Spis treści Historia

Mikroskop to instrument służący do obserwacji małych obiektów, zwykle niewidocznych gołym
okiem (tzn. nie mieszczących się w zakresie rozdzielczości ludzkiego oka). Znamy obecnie m.in.
mikroskopy optyczne, elektronowe, jonowe, ultradźwiękowe.
Metody obrazowania składników materii
TECHNIKA
Oko
OGRANICZENIA
Siatkówka
Mikroskop optyczny Dyfrakcja światła
ROZDZIELCZOŚĆ
700 000 Å
3 000 Å
Skaningowy ME
Dyfrakcja elektronów 30 Å
Transmisyjny ME
Dyfrakcja elektronów 1 Å
Spis treści
1 Historia
2 Pojęcia podstawowe
2.1 Apertura numeryczna
2.2 Jak zwiększyć zdolność rozdzielczą obiektywu mikroskopu?
2.3 Właściwości światła pogorszające zdolność rozdzielczą mikroskopu:
2.4 Konstrukcja mikroskopu optycznego
2.5 Całkowite powiększenie mikroskopu
3 Rodzaje mikroskopii optycznej
3.1 Mikroskopia transmisyjna
3.2 Mikroskopia kontrastu fazowego
3.3 Mikroskopia polaryzacyjna
3.4 Mikroskopia ciemnego pola
3.5 Mikroskopia fluorescencyjna
3.5.1 Barwienie preparatów
3.5.2 Barwniki fluorescencyjne
3.6 Mikroskopia konfokalna
3.6.1 Zasada działania
3.6.2 Przykłady mikroskopów konfokalnych
4 Mikroskopia elektronowa
4.1 Budowa mikroskopu elektronowego
4.2 Soczewki mikroskopu elektronowego
4.3 Skaningowy mikroskop elektronowy
5 Przygotowanie próbek do badania za pomocą mikroskopii elektronowej
Historia
Około roku 1590 Holendrzy — Zachariasz i Hans Jansenowie skonstruowali pierwszy mikroskop
optyczny umożliwiający uzyskiwanie 10-krotnie powiększonego obrazu obiektów.
W XVII wieku Antonie van Leeuwenhoek udoskonalił konstrukcje mikroskopu (powiększenie
maksymalne 270x), rozwinął produkcję tego urządzenia i jako pierwszy zaobserwował naczynia
włosowate, plemniki, erytrocyty, bakterie, plankton itp. Robert Hooke posługując się zbudowanym
przez siebie mikroskopem, w 1665 roku jako pierwszy zobaczył komórkę (fragment korka). Pod
koniec XIX wieku stosowanie mikroskopów optycznych w naukach technicznych i przyrodniczych
stało się powszechne.
Dominował pogląd, że wytwarzając coraz doskonalsze soczewki oraz osiągając coraz większe
powiększenia, można będzie zobaczyć coraz więcej szczegółów struktury. Dopiero teoria zdolności
rozdzielczej przyrządów optycznych, rozwinięta przez Ernsta Abbego i Williama Strutta wykazała,
że zdolność rozdzielcza mikroskopu optycznego zależy od długość fali świetlnej, współczynnika
załamania światła i apertury soczewki.
Sposobem na poprawę zdolności rozdzielczej mikroskopu jest znalezienie promieniowania o
krótszej fali. W roku 1931 pierwszy mikroskop elektronowy skonstruowali w Berlinie Ernst Ruska i
Maks Knoll ze współpracownikami. W 1936 roku powstał pierwszy mikroskop elektronowy firmy
Siemens. W roku 1982 Gerd Binnig i Heinrich Rohrer skonstruowali w Zurichu mikroskop STM
(Scanning Tunneling Microscope), pozwalający na obserwację struktur złożonych z pojedynczych
atomów. W 1986 roku powstał pierwszy mikroskop sił atomowych (AFM).
Pojęcia podstawowe
Prędkość fazowa fali — prędkość, z jaką rozchodzą się miejsca fali o tej samej fazie, np. czoło fali.
Współczynnik załamania — stosunek prędkości fazowej fali w ośrodku odniesienia do prędkości
fazowej fali w danym ośrodku:
gdzie
— prędkość fali w ośrodku, w którym fala rozchodzi się na początku,
ośrodku, w którym rozchodzi się po załamaniu.
