Kwasy nukleinowe 1 wersja 200

Budowa i właściwości kwasów nukleinowych
Budowa
Absorpcja i emisja światła
Zasada azotowa - jednopierścieniowe pirymidyny: cytozyna (C), tymina (T) i uracyl (U) oraz dwupierścieniowe puryny:
adenina (A) i guanina (G). Czasami spotykane są tzw. rzadkie zasady, np. 5-metylocytozyna lub hipoksantyna.
Nukleozyd - zasada azotowa połączona wiązaniem N-glikozydowym [przez atom azotu w pozycji 1 (N-1) u pirymidyn, w
pozycji 9 (N-9) u puryn] z cząsteczką cukru, np. rybozą lub 2-deoksyrybozą (w skrócie deoksyryboza), czyli N-glikozyd
pirymidyny lub puryny: cytydyna, deoksycytydyna, adenozyna, deoksyadenozyna, guanozyna, deoksyguanozyna, tymidyna
(deoksyryboza połączona z tyminą) i urydyna. Czasami spotykane są tzw. rzadkie nukleozydy, np. 5-metylocytydyna,
5-metylodeoksycytydyna, inozyna (ryboza połączona z hipoksantyną), rybotymidyna (ryboza połączona z tyminą) lub
pseudourydyna [ryboza połączona z uracylem przez jego atom węgla w pozycji 5 (C-5), tzn. wiązaniem C-glikozydowym].
Nukleotyd - nukleozyd z przyłączoną przynajmniej jedną resztą fosforanową do reszty cukru, czyli ester fosforanowy
nukleozydu. W monofosforanach jedyna reszta fosforanowa przyłączona jest za pomocą wiązania estrowego, np. w pozycji
3’ lub 5’ cukru, tak jak w 5’-monofosforanie adenozyny [inaczej adenozyno-5’-monofosforan (AMP)]. W bisfosforanach obie
reszty fosforanowe przyłączone są do cukru wiązaniami estrowymi w dwóch różnych pozycjach, jak np. w 3’,5’-bisfosforanie
adenozyny. W difosforanach obie reszty fosforanowe przyłączone są do tej samej pozycji w cząsteczce cukru, np. 5’.
Pierwsza z nich (reszta a) połączona jest z cukrem wiązaniem estrowym, zaś druga (reszta b) połączona z tą pierwszą resztą,
wysokoenergetycznym wiązaniem bezwodnikowym, tak jak w 5’-difosforanie deoksyadenozyny (dADP). W trifosforanach,
np. w 5’-trifosforanie adenozyny (ATP), trzecia reszta fosforanowa (reszta g) połączona jest z resztą b kolejnym
wysokoenergetycznym wiązaniem bezwodnikowym.
Oligonukleotydy i kwasy nukleinowe - związki liniowe powstałe poprzez połączenie nukleotydów wiązaniem
3’,5’ - fosfodiestrowym [jedna reszta fosforanowa jest połączona wiązaniem estrowym z pozycją 3’ jednego cukru
(nukleozydu) i drugim wiązaniem estrowym z pozycją 5’ drugiego cukru (nukleozydu)]. Oligonukleotydy zbudowane są z kilku
do kilkudziesięciu nukleotydów i są syntetyzowane chemicznie (mogą też powstawać w wyniku degradacji kw. nukleinowych).
Kw. nukleinowe są polinukleotydami liczącymi od kilkuset do kilkuset milionów nukleotydów i powstają w wyniku syntezy
biochemicznej [biosyntezy, ale również poza komórką, np. w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)]. RNA (kwas
rybonukleinowy) charakteryzuje się obecnością rybozy oraz czterech zasad azotowych: A, U, C i G. DNA (kwas
deoksyrybonukleinowy) charakteryzuje się obecnością deoksyrybozy oraz czterech zasad azotowych: A, T, C i G.
Roztwory kw. nukleinowych, oligonukleotydów, nukleotydów, nukleozydów i zasad są bezbarwne, więc związki te nie
absorbują światła widzialnego (400-700 nm).
Rozpuszczalność w wodzie
Zasady azotowe są mało polarne (hydrofobowe), a w konsekwencji słabo rozpuszczalne w wodzie. Nukleozydy poprzez
obecność w swej cząsteczce polarnej reszty cukru są już dobrze rozpuszczalne w wodzie. Nukleotydy zawierające dodatkowo
silnie polarną resztę fosforanową, a także oligonukleotydy i kw. nukleinowe są bardzo dobrze rozpuszczalne w wodzie.
