autoreferat - Wydział Medycyny Weterynaryjnej

Transkrypt

Załącznik nr 2 do wniosku o wszczęcie postępowania habilitacyjnego
AUTOREFERAT
dr Magdalena Rzewuska
Zakład Mikrobiologii
Katedra Nauk Przedklinicznych
Wydział Medycyny Weterynaryjnej
Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie
Warszawa, 2016
1. Imię i nazwisko:
Magdalena Rzewuska
2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/artystyczne – z podaniem nazwy,
miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej:

Stopień naukowy: doktor nauk weterynaryjnych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej,
SGGW w Warszawie, Warszawa, rok 1999; tytuł rozprawy doktorskiej „Różnicowanie
szczepów Serpulina sp. izolowanych od świń na podstawie cech fenotypowych i
genotypowych” (Promotor: dr hab. Danuta Klimuszko prof. nadzw. SGGW).

Tytuł: magister biologii (specjalność – mikrobiologia), Wydział Biologii Uniwersytetu
Warszawskiego, Warszawa, rok 1990.
3.
Informacje
o
dotychczasowym
zatrudnieniu
w
jednostkach
naukowych/artystycznych:
Od 2013 do dnia dzisiejszego
Zakład Mikrobiologii, Katedra Nauk Przedklinicznych,
Wydział
Medycyny
Weterynaryjnej,
SGGW
w
Warszawie; adiunkt
Od 2002 do 2012
Zakład Bakteriologii i Biologii Molekularnej, Katedra
Nauk
Przedklinicznych,
Wydział
Medycyny
Weterynaryjnej, SGGW w Warszawie; adiunkt
Od 2000 do 2001
Chorób Zakaźnych, Mikrobiologii i Parazytologii,
Wydział
Medycyny
Weterynaryjnej,
SGGW
w
Warszawie; adiunkt
Od 1996 do1999
Mikrobiologii i Immunologii, Wydział Medycyny
Weterynaryjnej, SGGW w Warszawie; asystent
0d 01.12.1990 do 1995
Zakład Bakteriologii, Katedra Mikrobiologii , Wydział
Medycyny Weterynaryjnej, SGGW w Warszawie;
asystent
-2-
4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14
marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i
tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 z późniejszymi zmianami).
a) Osiągnięciem naukowym jest jedno-tematyczny cykl publikacji objęty tytułem:
Charakterystyka i ocena potencjału chorobotwórczego szczepów Trueperella pyogenes oraz
Rhodococcus equi występujących u dzikich zwierząt w Polsce
b) Publikacje stanowiące osiągnięcie naukowe:
1. Rzewuska M., Stefańska I., Osińska B., Kizerwetter-Świda M., Chrobak D., Kaba J.,
Bielecki W. 2012. Phenotypic characteristics and virulence genotypes of Trueperella
(Arcanobacterium) pyogenes strains isolated from European bison (Bison bonasus).
Veterinary Microbiology 160, 69-76. IF (2012): 3.127, punkty MNiSW (2012): 40
Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań,
zaplanowaniu metodyki badań, zebraniu kolekcji izolatów bakteryjnych, wykonaniu
większości oznaczeń fenotypowych i genotypowych szczepów, analizie i interpretacji
wyników badań, napisaniu manuskryptu (autor korespondencyjny). Mój udział
procentowy szacuję na 85%.
2. Rzewuska M., Witkowski L., Cisek A.A., Stefańska I., Chrobak D., Stefaniuk E.,
Kizerwetter-Świda M., Takai S. 2014. Characterization of Rhodococcus equi isolates
from submaxillary lymph nodes of wild boars (Sus scrofa), red deer (Cervus elaphus)
and roe deer (Capreolus capreolus). Veterinary Microbiology 172, 272-278. IF
(2014): 2.511, punkty MNiSW (2014): 40
większości oznaczeń fenotypowych i genotypowych szczepów, analizie i interpretacji
wyników badań, napisaniu manuskryptu (autor korespondencyjny). Mój udział
procentowy szacuję na 80%.
-3-
3. Witkowski L., Rzewuska M., Cisek A.A., Chrobak-Chmiel D., Kizerwetter-Świda
M., Czopowicz M., Welz M., Kita J. 2015. Prevalence and genetic diversity of
Rhodococcus equi in wild boars (Sus scrofa), roe deer (Capreolus capreolus) and red
deer (Cervus elaphus) in Poland. BMC Microbiology, May 22;15:110. IF (2015):
2.581, punkty MNiSW (2015): 30
Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na uczestnictwie w opracowaniu koncepcji
badań, zebraniu i opracowaniu kolekcji izolatów bakteryjnych, analizie i interpretacji
wyników badań, korekcie manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 15%.
4. Stefańska I., Witkowski L., Rzewuska M., Dzieciątkowski T. 2016. Development and
evaluation of the internal-controlled real-time PCR assay for Rhodococcus equi
detection in various clinical specimens. Journal of Veterinary Medical Science 78(4),
543-549. IF (2015): 0.822, punkty MNiSW (2015): 20
Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań, zebraniu
kolekcji izolatów bakteryjnych, przygotowaniu materiału genetycznego do badań,
wykonaniu oznaczeń konwencjonalną metodą PCR, analizie i interpretacji wyników
badań, korekcie manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 25%.
5. Rzewuska M., Czopowicz M., Gawryś M., Markowska-Daniel I., Bielecki W. 2016.
Relationships between antimicrobial resistance, distribution of virulence factor genes
and the origin of Trueperella pyogenes isolated from domestic animals and European
bison (Bison bonasus). Microbial Pathogenesis 96, 35-41. IF (2015): 1.888, punkty
MNiSW (2015): 20
większości oznaczeń genotypowych szczepów, wykonaniu oznaczeń lekowrażliwości
szczepów, analizie i interpretacji wyników badań, napisaniu manuskryptu (autor
korespondencyjny). Mój udział procentowy szacuję na 85%.
Łączna punktacja prac wchodzących w skład jednotematycznego cyklu publikacji:
- według listy Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego: 150 punktów
- łączny impact factor wg listy JCR: 10.929
Dla publikacji z roku 2016 (publikacje nr 4 i 5) podano aktualne dane z roku 2015.
-4-
Zarząd Główny Polskiego Towarzystwa Nauk Weterynaryjnych przyznał autorom w 2013
roku nagrodę I stopnia za publikację nr 1, oraz wyróżnienie w roku 2015 za publikację nr 2.
Artykuły stanowiące osiągnięcie naukowe oraz oświadczenia współautorów,
określające indywidualny wkład każdego z nich w powstanie pracy znajdują się w załączeniu
(zał. 5 i 6).
c) Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich
ewentualnego wykorzystania.
Wprowadzenie
Rodzaje Rhodococcus i Trueperella należą do rzędu Actinomycetales (tzw. aktinomycety).
Zaliczane do tego taksonu bakterie są gramdodatnimi, nie wytwarzającymi przetrwalników,
nieregularnymi pałeczkami, które mogą występować również w formie ziarniaków lub
filamentów z rozgałęzieniami przypominającymi grzybnię (Sullivan i Chapman, 2010).
Drobnoustroje te powszechnie występują w środowisku naturalnym, zasiedlając różnorodne
nisze ekologiczne, mogą być także składnikiem naturalnej bioty skóry, górnych dróg
oddechowych, przewodu pokarmowego lub układu moczowo-płciowego człowieka i
zwierząt. Niektóre gatunki są chorobotwórcze i powodują zakażenia oportunistyczne
najczęściej o charakterze ropnym. Najważniejsze i najlepiej poznane chorobotwórcze gatunki
z rzędu Actinomycetales należą do rodzajów Mycobacterium, Actinomyces, Nocardia,
Corynebacterium, a także Rhodococcus i Trueperella. W ostatnich latach coraz częściej
publikowane są opisy przypadków zakażeń, głównie u ludzi, wywołanych przez inne rodzaje
aktinomycetów, dotychczas słabo poznane, takie jak Arthrobacter, Brevibacterium,
Tsukamurella, Cellulosimicrobium, Tropheryma, Gordonia, Rothia czy Dietzia. Wywołują
one sporadyczne zakażenia oportunistyczne, najczęściej u osób z obniżoną odpornością,
przewlekle chorych np. na choroby nowotworowe czy AIDS.
Bakterie z rzędu Actinomycetales należące do poszczególnych rodzajów i gatunków,
w wielu przypadkach mają podobne właściwości fenotypowe, takie jak morfologia komórek
czy cechy wzrostu, natomiast w znacznym stopniu są zróżnicowane filogenetycznie. W ich
klasyfikacji taksonomicznej brane są pod uwagę właściwości genetyczne takie, jak sekwencja
genu 16S rRNA czy zawartość par G+C w DNA, chociaż w wielu przypadkach to struktura
ściany komórkowej jest cechą charakterystyczną danego taksonu (Sullivan i Chapman, 2010).
Jednymi z ważniejszych jej składników są kwasy mikolowe, które wykazują dużą zmienność
pod względem budowy strukturalnej u poszczególnych taksonów i dlatego są ważnymi
-5-
markerami taksonomicznymi, pozwalającymi na zróżnicowanie aktinomycetów (Kowalski i
wsp., 2012). Diagnostyka zakażeń wywołanych przez aktinomycety bywa trudna, ponieważ
ich objawy kliniczne są na ogół niespecyficzne, a prawidłowe rozpoznanie czynnika
etiologicznego wymaga często zastosowania, oprócz rutynowych metod bakteriologicznych,
również dodatkowych technik hodowli i różnicowania drobnoustrojów. Obserwowany w
ostatnich latach wzrost liczby badań nad tymi bakteriami związany jest z wprowadzeniem do
diagnostyki mikrobiologicznej nowych metod, takich jak spektrometria masowa np. MALDITOF MS (ang. matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry),
czy sekwencjonowanie genów, które umożliwiają rozpoznawanie taksonów blisko
spokrewnionych oraz tych o bardzo podobnych cechach fenotypowych. Stosując te metody
odkryto i opisano wiele nowych rodzajów i gatunków aktinomycetów, a także zmieniono
klasyfikację niektórych dawno poznanych (Rowlinson i wsp., 2006).
Moje zainteresowanie bakteriami z rzędu Actinomycetales wywołującymi zakażenia u
zwierząt jest związane z wieloletnimi badaniami prowadzonymi w Mikrobiologicznym
Laboratorium Diagnostycznym Katedry Nauk Przedklinicznych oraz ścisłą współpracą
naukową z zespołami zajmującymi się na Wydziale Medycyny Weterynaryjnej SGGW
chorobami zakaźnymi małych przeżuwaczy, koni oraz zwierząt towarzyszących człowiekowi,
a także z zespołem monitorującym zdrowie populacji żubrów w Polsce. W badaniach
naukowych szczególną uwagę poświęciłam dwóm gatunkom aktinomycetów, Trueperella
pyogenes (T. pyogenes) oraz Rhodococcus equi (R. equi), które są ważnymi patogenami
zwierząt, w tym gospodarskich, powodującymi znaczne straty ekonomiczne w ich hodowli.
Mimo, iż są to bakterie znane od dawna, nadal wiele kwestii związanych z ich zjadliwością,
rezerwuarem i drogami rozprzestrzeniania się, a także patogenezą wywoływanych przez nie
zakażeń, pozostaje niewyjaśnionych. Efektem moich badań prowadzonych nad szczepami T.
pyogenes i R. equi wyizolowanymi od dzikich zwierząt są prace oryginalne, w tym te, które
stanowią omawiane osiągnięcie naukowe, a także publikacje w materiałach konferencyjnych.
Cel badań
Badania przedstawione w publikacjach stanowiących omawiane osiągnięcie naukowe były
poświęcone przede wszystkim szczepom T. pyogenes i R. equi wyizolowanym od wybranych
gatunków dzikich zwierząt. Ich głównymi celami było:
1) oznaczenie właściwości fenotypowych oraz genotypowych szczepów T. pyogenes
wyizolowanych od żubrów, ze szczególnym uwzględnieniem izolatów z przypadków
nekrotycznego zapalenia napletka;
-6-
2) porównanie izolatów T. pyogenes od żubrów i od zwierząt gospodarskich pod względem
występowania genów zjadliwości oraz profilów lekowrażliwości;
3) ustalenie zależności między genotypem zjadliwości szczepów T. pyogenes a typem
wywoływanych przez nie zakażeń;
4) oznaczenie właściwości fenotypowych oraz genotypowych, z uwzględnieniem czynników
zjadliwości, szczepów R. equi wyizolowanych od dzików, jeleni i saren;
5) opracowanie metody umożliwiającej wykrywanie R. equi w różnym materiale klinicznym
bez względu na typ zjadliwości szczepu;
6) ustalenie znaczenia badanych gatunków dzikich zwierząt jako rezerwuarów szczepów T.
pyogenes oraz R. equi potencjalnie groźnych dla zwierząt gospodarskich.
Opublikowane wyniki dotyczące izolatów T. pyogenes od żubrów, jak również
izolatów R. equi z tkanek od jeleni i saren, były pierwszymi danymi na ten temat w
piśmiennictwie światowym. Natomiast badania izolatów R. equi
od dzików dostarczyły
pierwszych informacji o występowaniu i cechach tych bakterii u dzików w Polsce.
Charakterystyka szczepów T. pyogenes występujących u żubrów (Bison bonasus),
z uwzględnieniem właściwości chorobotwórczych
Bakterie z gatunku Trueperella pyogenes do roku 2011 klasyfikowane były jako
Arcanobacterium pyogenes, a wcześniej jako Actinomyces pyogenes i Corynebacterium
pyogenes (Yassin i wsp., 2011). Są one oportunistycznymi patogenami zwierząt, natomiast u
ludzi sporadycznie wywołują zakażenia odzwierzęce (Jost i Billington, 2005). Rezerwuarem
pałeczek T. pyogenes są zwierzęta różnych gatunków, u których bytują na błonach śluzowych
i skórze. Bakterie te wywołują zakażenia najczęściej endogenne, o charakterze ropnym.
Niekiedy tak, jak w przypadku tzw. „letniego” zapalenia gruczołu mlekowego u bydła, mogą
przenosić się ze zwierzęcia na zwierzę za pośrednictwem much. U zwierząt gospodarskich
zakażenia T. pyogenes występują głównie u bydła, owiec, kóz, świń, rzadziej u koni i ptaków.
Bakterie te mogą wywoływać zakażenia różnego typu m.in. przewlekłe lub ostre ropne
zapalenie gruczołu mlekowego, ropne zapalenie płuc, zapalenie stawów, zapalenie wsierdzia
(u bydła), zapalenie szpiku (u indyków), zakażenia układu moczowo-płciowego (zapalenie
błony śluzowej macicy czy pęcherzyków nasiennych), a także zakażenia przyranne oraz
ropnie o różnej lokalizacji. U zwierząt dzikich zakażenia T. pyogenes odnotowane były
głównie u przeżuwaczy, takich jak antylopy, jeleniowate, piżmowce (Moschus berezovskii),
bizony (Bison bison) oraz żubry (Bison bonasus), poza tym u wielbłądów, słoni, dzikich
ptaków i in. (Jost i Billington, 2005; publikacja nr 1).
-7-
Pierwszy szczep T. pyogenes od żubra został wyizolowany przeze mnie w 2001 roku, i
opisany wówczas jako Arcanobacterium pyogenes. Był to izolat z wycinka napletka ze
zmianami martwicowo-ropnymi od byka z nekrotycznym zapaleniem napletka (NZN;
balanoposthitis). Choroba ta już od lat 80-tych ubiegłego wieku była obserwowana, głównie u
byków ze stada w Puszczy Białowieskiej, stając się poważnym problemem zdrowotnym i
zagrożeniem dla tej populacji żubrów. Pojawia się ona u zwierząt w różnym wieku, a w jej
przebiegu niekiedy dochodzi do autoamputacji prącia. Poszukiwanie etiopatogenezy NZN
było tematem projektu badawczego, w którego realizacji brałam udział (zał. 3, II.I.9). Różne
czynniki, zarówno zakaźne, jak i genetyczne były brane pod uwagę jako przyczyny tej
choroby. Rozważano udział w jej rozwoju T. pyogenes oraz beztlenowców, jako że bakteria
ta wraz Fusobacterium necrophorum czy Peptostreptococcus indolicus, może powodować
zakażenia mieszane np. „letnie" zapalenie gruczołu mlekowego lub ropnie wątroby u bydła.
Jednak moje obserwacje sugerują istotną rolę w etiologii tej choroby jedynie T. pyogenes,
ponieważ w ogromnej większości badanych przypadków NZN bakteria ta była wyizolowana
praktycznie w czystej kulturze. Informacje na ten temat były prezentowane w formie
doniesień na konferencjach naukowych poświęconych żubrom (zał. 3, II.A.2.1; zał. 3,
II.D.2.3; zał. 4, B.13). Etiologia NZN do chwili obecnej nie została jednak w pełni
wyjaśniona, choć wydaje się prawdopodobnym, że ma ona charakter wieloczynnikowy oraz,
że inne niż zakaźne czynniki predysponują do rozwoju choroby.
W trakcie badań materiału klinicznego pobranego od żubrów ze stad wolno żyjących
oraz z hodowli zamkniętych (w okresie 16 lat przebadałam ponad 1350 próbek), które padły
lub były eliminowane z populacji z uwagi na zły stan zdrowia (odstrzały w ramach selekcji),
okazało się, że zakażenia T. pyogenes występują stosunkowo powszechnie u osobników obu
płci. T. pyogenes wyizolowano od około 12% przebadanych zwierząt (dane nie