— prędkość fali w
Ośrodkiem odniesienia przy określaniu współczynnika załamania światła jest próżnia. Gdy mowa jest
o współczynniku załamania światła, chodzi o współczynnik załamania względem próżni (bezwzględny
współczynnik załamania światła).
Dyspersja fali — zależność prędkości fazowej fali od jej częstotliwości (długości). Dyspersja w
optyce — zależność współczynnika załamania ośrodka od częstotliwości fali (świetlnej). Jednym ze
skutków dyspersji jest rozszczepienie światła białego przez pryzmat.
Apertura numeryczna
Kąt apertury to kąt
pod którym widać źrenicę wejściową układu optycznego, patrząc z punktu
przecięcia się głównej osi optycznej przyrządu z płaszczyzną, w której znajduje się przedmiot.
Apertura numeryczna jest opisywana wzorem:
ośrodka, w którym znajduje się przedmiot.
gdzie:
— współczynnik załamania
Imersja — metoda stosowana w mikroskopii w celu zwiększenia zdolności rozdzielczej mikroskopu
optycznego. Przestrzeń pomiędzy preparatem a obiektywem wypełnia się przeźroczystą cieczą
(imersyjną) o współczynniku załamania zbliżonym do współczynnika załamania szkła soczewki.
Zapobiega to załamaniu się światła po przejściu ze środowiska optycznie gęstszego (szkła) do
środowiska optycznie rzadszego (powietrza).
Zdolność rozdzielcza — najmniejsza odległość między dwoma punktami, które w uzyskanym
obrazie mogą być jeszcze rozróżniane jako oddzielne.
Kryterium Rayleigha (stosowane do określenia zdolności rozdzielczej elementów i układów
optycznych):
Obrazy dwóch różnych punktów są uważane za oddzielne, gdy główne maksimum
dyfrakcyjne pierwszego obrazu pokrywa się z minimum obrazu drugiego. Zdolność
rozdzielcza mikroskopu optycznego:
gdzie: — najmniejsza odległość pomiędzy dwoma punktami przedmiotu, które w obrazie
mikroskopowym mogą być jeszcze rozróżniane jako oddzielne, — współczynnik załamania światła
(dla powietrza
, dla olejku imersyjnego
apertura numeryczna obiektywu mikroskopowego.
),
— długość fali światła,
—
Jak zwiększyć zdolność rozdzielczą obiektywu mikroskopu?
1. Poprzez zwiększenie apertury numerycznej. W tym celu należy powiększyć współczynnik
załamania n przestrzeni między przedmiotem a obiektywem nanosząc na preparat kroplę
cieczy immersyjnej, o dużym współczynniku załamania n i w niej zanurzając czoło obiektywu.
2. Stosując do oświetlenia preparatu promieniowanie o długości fali krótszej od światła białego.
Właściwości światła pogorszające zdolność rozdzielczą mikroskopu:
1. Dyfrakcja — przy dużych powiększeniach utracona zostaje informacja o drobnej strukturze
przedmiotu; uginające się światło na krawędziach bardzo małych obiektów powoduje, że
szczegóły obserwowanego obiektu stają się coraz mniej widoczne.
2. Aberracje geometryczne — nie wszystkie promienie wychodzące z przedmiotu spotykają się po
odwzorowaniu w jednym punkcie obrazowym co w rezultacie powoduje utratę lub
zafałszowanie niektórych szczegółów obrazu.
Aberracja sferyczna — cecha układu optycznego polegająca na odmiennych długościach
ogniskowania promieni świetlnych ze względu na ich położenie pomiędzy środkiem a brzegiem
urządzenia optycznego — im bardziej punkt przejścia światła oddala od osi optycznej
urządzenia tym bardziej uginają się promienie świetlne.
Aberracja chromatyczna — cecha układu optycznego, wynikająca z różnych odległości
ogniskowania (ze względu na różną wartość współczynnika załamania) dla poszczególnych
długości fali światła. W rezultacie występuje rozszczepienie widoczne na granicach
kontrastowych obszarów pod postacią kolorowej obwódki.