Zasady azotowe posiadając aromatyczny pierścień absorbują światło ultrafioletowe (UV). Zasady nieznacznie różnią się
między sobą długością fali przy której obserwowane jest maksimum absorpcji (253-271 nm w pH obojętnym). Oznaczając
pojedynczą zasadę w spektrofotometrze wybiera się falę zgodną z jej maksimum absorpcji. Oznaczając wszystkie zasady
razem wybiera się falę o długości 260 nm. Nukleozydy, nukleotydy, oligonukleotydy i kw. nukleinowe poprzez obecność
w swych cząsteczkach zasady azotowej również absorbują UV. Ani reszta fosforanowa ani reszta cukru praktycznie nie
absorbują światła UV w zakresie 230 - 400 nm. Stąd w pH obojętnym pojedyncze nukleozydy i nukleotydy oznacza się
zgodnie z maksimum absorpcji ich zasad. Oznaczając mieszaniny tych związków oraz oligonukleotydy i kw. nukleinowe
(zbudowane ze wszystkich zasad azotowych) stosuje się falę 260 nm. W pH kwaśnym lub zasadowym maksima absorpcji
nukleozydów i nukleotydów mogą się jednak różnić o kilka nanometrów od wartości dla ich zasad.
Efekt hipochromowy - kw. nukleinowe o dwuniciowej strukturze, zarówno DNA i RNA, wykazują obniżoną absorbancję w
UV, ponieważ elektrony z aromatycznego pierścienia ich zasad zaangażowane są w oddziaływania warstwowe i nie są tak
podatne na wzbudzanie UV, jak te w jednoniciowym kw. nukleinowym o tym samym składzie zasad. Odwrotnością tego efektu
jest efekt hiperchromowy - przyrost absorbancji w UV związany ze zniszczeniem struktury dwuniciowej kw. nukleinowego
(denaturacją). Maksymalny przyrost absorbancji obserwuje się przy degradacji kw. nukleinowego do wolnych nukleotydów.
Kompleksy DNA, ale także RNA lub oligonukleotydów z niektórymi związkami chemicznymi w pewnych warunkach
mogą świecić światłem widzialnym. Najczęściej używany jest w tym celu bromek etydyny. Związek ten interkaluje między
pierścienie zasad i powoduje, że energia zaabsorbowana w postaci światła UV jest oddawana poprzez fluorescencję światła
pomarańczowego. Połączenie zachodzi w sposób ilościowy, można więc, oprócz samego stwierdzenia obecności DNA, RNA
lub oligonukleotydu (np. w żelu agarozowym po elektroforezie), oznaczać ich zawartość przy pomocy fluorymetru. Kompleks
DNA z innym barwnikiem fluorescencyjnym - DAPI, absorbuje UV i emituje światło niebieskie, zaś z SYBR Green I
(używany m. in. do pomiaru ilości powstającego DNA w trakcie real-time PCR), absorbuje światło niebieskie i emituje zielone.
Lepkość
DNA, zwłaszcza wysokocząsteczkowy, nadaje dużą lepkość roztworom. Denaturacja DNA lub jego fragmentacja powodują
znaczący spadek lepkości roztworu.
Denaturacja
Wytrącanie z roztworów
Denaturacja to zniszczenie struktury cząsteczki wyższej od jej struktury pierwszorzędowej (w przypadku kw. nukleinowych
sekwencji nukleotydów). Dla kw. nukleinowych (w roztworze) przez denaturację rozumie się zniszczenie ich struktury
dwuniciowej, utrzymywanej przez wiązania wodorowe między parami zasad AT i GC oraz oddziaływania warstwowe (siły
van der Waalsa) między płaszczyznami kolejnych zasad. Struktury takie występują w dwuniciowym DNA na całej jego
długości, między jednoniciowym DNA a sparowanym komplementarnym oligonukleotydem, ale są także spotykane w
jednoniciowym DNA i RNA jako wewnątrzcząsteczkowe obszary dwuniciowe, np. w tRNA lub rRNA. Wiązania wodorowe w kw.
nukleinowych są niszczone przez wysoką temperaturę lub skrajne pH (< 3,5 i > 12). Związki będące donorem lub akceptorem
wiązania wodorowego, np. formamid, również ułatwiają denaturację (choć sama ich obecność jej nie wywołuje). Denaturacja
kw. nukleinowych nie oznacza spadku ich rozpuszczalności (wytrącania się z roztworu) - jednoniciowe kw. nukleinowe są
nadal bardzo dobrze rozpuszczalne w wodzie. Renaturacja jest procesem odwrotnym do denaturacji. Starannie
przeprowadzona, pozwala odtworzyć dwuniciową strukturę kw. nukleinowego sprzed jego denaturacji.