opublikowane). Oprócz przypadków NZN, bakterie te wyizolowano również z różnie
zlokalizowanych ropni, m.in. wątroby, śledziony, węzłów chłonnych, płuc, mięśni oraz
sporadycznie dróg rodnych (publikacja nr 1; zał. 3, II.D.1.35; zał. 4, B.36 i 49). U licznych
zwierząt stwierdzano zapalenie nieżytowe i nieżytowo-ropne płuc, a badanie bakteriologiczne
często wykazywało obecność w wycinkach płuc T. pyogenes lub Pasteurella multocida (zał.
3, II.D.2.4; zał. 4, B.57). Należy jednak zaznaczyć, że w tych przypadkach bardzo często
obserwowano inwazję nicieni płucnych, które prawdopodobnie były główną przyczyną zmian
chorobowych, zaś bakterie były tylko czynnikami wikłającymi. Jednym z ciekawszych
przypadków, z których wyizolowano T. pyogenes było martwicowe zapalenie krtani u samca,
które powstało prawdopodobnie na skutek urazu mechanicznego (zał. 3, II.A.2.2).
-8-
Wyniki badań bakteriologicznych wyraźnie wskazały na istotną rolę T. pyogenes jako
czynnika powodującego ropne i martwicowo-ropne zmiany u żubrów, szczególnie tych ze
stada białowieskiego, z którego pochodziła większa część materiału klinicznego. Biorąc to
pod uwagę podjęto dalsze badania mające na celu dokładne scharakteryzowanie otrzymanych
izolatów, a ich wyniki przedstawiono w publikacji nr 1. Oznaczenia wykonano dla 25
wybranych izolatów T. pyogenes z różnego typu zakażeń od żubrów obu płci. Wstępnej
identyfikacji gatunku dokonano na podstawie właściwości fenotypowych, tj. cechy wzrostu
na podłożu z krwią, morfologia komórek, typowa aktywność biochemiczna, w tym ujemny
wynik
testu
na
katalazę.
Następnie
potwierdzono
wstępne
rozpoznanie
poprzez
zsekwencjonowanie genu 16S rRNA (4 sekwencje zostały zdeponowane w bazie NCBI
GenBank) oraz wykonanie analizy filogenetycznej, która wykazała 100% podobieństwo
otrzymanych sekwencji do sekwencji referencyjnego szczepu T. pyogenes ATCC 19411, a
także bliskie pokrewieństwo do gatunków T. abortisuis i T. bernardiae, wynoszące 98 i 96%,
odpowiednio. Fenotyp badanych szczepów był zgodny z opisanym dla gatunku przez Yassin i
wsp. (2011), z wyjątkiem aktywności hemolitycznej ocenianej w teście CAMP. Według opisu
szczepu standardowego wynik testu CAMP w przypadku T. pyogenes powinien być ujemny,
natomiast w naszych badaniach szczepy powodowały w różnym stopniu nasilenie hemolizy
Staphylococcus aureus, w tym wiele z nich bardzo mocne. Podobne wyniki dla T.pyogenes
uzyskali również Ülbegi-Mohyla i wsp. (2009). Porównując profile właściwości
biochemicznych izolatów od żubrów z dostępnymi danymi dla izolatów od innych zwierząt,
w tym od bydła, nie zaobserwowano znaczących różnic. Kolejnym etapem badań było
określenie genotypów zjadliwości izolatów od żubrów. W tym celu techniką PCR
sprawdzono obecność w genomie izolatów siedmiu genów związanych ze zjadliwością T.
pyogenes. U wszystkich szczepów wykryto gen piolizyny (plo), białka uważanego za
najważniejszy czynnik chorobotwórczości T. pyogenes, które jest odpowiedzialne za lizę
erytrocytów i aktywnością przypomina cytolizyny wytwarzane przez inne bakterie
gramdodatnie. Z dotychczasowych danych literaturowych wynika, że gen ten występuje we
wszystkich szczepach tego gatunku. Genem, którego obecność stwierdzono również we
wszystkich izolatach od żubrów był gen fimA, kodujący fimbrialną podjednostkę typu A.
Pozostałe z badanych genów (fimC i fimG – geny podjednostek fimbrii typu C i G, nanH i
nanP – geny neuraminidaz H i P, cbpA – gen białka A wiążącego kolagen) występowały z
różną częstością. Analiza statystyczna w tym badaniu nie wykazała istotnych statystycznie
zależności pomiędzy profilem genów zjadliwości (genotypem zjadliwości) a typem zmian
anatomopatologicznych, z których pochodził izolat.
-9-
Bakterie z gatunku T. pyogenes powodują zakażenia różnego typu, o różnej
lokalizacji, a ich patogeneza nie jest dobrze poznana. Tak jak większość patogennych
aktinomycetów T. pyogenes ma zdolność przeżywania w makrofagach, chociaż w
dotychczasowych, nielicznych badaniach nie zaobserwowano namnażania się bakterii w ich
wnętrzu (Jost i Billington, 2005). Nie wiadomo też, jakie czynniki, środowiskowe lub
bakteryjne, są determinantami decydującymi o powstaniu zakażenia i jego przebiegu. W kilku
wcześniejszych pracach nad izolatami z przypadków zapalenia macicy u bydła (Silva i wsp.,
2008; Santos i wsp., 2010)
poświęcono uwagę tym zagadnieniom, lecz nie uzyskano
rozstrzygającej odpowiedzi. Podjęłam więc dalsze badania w celu ustalenia zależności między
występowaniem genów zjadliwości a typem zakażenia, przeprowadzone na większej puli
szczepów T. pyogenes, wyizolowanych od różnych zwierząt gospodarskich. Zbadano
obecność w genomie tych samych siedmiu genów związanych ze zjadliwością T. pyogenes,
które były wcześniej wykrywane u izolatów od żubrów (publikacja nr 1). Badania te i ich
wyniki zostały przedstawione w publikacji nr 5. W pracy tej przeanalizowano dane dla 97
szczepów T. pyogenes o różnym pochodzeniu (od bydła, świń, kóz, owiec i antylopy) oraz te
uzyskane wcześniej dla 25 szczepów od żubrów. Analiza statystyczna otrzymanych wyników
pokazała, że trzy geny, nanH, nanP oraz fimG, występowały znacznie rzadziej w szczepach
pochodzących od żubrów niż w wyizolowanych od innych zwierząt. Jednak na podstawie
tych wyników trudno jest jednoznacznie stwierdzić, że izolaty od żubrów są mniej zjadliwe,
ponieważ wszystkie one były wyizolowane z tkanek zmienionych chorobowo. Być może
inne, nie poznane jeszcze mechanizmy chorobotwórczości bakterii biorą udział w rozwoju
tych zakażeń. Ta sugestia jest tym bardziej uzasadniona, iż porównanie obecności
poszczególnych genów zjadliwości z typem zakażenia, z którego pochodził izolat
(analizowano izolaty z: ropni, zapalenia płuc, zapalenia gruczołu mlekowego i zapalenia
macicy, oraz nekrotycznego zapalenia napletka), ponownie nie wykazało statystycznie
istotnej zależności.
W tej sytuacji wydało się koniecznym przeprowadzenie różnicowania genomów
izolatów T. pyogenes o różnym pochodzeniu, aby ocenić dokładnie ich podobieństwo
genetyczne. Do tego celu wybrano analizę restrykcyjną z zastosowaniem elektroforezy
pulsowej (ang. pulse field gel electroforesis; PFGE), metodę uznaną za tzw. „złoty standard”
w różnicowaniu DNA genomowego, która jednak nigdy wcześniej nie była stosowana do
badania T. pyogenes (brak danych literaturowych). Niestety próby uzyskania czytelnych
wyników analizy nie powiodły się (dane nie opublikowane). Badania te są jednak
kontynuowane, przy użyciu metod, które z powodzeniem były wykorzystane do różnicowania
- 10 -
innych aktinomycetów m. in. Corynebacterium pseudotuberculosis czy Rhodococcus equi
(zał. 3, II.D.1.19; publikacja nr 3).
Charakteryzując szczepy bakterii chorobotwórczych nie można pominąć zbadania ich
lekowrażliwości, dlatego wykonano także to oznaczenie dla izolatów T. pyogenes od żubrów i
zwierząt gospodarskich (publikacja nr 5). Oznaczono minimalne stężenie hamujące (MIC)
12 antybiotyków i kierując się aktualnymi wytycznymi Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI), określającymi „MIC breakpoints”, sklasyfikowano szczepy jako oporne lub
wrażliwe. Tak jak oczekiwano, izolaty od żubrów okazały się mniej oporne niż izolaty od
zwierząt gospodarskich, zwłaszcza bydlęce i świńskie (różnica była istotna statystycznie).
Należy to tłumaczyć brakiem presji antybiotykowej, jako że u tych wolno żyjących zwierząt
antybiotykoterapia nigdy nie była stosowana. Ogromne znaczenie jakie ma kontakt bakterii z
antybiotykami na selekcję szczepów opornych, widać na przykładzie izolatów T. pyogenes od
jeleniowatych trzymanych w niewoli, poddawanych antybiotykoterapii (Tell i wsp., 2011;
Zhao i wsp., 2011), w przypadku których często notowano wielolekooporność.
W omawianych badaniach zanotowaliśmy wysoki odsetek szczepów opornych na
tetracyklinę oraz, co było zaskakujące, na fluorochinolony. Wysoka oporność T. pyogenes,
zwłaszcza szczepów bydlęcych, na tetracyklinę była obserwowana również przez innych
badaczy. Co ciekawe okazało się, że 24% izolatów od żubrów też cechuje oporność na
tetracyklinę. Według obecnej wiedzy oporność na tetracyklinę jest uwarunkowana obecnością
genu tet(W), który zlokalizowany na transpozonach może łatwo rozprzestrzeniać się wśród
bakterii (Billington i Jost, 2006). Można więc przyjąć, iż u żubrów występują szczepy T.
pyogenes będące rezerwuarem genu oporności na tetracyklinę. Natomiast zastanawiająca jest
stosunkowo wysoka oporność badanych izolatów, w tym również tych od żubrów, na
enrofloksacynę
i
ciprofloksacynę.
Dotychczas
szczepy
T.
pyogenes
oporne
na
fluorochinolony opisywane były rzadko. Nie znany jest też mechanizm oporności na te
antybiotyki u tych bakterii. Oprócz tetracyklin, fluorochinolonów i beta-laktamów (wszystkie
badane izolaty były na nie wrażliwe) w leczeniu zakażeń wywołanych przez T. pyogenes
powszechnie stosowane są także makrolidy. Oporność na nie oraz klindamycynę zanotowano
przede wszystkim u szczepów świńskich wyizolowanych z przypadków zapalenia płuc.
Jak wynika z przeprowadzonych badań szczepy T. pyogenes występujące u żubrów nie
różnią się w znacznym stopniu właściwościami związanymi z chorobotwórczością od
szczepów powodujących zakażenia u zwierząt gospodarskich (publikacje nr 1 i 5). Należy
brać to pod uwagę w kontekście możliwego kontaktu żubrów ze zwierzętami gospodarskimi,
a szczególnie bydłem. Populacja żubrów w Polsce powiększa się (Olech i Perzanowski, 2014)
- 11 -
i coraz częściej zdarzają się przypadki wychodzenia ich z obszaru leśnego na pola i łąki, w
tym pastwiska, na których wypasane jest bydło. Stwarzać to może zagrożenie przenoszenia
patogenów, takich jak T. pyogenes z żubrów na bydło i w odwrotną stronę. Aczkolwiek,
niewiele wiadomo na temat szerzenia się zakażeń T. pyogenes. Według aktualnej wiedzy do
zakażeń dochodzić może na drodze endogennej, jako że bakterie te są elementem normalnej
bioty skóry i błon śluzowych, lub za pośrednictwem much, co stwierdzono w przypadku
„letniego” zapalenia gruczołu mlekowego. Brak jest natomiast doniesień o wyizolowaniu
szczepów T. pyogenes ze środowiska, nie są też dotąd znane szczepy opisane jako
niepatogenne, środowiskowe, tak jak to ma miejsce w przypadku R. equi. Wydaje się więc, że
głównym rezerwuarem tych bakterii są zwierzęta. Trudno jest określić drogi zakażenia T.
pyogenes u żubrów. W trakcie wieloletnich badań odnotowałam sporadyczne przypadki
izolacji tych bakterii z nie zmienionej chorobowo błony śluzowej, głównie układu moczowopłciowego oraz ze skóry (dane nie opublikowane). W nielicznych przypadkach można było
przypuszczać, że do zakażenia dochodziło po uszkodzeniu tkanki w skutek urazu
mechanicznego. Bierze się też pod uwagę możliwość wnikania bakterii w głębsze tkanki
przez mikrourazy spowodowane przez ektopasożyty takie jak kleszcze, które mogłyby być
jednocześnie wektorami T. pyogenes. Aby potwierdzić to przypuszczenie wykonałam badanie
kleszczy zebranych ze skóry żubrów na obecność materiału genetycznego T. pyogenes.
Wstępne wyniki tych oznaczeń, wskazujące na potencjalny udział kleszczy w przenoszeniu T.
pyogenes, zostały opublikowane w 2016 r. w materiałach z międzynarodowej konferencji
patologicznej w Helsinkach (zał. 3, II.A.2.4).
Badania mikrobiologiczne związane z monitoringiem zdrowia żubrów w Polsce
realizowane były jako część projektu „Ochrona in situ żubra w Polsce – część północnowschodnia” (zał. 3, II.I.1.8), którego kierownikiem była prof. dr hab. Wanda Olech-Piasecka
(Wydział Nauk o Zwierzętach SGGW). Natomiast dokładna charakterystyka izolatów T.
pyogenes wykonana była w ramach grantu NCN dotyczącego etiopatogenezy NZN u żubrów
w Puszczy Białowieskiej (zał. 3, II.I.1.9), którym kierował dr hab. Wojciech Bielecki
(Wydział Medycyny Weterynaryjnej SGGW).
Charakterystyka szczepów R. equi występujących u dzików (Sus scrofa),
jeleni (Cervus elaphus) i saren (Capreolus capreolus)
Rhodococcus equi (dawniej Corynebacterium equi) jest dobrze poznanym oportunistycznym
patogenem zwierząt. Bakteria ta występuje powszechnie w środowisku naturalnym, glebie,
wodzie i na roślinach. U zwierząt bytuje ona w przewodzie pokarmowym oraz na błonach
- 12 -
śluzowych, przede wszystkim układu oddechowego (Prescott, 1991). Bywa też izolowana z
węzłów chłonnych od zwierząt bez objawów chorobowych (zał. 3, II.A.1.24; VázquezBoland i wsp., 2013).
Najgroźniejsze zakażenia R. equi powoduje u koni. Choroba zwana rodokokozą,
objawiająca się ropnym zapaleniem płuc i węzłów chłonnych, niekiedy jelit, dotyka przede
wszystkim 1 – 6 miesięczne źrebięta, dla których może być śmiertelna (Grądzki i wsp., 2002;
zał. 3, II.D.1.4, 17 i 22). Rzadziej obserwuje się inne formy zakażenia R. equi, tj. septyczne
zapalenie stawów, zapalenie szpiku, zapalenie wsierdzia, zapalenie skóry, ropnie podskórne,
zapalenie naczyń chłonnych, zapalenie opłucnej, ropniaki macicy i in. Rhodococcus equi
może wywoływać ropno-ziarniniakowe zmiany w różnych tkankach także u innych gatunków
zwierząt. Bakteria izolowana jest stosunkowo często od świń z zapaleniem węzłów
chłonnych, a także od bydła, kóz, wielbłądowatych, niekiedy od psów i kotów (VázquezBoland i wsp., 2013). U ludzi zakażenia R. equi notowane są rzadko, występują głównie u
osób z obniżoną odpornością i mają prawdopodobnie charakter zoonotyczny (zał. 3,
II.D.1.26). Podejrzewa się, że źródłem chorobotwórczych dla człowieka szczepów R. equi
mogą być nie tylko zwierzęta i środowisko zanieczyszczone ich odchodami, szczególnie koni,
ale także surowe lub niedogotowane mięso (Ribeiro i wsp., 2011). Do zakażeń R. equi
dochodzi głównie drogą wziewną lub pokarmową.
Na temat zjadliwości R. equi i patogenezy wywoływanych przez ten drobnoustrój
zakażeń wiadomo znacznie więcej niż o patogenezie zakażeń T. pyogenes. W przypadku R.
equi wyróżnić można szczepy chorobotwórcze oraz środowiskowe, określane jako
niechorobotwórcze. Podział ten uwzględnia przede wszystkim obecność w komórkach
plazmidów związanych ze zjadliwością (ang. virulence-associated plasmids; pVAP).
Plazmidy te zawierają geny kodujące istotne determinanty chorobotwórczości, między innymi
odpowiedzialne za zdolność przeżywania i namnażania się R. equi w makrofagach czy
tworzenie
biofilmu.
Do
jednych
z
ważniejszych
czynników
zjadliwości
należą
powierzchniowe białka z rodziny Vap (ang. virulence-associated proteins), których geny vap
znajdują się na „wyspie patogenności” (ang. pathogenicity island; PAI) w plazmidach pVAP.
Szczepy R. equi wykazują pewien rodzaj tropizmu w stosunku do gospodarza, która to
właściwość uwarunkowana jest obecnością plazmidów pVAP o odmiennej strukturze
genetycznej vap PAI (Vázquez-Boland i wsp., 2013; Takai, 1997). Dotychczas poznano trzy
typy plazmidów pVAP różniące się składem genów vap: pVAPA (tzw. typ koński; zawiera
m.in. vapA), pVAPB (tzw. typ świński; zawiera m.in. vapB) oraz pVAPN (tzw. typ bydlęcy;
nie zawiera genów vapA i vapB). Jak wykazała analiza genetyczna izolatów R. equi od ludzi,
- 13 -
zakażenia wszystkimi trzema typami plazmidowymi mogą występować u człowieka, chociaż
najczęściej szczepami typu świńskiego oraz bez-plazmidowymi (Ocampo-Sosa i wsp., 2007).
Należy zaznaczyć, że plazmidy pVAP mogą przenosić się w procesie koniugacji ze szczepów
