki celulozy nadają tkankom roślinnym wytrzymałość mechaniczną i elastyczność.
Glikogen, cukier zapasowy zwierząt, przypomina strukturą amylopektynę, lecz jego
cząsteczka jest bardziej rozgałęziona, ponieważ rozgałęzienia występują przeciętnie co dziesięć reszt glukozy (Ryc. 12).
Ważne reakcje
Monosacharydy, tworząc różne formy, uczestniczą w wielu procesach metabolicznych. Na Ryc. 13, na przykładzie glukozy, przedstawione są niektóre ważne reakcje monosacharydów.
11
Ryc. 13. Przykłady reakcji monosacharydów (Koolman i Röhm 2005)
REAKCJE BARWNE I REDUKCYJNE CUKRÓW
Metody identyfikacji cukrów oparte są na ich właściwościach:
•
Heksozy i pentozy pod wpływem stężonych kwasów ulegają odwodnieniu do cyklicznych aldehydów – hydroksymetylofurfuralu lub furfuralu, które następnie ulegają kondensacji z fenolami lub aminami dając barwne pochodne:
12
•
W środowisku zasadowym łańcuchowe formy cukrów z wolną grupą aldehydową wykazują właściwości redukcyjne, przy czym same utleniają się do kwasów:
glukoza
kwas glukonowy
•
Produktami utlenienia cukrów są: kwasy onowe, kwasy uronowe i kwasy cukrowe:
•
Cukry z wolną grupą karbonylową reagują również z fenylohydrazyną tworząc osazony wykazujące charakterystyczną dla danego cukru postać krystaliczną oraz temperaturę
topnienia
•
Polisacharydy wykazują zdolność adsorbowania cząsteczek jodu (J2), w wyniku czego
powstają barwne kompleksy o różnym zabarwieniu (granatowe, brunatne, czerwonofioletowe) (Ryc. 11C).
WYKONANIE
Odczynniki:
1. 2% roztwory wzorcowe cukrów
2. Odczynnik Molischa – 1% etanolowy roztwór α-naftolu
3. Stężony H2SO4
4. Stężony HCl
5. HCl : H2O (1 : 1)
13
6. Odczynnik Seliwanowa – 2% etanolowy roztwór rezorcyny
7. Odczynnik Tollensa – 2% etanolowy roztwór floroglucyny
8. Odczynnik Biala – 0,2% roztwór orcyny w 20% HCl
9. 1% roztwór FeCl3
10. 1M roztwór NaOH
11. 0,25M roztwór CuSO4
12. Odczynnik Fehlinga:
I – rozpuścić w wodzie destylowanej 34,65 g krystalicznego CuSO4 5H2O i uzupełnić w
cylindrze miarowym do 500 ml
II – rozpuścić w wodzie 173 g winianu sodu i potasu i 15 g NaOH, uzupełnić do 500 ml
13. Odczynnik Benedicta – w 700 ml wrzącej wody rozpuścić 173 g cytrynianu sodu i 100 g
bezwodnego Na2CO3. Po ochłodzeniu dodać powoli 100 ml 17,3% CuSO4 5H2O, stale
mieszając. Uzupełnić wodą do 1 000 ml
14. Odczynnik Barfoeda – rozpuścić na gorąco 24 g Cu(CH3COO)2 w 450 ml wody i dodać
25 ml 8,5% kwasu mlekowego. Wstrząsnąć aż do rozpuszczenia osadu. Oziębić, uzupełnić
wodą do 500 ml i przesączyć.
15. Roztwór J2 w KJ
Reakcje charakterystyczne
Próba Molischa z α-naftolem
Jest to najbardziej ogólna reakcja na cukrowce, tak wolne jak i związane. Ujemny jej wynik wyklucza obecność cukrowca, dodatni zaś nie wystarcza do stwierdzenia jego obecności,
gdyż dodatnią reakcję dają także aldehydy, aceton, kwas szczawiowy, cytrynowy. Nie można
również stosować tej próby do wykrycia cukrowców w moczu, ponieważ dodatni odczyn dają
obecne tam związki niecukrowe. Zasada próby polega na powstaniu czerwono-fioletowego
zabarwienia w wyniku kondensacji pochodnych furfuralowych z α-naftolem.
14
Do około 0,5 ml 2% roztworu badanego cukru dodać 2 krople etanolowego roztworu αnaftolu. Po dokładnym zmieszaniu, po ściance ukośnie ustawionej probówki wprowadzić
bardzo ostrożnie 0,5 ml stężonego H2SO4 tak, aby była widoczna granica między cieczami.
W miejscu zetknięcia się obu cieczy powstaje czerwono-fioletowy pierścień. Wyniki podać
w tabeli.
