Mechanizm przenikania przeznaskórkowego przy

Mechanizm przenikania
derma rollera DTS.
przeznaskórkowego
przy
użyciu
Hyeong Mi Kim1, MS, Yun Young Lim1, PhD, Joo-Hee An2, MS,
Myeung Nam Kim1, MD, PhD, and Beom Joon Kim1, MD, PhD
1Department
of Dermatology, Chung-Ang University College of Medicine, Seoul,
South Korea, and 2Department of Life Sciences,
Chung-Ang University College of Natural Sciences, Seoul, South Korea
Correspondence: Beom Joon Kim, MD, PhD Department of Dermatology Chung-Ang
University College of Medicine Heuksuk-dong Dongjak-gu Seoul 156–775 South Korea
E-mail: [email protected]
Funding: This study was supported by a grant from the Korea Healthcare Technology
R&D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, South Korea (A090180).
Conflicts of interest: None.
Streszczenie:
Transdermalne systemy dostarczania substancji aktywnych (TDDSs) stanowią bardziej niezawodną
i spójną metodę podania leku niż podawanie doustne. Jednak, TDDSs, jako metoda podlega
ograniczeniom - może transportować tylko składniki posiadające bardzo małe cząsteczki i wymaga
źródła energii. Derma rollery, jako przyrządy medyczne, ułatwiają przejście substancji zarówno niskojak i wysokocząsteczkowych poprzez bezpośrednią perforację w skórze, dostarczając leki do warstwy
rogowej i skóry właściwej, bez stymulacji zakończeń nerwowych w skórze.
Cel badania:
Badaliśmy in vitro, czy derma rollery, opatentowane, jako system DTS (System terapii mikroigłowej)
w Korei Południowej, mogą dostarczać efektywnie składniki aktywne, przenikając przez skórę
bezwłosych szczurów.
Metodyka:
Derma rollery użyte w badaniu składają się m.in. z głowicy, na obwodzie, której umieszczono igły ze
stali chirurgicznej, o stopniowanej długości (0.15 mm, 0.25 mm, 0.50 mm). Do przeprowadzenia testu
w warunkach in vitro, skóra szczurów została umieszczona w komorze dyfuzyjnej Franza i poddawana
mikronakłuwaniu derma rollerem, przy użyciu kolejno głowic wyposażonych w igły wszystkich
długości. Do testów wykorzystano bazę zawierającą barwnik rodaminę B, nanoszoną na skórę na
24, 48 i 72 godziny. Badanie mikroskopem fluorescencyjnym wykonane w sześć godzin po aplikacji
wykryło obecność rodaminy B i potwierdziło związanie barwnika przez skórę.
Rezultaty:
Ocena za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego dowiodła, że użycie derma rollera mikroigłowego
zwiększa penetrację przez bazę zawierającą rodaminę B w skórze bezwłosych szczurów, w stopniu
zależnym od długości użytych igieł.
Wnioski:
Derma rollery mikroigłowe, jako przyrząd przeznaczony do transdermalnego systemu transportu
składników aktywnych, mogą być wykorzystywane do przezskórnej dostawy leków. Wybór rodzaju
rollera i odpowiedniej długości igieł koreluje z docelową aplikacją.