zjadliwych do niechorobotwórczych (bez-plazmidowych), co udowodniono doświadczalnie
(Tripathi i wsp., 2012). Zjawisko to powinno być brane pod uwagę w epidemiologii zakażeń
R. equi.
Rezerwuarem R. equi jest głównie gleba, szczególnie miejsca zanieczyszczone kałem
zwierząt roślinożernych, który zawiera substancje wzmagające wzrost tych bakterii. Jak już
wspomniano również zwierzęta, zarówno chore, jak i bez objawów klinicznych, mogą być
źródłem R. equi. Szczepy zjadliwe, zawierające plazmidy pVAP, izolowane są przede
wszystkim od zwierząt domowych i z ich otoczenia (Kalinowski i wsp., 2016). U zwierząt
dzikich zakażenia odnotowywane były najczęściej u dzików, zarówno wolno żyjących, jak i
trzymanych w niewoli. Poza tym stosunkowo nieliczne są opisy izolacji R. equi od innych
gatunków np. z kału antylop, jeleni i dzikich ptaków, z tkanek ze zmianami ropnymi od fok,
koala, krokodyli, alpak, lam czy bizonów. Szczepy wyizolowane z tych przypadków na ogół
nie zostały dokładnie scharakteryzowane, więc niewiele wiadomo o ich chorobotwórczości.
Początkowo moje badania nad R. equi związane były tylko z przypadkami rodokokozy
koni. Materiał kliniczny do badania pobierany był od zwierząt z objawami rodokokozy
(popłuczyny z tchawicy i oskrzeli, wymazy z nosa) lub padłych (wycinki płuc i węzłów
chłonnych ze zmianami ropnymi, ropnie wątroby, śledziony i in.), pochodzących z hodowli
koni w całej Polsce. W trakcie wieloletnich badań powstała kolekcja szczepów R. equi, które
następnie zostały poddane oznaczeniom genotypowym (zał. 3, II.A.2.3; zał. 3, II.D.1.4).
Równocześnie prowadzone były działania profilaktyczne mające na celu ograniczenie liczby
przypadków rodokokozy koni poprzez uodpornianie zwierząt za pomocą autoszczepionek
przygotowywanych dla poszczególnych stad. W innym doświadczeniu badany był poziom
przeciwciał przeciwko R. equi w surowicy i siarze koni po szczepieniu antygenem w postaci
lizatu komórek bakteryjnych (zał. 3, II.A.1.17). Wydaje się, że dzięki profilaktyce oraz
właściwemu leczeniu liczba przypadków rodokokozy, zwłaszcza tych o ciężkim przebiegu
zmniejszyła się (dane nie opublikowane), ale w niektórych stadninach problem endemicznych
zakażeń R. equi nadal jest aktualny.
O ile epidemiologia rodokokozy koni w Polsce została dosyć dobrze poznana, o tyle
brak było danych dotyczących rezerwuaru zjadliwych szczepów R. equi w środowisku
naturalnym, w tym występowania tych bakterii u zwierząt dzikich wolno żyjących. Dlatego
- 14 -
podjęto badania w tym kierunku i temu właśnie zagadnieniu poświęcone są prace będące
częścią omawianego osiągnięcia naukowego.
Badaniami objęto trzy gatunki zwierząt, dzik (Sus scrofa), sarna (Capreolus
capreolus) i jeleń szlachetny (Cervus elaphus), które wydawały się najbardziej
prawdopodobnymi nosicielami R. equi, a ponieważ są to zwierzęta łowne istniała możliwość
pobrania od nich materiału klinicznego. Do badań pobierano węzły chłonne podżuchwowe od
zwierząt odstrzelonych w trakcie polowań w różnych regionach Polski w okresie od 2009 do
2011 roku (publikacja nr 3). Materiał pochodził od zwierząt zakwalifikowanych do
konsumpcji przez ludzi, i tylko w 8.4% węzłów chłonnych od dzików stwierdzono zmiany
ropne. W sumie przebadano próbki od 452 dzików, 272 jeleni oraz 212 saren. Rhodococcus
equi wykryto w próbkach od 23 dzików, 2 jeleni i 2 saren, co stanowiło 5.1%, 0.7% i 0.9%
badanych zwierząt, odpowiednio. Wszystkie szczepy R. equi (w sumie 27) wyizolowano z
tkanek nie zmienionych chorobowo.
Do izolacji R. equi z węzłów chłonnych użyte zostało wybiórcze podłoże,
zmodyfikowane
przeze
mnie
tak,
aby
maksymalnie
ograniczało
wzrost
innych
drobnoustrojów, w tym grzybów pleśniowych, które były obecne w badanym materiale,
szczególnie licznie w próbkach od dzików (publikacja nr 2). Optymalne działanie wybiórcze
tego podłoża, zawierającego ceftazydym, nowobiocynę, cykloheksymid oraz teluryn potasu,
zostało wcześniej przetestowane doświadczalnie (dane nie opublikowane). Podłoże to było
przygotowywane na bazie pożywki Mueller-Hinton agar bez dodatku krwi, a wyrosłe na nim
kolonie R. equi były śluzowe, barwy szaro-mlecznej, o nieregularnych kształtach. Z kolonii o
tych cechach, uzyskanych z posiewów badanych próbek, wykonywano na podłożu nie
wybiórczym z krwią test CAMP z Staphylococcus aureus. Do dalszych analiz wybierano
izolaty, które w teście tym powodowały charakterystyczne nasilenie hemolizy gronkowca.
Następnie wykonywano dokładne badania aktywności biochemicznej izolatów, które
pozwoliły na identyfikację bakterii jedynie do rodzaju (publikacja nr 2). Po tym wstępnym
rozpoznaniu izolatów wykonano dla nich amplifikację i sekwencjonowanie genów 16S rRNA
oraz rpoB, w celu identyfikacji do gatunku (uzyskane sekwencje zostały zdeponowane w
bazie NCBI GenBank). W analizie tej wszystkie izolaty wykazały 100% podobieństwa
sekwencji 16S rRNA oraz mniejsze podobieństwo sekwencji genu rpoB do sekwencji tych
genów w referencyjnym szczepie R. equi. Dodatkowo zastosowano także technikę MALDITOF MS, która umożliwia właściwą identyfikację drobnoustrojów na podstawie widm
masowych białek. W trakcie tego oznaczenia okazało się, że sposób przygotowania próbek do
spektrometrii masowej ma duże znaczenie jeśli chodzi o prawidłową identyfikację R. equi,
- 15 -
ponieważ lepsze efekty uzyskano stosując metodę ekstrakcji niż tzw. bezpośrednią.
Ostatecznie potwierdzono przynależność do gatunku R. equi 23 izolatów od dzików, 2 od
jeleni i 2 od saren.
Pomimo, że gatunek R. equi w rutynowych badaniach rozpoznawany jest tylko na
podstawie cech fenotypowych tj. cechy wzrostu, morfologia komórek i dodatni wynik testu
CAMP, podjęto tak szczegółowe badania, aby uniknąć błędnej identyfikacji izolatów. Znane
są bowiem bakterie, np. Dietzia spp., które mają cechy fenotypowe na tyle podobne do R.
equi, że może dojść do nieprawidłowego ich rozpoznania (Pilares i wsp., 2010; Niwa i wsp.,
2012). To właśnie dzięki wynikom analizy genetycznej i oznaczeniom MALDI-TOF MS
udało się uniknąć błędnej identyfikacji kilku szczepów wyizolowanych podczas omawianych
badań, a wstępnie rozpoznanych jako R. equi (dane nie opublikowane). Badania nad tymi
szczepami są nadal prowadzone, ale niestety dotychczas nie udało się ich sklasyfikować.
W publikacji nr 2 przedstawiono oprócz właściwości fenotypowych 27 szczepów R.
equi również ich cechy genotypowe związane ze zjadliwością. Techniką PCR wykonano
badania na obecność w izolatach czterech genów: choE (chromosomalny gen oksydazy
cholesterolowej), traA (plazmidowy gen białka związanego z mechanizmem transferu
koniugacyjnego), vapA (plazmidowy gen białka A związanego ze zjadliwością), vapB
(plazmidowy gen białka B związanego ze zjadliwością). Oksydaza cholesterolowa występuje
we wszystkich szczepach R. equi i można kodujący ją gen traktować jako markerowy dla
gatunku, aczkolwiek należy pamiętać, że białko to może być wytwarzane również przez inne
rodokoki np. Rhodococcus ruber czy Rhodococcus erythropolis. Enzym ten uszkadza błonę
komórkową i jest jednym z czynników chorobotwórczości R. equi, chociaż nie jest uważany
za najistotniejszy (Pei i wsp., 2006). Gen choE został wykryty we wszystkich 27 izolatach, co
dodatkowo potwierdziło ich prawidłową identyfikację jako R. equi. Jak wcześniej
wspomniano, kluczowa dla zjadliwości szczepów jest obecność plazmidów pVAP. W celu
sprawdzenia czy izolat zawiera plazmidy wykonano amplifikację genu traA, który znajduje
się w plazmidach zjadliwości. Gen ten wykryto u 16 z 27 badanych izolatów, pochodzących
wyłącznie od dzików. Dalsze badanie wykazało, że wszystkie te „plazmidowe” izolaty
zawierają gen vapB, a zatem mają plazmidy pVAPB i należą do R. equi typu świńskiego.
Następnie przeprowadzono analizę restrykcyjną wyizolowanych plazmidów pVAPB i
ustalono ich typ według schematu Takai’ego (Takai i wsp., 1993; Takai i wsp., 2002).
Okazało się, że dominującym plazmidem był pVAPB typu 5, który stwierdzono u 14
szczepów z 16 zawierających plazmidy. Pozostałe dwa izolaty miały plazmidy pVAPB typu 7
- 16 -
pierwszy, i typu 11 drugi. U 7 izolatów od dzików oraz od jeleni i saren (po dwa izolaty) nie
stwierdzono obecności genu traA, i uznano je za niezjadliwe szczepy „bez plazmidowe”.
Uzyskane wyniki wskazują, że dziki z badanej populacji są rezerwuarem zjadliwych
szczepów R. equi typu świńskiego, które określane są również jako średnio-zjadliwe (ang.
intermediately virulent). Jak wynika z danych dotyczących występowania R. equi u świń w
Polsce, aż 98% izolatów stanowią szczepy vapB-dodatnie, z tego 87.9% zawiera plazmid
pVAPB typu 5 (zał. 3, II.A.1.24). Sugeruje to możliwość przenoszenia się szczepów R. equi
pomiędzy świniami a dzikami, zwłaszcza biorąc pod uwagę zwiększającą się w ostatnich
latach liczebność populacji tych ostatnich oraz coraz częstsze przypadki bytowania ich w
bliskim sąsiedztwie człowieka i zwierząt gospodarskich.
Kolejnym etapem badań było określenie stopnia pokrewieństwa szczepów R. equi
krążących w badanych populacjach dzików, jeleni i saren. W tym celu wykonano analizę
restrykcyjną z użyciem rzadko-tnącego enzymu VspI i zastosowaniem techniki PFGE. Wyniki
tej analizy w postaci dendrogramu przedstawiono w publikacji nr 3. Uwagę zwraca
stosunkowo bliskie pokrewieństwo niektórych izolatów. Okazało się, że wśród badanych
izolatów można wyróżnić cztery grupy tzw. PFGE-typy (szczepy o homologii powyżej 80%),
które oznaczono literami od A do D. Najliczniej reprezentowany był PFGE-typ A (11
izolatów), następnie B (3 izolaty), C i D (po 2 izolaty). Co ciekawe PFGE-typ A obejmował
izolaty od dzików oraz jeden izolat od jelenia. Dziewięć izolatów miało unikalny profil
PFGE, nie zaklasyfikowany do żadnego PFGE-typu. Niestety ze względu na niepełne dane o
miejscu pochodzenia zwierząt nie było możliwe oszacowanie podobieństwa szczepów w
zależności od regionu, z którego pochodziły. W dalszych badaniach natomiast planowane jest
genotypowanie techniką PFGE izolatów R. equi od świń, co umożliwi porównanie ich z
izolatami od dzikich zwierząt oraz ustalenie kierunku transmisji szczepów. Oznaczenia te
wydają się niezbędne z epidemiologicznego punktu widzenia, zwłaszcza w kontekście
potencjalnego zagrożenia jakie mogą stanowić dla zdrowia człowieka szczepy R. equi
występujące u zwierząt łownych, których mięso przeznaczane jest do konsumpcji.
Lekooporność R. equi staje się coraz poważniejszym problemem, zwłaszcza w
leczeniu rodokokozy koni. W ostatnich latach odnotowuje się wzrost oporności izolatów
końskich na antybiotyki najczęściej stosowane w zwalczaniu tej choroby, tj. makrolidy,
rifampicyna, fluorochinolony czy aminoglikozydy (zał.
3,
II.A.1.19). Oznaczenia
lekowrażliwości wykonane dla izolatów od dzików (te badania nie są włączone do prac
stanowiących osiągnięcie naukowe) pokazały, że są one bardziej wrażliwe (porównywano
wartości MIC50 i MIC90) na teracyklinę, klindamycynę i rifampicynę niż izolaty od zwierząt
- 17 -
gospodarskich (zał. 3, II.D.2.10). Jednocześnie izolaty te okazały się bardziej oporne na
cefalotynę i amoksycylinę z kwasem klawulanowym. Mechanizmy warunkujące oporność R.
equi na antybiotyki beta-laktamowe nie zostały w pełni poznane, ale wiadomo, że w
większości beta-laktamazy występujące u tych bakterii kodowane są przez geny
chromosomalne (Letek i wsp., 2010). Poza tym część izolatów od dzików cechowała się
wysokimi wartościami MIC także dla enrofloksacyny i erytromycyny, co sugeruje, że są one
rezerwuarem genów oporności na te antybiotyki.
Problemy diagnostyczne pojawiające się w niektórych przypadkach rodokokozy koni i
zakażeń R. equi u innych zwierząt, a także doświadczenia nabyte w trakcie omawianych
badań, związane z prawidłową identyfikacją bakterii, wskazały na celowość opracowania
metodyki, opartej na technikach molekularnych, umożliwiającej bezpośrednie wykrywanie
tego patogenu w różnego typu materiale klinicznym, bez względu na zjadliwość szczepu
uwarunkowaną obecnością plazmidów. Już wcześniej opisano kilka metod bazujących na
technice PCR, lecz były one przeznaczone głównie do diagnostyki rodokokozy koni i
ewaluowane dla szczepów R. equi typu końskiego, czyli zawierających plazmid pVAPA
niosący gen vapA (Halbert i wsp., 2005; Pusterla i wsp., 2007; Rodriguez-Lázaro i wsp.,
2006; Vivrette i wsp., 2000). Bardziej uniwersalna metoda, ewaluowana dla szerokiego
zakresu próbek klinicznych pochodzących od różnych gatunków zwierząt, w tym dzikich,
oraz dla szczepów o różnym genotypie zjadliwości została przedstawiona w publikacji nr 4.
Polega ona na wykrywaniu materiału genetycznego R. equi techniką real-time PCR
bezpośrednio w totalnym DNA wyizolowanym z materiału klinicznego. Metoda została
opracowana w oparciu o amplifikację genu choE, który jak wcześniej wspomniano występuje
we wszystkich szczepach R. equi. Swoistość zaprojektowanych starterów oraz sondy dla tego
genu testowano najpierw in silico, a następnie w reakcjach kontrolnych z różnymi szczepami
R. equi, w tym również nie zawierającymi plazmidów, oraz ze szczepami bakterii
pokrewnych i patogenów często izolowanych od zwierząt z zakażeń o charakterze ropnym.
Wynik reakcji, a zarazem swoistość amplikonu, odczytywany jest na podstawie pomiaru
fluorescencji sondy. Dla sprawdzenia efektywność izolacji materiału genetycznego z
badanych próbek oraz wykluczenia działania postronnych czynników hamujących reakcję
powinna być wykonywana tzw. kontrola wewnętrzna reakcji. W tym celu zaprojektowane
zostały dwie pary starterów oraz dwie sondy dla genów beta-2-mikroglobulin, końskiej oraz
świńskiej, należących do grupy tzw. „housekeeping genes”. Metoda została przetestowana na
różnym materiale klinicznym, a jednocześnie porównano jej skuteczność z wynikami
tradycyjnej metody hodowlanej, a także konwencjonalnej metody PCR, w której też
- 18 -
wykrywany był gen choE (Ladrón i wsp., 2003). Rezultat tego doświadczenia był
zadowalający, ponieważ przy zastosowaniu omawianej metody R. equi wykryto w 90%
badanych próbek, zaś w przypadku hodowli w 60%, a w PCR konwencjonalnym jedynie w
20% próbek. Opracowana metoda cechuje się wysoką czułością analityczną i wydaje się, że
będzie bardzo przydatna w diagnostyce zakażeń R. equi, zwłaszcza w przypadkach, gdy
badany materiał jest mocno zanieczyszczony postronnymi bakteriami lub wcześniej
zamrożony. Może ona mieć też zastosowanie w badaniu nosicielstwa tego patogenu w
różnych tkankach. Została już ona z powodzeniem wykorzystana przez nasz zespół do
wykrywania nosicielstwa R. equi w tkankach świń (dane nie opublikowane).
Badania przedstawione w publikacjach nr 2, 3 i 4 były wykonane w ramach grantu
NCN (zał. 3, II.I.1.6), którego kierownikiem był dr Lucjan Witkowski (Wydział Medycyny
Weterynaryjnej SGGW).
Podsumowanie
Badania przedstawione w omawianych publikacjach stanowiących osiągnięcie naukowe
dostarczyły istotnych danych dotyczących właściwości oraz występowania T. pyogenes i R.
equi u wybranych gatunków dzikich zwierząt w Polsce. Bakterie te, poza Corynebacterium
pseudotuberculosis i prątkami, są najważniejszymi aktinomycetami chorobotwórczymi dla
zwierząt. Obie wywołują zakażenia o charakterze ropnym, których patogeneza i