3. Astygmatyzm, dystorsja, koma.
Konstrukcja mikroskopu optycznego
Standardowy mikroskop optyczny z oświetleniem próbki od dołu jest przedstawiony na Rys. Figure 1.
Składa się on z 1. okularu osadzonego w tubusie; 2. rewolweru; 3. obiektywu; 4. śruby
makrometrycznej; 5. śruby mikrometrycznej; 6. stolika; 7. źródła światła (lub zwierciadła
oświetlającego); 8. kondensora; 9. statywu.
Budowa mikroskopu optycznego. 1. okular osadzony w
tubusie; 2. rewolwer; 3. obiektyw; 4. śruba
makrometryczna; 5. śruba mikrometryczna; 6. stolik; 7.
źródło światła (lub zwierciadło oświetlające); 8. kondensor;
9. statyw.
Całkowite powiększenie mikroskopu
Całkowite powiększenie mikroskopu przedstawia się wzorem:
gdzie:
. — długość optyczna tubusu mikroskopu, w mm (odległość pomiędzy
ogniskiem obrazowym obiektywu a ogniskiem przedmiotowym okularu, — odległość najlepszego
widzenia (250 mm),
— ogniskowa obiektywu,
— ogniskowa okularu.
Powiększenie „puste” —przy zwiększaniu bez zmiany apertury obiektywu prowadzi do rozciągnięcia
obrazu bez ujawnienia nowych szczegółów).
Powiększenie użyteczne to najmniejsze powiększenie obrazu obiektu przy którym zarejestrujemy lub
dostrzeżemy całą informację zawartą w obrazie.
Granice użytecznego powiększenia mikroskopu wynikają ze zdolności rozdzielczej obiektywu i
zdolności rozdzielczej układu rejestrującego obraz (oka lub aparatu fotograficznego).
gdzie
— zdolność rozdzielcza oka około (0,15 – 0,3) mm,
Przyjmując średnią długość fali dla światła białego
— zdolność rozdzielcza mikroskopu.
można wykazać, że:
Rodzaje mikroskopii optycznej
Mikroskopia transmisyjna
Obserwacja światła przechodzącego przez badany obiekt i rozróżnienie obszarów różniących się
stopniem absorpcji.
Mikroskopia kontrastu fazowego
Obraz powstaje w wyniku nałożenia dwóch wiązek światła — bezpośredniej ze źródła i tej, która
przechodzi przez badany obiekt. Obserwacja elementów obiektu różniących się współczynnikiem
załamania (różne przesunięcie fazowe promieni).
Mikroskopia polaryzacyjna
Obserwacja obiektów zdolnych do skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego liniowo (obiekty
biologiczne). Uwidaczniane są obszary różniące się stężeniem tych obiektów. Obraz powstaje przez
nałożenie na siebie dwóch wiązek światła spolaryzowanego (przechodzącej przez obiekt i
odniesienia)
Mikroskopia ciemnego pola
Obserwacja światła rozpraszanego przez obiekt. Technika przydatna do obserwacji struktur typu
rzęski, odnóża.
Mikroskopia fluorescencyjna
Preparat oświetlany jest od strony obiektywu światłem o długości fali pochłanianej przez barwnik, a
obserwacje prowadzi się przy długości fali odpowiadającej silnej fluorescencji tego barwnika.
Barwienie preparatów
Właściwości dobrych barwników:
Wnikają do wnętrza komórki.
Wiążą się wybiórczo z elementami komórki.
Posiadają intensywna absorpcję, która umożliwia obserwacje struktur komórkowych po ich
związaniu z barwnikiem
Przydatne są barwniki o właściwościach zależnych od pH.
Barwniki fluorescencyjne
Obserwacja emisji światła na ciemnym tle, co zwiększa czułość metody i poprawia kontrast
obserwowanych szczegółów. Z powodu wysokiej czułości w technikach wybiórczego badania
cząsteczek biologicznych stosuje się barwniki fluorescencyjne zamiast absorpcyjnych.
Siła i barwa fluorescencji mogą zależeć od warunków panujących w środowisku: pH, potencjał
redox, lipofilowość, oraz od stężenia niektórych jonów np. Ca2+.