Wprowadzenie:
Transdermalne systemy terapeutycznego dostarczania leków (TDDSs) umożliwiają bardziej
niezawodne i spójne podanie leków niż drogą doustną ze względu na fakt, iż pozwalają uniknąć
skutków degradacji leku w przewodzie pokarmowym i nie podlegają w znaczącym stopniu
metabolizmowi pierwszego przejścia przez wątrobę. Systemy transportu przezskórnego są
bezpieczniejsze niż iniekcje dożylne i pozwalają uniknąć związanego z nimi bólu. Jednak TDDSs może
dostarczać leki o małej masie cząsteczkowej (MW) i wymaga źródła energii. Wykorzystanie derma
rollerów w TDDSs, po raz pierwszy opisane w 1998 roku, zostało przedstawione, jako metoda
ułatwiająca penetrację leku przez warstwę rogową (1-3) i mieszki włosowe (4-7). Od tego czasu,
rollery różnej wielkości, struktury i wykonane z różnych materiały są wykorzystywane w transporcie
przezskórnym wielu rodzajów leków. Inne znane sposoby, aby zwiększyć przepuszczalność skóry
obejmują stosowanie peelingów chemicznych, sekwencji wzmacniających lipidy(8, 9), jonoforezę czy
elektroporację (10, 11). Te metody łagodnie zaburzają warstwę rogową, tworząc ścieżki przejścia dla
aktywnych cząsteczek (12). Igiełki nakłuwają warstwę rogową i skórę właściwą bez podrażniania
zakończeń nerwowych, co powoduje, że składniki aktywne, zarówno o małych jak i dużych
cząsteczkach, mogą przenikać przez skórę, wywołując jedynie niewielkie doznania bólowe. Długie igły
(0,25 mm lub 0,50 mm) umożliwiają skuteczny transport leków, ponieważ penetrują naskórek, jednak
mogą one również pobudzać zakończenia nerwowe. Dlatego też przyjęliśmy hipotezę, że krótsze igły
(0,15 mm) mogłyby być skuteczne, nie powodując bólu. W tym badaniu testowaliśmy skuteczność
podawania leków za pomocą rollerów mikroigłowych, opracowanych w systemie DTS (Diskneedle
Therapy System) przez DTSTM LAB Co Ltd, Seoul, Korea Południowa, o różnej długości igieł (głowica
bez igieł, 0,15 mm, 0,25 mm, 0,50 mm). Przenikanie leku mierzono, jako penetrację bazy kremowej
zawierającej barwnik rodaminę B w skórze bezwłosych szczurów, używając do pomiarów fragmentów
skóry, komory dyfuzyjnej Franza (FDC) i mikroskopu fluorescencyjnego.
Surowce i metoda
Materiały
Rollery DTS użyte w niniejszym opracowaniu zostały dostarczone przez DTSTM LAB Co Ltd. Derma
rollery miały igły o długości 0,15 mm, 0,25 mm i 0,5 mm, a roller do próby kontrolnej był
bezigłowy(rys. 1). Rodamina B (C28H31ClN2O3, MW = 479), odczynnik analityczny użyty do badania,
został zakupiony w firmie Sigma- Aldrich Co (St. Louis, MO, USA) i przygotowany do testu przez
rozpuszczenie w dejonizowanej wodzie do stężenia 0,005 M (15).Rodamina B była składnikiem
bazowego kremu/balsamu, łatwego do identyfikacji w trakcie badania. W badaniu użyto systemu
komór dyfuzyjnych Franza - FDC, dostarczonego przez firmę PermeGear, Inc Hellertown, PA, USA.
Aparat składał się z portu do pobierania próbek, komory z próbką, uchwytu membrany, komory
z płynem akceptorowym, wytrząsarki. Próbki skóry, przygotowane do mikronakłuwania, zostały
umocowane w uchwycie membrany systemu FDC. Skóra pełnej grubości, bezwłosa, została pobrana
z grzbietów szczurzych, ostrożnie pozbawiona warstwy tłuszczowej, umyta bawełnianym wacikiem
zmoczonym w nasyconym, buforowanym roztworze solanki fosforanowej (PBS) i przechowywana
w temperaturze -70oC do dalszej fazy eksperymentu. Skóra z grzbietów stanowiła ponad 70%
powierzchni skóry szczura i stanowiła doskonały materiał do mikronakłuwania.
Badanie penetracji in vitro
Próbki skóry zostały rozmrożone w otwartym pojemniku, pocięte na 2 mm kwadraty i umieszczone
w aparacie FDC, w taki sposób, że naskórek był wystawiony na działanie powietrza, a skóra właściwa
na działanie PBS (pH 6.8 przy 37oC). System był ogrzewany przy ciągłym wytrząsaniu przez 30 minut.