epidemiologia nie są w pełni poznane, szczególnie słabo w przypadku T. pyogenes.
Przewlekłe zakażenia wywoływane przez T. pyogenes, wyniszczające zwierzęta i
uniemożliwiające w niektórych przypadkach ich reprodukcję, stanowią duże zagrożenie dla
ich populacji. Omawiane badania są pierwszymi poświęconymi charakterystyce szczepów
tego patogenu wyizolowanych od żubrów, gatunku będącego pod ścisłą ochroną i wpisanego
do tzw. czerwonej Księgi Gatunków Zagrożonych (the Red List of Threatened Species of the
International Union for Conservation of Nature). Wyniki przedstawione w publikacjach nr 1
i 5 wskazują, że szczepy T. pyogenes wywołujące zakażenia u żubrów mają genotypy
zjadliwości różniące się w niewielkim stopniu od stwierdzanych w szczepach izolowanych od
zwierząt gospodarskich, natomiast cechują się niższą lekoopornością. Celowym wydaje się
kontynuowanie badań, skoncentrowanych przede wszystkim na dokładnym poznaniu
epidemiologii zakażeń T. pyogenes, których wyniki mogłyby pomóc ograniczyć problemy
zdrowotne żubrów powodowane przez ten patogen.
Badania opisane w publikacjach nr 2 i 3 wykazały, że procent nosicielstwa R. equi w
węzłach chłonnych podżuchwowych u badanych gatunków zwierząt jest nieznaczny, chociaż
- 19 -
szczepy wykryte u dzików należały do R. equi typu świńskiego, określanego jako średniozjadliwy. Z uwagi na sposób pobierania pokarmu przez dziki najbardziej prawdopodobnym
źródłem tych bakterii jest gleba, chociaż nie ma dotychczas danych potwierdzających ich
występowanie w środowisku bytowania tych zwierząt. U jeleniowatych stwierdzono jedynie
szczepy R. equi nie zawierające plazmidów uważane za niechorobotwórcze, które jednak
mogłyby stać się zjadliwe po uzyskaniu plazmidu. Określenie kierunków przenoszenia się R.
equi wymaga dalszych badań, w których pomocna może być przedstawiona w publikacji nr
4 metoda wykrywania tych bakterii.
Podsumowując, szczepy T. pyogenes i R. equi występujące u badanych gatunków
dzikich zwierząt są potencjalnie chorobotwórcze dla zwierząt gospodarskich.
Wnioski
Wyniki badań przedstawionych w pracach stanowiących omawiane osiągnięcie naukowe
pozwalają na wyciągnięcie następujących wniosków:
1. Żubry w badanej populacji są rezerwuarem szczepów T. pyogenes potencjalnie
chorobotwórczych dla zwierząt gospodarskich.
2. Żaden z badanych czynników zjadliwości T. pyogenes nie wydaje się mieć
kluczowego znaczenia dla rozwoju określonego typu zakażenia. Zapewne inne, nie
poznane dotąd determinanty mają ważny wpływ na przebieg zakażeń tym patogenem.
3. Konieczne jest ustalenie pokrewieństwa szczepów T. pyogenes pochodzących od
różnych gospodarzy, co powinno być pomocne w dalszym wyjaśnianiu mechanizmów
chorobotwórczości tych bakterii oraz w określeniu kierunków ich rozprzestrzeniania
się w środowisku.
4. Dziki, jelenie i sarny w badanych populacjach stanowią rezerwuar szczepów R. equi
potencjalnie groźnych dla zdrowia zwierząt gospodarskich, a także ludzi.
5. Konieczne są dalsze badania epidemiologiczne, w tym obejmujące także materiał
środowiskowy, w celu ustalenia źródła szczepów R. equi typu świńskiego
występujących u dzików.
6. W badaniu nosicielstwa, ale także zakażeń R. equi należy brać pod uwagę szczepy o
różnych profilach plazmidowych oraz nie zawierające plazmidów. Do wykrywania
różnego typu szczepów R. equi w materiale klinicznym przydatna jest omawiana
metoda real-time PCR, jako dodatkowe narzędzie diagnostyczne.
- 20 -
Przedstawione wyniki badań i płynące z nich wnioski dostarczyły nowych danych
uzupełniających dotychczasową wiedzę o epidemiologii zakażeń T. pyogenes i R. equi.
Piśmiennictwo
Billington S.J., Jost B.H. 2006. Multiple genetic elements carry the tetracycline resistance gene tet(W)
in the animal pathogen Arcanobacterium pyogenes. Antimicrob. Agents Chemother. 50: 35803587.
Grądzki Z., Ziętek A., Boguta L., Winiarczyk S., Wołoszyn S. 2002. Rodokokoza źrebiąt. Medycyna
Wet. 58(12): 915-920.
Halbert N. D., Reitzel R. A., Martens R. J., Cohen N. D. 2005. Evaluation of a multiplex polymerase
chain reaction assay for simultaneous detection of Rhodococcus equi and the vapA gene. Am.
J. Vet. Res. 66: 1380-1385.
Jost B.H., Billington S.J. 2005. Arcanobacterium pyogenes: molecular pathogenesis of an animal
opportunist. Antonie Van Leeuwenhoek 88: 87-102.
Kalinowski M., Grądzki Z., Jarosz Ł., Kato K., Hieda Y., Kakuda T., Takai S. 2016. Plasmid profiles
of virulent Rhodococcus equi strains isolated from infected foals in Poland. PLoS One. 11(4):
e0152887.
Kowalski K., Szewczyk R., Druszyńska M. 2012. Kwasy mykolowe – potencjalne markery
diagnostyki oportunistycznych zakażeń mikroorganizmami z podrzędu Corynebacterineae.
Postępy Hig. Med. Dośw. 66: 461-468.
Ladrón N., Fernández M., Agüero J., González-Zörn B., Vázquez-Boland J. A., Navas J. 2003. Rapid
identification of Rhodococcus equi by a PCR assay targeting the choE gene. J. Clin.
Microbiol. 41: 3241–3245.
Letek M., González P., Macarthur I., Rodríguez H., Freeman T.C., Valero-Rello A., Blanco M.,
Buckley T., Cherevach I., Fahey R., Hapeshi A., Holdstock J., Leadon D., Navas J., Ocampo
A., Quail M.A., Sanders M., Scortti M.M., Prescott J.F., Fogarty U., Meijer W.G., Parkhill J.,
Bentley S.D., Vázquez-Boland J.A. 2010. The genome of a pathogenic rhodococcus: cooptive
virulence underpinned by key gene acquisitions. PLoS Genet. 6(9): e1001145.
Niwa H., Lasker B. A., Hinrikson H. P., Franzen C. G., Steigerwalt A. G., Whitney A. M., Brown J.
M. 2012. Characterization of human clinical isolates of Dietzia species previously
misidentified as Rhodococcus equi. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31: 811-820.
Ocampo-Sosa A.A., Lewis D.A., Navas J., Quigley F., Callejo R., Scortti M., Leadon D.P., Fogarty
U., Vázquez-Boland J.A. 2007. Molecular epidemiology of Rhodococcus equi based on traA,
vapA and vapB virulence plasmid markers. J. Infect. Dis. 196: 763–769.
Olech W., Perzanowski K. Podręcznik najlepszych praktyk ochrony żubra. wyd. Centrum Koordynacji
Projektów Środowiskowych, 2014, Warszawa.
Pei Y., Dupont C., Sydor T., Haas A., Prescott J.F. 2006. Cholesterol oxidase (ChoE) is not important
in the virulence of Rhodococcus equi. Vet. Microbiol. 118: 240-246.
Pilares L., Agüero J., Vázquez-Boland J. A., Martínez-Martínez L., Navas J. 2010. Identification of
atypical Rhodococcus-like clinical isolates as Dietzia spp. by 16S rRNA gene sequencing. J.
Clin. Microbiol. 48: 1904–1907.
Prescott J.F. 1991. Rhodococcus equi : an animal and human pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 4: 20–
34.
Pusterla N., Wilson W. D., Mapes S., Leutenegger C. M. 2007. Diagnostic evaluation of real-time
PCR in the detection of Rhodococcus equi in faeces, nasopharyngeal swabs from foals with
pneumonia. Vet. Rec. 161: 272-275.
Ribeiro M.G., Takai S., Guazzelli A., Lara G.H., da Silva A.V., Fernandes M.C., Condas L.A.,
Siqueira A.K., Salerno T. 2011. Virulence genes and plasmid profiles in Rhodococcus equi
isolates from domestic pigs and wild boars (Sus scrofa) in Brazil. Res. Vet. Sci. 91: 478–481.
Rodríguez–Lázaro D., Lewis D. A., Ocampo-Sosa A. A., Fogarty U., Makrai L., Navas J., Scortti M.,
Hernández M., Vázquez-Boland J. A. 2006. Internally controlled real-time PCR method for
- 21 -
quantitative species-specific detection and vapA genotyping of Rhodococcus equi. Appl.
Environ. Microbiol. 72: 4256-4263.
Rowlinson M. C., Bruckner D. A., Hinnebusch C., Nielsen K., Deville J. G. 2006. Clearance of
Cellulosimicrobium cellulans Bacteriemia in a Child without Central Venous Catheter
Removal. J. Clin. Microbiol. 44: 2650-2654.
Santos T.M., Caixeta L.S., Machado V.S., Rauf A.K., Gilbert R.O., Bicalho R.C. 2010. Antimicrobial
resistance and presence of virulence factor genes in Arcanobacterium pyogenes isolated from
the uterus of postpartum dairy cows. Vet. Microbiol. 145: 84-89.
Silva E., Gaivão M., Leitão S., Jost B.H., Carneiro C., Vilela C.L., Lopes da Costa L., Mateus L. 2008.
Genomic characterization of Arcanobacterium pyogenes isolates recovered from the uterus of
dairy cows with normal puerperium or clinical metritis. Vet. Microbiol. 132: 111-118.
Sullivan D.C., Chapman S.W. 2010. Bacteria that masquerade as fungi: actinomycosis/nocardia. Proc.
Am. Thorac. Soc. 7(3): 216-221.
Takai S., Watanabe Y., Ikeda T., Tsubaki S., Ozawa T., Matsukura S., Tamada Y., Sekizaki T. 1993.
Virulence-associated plasmids in Rhodococcus equi. J. Clin. Microbiol. 31: 1726–1729.
Takai S., Tharavichitkul P., Sasaki C., Onishi Y., Yamano S., Kakuda T., Tsubaki S., Trinarong C.,
Rojanasthien S., Sirimalaisuwan A., Tesaprateep T., Maneekarn N., Sirisanthana T., Kirikae
T. 2002. Identification of virulence-associated antigens and plasmids in Rhodococcus equi
from patients with acquired immune deficiency syndrome and prevalence of virulent R. equi in
soil collected from domestic animal farms in Chiang Mai, Thailand. Am. J. Trop. Med. Hyg.
66: 52–55.
Takai S. 1997. Epidemiology of Rhodococcus equi infections: a review. Vet. Microbiol. 56: 167-176.
Tell L.A., Brooks J.W., Lintner V., Matthews T., Kariyawasam S. 2011. Antimicrobial susceptibility
of Arcanobacterium pyogenes isolated from the lungs of white-tailed deer (Odocoileus
virginianus) with pneumonia. J. Vet. Diagn. Invest. 23: 1009-1013.
Tripathi V.N., Harding W.C., Willingham-Lane J.M., Hondalus M.K. 2012. Conjugal transfer of a
virulence plasmid in the opportunistic intracellular actinomycete Rhodococcus equi. J.
Bacteriol. 194: 6790–6801.
Ülbegi-Mohyla H., Hassan A.A., Kanbar T., Alber J., Lämmler C., Prenger-Berninghoff E., Weiss R.,
Siebert U., Zschöck M. 2009. Synergistic and antagonistic hemolytic activities of bacteria of
genus Arcanobacterium and CAMP-like hemolysis of Arcanobacterium phocae and
Arcanobacterium haemolyticum with Psychrobacter phenylpyruvicus. Res. Vet. Sci. 87: 186188.
Vázquez-Boland J. A., Giguère S., Hapeshi A., MacArthur I., Anastasi E., Valero-Rello A. 2013.
Rhodococcus equi: The many facets of a pathogenic actinomycete. Vet. Microbiol. 167: 9–33.
Vivrette S. L., Sellon D. C., Gibbons D. S. 2000. Clinical application of a polymerase chain reaction
assay in the diagnosis of pneumonia caused by Rhodococcus equi in a horse. J. Am. Vet. Med.
Assoc. 217: 1348-1350.
Yassin A.F., Hupfer H., Siering C., Schumann P. 2011. Comparative chemotaxonomic and
phylogenetic studies on the genus Arcanobacterium Collins et al. 1982 emend. Lehnen et al.
2006: proposal for Trueperella gen. nov. and emended description of the genus
Arcanobacterium. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61: 1265-1274.
Zhao K.L., Liu Y., Zhang X.Y., Palahati P., Wang H.N., Yue B.S. 2011. Detection and
characterization of antibiotic resistance genes in Arcanobacterium pyogenes strains from
abscesses of forest musk deer. J. Med. Microbiol. 60: 1820-182.
5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych.
Studia na Wydziale Biologii Uniwersytetu Warszawskiego ukończyłam w 1990 roku obroną
pracy magisterskiej dotyczącej analizy właściwości restrykcyjnych szczepów Escherichia coli
- 22 -
zawierających sklonowane bakteryjne geny metylotransferaz DNA, której promotorem był
prof. dr hab. Andrzej Piekarowicz. W tym samym roku zostałam zatrudniona na stanowisku
asystenta dydaktyczno-naukowego w Zakładzie Bakteriologii Katedry Mikrobiologii (obecna
nazwa Zakład Mikrobiologii Katedry Nauk Przedklinicznych) Wydziału Medycyny
Weterynaryjnej (WMW) SGGW. Od początku pracy na Wydziale Medycyny Weterynaryjnej
moje zainteresowania naukowe były skoncentrowane na szeroko pojętej bakteriologicznej
diagnostyce zakażeń u zwierząt. Szczególnie ważne są dla mnie zagadnienia związane z
rozwojem i stosowaniem nowoczesnych technik diagnostycznych, które staram się wedle
możliwości wprowadzać do Mikrobiologicznego Laboratorium Diagnostycznego działającego
w Katedrze Nauk Przedklinicznych. Drugim istotnym problemem, któremu poświęcam wiele
uwagi jest oporność drobnoustrojów na chemioterapeutyki oraz inne czynniki. Od wielu lat
uczestniczę czynnie lub biernie w sympozjach, konferencjach oraz szkoleniach dotyczących
tej tematyki. Moje badania naukowe obejmujące liczne gatunki bakterii, związane są nie tylko
z ich lekoopornością, ale także zjadliwością oraz patogenezą i epidemiologią wywoływanych
przez nie zakażeń. Badania te prowadzę od lat w ścisłej współpracy z klinicystami z Wydziału
Medycyny Weterynaryjnej SGGW zajmującymi się chorobami zakaźnymi i wewnętrznymi
zwierząt różnych gatunków. Doświadczenie naukowe nabyte w trakcie pracy badawczej i
diagnostycznej jest mi niezwykle przydatne w prowadzeniu zajęć dydaktycznych z zakresu
mikrobiologii weterynaryjnej dla studentów Wydziału Medycyny Weterynaryjnej, Wydziału
Nauk o Zwierzętach oraz Wydziału Rolnictwa i Biologii, SGGW.
a) Dorobek naukowy przed uzyskaniem stopnia doktora nauk weterynaryjnych
Praca badawcza, którą zajmowałam się przed uzyskaniem stopnia doktora nauk
weterynaryjnych, dotyczyła przede wszystkim chorobotwórczych bakterii beztlenowych
występujących w przewodzie pokarmowym zwierząt, głównie świń oraz psów. Badania o tej
tematyce były jednymi z wiodących, które były realizowane przez zespół ówczesnego
Zakładu Bakteriologii kierowanego przez prof. dra hab. Zbigniewa Szynkiewicza.
Początkowo, przez krótki okres, badałam właściwości szczepów Bacteroides vulgatus
wyizolowanych z przewodu pokarmowego świń. Następnie moja praca naukowa
skoncentrowała się na zagadnieniach związanych z chorobotwórczymi krętkami z rodzaju
Brachyspira, przede wszystkim z gatunku Brachyspira hyodysenteriae (dawniej Serpulina
hyodysenteriae, a wcześniej Treponema hyodysenteriae). Pionierami badań nad tymi
drobnoustrojami byli prof. dr hab. Zbigniew Szynkiewicz, prof. dr hab. Marian Binek oraz dr
- 23 -
hab. Danuta Klimuszko, prof. nadzw. SGGW (WMW SGGW), i to pod ich opieką naukową
prowadziłam doświadczenia.
Do rodzaju Brachyspira należą ściśle beztlenowe bakterie spiralne bytujące w
przewodzie pokarmowym zwierząt i ludzi. Obecność krętków w przewodzie pokarmowym
została mikroskopowo stwierdzona na długo przed opracowaniem skutecznych metod ich
namnażania in vitro. Przez lata wyizolowano szereg szczepów krętków stosując metody
opracowane do hodowli B. hyodysenteriae. Wiele izolatów różniło się jednak fenotypowo od
B. hyodysenteriae i z czasem wyodrębniono spośród nich nowe gatunki. Do najważniejszych
z nich należą: B. innocens, B. pilosicoli, B. intermedia, B. murdochii, B. aalborgi i B.
alvinipulli. Niektóre gatunki wywołują groźne choroby zwierząt takie, jak dyzenteria świń,
biegunka krętkowa czy ptasia spirochetoza jelitowa. Obserwowana duża heterogenność
wyizolowanych szczepów Brachyspira utrudniała ich identyfikację na podstawie cech
fenotypowych, dlatego techniki stosowane w rutynowej diagnostyce laboratoryjnej były w
tym przypadku mało skuteczne. Dopiero wprowadzenie do badań technik molekularnych i
histochemicznych umożliwiło wykrycie i dokładne oznaczenie właściwości tych bakterii.
Badania nad krętkami Brachyspira, w których uczestniczyłam obejmowały nie tylko
charakterystykę fenotypową tych bakterii, ale również ich właściwości genotypowe. Wyniki
tych badań zostały przedstawione w artykule:

Binek M., Szynkiewicz Z., Spohr de Faundez I., Wójcik U., Klimuszko D., Rzewuska M. 1995. The
cytotoxic properties of Serpulina hyodysenteriae. Acta Microbiol. Polonica, 44 (1), 63-68.
oraz w publikacjach konferencyjnych (zał. 4, B.2, 3, 6, 9, 12, 14, 19 i 20).
Charakterystyka izolatów B. hyodysenteria była również tematem mojej pracy
doktorskiej, której promotorem była dr hab. Danuta Klimuszko, prof. nadzw. SGGW (tytuł
pracy: „Różnicowanie szczepów Serpulina sp. izolowanych od świń na podstawie cech
fenotypowych i genotypowych”; obrona w 1999 roku). Celem tej pracy było porównanie
skuteczności metod fenotypowego i genotypowego różnicowania szczepów Brachyspira
(Serpulina) spp. wyizolowanych od świń w Polsce. Badania cech genotypowych
doprowadziły do wykrycia, metodą PCR i hybrydyzacji, w genomach wyizolowanych
szczepów genów tlyA i cbII. Badane geny kodują dwa białka o aktywności hemolitycznej, z
których jedno, hemolizyna TlyA jest istotnym czynnikiem chorobotwórczości krętków
Brachyspira. Obecność genu tlyA wykazano tylko w szczepach patogennego gatunku
B.hyodysenteriae. Natomiast obecność genu cbII stwierdzono u 85% badanych szczepów.
Szczególnie interesujący był fakt, że gen ten znaleziono między innymi w szczepach
należących do gatunku B. innocens uważanego za niepatogenny. Uzyskane wyniki
- 24 -
świadczyły o istotnej roli hemolizyny CBII, jako potencjalnego czynnika związanego z
chorobotwórczością
krętków
Brachyspira.
Porównanie
metod
wykorzystanych
do
różnicowania wyizolowanych szczepów pozwoliło na stwierdzenie, że oznaczenie cech
fenotypowych jest niewystarczające, a dokładna identyfikacja krętków Brachyspira jest
możliwa dopiero na podstawie określenia ich właściwości genotypowych, które świadczą też
o patogenności szczepów.
Badania dotyczące krętków Brachyspira były realizowane w ramach grantu
kierowanego przez dr hab. Danutę Klimuszko prof. nadzw. SGGW, który dotyczył analizy
genotypowej krętków Brachyspira (zał. 3, II.I.1.1).
W tym okresie uczestniczyłam także w realizacji grantu dotyczącego zakażeń
przewodu pokarmowego wywoływanych przez Clostridium spp. u psów, którego
kierownikiem był dr Cezariusz Hułas z Katedry Epizootiologii WMW SGGW (zał. 3,
II.I.1.2). Bakterie należące do rodzaju Clostridium są składnikiem bioty przewodu
pokarmowego psów. Te z nich, które cechuje chorobotwórczość uwarunkowana
wytwarzaniem silnych egzotoksyn, wywołują toksykoinfekcje, enterotoksemie i toksemie. W
określonych warunkach środowiskowych Clostridium perfringens i Clostridium difficile
wytwarzają przetrwalniki, które po dostaniu się do organizmu per os mogą powodować
zakażenia o ciężkim przebiegu klinicznym, z krwawymi wymiotami, biegunkami,
intoksykacją i wstrząsem septycznym. Zdolność do wytwarzania enterotoksyny przez C.
perfringens nie jest zależna od serotypu, a nawet może się zdarzyć, że enterotoksyczne
szczepy obecne w jelitach psów należą do wielu serotypów. Moje badania polegały na izolacji
laseczek Clostridium z materiału klinicznego pobranego od psów, identyfikacji izolatów i
ocenie ich zjadliwości, głównie enterotoksyczności. Wyniki tych badań zostały opublikowane
w pracy:

Hułas C., Rzewuska M., Cianciara T., Dobrzyński A., Binek M. 1997. Udział bakterii beztlenowych w
zakażeniach przewodu pokarmowego psów. Izolacja laseczek z rodzaju Clostridium z przewodu
pokarmowego chorych psów.. Med. Wet., 53 (10 ), 600-602.
oraz w publikacjach konferencyjnych (zał. 4, B.4, 7 i 18).
Dodatkowe badania naukowe, w których brałam udział związane były z zakażeniami
pałeczkami Salmonella u drobiu. Ich wyniki zostały opublikowane w pracy:

Błaszczak B., Rzewuska M., Binek M. 1996. Częstość zakażeń i lekooporność pałeczek Salmonella. Med.
Wet.,52 (6), 392-395.
oraz w publikacjach konferencyjnych (zał. 4, B.5, 8 i 16).
- 25 -
Poza wymienionymi badaniami, w tym okresie zajmowałam się diagnostyką
laboratoryjną
różnych
zakażeń
u
zwierząt
prowadzoną
w
ramach
działalności
Mikrobiologicznego Laboratorium Diagnostycznego. Jeden z ciekawszych przypadków
zakażenia u drobiu mało znanym gatunkiem, Clostridium baratii, został opisany w publikacji:

Kosowska G., Borzemska W., Karpińska E., Binek M., Rzewuska M., Romanik A., Malicka E. 1999. Ostre
zachorowania piskląt na tle zakażenia Clostridium baratii. Medycyna Wet., 55 (2):111-113.
W omawianym okresie, w 1993 roku, odbyłam trzymiesięczny staż naukowy w
Laboratorium Mikrobiologii i Genetyki Molekularnej, Centre National de la Recherche
Scientifique przy Université Paul-Sabatier w Tuluzie, podczas którego brałam udział w
badaniach nad organizacją genomu Streptococcus pneumoniae prowadzonych przez profesora
Michel Sicard i dr Anne-Marie Gasc. W trakcie tego pobytu zyskałam cenną wiedzę i
doświadczenie dotyczące stosowania takich technik molekularnych, jak sekwencjonowanie i
hybrydyzacja kwasów nukleinowych, które okazały się bardzo przydatne w dalszych moich
badaniach oraz zajęciach dydaktycznych.
b) Dorobek naukowy po uzyskaniu stopnia doktora nauk weterynaryjnych
Po uzyskaniu stopnia doktora nauk weterynaryjnych, w roku 2000 zostałam zatrudniona na
etacie adiunkta. Od tej pory moja praca naukowa w Katedrze Nauk Przedklinicznych WMW
SGGW, kierowanej przez prof. dra hab. Marka Niemiałtowskiego, związana była z wieloma
aspektami bakteriologii weterynaryjnej, przy czym istotną jej część stanowiły badania
dotyczące bakterii należących do rzędu Actinomycetales. W wielu przypadkach była ona
prowadzona w ramach współpracy krajowej oraz międzynarodowej.
Główne kierunki badań prowadzonych przeze mnie po uzyskaniu stopnia doktora:
1) kontynuacja badań nad krętkami Brachyspira;
2) badania nad wybranymi bakteryjnymi patogenami ptaków;
3) charakterystyka patogenów wywołujących ropne zakażenia u małych przeżuwaczy;
4) znaczenie bakterii występujących w gruczole mlekowym i mleku przeżuwaczy;
5) badania etiologii ropnych zakażeń bakteryjnych u żubrów;
6) charakterystyka szczepów Treuperella pyogenes wyizolowanych od zwierząt;
7) badania dotyczące Rhodococcus equi i rodokokozy koni;
8) badania lekowrażliwości i zjadliwości izolatów Escherichia coli od psów i kotów;
9) charakterystyka fenotypowa i genotypowa gronkowców występujących u zwierząt;
10) diagnostyka zakażeń wywoływanych przez Mycobacterium spp. u psów i kotów;
- 26 -
11) badanie aktywności przeciwdrobnoustrojowej materiałów kompozytowych.
Krótki opis prac naukowych związanych z wymienionymi kierunkami badań:
Ad 1) Badania nad patogenezą zakażeń krętkami Brachyspira u świń były prowadzone w
ramach grantu KBN (zał. 3, II.I.1.3), którego kierownikiem był dr Tadeusz Jakubowski
(Katedra Chorób Dużych Zwierząt WMW SGGW). Były one kontynuacją wcześniejszych
naszych prac, obejmowały nie tylko ocenę właściwości izolatów Brachyspira, ale również
badanie
elementów
odpowiedzi
immunologicznej
na
zakażenie
tymi
bakteriami.
Występowanie Brachyspira spp. badałam także w kontekście mieszanych zakażeń z
Lawsonia intracellularis u świń. Zagadnienie to było badane w trakcie realizacji pracy
doktorskiej dr Joanny Pławińskiej-Czarnak poświęconej Lawsonia spp. Wyniki tych prac
zostały przedstawione w publikacji:

Pławińska J., Jakubowski T., Rzewuska M., Binek M. 2004. Occurrence of Lawsonia intracellularis and
Brachyspira spp. infection in swine suffering from diarrhoea. Pol. J. Vet. Sci. vol. 7, No. 3, 203 - 206.

Rzewuska M. 2007. Bakterie z rodzaju Brachyspira – ogólna charakterystyka, chorobotwórczość dla
zwierząt i człowieka. Monografia PTM „Świat człowieka światem drobnoustrojów” pod red W. Hryniewicz,
s. 121-128.
oraz w publikacjach konferencyjnych (zał. 4, B.15, 17, 21, 27 i 29).
Kolejne badania dotyczące krętków Brachyspira poświęcone były izolacji,
identyfikacji i charakterystyce szczepów występujących w przewodzie pokarmowym kur z
objawami spirochetozy jelitowej. Były to jedne z nielicznych wtedy prac na ten temat.
Okazało się, że otrzymane izolaty cechowały się dużym zróżnicowaniem badanych
właściwości, a części z nich nie udało się wówczas zidentyfikować do gatunku. Wyniki tych
badań opublikowano w pracach:

Kizerwetter-Świda M., Rzewuska M., Binek M. 2005. Characterization of Brachyspira sp. strains isolated
from flock of hens with diarrhoea. Bull. Vet. Inst. Pulawy 49, 169-173.

Kizerwetter-Świda M., Rzewuska M., Binek M. 2007. Krętki z rodzaju Brachyspira jako czynnik
etiologiczny spirochetozy jelitowej ptaków. Medycyna Wet. 63 (8), 883-886.
oraz w publikacji konferencyjnej (zał. 4, B.33).
Ad 2) Część moich prac badawczych poświęcona była patogenom ptaków dobrze znanym tj.
Salmonella spp. czy E. coli, oraz tym rzadziej opisywanym, jak Gallibacterium spp.,
Aeromonas spp. czy Erysipelothrix rhusiopathiae. Badania nad nimi prowadzone były we
współpracy z zespołem Zakładu Chorób Ptaków WMW SGGW kierowanym przez prof. dra
hab. Piotra Szeleszczuka. Izolaty Salmonella spp. i E. coli testowane były głównie pod
- 27 -
względem ich lekooporności, a także właściwości związanych ze zjadliwością. Wyniki, m. in.
te wskazujące na narastanie lekooporności tych bakterii, zostały przedstawione w
publikacjach:

Madajczak G., Klimuszko D., Rzewuska M., Błaszczak B., Fafiński Z., Binek M. 2003. Występowanie
zgrupowania spv na dużym plazmidzie zjadliwości u Salmonella Enteritidis izolowanych od drobiu.
Medycyna Wet., 59 (1): 44-46.

Binek M., Rzewuska M. 2006. Oporność na chemioterapeutyki bakterii izolowanych od drobiu a zdrowie
człowieka. Monografia „Terapia chorób drobiu u progu XXI wieku”, Magazyn Weterynaryjny, suplement –
Drób, Maj 2006, s. 12-14.

Rzewuska M., Szeleszczuk P., Kosowska G., Turkowska M. 2006. Fenotypowa charakterystyka szczepów
Escherichia coli izolowanych z przypadków cellulitis u kurcząt brojlerów. W monografii
”Aktualne
problemy w patologii drobiu” pod red. A. Wieliczko, Wrocław 2006, s. 54-57.
W
przypadku
innych
patogenów
ptaków,
badania
polegały
na
ustaleniu
etiopatogenezy zakażeń i charakterystyce izolatów. Wyniki potwierdziły oportunistyczny
charakter zakażeń wywoływanych przez Gallibacterium spp. i Erysipelothrix rhusiopathiae,
na rozwój których mają wpływ różne czynniki zewnętrzne powodujące spadek odporności
ptaków. Opisany przeze mnie przypadek zakażenia Gallibacterium spp. u pawi był
pierwszym związanym z tymi bakteriami u ptaków tego gatunku.
Badania dotyczące tych bakterii przedstawiono w pracach:

Żbikowski A., Szeleszczuk P., Karpińska E., Rzewuska M., Malicka E., Binek M. 2006. Zakażenie
Aeromonas hydrophila przyczyną padnięć dzikich kaczek. Medycyna Wet. 62 (6), 720-722.

Rzewuska M., Karpińska E., Szeleszczuk P., Binek M. 2007. Isolation of Gallibacterium spp. from
peacocks with respiratory tract infections. Medycyna Wet. 63 (11) supl., 1431-1433.

Rzewuska M., Żbikowski A., Sałamaszyńska-Guz A., Karpińska E., Szeleszczuk P., Binek M. 2010.
Właściwości fenotypowe szczepów włoskowca różycy wyizolowanych od gęsi. Monografia „Aktualne
problemy w patologii drobiu ze szczególnym uwzględnieniem embriologii i okresu okołolęgowego” pod
red. prof. A. Wieliczko, Wrocław 2010, s. 173-178.

Żbikowski A., Karpińska E., Rzewuska M., Szeleszczuk P. 2011. Różyca u drobiu. Życie Weterynaryjne 86
(5), 357-360.

Ledwoń A., Szeleszczuk P., Sapierzyński R., Rzewuska M. 2011. Trichomoniasis, psittacine circovirosis
and clostridial infectin in a budgerigar. Medycyna Wet. 67 (2), 133-135.

Rzewuska M., Karpińska E., Kosowska G., Kizerwetter-Świda M., Chrobak-Chmiel D., Szeleszczuk P.,
Binek M. 2014. „Phenotypic properties of Gallibacterium anatis biovar haemolytica strains isolated from
birds in Poland”. Proceedings of XV Conference DIAGMOL „Molecular biology in diagnostics of
infectious diseases and biotechnology”, 25 October 2014, WULS-SGGW in Warsaw, Poland, s. 157-160.
Ad 3) Znaczną część mojego dorobku naukowego stanowią prace dotyczące etiologii i
patogenezy ropnych zakażeń u małych przeżuwaczy. Były one prowadzone w ścisłej
- 28 -
współpracy z dr. hab. Jarosławem Kabą prof. nadzw. SGGW i jego zespołem (Samodzielna
Pracownia Epidemiologii i Ekonomiki Weterynaryjnej WMW SGGW): prof. dr hab. Iwoną
Markowską-Daniel,
doktorem
Michałem
Czopowiczem
oraz
doktorem
Lucjanem
Witkowskim, a także dr Olgą Szaluś-Jordanow (Katedra Chorób Małych Zwierząt z Kliniką
WMW SGGW). Te wieloletnie badania obejmowały stada kóz i owiec o różnym statusie
hodowlanym w całej Polsce. Mój udział w nich, oprócz pracy doświadczalnej, polegał w
dużej mierze również na opiece merytorycznej i wspieraniu prac badawczych młodszych
pracowników naukowych przygotowujących swoje rozprawy doktorskie. Tej tematyki
dotyczyła także, poświęcona charakterystyce Corynebacterium pseudotuberculosis, praca
magisterska dr Ilony Stefańskiej (Katedra Nauk Przedklinicznych WMW SGGW), której
byłam promotorem (zał. 4, J.1). Kontynuowała ona badania nad chorobotwórczością tej
bakterii w ramach pracy doktorskiej, której byłam opiekunem naukowym, a promotorem był
prof. dr hab. Marian Binek. Poza C. pseudotuberculosis, bakteriami najczęściej izolowanymi
z zakażeń ropnych u kóz i owiec były T. pyogenes i Staphylococcus aureus, a sporadycznie S.
aureus subsp. anaerobius. Właściwości tych patogenów oraz dane epidemiologiczne
dotyczące wywoływanych przez nie zakażeń zostały przedstawione w pracach:

Nowicki M., Kaba J., Stefańska I., Rzewuska M., Frymus T., Binek M. 2004. Diagnostyka serowaciejącego
zapalenia węzłów chłonnych u kóz. Życie Weterynaryjne 79 (9), 493 – 497.

Stefańska I., Rzewuska M., Binek M. 2007. Corynebacterium pseudotuberculosis – zakażenia u zwierząt.
Post. Mikrobiol. 46, 2, 101-112.

Kaba J., Szaluś O., Rzewuska M., Stefańska I., Binek M., Frymus T. 2007. Ognisko choroby Morela w
stadzie kóz. Magazyn Weterynaryjny, vol. 16, nr 122, 46-48.

Stefańska I., Rzewuska M., Nowicki M., Kaba J., Binek M. 2007. Właściwości fizjologiczne i zmienność
genomowa szczepów Corynebacterium pseudotuberculosis wyizolowanych od kóz w Polsce. Medycyna
Wet. 63 (11) supl., 1474-1477.

Stefańska I., Rzewuska M., Binek M. 2008. Evaluation of Three Methods for DNA Fingerprinting of
Corynebacterium pseudotuberculosis Strains Isolated from Goats in Poland. Polish J. Microbiol. 57, 2, 105112.

Kaba J., Bagnicka E., Nowicki M., Rzewuska M., Nowicka D., Witkowski L., Sobczak-Filipiak M.,
Osińska B., Sendecka H., Czopowicz M., Szaluś-Jordanow O. 2009. Zapalenie wymienia u kóz –
najczęstsze przyczyny i rozpoznawanie. Życie Weterynaryjne 84(8), 637-643.

Stefańska I., Gieryńska M., Rzewuska M., Binek M. 2010. Survival of Corynebacterium
pseudotuberculosis within macrophages and induction of phagocytes death. Polish Journal of Veterinary
Sciences Vol. 13, No. 1, 143-149.