Mikroskopia konfokalna
Problem — światło pochodzące spoza płaszczyzny ogniskowania zmniejszające ostrość konturów i
powodujące wysokie tło .
Cel — wyeliminowanie obrazów pochodzących spoza płaszczyzny ogniskowania. Uzyskany obraz
charakteryzuje się słabszym tłem i ostrzejszymi konturami.
Możliwość uzyskania obrazów warstwicowych dla kolejnych przekrojów obiektu poprzez zmianę
położenia płaszczyzny ogniskowania.
Zasada działania
Wiązka lasera skupiana jest na pojedynczym punkcie obserwowanego obiektu.
Światło odbite od tego punktu (lub wyemitowane) przechodzi przez układ optyczny (obiektyw)
zogniskowany na płaszczyźnie prostopadłej do osi optycznej i trafia do detektora.
Obraz obiektu tworzony jest punkt po punkcie dzięki skokowemu przemieszczaniu się wiązki
po obiekcie obserwacji.
W punkcie przecięcia się promieni z płaszczyzną ogniskowania umieszczona jest przesłona z
małym otworkiem — do detektora docierają tylko promienie z tej płaszczyzny.
Promienie pochodzące z innych miejsc obiektu zostaną przez przesłonę odbite lub pochłonięte.
Zmieniając położenie przesłony z otworem wzdłuż osi optycznej uzyskuje się zmianę
płaszczyzny ogniskowania.
Przykłady mikroskopów konfokalnych
1. Laserowy skanujący mikroskop konfokalny ( Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM).
2. Dwufotonowy mikroskop konfokalny (TPCM, ang. Two-photon Confocal Microscope).
Mikroskopia elektronowa
Dyfrakcja i interferencja światła ogranicza zastosowanie mikroskopów optycznych. Wykorzystując
światło widzialne można obserwować obiekty o minimalnych rozmiarach rzędu 200 nm. W przypadku
promieniowania ultrafioletowego granica przesuwa się do ok. 100 nm. Zastosowanie promieniowania
elektromagnetycznego o mniejszej długości fali (promienie X, γ) napotyka na bariery techniczne:
brak materiałów z których można wykonać soczewki lub zwierciadła.
Mikroskopia elektronowa mogła się rozwinąć dzięki
odkryciu elektronu przez Josepha J. Thompsona;
odkryciu dwoistej natury falowo-korpuskularnej elektronów przez Victora de Broglie w 1924 r.
(nagroda Nobla 1929 r. „za odkrycie falowej natury elektronu”);
użyciu pola magnetycznego jako soczewki skupiającej elektrony przez Hansa Busha w 1926 r.
Według hipotezy de Broglie'a każdy obiekt materialny może być opisywany jako zbiór cząstek, albo
jako fala materii. Wzór pozwalający wyznaczyć długość fali materii dla cząstki o określonym pędzie
ma postać:
gdzie:
— długość fali cząstki,
— stała Plancka,
— pęd cząstki.
Dzięki temu, że długość fali materii dla rozpędzonego elektronu jest bardzo mała w porównaniu z
długością fali światła, elektrony nadają się do obserwacji małych obiektów, co wykorzystano w
konstrukcji mikroskopu elektronowego o wielokrotnie wyższej rozdzielczości niż mikroskop
optyczny. Powyższe rozważania dotyczą ruchu swobodnego cząstek . W realnych
przypadkach cząstce należy przypisać paczkę falową.
Dla elektronu:
.
Zakładając dalej, że energia kinetyczna elektronu wynosi (przy nieuwzględnieniu zjawisk
relatywistycznych)
.
otrzymujemy
.
Dla wysokich napięć (> 6 kV) zauważalny jest efekt relatywistycznego przyrostu masy elektronów:
.
Stąd wzór na długość fali uwzględniający relatywistyczny przyrost masy elektronów:
.
Dla napięcia 100 kV otrzymamy
.
Budowa mikroskopu elektronowego
Działo elektronowe — pełni rolę analogiczną jak żarówka w mikroskopie świetlnym. Zbudowane
jest z trójelektrodowego systemu: katody, tzw. cylindra Wehnelta i anody. Rolę katody pełni
wyprofilowane włókno wolframowe, wygięte w kształcie litery „V”, rozgrzane prądem do
temperatury powyżej 1000oC. W procesie termoemisji emituje ono chmurę elektronów. Pomiędzy
katodą, a anodą w dolnej części działa, wytworzona jest różnica potencjałów np. 1000000 V.