Następnie próbki skóry były wyjęte z FDC i nakłuwane rollerem kontrolnym bez igieł i rollerami
o długości igieł 0,15 mm, 0,25 mm i 0,50 mm. Wszystkie zabiegi były wykonywane przy stosowaniu
tego samego nacisku we wszystkich kierunkach ruchu. Tak przygotowana skóra została przeniesiona
do aparatu Franza, a baza zawierająca 0,0005 M rodaminy B została dodana do komory do
pobierania próbek. W ściśle określonych przedziałach czasowych - po 12, 24, 48 i 72 godzinach próbki
PBS (200mikrolitrów) były przeniesione z komory akceptorowej do 96-punktowych płyt, gdzie
zmierzono penetrację rodaminy B za pomocą czytnika mikropłytek przy długości fali emisji 543nm. W
przypadku każdej próbki PBS usuwano i zastępowano nowym roztworem buforowym (200
mikrolitrów) dodawanym do komory z płynem akceptorowym.
Rysunek 1. Głowice derma rollerów użytych w trakcie badania. Igły zostały rozmieszczone w głowicy w sposób
umożliwiający gęstą i równomierną perforację.
Badanie mikroskopem fluorescencyjnym
Próbki skóry były płukane w buforowanym roztworze soli fosforanowej PBS, następnie cięte na
kwadraty 2x2 mm, umieszczane w membranie aparatu FDC i wystawione na działanie powietrza od
strony naskórka i PBS od strony skóry właściwej (pH 6.8 przy 37oC) w komorze akceptora. Komora
była wytrząsana i ogrzewana przez około30 minut. Po tym czasie skóra została usunięta z FDC,
nakłuwana przez przygotowany zestaw rollerów mikroigłowych i poddana działaniu barwnika
rodaminy B w celu zbadania stopnia penetracji w warunkach in vitro. Aby umożliwić penetrację, baza
z barwnikiem została pozostawiona na skórze przez 6 godzin, następnie próbki były płukane w PBS
w celu usunięcia resztek barwnika. Preparat biologiczny o optymalnie obniżonej temperaturze
umieszczono w mikrotomie i pocięto na wycinki za pomocą kriosekcji do dalszej obserwacji
w mikroskopie fluorescencyjnym.
Analiza statystyczna
Rezultaty badania zostały przedstawione, jako wartości średnie +/- odchylenie standardowe (SD)
z rezultatów uzyskanych w trzech identycznych próbach. Dane zostały ocenione w teście t-Studenta
i teście p-value. Wartości <0,5 zostały przyjęte, jako statystycznie istotne.
Rezultaty badania penetracji in vitro
Badanie przenikania przezskórnego in vitro z użyciem barwnika rodaminy B pokazało, że transport
substancji w skórze zwiększa się wraz ze wzrostem długości igieł w derma rollerze (rys. 2 i 3). Na tej
podstawie oczekiwaliśmy, że roller mikroigłowy będzie efektywny w przezskórnym transporcie
terapeutycznym. Chociaż wszystkie rollery mikroigłowe o wymiarach 0,25 mm, 0,50 mm, 1,00 mm
i 1,50 mm zwiększają stopień przenikania leków przez warstwę rogową naskórka i skórę właściwą,
rollery o igłach mierzących 0,50 mm, 1,00 mm i 1,50 mm wywołują mikrouszkodzenia skóry
i stymulację nerwów skórnych. Tym samym rollery z mikroigłami o długości 0,15 mm i 0,25 mm
okazały się być najbardziej odpowiednie do transportu składników aktywnych w określonych
warunkach.
Rysunek 2. Efektywność penetracji badana w warunkach in vitro na skórze bezwłosych szczurów z użyciem systemu
komór Franza. Barwnik rodamina B został naniesiony na bezwłosą skórę szczurów za pomocą rollera mikroigłowego.
Przenikanie barwnika zostały wykryte
Badanie mikroskopem fluorescencyjnym
Badania mikroskopowe wykazały, że zabiegi derma rollerem mikroigłowym, przy stosowaniu różnych
długości igieł, wzmacniają przejście rodaminy B przez skórę bezwłosych szczurów. Roller bez igieł nie
powodował przenikania rodaminy B do warstwy rogowej. Podobnie jak w badaniach
transdermalnego systemu terapeutycznego, przeprowadzonego w warunkach in vitro, stopień
przenikania rodaminy B zwiększał się wraz z długością mikroigły (0,15 mm, 0,25 mm, 0,50 mm)
(rys. 2 i 4). W szczególności porównywaliśmy skuteczność podawania leków przy użyciu igieł
o długości odpowiednio 0,15 mm, 0,25 mm i 0,50 mm i stwierdziliśmy, że najkrótsze mikroigły były
w stanie skutecznie nakłuwać warstwę rogową naskórka przy minimalnym uszkodzeniu tkanki.