Kw. nukleinowe są wytrącane z roztworów wodnych przede wszystkim przy pomocy rozpuszczalników organicznych: etanolu
i propanolu-2 (izopropanolu). Rzadziej stosowany jest w tym celu kwas trichlorooctowy (TCA). Oligonukleotydy w typowych
procedurach wytrącane są za pomocą etanolu. Nukleotydy, nukleozydy i wolne zasady jako związki drobnocząsteczkowe
nie są wytrącane z roztworów tymi rozpuszczalnikami i kwasami.
Temperatura topnienia danego kw. nukleinowego (Tm) jest to temperatura w której połowa tego kwasu jest zdenaturowana.
Jest ona tym wyższa, im dłuższa jest jego dwuniciowa struktura i im wyższa jest w niej zawartość par GC (więcej
stabilizujących wiązań wodorowych do rozerwania) oraz im wyższa jest siła jonowa roztworu. Kilkunastunukleotydowe obszary
dwuniciowe ulegną całkowitej denaturacji w temp. poniżej 60°C, zaś nawet najdłuższe cząsteczki DNA będą całkowicie
zdenaturowane w temp. 95°C. Do wyznaczania Tm można wykorzystać efekt hiperchromowy, czyli towarzyszący denaturacji
kw. nukleinowego przyrost absorbancji jego roztworu w ultrafiolecie (UV). Za temperaturę topnienia danego kw. nukleinowego
przyjmuję się taką, przy której został osiągnięty 50% przyrost absorpcji w UV podczas jego termicznej denaturacji.
Dializa
Degradacja
Degradacja chemiczna zachodzi pod wpływem kwasów i zasad. DNA i oligodeoksyrybonukleotydy (nukleotydy zawierające
2-deoksyrybozę) ulegają degradacji tylko w środowisku kwaśnym. RNA i oligorybonukleotydy (nukleotydy zawierające rybozę)
ulegają degradacji zarówno w środowisku kwaśnym jak i zasadowym.
W przypadku środowiska kwaśnego, w pierwszej kolejności hydrolizie ulega wiązanie N9-glikozydowe między puryną a
cukrem, dając wolne puryny i tzw. kwas apurynowy. Wiązanie to ulega rozerwaniu znacznie łatwiej w DNA niż w RNA.
Intensywniejsza hydroliza prowadzi do rozpadu wiązań estrowych między fosforanem a cukrem z byłego nukleotydu
purynowego dając wolne zasady purynowe, odpowiedni cukier (rybozę lub 2-deoksyrybozę) i fosforan (pochodzące z
rozpadniętych nukleotydów purynowych) oraz wiązania fosfodiestrowego między nukleotydami pirymidynowymi, uwalniając je.
Pełna hydroliza prowadzi także do rozpadu wiązania N1-glikozydowego między pirymidyną a cukrem i wiązania estrowego
między tym cukrem a fosforanem. W efekcie, po jej przeprowadzeniu otrzymuje się mieszaninę wolnych zasad azotowych
(puryn i pirymidyn), fosforanu i cukru (rybozy lub 2-deoksyrybozy - w zasadzie jego pochodnej, która powstała w takich
warunkach). Hydrolizie kwaśnej ulegać też będą wolne nukleozydy i nukleotydy, dając wolne zasady azotowe i cukier (a także
fosforan w przypadku nukleotydów).
W przypadku środowiska alkalicznego, hydrolizie ulega jedynie wiązanie 3’,5’-fosfodiestrowe między fosforanem a pozycją
5’ cukru (wiązanie N-glikozydowe jest odporne na działanie zasad), dając produkty przejściowe - cykliczne 2’,3’-monofosforany
nukleozydów, które ostatecznie hydrolizują na równowagową mieszaninę 2’- i 3’-monofosforanów nukleozydów. Ponieważ
hydroliza ta wymaga wytworzenia wiązania estrowego między fosforanem a grupą OH w pozycji 2’ cukru, ulega jej tylko RNA i
oligorybonukleotydy, zawierające rybozę (2-deoksyryboza występująca w DNA nie zawiera właśnie w tej pozycji grupy OH).