Elektrony, wyemitowane przez katodę, zostają przyśpieszone polem elektrostatycznym i skierowane
w stronę otworu w anodzie. Skupienie wiązki osiąga się przez wykorzystanie pola elektrostatycznego
wytworzonego przez soczewkę elektrostatyczną (cylinder Wehnelta), znajdującą się między katodą, a
anodą, wytwarzającą ujemne pole potencjału powodujące odpychanie elektronów. W efekcie
średnica wiązki zostaje zmniejszona (do ok. 100 μm) i skierowana do dalszej części kolumny
mikroskopu.
Komora preparatu zaopatrzona w śluzę zapobiegającą zapowietrzaniu całego mikroskopu
podczas wymiany preparatu. W komorze znajduje się stolik o dużej precyzji przesuwu i goniometr
pozwalający nachylać preparat.
Układ próżniowy — ponieważ wiązka elektronów ulega na atomach gazu rozproszeniu, konieczne
jest stosowanie wysokiej próżni wytwarzanej za pomocą układu pomp rotacyjnych i dyfuzyjnych.
Etapy uzyskiwania próżni:
1. etap — odpompowanie powietrza z wstępnej komory (śluzy) przez którą wprowadza się próbkę
do wnętrza kolumny.
2. etap — dokładniejsze usunięcie resztek powietrza z kolumny poprzez otwarcie zaworów
łączących wnętrze kolumny z pompą dyfuzyjną i rotacyjną. Resztki gazów pompowane są przez
pompę dyfuzyjna do zbiornika próżni, a stąd odciągane przez pompę rotacyjna na zewnątrz.
Pompa dyfuzyjna wytwarza próżnię umożliwiającą uzyskanie odpowiednich warunków dla
emisji wiązki elektronowej.
Soczewka elektromagnetyczna — cewka, zasilana prądem stałym, obudowana płaszczem z
materiału ferromagnetycznego. W środkowej części płaszcza utworzona jest szczelina,
uniemożliwiająca pełne zamknięcie pola magnetycznego w płaszczu ferromagnetycznym. Końce
szczeliny są biegunami magnesu N i S , wokół których w specyficzny sposób układają się linie sił pola
magnetycznego. Kształt linii pola magnetycznego jest ustalany przez nabiegunniki soczewki.
Stabilność układu powiększającego wymaga bardzo wysokiej stabilizacji prądu soczewek, od którego
zależy pole magnetyczne wytworzone w soczewkach. Także niewielkie wahania napięcia
przyśpieszającego, zmieniając nieznacznie prędkość elektronów, mogą spowodować drgania obrazu
na ekranie. Z tego powodu, napięcie przyśpieszające jest stabilizowane z dokładnością lepszą niż 0,1
V.
Soczewki mikroskopu elektronowego
Układ soczewek kondensora służy do zmiany natężenia i rozbieżności wiązki elektronów padającej
na próbkę. Układ powiększający składa się z:
1. Soczewki obiektywowej (najważniejsza część mikroskopu — od niej zależy zdolność
rozdzielcza).
2. Soczewki pośredniej (mogą być dwie, służą do uzyskiwania obrazu dyfrakcyjnego).
3. Soczewka projekcyjna (służy do uzyskiwania żądanych powiększeń).
Wadami soczewek elektronowych są:
astygmatyzm związany z tym, że pole magnetyczne nabiegunników nigdy nie jest idealnie
symetryczne,
oddziaływanie elektrostatyczne zanieczyszczeń gromadzących się na przesłonach z wiązką
elektronów.
Wady te wpływają na zdolność rozdzielczą mikroskopu, która obecnie wynosi około 1 Å.
Do usuwania astygmatyzmu soczewek stosuje się tzw. stygmatory. Korekcja astygmatyzmu polega na
wytwarzaniu przez stygmator asymetrycznego pola magnetycznego takiego, by kompensowało
asymetrie pola magnetycznego soczewki i przesłony.