Wnioski:
Rysunek 3. Długość igieł rollerów DTS warunkowała głębokość penetracji w skórze bezwłosych myszy. Rodamina B
przeniknęła poprzez warstwę rogową naskórka podczas mikroiniekcji, a głębokość penetracji była wprost proporcjonalna
do długości igieł (w próbie kontrolnej użyto głowicy bez igieł).*P < 0.01; P < 0.05
Podawanie leków metodą TDDS pozwala uniknąć problemów, takich jak metabolizm wątrobowy
pierwszego przejścia, mała biodostępność przy podawaniu doustnym i bolesność w trakcie iniekcji
podskórnych. Transdermalny system transportu składników aktywnych może również zmniejszyć
koszty i niedogodności związane z podawaniem leków. Jednak niektóre leki i farmaceutyki nie
przenikają łatwo warstwy rogowej naskórka i skóry właściwej, a do skutecznej penetracji muszą
mieścić się w odpowiednim zakresie wielkości cząstek 12. Badania pokazują, że mikroigły ułatwiają
transport leków, które już przy długości igiełek <0,2 mm przechodzą warstwę rogową, bez
wywoływania bólu. Derma rollery, stosowane w transdermalnych systemach terapeutycznych
podawania leków zostały przetestowane w długościach od mikrometrów do milimetrów (12, 16-18).
W badaniu tym potwierdzono, że roller mikroigłowy zwiększa przenikanie leków przez skórę. Stosując
rodaminę B, jako bazowy składnik aktywny, wykryliśmy różnicę w czasie potrzebnym do penetracji,
jak określono to podczas badania mikroskopem fluorescencyjnym poszczególnych fragmentów skóry
(6 godzin) i podczas pomiaru spektroskopowego koncentracji barwnika w komorze akceptora
systemu Franza (24 godziny). Stwierdziliśmy, że skuteczność penetracji leku wzrastała wraz
z długością mikroigieł. Roller bez mikroigiełek nie powodował penetracji substancji aktywnej w głąb
skóry. Rollery o wymiarach mikroigieł 0,25 mm i 0,50 mm pozwalały na penetrację leku do skóry
właściwej, aczkolwiek mechanizm, który to umożliwiał, pozostaje nieznany (19). Derma rollery
wyposażone w igły 0,15 mm mogą ułatwiać przejście leku przez warstwę rogową naskórka, ale nie
przez naskórek ani skórę właściwą. Użycie krótszych igieł może zmniejszyć uszkodzenie naskórka i w
konsekwencji ból spowodowany mikronakłuwaniem dłuższymi igłami. Skuteczność działania rollera
wyposażonego w igły o długości 0,15 mm była zwiększona przez kontrolę czasu wkłuwania i nacisku,
jakiemu poddaje się skórę podczas wielokrotnego powtarzania mikronakłuć. Niniejsze badanie
pozwoliło na uzyskanie pierwszych danych klinicznych dotyczących skuteczności podawania leków
w trakcie nakłuwania krótkimi igłami (0,15 mm). Podsumowując, roller mikroigłowy może być
wykorzystany do ułatwienia transportu substancji aktywnych i leków, a skuteczność jego działania
można zwiększyć poprzez dopasowanie długości mikroigieł do potrzeb aplikacyjnych (20, 21).
Niezbędne są dalsze badania, aby określić, jak transdermalny system terapeutyczny wpływa na
eliminację leku z układu krwionośnego.