Degradacja enzymatyczna zachodzi pod wpływem nukleaz - enzymów hydrolizujących wiązanie 3’,5’-fosfodiestrowe, które
prowadzą do otrzymania z kw. nukleinowego mieszaniny nukleotydów i glikozydaz - enzymów hydrolizujących wiązanie
N-glikozydowe, które prowadzą do otrzymania z kw. nukleinowego mieszaniny wolnych zasad azotowych i szkieletu
fosforanocukrowego. Ponadto, fosforan może być uwolniony od reszty cukru w nukleotydzie przez fosfatazy - enzymy
hydrolizujące wiązanie estrowe. Wspólne działanie wszystkich tych enzymów prowadzi do otrzymania mieszaniny wolnych
zasad azotowych (puryn i pirymidyn), fosforanu i cukru (rybozy lub 2-deoksyrybozy). Nukleazy dzielimy na DNazy, które
specyficznie degradują DNA i oligodeoksyrybonukleotydy oraz RNazy, które specyficznie degradują RNA i oligorybonukleotydy.
Obecnie, do selektywnego usunięcia z roztworu kw. nukleinowych jednego z nich, rutynowo stosuje się powyższe nukleazy,
np. DNazę w celu pozbycia się DNA (RNA od uwolnionych z DNA nukleotydów trzeba oddzielić innymi metodami). W drugą
stronę, można użyć RNazy lub przeprowadzić hydrolizę zasadową (to ostatnie obecnie rzadko stosowane). Hydrolizę kwaśną
przeprowadza się na ogół w celu identyfikacji i oznaczenia ilościowego zasad azotowych (zwłaszcza zmodyfikowanych lub
tzw.rzadkich) występujących w badanym kw. nukleinowym. Jednak w jej trakcie może dojść do przekształcania niektórych
zasad, np. cytozyna ulec deaminacji do uracylu. Dlatego stosuje się w tym celu także degradację enzymatyczną (nukleazami)
do nukleotydów, które się oznacza, lub za pomocą fosfatazy usuwa się jeszcze fosforan i oznacza wtedy nukleozydy. Dla RNA
można przeprowadzić hydrolizę zasadową do nukleotydów i te oznaczać. Kolejność zasad w łańcuchu polinukleotydowym
(a więc także jego skład z dokładnością do jednej zasady) można ustalać poprzez jego sekwencjonowanie.
© 2008 Zakład Biologii Molekularnej UW
materiał dostępny na stronie www.biol.uw.edu.pl/zbm
Do wytrącania kw. nukleinowych i oligonukleotydów nie jest konieczna ich denaturacja - wytrąceniu ulegają zarówno dwu- jak
i jednoniciowe cząsteczki. Wytrącanie może służyć oddzieleniu kw. nukleinowych od związków drobnocząsteczkowych (np.
wolnych nukleotydów lub soli nieorganicznych) - kw. nukleinowe po wirowaniu zostaną w osadzie, zaś nukleotydy lub sole w
supernatancie. Wytrącanie stosuje się także do zatężenia kw. nukleinowych - po wytrąceniu z większej objętości roztworu o
niskim stężeniu, ich osad zawiesza się w małej objętości roztworu.
Kw. nukleinowe są makrocząsteczkami i pozostają w woreczku dializacyjnym nawet po wyczerpującej dializie. Nukleotydy,
nukleozydy i wolne zasady, a także inne związki drobnocząsteczkowe, np. sole nieorganiczne swobodnie przechodzą przez
pory woreczka dializacyjnego. Zachowanie się oligonukleotydów zależy od ich długości - te krótkie mogą być na tyle małe,
aby przejść swobodnie przez pory woreczka.
Dializa może służyć oddzieleniu kw. nukleinowych (i dłuższych oligonukleotydów) od związków drobnocząsteczkowych (np.
wolnych nukleotydów lub soli nieorganicznych) - po dializie pozostaną bowiem w woreczku dializacyjnym.