Próba Seliwanowa z rezorcyną na ketozy
W reakcji tej barwny związek z rezorcyną daje hydroksymetylofurfural, powstający pod
działaniem kwasu solnego dużo łatwiej z ketoz niż z aldoz. Próba ta pozwala więc na odróżnienie ketoz od aldoz, ponieważ w obecności 3-krotnie rozcieńczonego roztworu HCl tylko
ketozy ulegają odwodnieniu w czasie ogrzewania w 100oC przez 30 sekund.
Do około 0,5 ml 2% roztworu fruktozy dodać 1 ml roztworu HCl (rozcieńczonego wodą 1 : 1)
i kroplę roztworu rezorcyny. Po zmieszaniu próbę wstawić do wrzącej łaźni wodnej. Po około
30 sekundach powstaje czerwono-łososiowe zabarwienie. Po dłuższym ogrzaniu barwa może wystąpić i przy innych cukrach. Próbę powtórzyć z roztworami pozostałych cukrów.
Próba Tollensa z floroglucyną na pentozy
Wskutek działania kwasu chlorowodorowego na pentozy powstaje furfural, który tworzy z
floroglucyną związek o barwie wiśniowej.
15
Do około 0,5 ml 2% roztworu pentozy dodać 1 ml stężonego roztworu HCl i 2 krople roztworu floroglucyny. Ogrzać. Powstaje barwa wiśniowa. Reakcję powtórzyć z roztworami pozostałych cukrów.
Próba Biala na pentozy
Do 2 ml roztworu orcyny w HCl dodać kroplę 1% FeCl3 i 0,5 ml roztworu pentozy.
Próbę wstawić do wrzącej łaźni wodnej. Powstaje zielone zabarwienie. Reakcję powtórzyć z
roztworami pozostałych cukrów. W obecności jonów żelaza (III), powstający furfural daje z
orcyną kompleks o zielonej barwie.
Próba Fehlinga
Zmieszać w probówce 3 ml roztworu Fehlinga I z 3 ml roztworu Fehlinga II. Próbę
ogrzać do wrzenia w celu sprawdzenia czy nie wystąpi redukcja własna odczynnika. Do 1 ml
sprawdzonego roztworu Fehlinga dodać kilka kropel badanego roztworu cukru, a następnie ogrzać w łaźni wodnej. Opisać wynik.
Próba Benedicta
Do 1 ml odczynnika Benedicta dodać 2 krople 2% roztworu cukru i wstawić na 5 minut do wrzącej łaźni wodnej. Powstające pomarańczowe zabarwienie roztworu wynika z
redukcji Cu2+ do Cu+. Próba Benedicta należy do najbardziej specyficznych i czułych prób
redukcyjnych na cukrowce. Odczynnik różni się od odczynnika Fehlinga tym, że zamiast wodorotlenku sodu zawiera węglan sodu i zamiast winianu, cytrynian sodu. Powstaje więc nie
wodorotlenek miedzi (II) a węglan. Jest to próba bardziej swoista od próby Fehlinga, gdyż
związki redukujące odczynnik Fehlinga, jak: chloroform, kreatynina i kwas moczowy, nie
redukują odczynnika Benedicta. Czułość próby jest dość duża. Już 0,1% stężenie cukrowca
powoduje zmianę barwy z niebieskiej na zieloną. Zielone zabarwienie jest wynikiem nakładania się pomarańczowej barwy zawiesiny Cu2O z niebieskim zabarwieniem odczynnika.
16
Próba Barfoeda w modyfikacji Tauber-Kleinera – odróżnienie jednocukrów od dwucukrów
redukujących
Do 1 ml 2% roztworów badanych cukrów dodać po 1 ml odczynnika Barfoeda. Próbę
wymieszać, a następnie wstawić dokładnie na 3 min do wrzącej łaźni wodnej. Zanotować
wynik reakcji. Próby następnie pozostawić we wrzącej łaźni wodnej na dalsze 15 minut, po
czym zanotować wynik reakcji. Próba ta pozwala na odróżnienie mono- od dwucukrów redukujących. Jednocukrowce wykazują właściwości redukujące w środowisku lekko kwaśnym
po krótkim ogrzewaniu (3 min), natomiast dwucukrowce redukujące dopiero po 15 minutach ogrzewania we wrzącej łaźni wodnej.