Rysunek 4. Zdjęcia mikroskopowe pokazujące stopień penetracji bazy z rodaminą B po 6 godzinach. Przenikanie bazy
rodaminowej w skórze bezwłosych myszy było badane przy użyciu derma rollera o różnych długościach igieł. Obecność
barwnika fluorescencyjnego została z łatwością wykryta jako zabarwienia widoczne w świetle mikroskopu
fluorescencyjnego. (roller do próby kontrolnej nie miał igieł) Oryginalne powiększenie: X 100
1 Kuntsche J, Bunjes H, Fahr A, et al.
Interaction of lipid nanoparticles with human
epidermis and an organotypic cell culture
model. Int J Pharm 2008; 354: 180–195.
2 Lademann J, Weigmann HJ, Rickmeyer C, et
al. Penetration of titanium dioxide
microparticles in a sunscreen formulation into
the horny layer and the follicular orifice. Skin
Pharmcol Physiol 1999; 12: 247–256.
3 Zhang LW, Yu WW, Colvin VL, MonteiroRiviere NA. Biological interactions of quantum
dot nanoparticles inskin and in human
epidermal keratinocytes. Toxicol Appl
Pharmacol 2008; 228: 200–211.
4 Alvarez-Roman R, Naik A, Kalia YN, et al. Skin
penetration and distribution of polymeric
nanoparticles. J Control Release 2004; 99: 53–
62.
5 Lademann J, Richter H, Teichmann A, et al.
Nanoparticles – an efficient carrier for drug
delivery into the hair follicles. Eur J Pharm
Biopharm 2007; 66: 159–164.
6 Toll R, Jacobi U, Richter H, et al. Penetration
profile of microspheres in follicular targeting
of terminal hair follicles. J Invest Dermatol
2003; 123: 168–176.
7 Yoo KH, Lee JW, Li KS, et al. Photodynamic
therapy with methyl 5-aminolevulinate acid
might be ineffective in recalcitrant alopecia
totalis regardless of using a microneedle roller
to increase skin penetration. Dermatol Surg
2010; 36: 618–622.
8 Barry B, Williams A. Penetration enhancers.
Adv Drug Deliv Rev 2003; 56: 603–618.
9 Cevc G. Lipid vesicles and other colloids as
drug carriers on the skin. Adv Drug Deliv Rev
2004; 56: 675–711.
10 Kalia Y, Guy R. Iontophoresis. Adv Drug
Deliv Rev (in press).
11 Preat V, Vanbever R. Skin electroporation
for transdermal and topical delivery. Adv Drug
Deliv Rev 2004; 56: 659–674.
12 Prausnitz MR. Microneedles for
transdermal drug delivery. Adv Drug Deliv Rev
2004; 56: 581–587.
13 Park JH, Choi SO, Seo SM, et al. A
microneedle roller for transdermal drug
delivery. Eur J Pharm Biopharm 2010; 76: 282–
289.
14 Noh YW, Kim TH, Baek JS, et al. In vitro
characterization of the invasiveness of
polymer microneedle against skin. Int J Pharm
2010; 397: 201–205.
15 Wu Y, Qiu Y, Zhang S, et al. Microneedlebased drug delivery: studies on delivery
parameters and biocompatibility. Biomed
Microdevices 2008; 10: 601–610.
16 McAllister DV, Allen MG, Prausnitz MR.
Microfabricated microneedles for gene and
drug delivery. Annu Rev Biomed Eng 2000; 2:
289–313.
17 Reed ML, Lye W-K. Microsystems for drug
and gene delivery. Proc IEEE 2004; 92: 56–75.
18 Teo AL, Shearwood C, Ng KC, et al.
Transdermal microneedles for drug delivery
applications. Mater Sci Eng B 2006; 132: 151–
154.
19 Coulman SA, Anstey A, Gateley C, et al.
Microneedlemediated
delivery
of
nanoparticles into human skin. Int J Pharm
2009; 366: 190–200.
20 Clementoni MT, Roscher MB, Munavalli GS.
Photodynamic photorejuvenation of the face
with a combination of microneedling, red
light, and broadband pulsed light. Lasers Surg
Med 2010; 42: 150–159.
21 Yoon JH, Park DH, Son TY, et al. A physical
method to enhance transdermal delivery of a
tissue optical clearing agent: combination of
microneedling and sonophoresis. Lasers Surg
Med 2010; 42: 412–417.