docIdentyfikacja mikro RNA specyficznych dla podkładki w
download 
Reklamacja Transkrypt
Identyfikacja mikro RNA specyficznych dla podkładki w
Elżbieta Kaja Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu Stypendystka projektu pt. „Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”, Poddziałanie 8.2.2 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki Identyfikacja mikro RNA specyficznych dla podkładki w szczepionych jabłoniach odmiany Gala Cząsteczki mikro RNA (miRNA) należą do grupy małych, endogennych, niekodujących RNA, powszechnie występujących zarówno wśród organizmów roślinnych, jak i zwierzęcych. O niezwykle istotnej roli tych cząsteczek w organizmach żywych może świadczyć fakt, że około jedna trzecia ludzkich genów jest przez nie kontrolowana (Lewis et al. 2005). Udowodniono, że cząsteczki roślinnych miRNA poprzez regulację poziomu ekspresji genów, są zaangażowane w liczne procesy, takie jak: rozwój roślin (np. morfogeneza liści, polarność), sygnalizacja hormonalna, rozwój kwiatów oraz wzrost i rozwój owoców (Bartel, 2004; Carra A. et al., 2009). Ponadto miRNA biorą udział w odpowiedzi komórek roślinnych na stres, np. na zakażenie wirusami lub bakteriami (Navarro et al., 2008). Coraz więcej nowych cząsteczek miRNA zostaje zidentyfikowanych bioinformatycznie i eksperymentalnie wśród różnych gatunków roślin. Stosunkowo niewiele cząsteczek miRNA poznano u tak istotnego w sadownictwie gatunku, jakim jest jabłoń (Malus domestica). W największych bazach danych miRNA (np. miRBase, PMRD) możemy znaleźć ponad 500 miRNA zidentyfikowanych dla rzodkiewnika, prawie 600 dla kukurydzy, a od niedawna około 200 dla jabłoni. Identyfikacja nowych miRNA oraz poznawanie profilu ekspresji miRNA u roślin rosnących w różnych warunkach środowiskowych pozwala poznać funkcje poszczególnych miRNA i wykorzystać je w praktyce do regulacji ekspresji danych genów (np. poprzez wprowadzanie sztucznych miRNA). W sadownictwie stosuje się przeszczepianie jabłoni na inne rośliny zwane podkładkami, jako sposób bezpłciowego rozmnażania drzew (Ryc. 1). Metoda ta pozwala na zachowanie oczekiwanych cech fenotypowych drzew i tym samym ich owoców. Zauważono, że rodzaj podkładki ma wpływ na wiele cech fenotypowych zrazu (rośliny przeszczepianej), m.in. na wielkość drzewa, jak również na podatność na choroby, np. zarazę ogniową – Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego powszechną wśród drzew owocowych chorobę wywołaną przez bakterię Erwinia amylovora (Ryc. 2). Powyższe cechy fenotypowe jabłoni mają istotne znaczenie w sadownictwie, ponieważ dąży się do uzyskania niskich drzew o możliwie jak największej odporności na choroby. Dotychczasowe badania profilu ekspresji genów jabłoni odmiany Gala rosnącej na różnych podkładkach wykazały, że profil ten w pędach jabłoni znacznie się różni pomiędzy zrazami szczepionymi na podkładki odporne na zarazę ogniową, a tymi szczepionymi na podkładki podatne na tę chorobę (Jensen et al., 2012) Mechanizm wpływu podkładki na poziom ekspresji genów w zrazie nie został jeszcze poznany. Jednakże ostatnie odkrycia dotyczące znaczącej roli cząsteczek mikro RNA (miRNA) w potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów, pozwalają wysunąć hipotezę, że mogą one być transportowane z podkładki do zrazu i wpływać na ekspresję jego genów (Kim et al., 2001). Realizowany przeze mnie projekt jest naturalną kontynuacją wspomnianych powyżej badań dotyczących wpływu podkładki na transkryptom zrazu i obejmuje szeroką analizę eksperymentalną i bioinformatyczną cząsteczek miRNA jabłoni. Praca ma na celu identyfikację i charakterystykę cząsteczek miRNA zaangażowanych w regulację ekspresji genów istotnych dla wykształcenia takich cech fenotypowych, jak wielkość drzewa i podatność na choroby. Porównanie profilu ekspresji miRNA pędów rosnących na podatnych i odpornych na zarazę ogniową podkładkach pozwoli stwierdzić, czy cząsteczki miRNA mogą być zaangażowane w reakcje obronne jabłoni przed tą chorobą. W dalszym etapie badań będzie można określić, które miRNA odgrywają istotną rolę w kształtowaniu tych ważnych dla sadownictwa cech jabłoni. Pierwszy etap wykonanych dotychczas analizy cząsteczek mikro RNA u jabłoni polegał na ich identyfikacji dzięki wykorzystaniu nowoczesnej metody tzw. głębokiego sekwencjonowania RNA jabłoni. Wyniki głębokiego sekwencjonowania wymagają obróbki bioinformatycznej oraz wieloetapowej komputerowej analizy w celu wyciągnięcia wniosków. Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego Wszystkie te etapy (zawierające m.in. mapowanie odczytów do genomu jabłoni, czy identyfikację prekursorów miRNA) pozwoliły zidentyfikować 252 cząsteczki miRNA u jabłoni, określić poziom ich ekspresji w zrazach szczepionych na różne podkładki oraz znaleźć ich geny docelowe (tzw. targety) wśród genów jabłoni. Spośród 252 miRNA zidentyfikowanych w pędach jabłoni Gala, aż 109 nie było wcześniej opisanych dla jabłoni, a 78 zostało określonych jako cząsteczki specyficzne dla jabłoni, czyli niezakonserwowane ewolucyjnie. Dla tej grupy cząsteczek podjęto próbę ich eksperymentalnego potwierdzenia ich sekwencji prekursorów. Potwierdzanie wyników analiz bioinformatycznych jest bowiem ważnym sposobem weryfikacji wyników. Przy użyciu metody RT-PCR udało się potwierdzić 5 sekwencji prekursorów, co świadczy o prawidłowości naszych przewidywań bioinformatycznych. Dzięki porównaniu poziomów ekspresji miRNA pomiędzy zrazami jabłoni Gala rosnącymi na różnych podkładkach wytypowaliśmy kilka cząsteczek, które mogą być odpowiedzialne za kształtowanie odporności jabłoni na zarazę ogniową. Wśród wskazanych przez nas miRNA jest miR160 i miR169, które wykazują znacznie podwyższony poziom ekspresji w jabłoniach odpornych na zarazę ogniową. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami obie cząsteczki są zaangażowane w odpowiedź roślin na stres bakteryjny. miR167 natomiast wykazuje podwyższoną poziom ekspresji w jabłoniach podatnych na zarazę ogniową, co również może oznaczać jego związek z odpornością jabłoni na tę chorobę. Ponadto przewidziano kilka genów docelowych dla zidentyfikowanych miRNA, które dają początek białkom prawdopodobnie zaangażowanym w obronę jabłoni przed atakiem bakterii. Należą do nich m.in. białko NHX1, noduliny oraz hydrolaza dinelaktozowa. Geny tych białek wykazały podwyższoną ekspresję w odpornych na zarazę ogniową jabłoniach, wg badań innych grup badawczych, co może również świadczyć o znaczeniu tych genów w kształtowaniu odporności rośliny. Polska jest wiodącym producentem jabłek w Unii Europejskiej, z wyrobiona pozycją na arenie międzynarodowej, gdzie wraz z Chinami i Stanami Zjednoczonymi znajduje się w pierwszej trójce największych producentów jabłek na świecie (FAO, 2010). Z 7 tysięcy hektarów upraw sadowniczych w Wielkopolsce, aż 70% to właśnie jabłonie. Istotnym wydaje się więc prowadzenie intensywnych badań mających na celu utrzymanie konkurencyjności polskiego sadownictwa, jak również nawiązanie współpracy z innymi krajami doświadczonymi zarówno w produkcji, jak i w badaniach naukowych dotyczących jabłoni (USA). Tego typu współpraca i jej promocja pozwala na zwiększenie świadomości obu krajów na temat wspólnych celów, konieczności zwiększania konkurencyjności kształtowania postaw proinnowacyjnych. Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego i Zaraza ogniowa należy do najbardziej szkodliwych chorób jabłoni i grusz na świecie, a mechanizmy molekularne zachodzące pomiędzy patogenem a rośliną (żywicielem) nie zostały jeszcze poznane. Poznanie tych interakcji, jak również zbadanie udziału cząsteczek miRNA w reakcjach obronnych roślin, przyczyni się do rozwoju skuteczniejszych metod ochrony upraw jabłoni. Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