Reakcja z jodem
Reakcja ta pozwala na odróżnienie polisacharydów od innych cukrowców, ponieważ
kompleksy z jodem mogą tworzyć tylko cząsteczki o uporządkowanej strukturze i odpowiednio duże. Efekt barwny jest związany z wielkością cząsteczki – im większa cząsteczka polisacharydu tym więcej cząsteczek jodu jest związanych w kompleksie. Amyloza barwi się intensywnie na kolor ciemnoniebieski. Barwa kompleksów jodu z polisacharydami o krótszych łańcuchach zmienia się na fioletowoczerwoną (amylopektyna) i czerwoną (dekstryny). Glikogen daje kompleks o barwie czerwonej.
Do 1 ml zawiesiny skrobi dodać 1 kroplę roztworu J2 w KJ. Powstaje niebieskie zabarwienie. Reakcje powtórzyć z pozostałymi cukrowcami.
UWAGA ! Wyniki uzyskane w powyższych reakcjach zestawić w tabeli zaznaczając dodatni wynik jako + , a ujemny jako –
17
Cukier
Reakcja
Molischa
Seliwanowa
Tollensa
Biala
Fehlinga
Trommera
Benedicta
Barfoeda
J2 w KJ
Tworzenie osazonów
Cukry tworzą z fenylohydrazyną żółte, trudno rozpuszczalne w wodzie dwuhydrazony
(osazony). Osazony różnią się formami kryształów i temperaturą topnienia, co pozwala
na identyfikację różnych cukrów (Ryc. 14). Związki te mogą powstawać tylko w reakcji z
cukrami redukującymi, gdyż fenylohydrazyna kondensuje z wolną grupą aldehydowa lub ketonową. Ponieważ cukry w roztworach występują przeważnie w postaci pierścieniowej, w
której grupa karbonylowa jest zablokowana, konieczne jest rozerwanie mostka tlenowego.
Proces ten zachodzi w środowisku zasadowym; również niektóre organiczne zasady m.in.
fenylohydrazyna mogą powodować otwarcie pierścienia w mono- i dwucukrach.
W pierwszym etapie reakcji aldozy z fenylohydrazyną tworzy się fenylohydrazon, w wyniku
dalszej reakcji z dwiema cząsteczkami fenylohydrazyny powstaje osazon. Jak wynika z poniższych reakcji, w tworzeniu osazonu uczestniczą tylko dwa pierwsze atomy węgla (C-1 i C2). Cukry różniące się tylko ugrupowaniami przy C-1 i C-2, np. glukoza, fruktoza i mannoza dają w związku z tym identyczne osazony.
18
Reakcja tworzenia osazonów
Ryc. 14. Kryształy osazonów (Vogel 2006)
19
WYKONANIE
Odczynniki:
1. Chlorowodorek fenylohydrazyny (UWAGA ! Silna trucizna !)
2. Octan sodu in subst.
3. Wzorcowe roztwory cukrów – 0,2 % roztwory glukozy, ksylozy i galaktozy oraz 2% roztwory maltozy i laktozy
Postępowanie:
Do probówek napipetować po 1,5 ml roztworu badanych cukrów, dodać po około 100
mg chlorowodorku fenylohydrazyny i około 150 mg octanu sodu. Próby wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 45 min. Po tym czasie, próby wyjąć i umieścić w zlewce z zimną wodą
pozostawiając do powolnej krystalizacji (około godziny). Osad kryształów przenieść na
szkiełko podstawowe i obejrzeć pod mikroskopem. Wykonać rysunki kryształów badanych
osazonów
UWAGA ! W reakcji powszechnie stosuje się chlorowodorek fenylohydrazyny, trwalszy od
wolnej zasady. Ponieważ w reakcji z chlorowodorkiem będzie powstawał dodatkowo przeszkadzający w tworzeniu osazonów HCl, dla jego zobojętnienia do mieszaniny dodaje się
octanu sodu in subst.
Zagadnienia do przygotowania:
− szeregi konfiguracyjne D aldoz i D ketoz
− wzory rzutowe Fischera i wzory Hawortha
− terminy: enancjomer, anomer, mutarotacja, epimer,
− budowa disacharydów (maltoza, laktoza, sacharoza, trehaloza, celobioza)
− polisacharydy (budowa skrobi, glikogenu i celulozy)
− powstawanie furfuralu i hydroksymetylofurfuralu
− reakcje barwne pozwalające wykrywać różne cukry
− produkty utleniania cukrów
− reakcja powstawania osazonow; identyfikacja cukrów
20
Literatura:
1. Biochemia – JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer, PWN, Warszawa 2005
2. Biochemia. Ilustrowany przewodnik – J Koolman, K-H Röhm, PZWL, Warszawa 2005
3. Biochemistry – MK Campbell, Saunders College Publishing. Harcourt Brace College Publishers, Philadelphia, 1999
4. Biochemistry – RH Garrett, ChM Grischam, University of Virginia 1999
5. Preparatyka organiczna – AI Vogel, WNT 2006
21