Chromatografia
Obecność reszty fosforanowej w nukleotydach, oligonukleotydach i kw. nukleinowych pozwala tym związkom wiązać się do
złoża jonowymieniacza (anionitu). Dłuższe cząsteczki zawierające więcej reszt fosforanowych wiążą się mocniej niż krótsze
cząsteczki (generalnie DNA mocniej niż RNA i oligonukleotydy, oligonukleotydy mocniej niż nukleotydy, zaś wśród tych
ostatnich najmocniej wiążą się trifosforany, zaś najsłabiej monofosforany), do elucji wymagają więc roztworu o wyższej sile
jonowej lub niższym pH. Różnice w budowie zasad azotowych pozwalają rozdzielać między sobą w tej chromatografii także
nukleotydy o tej samej liczbie reszt fosforanowych w cząsteczce, np. 5’-monofosforany deoksyrybonukleozydów.
Kw. nukleinowe od oligonukleotydów i nukleotydów oraz oligonukleotydy od nukleotydów można rozdzielić wykorzystując
różnice w ich wielkości przy pomocy sączenia molekularnego, podczas którego większe cząsteczki będą wypływały
wcześniej z kolumny, zaś nukleotydy, będąc najmniejszymi cząsteczkami, jako ostatnie.
Wolne zasady, nukleozydy i nukleotydy można rozdzielać między sobą za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) w układzie faz odwróconych. W przypadku tej chromatografii podziałowej najbardziej hydrofobowe zasady,
nukleozydy lub nukleotydy wiążą się z niepolarnym złożem najsilniej, zaś te bardziej polarne najsłabiej. Te ostatnie będą
wymywane przy największym stężeniu polarnego rozpuszczalnika. Wraz z obniżaniem jego stężenia poprzez dodawanie
mniej polarnego, np. metanolu lub acetonitrylu (spadkiem polarności fazy ruchomej) elucji zaczną ulegać te silniej związane,
czyli bardziej hydrofobowe.
Składniki kw. nukleinowych: nukleotydy, nukleozydy, wolne zasady azotowe i fosforan można też rozdzielać (z pewnymi
ograniczeniami) wstępującą chromatografią bibułową (forma chromatografii podziałowej) w układzie rozwijającym
opartym na umiarkowanie polarnym rozpuszczalniku o niskim pH. Rozdzielane związki są wtedy maksymalnie
uprotonowane - reszty fosforanowe stają się obojętne (niezdysocjowane), zaś ugrupowania z atomem azotu posiadającym
wolną parę elektronów np. grupy NH2 w zasadach azotowych przyjmują ładunek dodatni (w postaci NH3+), co odwraca
normalną polarność tych związków przyjmowaną w obojętnych roztworach wodnych. Fosforan mający, w takim układzie,
najmniejsze powinowactwo do polarnej fazy stałej - wody zadsorbowanej na powierzchni włókien celulozy, migruje najszybciej
z mniej polarną fazą ruchomą. Wolne zasady zaś stają się tym układzie najbardziej polarnymi związkami i migrują najwolniej,
zatrzymywane przez polarną fazę stacjonarną. Nukleotydy zawierające zarówno fosforan jak i zasadę azotową migrują w
pośrednim tempie. Chromatografia bibułowa dobrze rozdziela małe ilości mieszanin zasad azotowych lub mieszanin zasad
purynowych i nukleotydów pirymidynowych, natomiast nie jest w stanie rozdzielić pewnych nukleotydów między sobą.
Obecnie, chromatografia na anionicie lub HPLC w układzie faz odwróconych stosowane są rutynowo w badaniach
naukowych i diagnostyce związanymi z kw. nukleinowymi i ich składnikami. Stosowane jest także sączenie molekularne.
Chromatografia bibułowa została prawie całkowicie wyparta przez chromatografię w układzie faz odwróconych ze
względu na to, że ta ostatnia oferuje zwiększoną czułość, łatwość oznaczania ilościowego, bardzo wysoką powtarzalność i
możliwość rozdzielania względnie dużych ilości substancji, także tych, które nie ulegały rozdziałowi w chromatografii bibułowej.
Obecność składników kw. nukleinowych: nukleotydów, nukleozydów, zasad azotowych, cukrów i fosforanu można stwierdzić
charakterystycznymi dla nich reakcjami barwnymi. Cechują się one jednak niską czułością i często nie potrafią rozróżnić
między sobą podobnych do siebie składników. Zasady azotowe, nukleozydy lub nukleotydy można w większości przypadków
rozróżnić między sobą po maksimach absorpcji w UV. W przypadku powtarzania konkretnych układów chromatograficznych,
poszczególne składniki można także zidentyfikować na podstawie, ustalonych wcześniej przy pomocy standardów tych
związków, współczynników przesunięcia (Rf) w chromatografii bibułowej lub czasów retencji (tr) w HPLC.