Skaningowy mikroskop elektronowy
Transmisyjny mikroskop elektronowy daje obraz dwuwymiarowy. Źródłem informacji o kształtach
struktur subkomórkowych może być skaningowy mikroskop elektronowy.
Układ próżniowy i emisji elektronów jak dla TEM.
Wiązka skupiona przez układ kondensora, jest kierowana na powierzchnię preparatu. Na
drodze wiązki elektronów znajdują się elektromagnesy odchylające wiązkę. Wiązka, o średnicy
0,1-1 μm biegnie po powierzchni preparatu. Obok próbki znajduje się licznik elektronów
odbitych od powierzchni próbki, które wpadając do niego powodują powstanie sygnału
prądowego. Sygnał jest wzmacniany i przesyłany na ekran, na którym intensywność świecenia
plamki jest proporcjonalna do sygnału z detektora. Plamka przesuwa się z taką samą
częstotliwością, jak wiązka po powierzchni próbki — dlatego na monitorze tworzy się obraz
odpowiadający topografii powierzchni od której zostały odbite elektrony.
Powiększenie obrazu w mikroskopie skaningowym jest równe stosunkowi szerokości ekranu
monitora do szerokości pola, po którym przebiega wiązka skanująca powierzchnię próbki.
Zdolność rozdzielcza zależy od średnicy wiązki: im mniejsza wiązka, tym większą uzyskuje się
rozdzielczość obrazu. Na ogół powiększenia uzyskiwane za pomocą mikroskopu skaningowego
nie przekraczają jednak kilkudziesięciu tysięcy razy.
Przygotowanie próbek do badania za pomocą mikroskopii
elektronowej
W mikroskopie elektronowym można oglądać preparaty z komórek utrwalonych. Próbki muszą być
odwodnione bez zniekształcenia istotnych elementów materiału.
We wnętrzu mikroskopu musi panować wysoka próżnia, aby elektrony nie rozpraszały się na
cząsteczkach powietrza i w takich warunkach przygotowany preparat musi być trwały. Metody
przygotowania preparatu do obserwacji w mikroskopie skaningowym zależą od stopnia uwodnienia
badanego obiektu.
Obiekty twarde takie jak zarodniki roślin, pokrywy chitynowe skorupiaków nie zmieniają swojej
naturalnej struktury i nie wymagają specyficznych metod natomiast tkanki roślinne i zwierzęce o
dużej zawartości wody wymagają odpowiednich metod przygotowania do badań w SEM w celu
uniknięcia deformacji próbki w próżni mikroskopowej.
Etapy przygotowania próbki:
1. Utrwalanie i osmowanie. Przykłady utrwalaczy:
aldehyd glutarowy (GA) 1.5-3% r-r w 0,2 M buforze fosforanowym lub kakodylowym o pH
= 7,2;
FAA (formaldehyd + kwas octowy lodowaty + alkohol etylowy 70%, 5:5:90);
czterotlenek osmu OsO4, 1-2% r-r w buforze fosforanowym lub kakodylowym.
2. Płukanie w buforze fosforanowym w celu usunięcia utrwalacza z tkanek.
3. Odwadnianie we wzrastających stężeniach alkoholu etylowego lub acetonu .
4. Suszenie.
5. Naklejanie i napylanie — próbki pokrywa się złotem technicznym w napylarce próżniowej.
6. Obserwacja i analiza obrazu.
W przypadku badań za pomocą elektronowego mikroskopu elektronowego próbki przygotowuje
podobnie, dodatkowo preparat musi być bardzo cienki (poniżej 1 μm). W grubszych warstwach
elektrony ulegają rozproszeniu i spowolnieniu co uniemożliwia ich zogniskowanie i otrzymanie
ostrego obrazu. W związku z tym po utrwaleniu za pomocą roztworu aldehydu glutarowego i
czterotlenku osmu (OsO4) i usztywnieniu, poprzez przesycanie polimerami akrylowymi (metakrylany)
lub epoksydowymi utwardzony blok tkanek tnie się na ultracienkie skrawki za pomocą
ultramikrotomu z użyciem noży diamentowych lub szklanych, a następnie wybarwia solami metali
ciężkich: ołowiu, uranu, złota