Szaluś-Jordanow O., Kaba J., Czopowicz M., Witkowski L., Nowicki M., Nowicka D., Stefańska I.,
Rzewuska M., Sobczak-Filipiak M., Binek M., Frymus T. 2010. Epidemiological features of Morel’s
disease in goats. Polish Journal of Veterinary Sciences Vol. 13, No. 3, 437-445.
- 29 -

Nowicki M., Kaba J., Mosiej E., Lutyńska A., Augustynowicz E., Rzewuska M., Binek M., SzaluśJordanow O., Stefańska I., Frymus T. 2011. Fingerprinting of Corynebacterium pseudotuberculosis strains
by random amplified polymorphic DNA and amplified fragment length polymorphism techniques. Bull.
Vet. Inst. Pulawy, 55, 403-409.

Mickiewicz M., Kaba J., Czopowicz M., Sobczak-Filipiak M., Rzewuska M., Bagnicka E. 2016.
Gronkowcowe zapalenie wymienia u kóz. Życie Weterynaryjne 91 (3), 175-177.
oraz w publikacjach konferencyjnych (zał. 4, B.24, 25, 28, 30, 38, 42, 45, 46, 52, 55, 60 i
85).
Ad 4) Innym zagadnieniem, w którego badaniu uczestniczyłam, dotyczącym małych
przeżuwaczy, ale także i bydła, był wpływ bakterii, w tym patogennych, na procesy
zachodzące w gruczole mlekowym oraz na parametry mleka tj. liczba komórek
somatycznych. Moim udziałem było wykonanie i opracowanie badań mikrobiologicznych.
Badania te u kóz były prowadzone pod kierunkiem prof. dr hab. Emilii Bagnickiej (Instytut
Genetyki i Hodowli Zwierząt, Polska Akademia Nauk w Jastrzębcu), m.in. w ramach sieci
naukowej BIOMILK (zał. 4, E.1) oraz grantu KBN (zał. 3, II.I.1.5).
Wyniki badań związanych z powyższą tematyką są opublikowane w pracach:

Cywińska A., Baś M., Karpiuk O., Krzyżowska M., Rzewuska M., Schollenberger A., Niemiałtowski M.
2006. Immunobiology of bovine mammary gland: apoptosis of somatic cell in milk during naturally
occuring mastitis. Polish Journal of Veterinary Sciences Vol. 9, No. 1, 63-70.

Dziekiewicz-Mrugasiewicz M., Rzewuska M., Stefańska I., Jakubczak A. 2008. Wybrane cechy
chorobotwórczości oraz zróżnicowanie genomowe szczepów Staphylococcus aureus wyizolowanych z
mleka krów z zapaleniem gruczołu mlekowego w regionie północno-wschodniej Polski. Medycyna Wet.
64(8), 1012-1015.

Bagnicka E., Jóźwik A., Rzewuska M., Strzałkowska N., Winnicka A., Czopowicz M., Kaba J.,
Krzyżewski J. 2011. Influence of the presence of pathogenic bacteria on the relationship between Nacetylcysteine administration and the population of somatic cells in goat milk. Centr. Eur. J. Immunol. 36
(1), 5-8.

Bagnicka E., Winnicka, A,. Jóźwik A., Rzewuska M., Strzałkowska N., Kościuczuk E., Prusak B., Kaba J.,
Horbańczuk J.O., Krzyżewski J. 2011. Relationship between somatic cell count and bacterial pathogens in
goat milk. Small Ruminant Research 100, 72-77.

Nowicka D., Czopowicz M., Bagnicka E., Rzewuska M., Strzałkowska N., Kaba J. 2015. Influence of small
ruminant lentivirus infection on cheese yield in goats. Journal of Dairy Research 82(1), 102-106.
oraz w publikacjach konferencyjnych (zał. 4, B.26, 41, 86 i 87).
Ad 5) W badaniach dotyczących etiologii zakażeń u żubrów uczestniczę od wielu lat. Są one
prowadzone przez liczny zespół m. in. prof. dr hab. Jerzego Kitę, dr hab. Wojciecha
- 30 -
Bieleckiego, dr Barbarę Osińską, dr Magdalenę Matuszewską, dr Katarzynę Olbrych z
Wydziału Medycyny Weterynaryjnej SGGW, z którymi ściśle współpracuję. Mój udział
polegał na wykonywaniu badań bakteriologicznych materiału klinicznego od żubrów (od
osobników padłych lub odstrzelonych w ramach selekcji), w którego pobieraniu wielokrotnie
uczestniczyłam. Szczególną uwagę zwróciły stosunkowo liczne przypadki izolacji T.
pyogenes z różnego typu zakażeń, w tym nekrotycznego zapalenia napletka (balanoposthitis).
Wyjaśnienie etiopatogenezy tej choroby było celem grantu kierowanego przez dra hab.
Wojciecha Bieleckiego z Katedry Patologii i Diagnostyki Weterynaryjnej WMW SGGW (zał.
3, II.I.1.9), którego byłam głównym wykonawcą. W efekcie tych badań powstała kolekcja
szczepów T. pyogenes, które w dalszych badaniach dokładnie scharakteryzowałam. Wyniki
badań związanych z omawianą tematyką były przedstawiane przede wszystkim w formie
doniesień konferencyjnych, głównie na konferencjach poświęconych żubrom, w tym
współorganizowanych przez Stowarzyszenie Miłośników Żubrów, którego jestem członkiem.
Wybrane publikacje:

Rzewuska M., Osińska B., Bielecki W., Skrzypczak M., Stefańska I., Binek M. 2006. Microflora of
urogenital tract in European bison (Bison bonasus). W “Health threats for the European Bison particularly
in free-roaming populations in Poland”, monografia pod redakcją J. Kity i K. Anusza. Wydawnictwo
SGGW, 2006; s. 27.

Osińska B.,
Rzewuska M., Skrzypczak M., Bielecki W., Dackiewicz J., Anusz K. 2006. Badania
anatomopatologiczne i bakteriologiczne płuc żubrów (Bison bonasus) z terenu Puszczy Białowieskiej. W
monografii pod red. W. Olech pt. „Perspektywy rozwoju populacji żubrów”, (konferencja w Pszczynie),
wydawnictwo ARTISCO, rozdz. XVI, s. 115-118.

Osińska B., Bielecki W., Rzewuska M., Demiaszkiewicz A., Anusz K. 2012. Balanoposthitis in European
bison from Bialowieża Forest: a preliminary investigation. Proceedings of the 29th Meeting of the ESVP
and the ECVP (Uppsala, Szwecja), in J. Comp. Pathol. 146 (1), pp. 90.

Krzysiak M.K., Bielecki W., Demiaszkiewicz A., Pyziel A.M., Krajewska M., Rzewuska M., Matuszewska
M., Wiśniewska J. 2012. Przypadek „POSESJI”, żubrzycy z Kiermus. European Bison Conservation
Newsletter 5, 117-122.

Osińska B., Bielecki W., Rzewuska M. 2013. Necrotic laryngitis of European Bison (Bison Bonasus) from
the Bialowieża Forest. Proceedings of the 30th Meeting of the ESVP and the ECVP (León, Hiszpania), in J.
Comp. Pathol. 148 (1), pp. 86.

Bielecki W., Amarowicz J., Hławiczka M., Kaczor S., Krzysiak M., Kuberka K., Lizoń R., Matuszewska
M., Olszewski B., Osińska B., Rzewuska M., Strzałkowski S. 2014. Monitoring zdrowia populacji żubrów
jako element ochrony gatunku. European Bison Conservation Newsletter 7, 43-50.

Olbrych K., Yan-Kalińska M., Urbańska K., Rzewuska M., Sokołowska J., Barszcz K., Romańska A. 2015.
The correlation between vaginal microflora and vaginal cytology in European bison. European Bison
Conservation Newsletter 8, 5-13.
- 31 -

Rzewuska M., Rodo A., Bielecki W. 2016. Dermacentor reticulatus ticks as possible vectors of Trueperella
pyogenes infection in European bison (Bison bonasus): preliminary studies. Proceedings of the 33th Meeting
of the ESVP, ECVP and NSVP (Helsinki, Finlandia), in J. Comp. Pathol. 154, pp. 120.
oraz inne doniesienia konferencyjne (zał. 4, B.13, 36, 37, 49, 56, 57 i 90).
Stan zdrowia populacji żubrów w Polsce jest ciągle monitorowany, w ostatnich latach
w ramach projektów dofinansowanych ze środków Unii Europejskiej, którymi kieruje prof. dr
hab. Wanda Olech-Piasecka z Wydziału Nauk o Zwierzętach SGGW, i w których również
uczestniczę.
Ad 6) Brak dostępnych danych o właściwościach szczepów T. pyogenes występujących u
żubrów, w tym o ich zjadliwości, a także słabo poznana patogeneza zakażeń tymi bakteriami,
skłoniły mnie do podjęcia badań w kierunku tych zagadnień. W badaniach wykorzystałam
zebraną przeze mnie kolekcję izolatów T. pyogenes od żubrów oraz zwierząt gospodarskich.
Wyniki tych badań są opublikowane w dwóch pracach będących częścią osiągnięcia
naukowego (publikacje nr 1 i 5), które zostały omówione w punkcie 4.c. W ramach badań
prowadzonych przeze mnie nad T. pyogenes przygotowana została również praca magisterska
mgr Marty Gawryś, której byłam promotorem (zał. 4, J.6).
Ad 7) Zagadnieniami związanymi z zakażeniami R. equi zajmowałam się od wielu lat,
początkowo we współpracy z prof. dr. hab. Jerzym Kitą (Katedra Epizootiologii WMW
SGGW), a później również z drem Lucjanem Witkowskim (Samodzielna Pracownia
Epidemiologii i Ekonomiki Weterynaryjnej WMW SGGW). Pierwsze moje badania
dotyczyły zakażeń u koni i obejmowały dokładną identyfikację izolatów oraz opracowywanie
autoszczepionek z R. equi dla hodowli, w których występowała rodokokoza. Dalsze prace w
tym kierunku prowadziłam wraz z drem Witkowskim, który rodokokozą, zwłaszcza w
aspekcie epidemiologicznym, zajmował się przygotowując swoją pracę doktorską. Następnie
badania epidemiologiczne dotyczące występowania R. equi u dzikich zwierząt były
prowadzone w ramach grantu NCN kierowanego przez dra Witkowskiego (zał. 3, II.I.1.6),
którego byłam głównym wykonawcą. Mój udział w tym projekcie związany był z badaniami
mikrobiologicznymi węzłów chłonnych podżuchwowych pobranych od dzików, jeleni i saren,
w
tym
szczegółowej
charakterystyce
izolatów
R.
equi.
Podczas
ich
realizacji
współpracowałam z profesorem Shinji Takai ze School of Veterinary Medicine, Kitasato
University w Japonii, który jest światowy autorytetem w tej dziedzinie. Wyniki badań zostały
opublikowane w dwóch pracach będących częścią osiągnięcia naukowego (publikacje nr 2 i
- 32 -
3), które są omówione w punkcie 4.c. Moje wieloletnie doświadczenia w pracy
diagnostycznej i badawczej nad R. equi
wskazały na potrzebę opracowania metody
wykrywania tego patogenu w materiale klinicznym bez względu na zjadliwość szczepu.
Metoda taka została opracowana w oparciu o technikę real-time PCR i jest opisana w
publikacji nr 4 stanowiącej część osiągnięcia naukowego omówionego w punkcie 4.c. Poza
wymienionymi publikacjami stanowiącymi osiągnięcie naukowe, badania związane z
omawianą tematyką zostały przedstawione w pracach:

Witkowski L., Sobczak–Filipiak M., Kaba J., Rzewuska M., Kita J. 2004. Rhodococcus equi infection in
foals – clinical and pathomorphological changes. Polish Journal of Veterinary Sciences Vol. 7, No. 3,
supplement, 151 – 154.

Bańbura M.W., Witkowski L., Chmielewska A., Tucholska A., Rzewuska M., Ruszczyk A. 2004. Izolacja
końskich herpeswirusów typu 1 i 2 (EHV-1 i EHV-2) od źrebiąt zakażonych Rhodococcus equi. Medycyna
Wet. 60 (12): 1333 - 1336.

Witkowski L., Rzewuska M., Kaba J., Binek M., Kita J. 2006. Występowanie rodokokozy źrebiąt w Polsce
– charakterystyka szczepów Rhodococcus equi. Monografia z IX Konferencji ”Biologia molekularna w
diagnostyce chorób zakaźnych i biotechnologii” – ”Stop TB”, 02.12.2006 Warszawa (ISBN 83-7244-787X), s. 184-186.

Witkowski L., Kaba J., Rzewuska M., Kita J. 2008. Możliwości zapobiegania rodokokozie źrebiąt. Życie
Weterynaryjne 5, 365-370.

Witkowski L., Kaba J., Rzewuska M., Kita J. 2008. Rodokokoza źrebiąt – rozpoznawanie i leczenie. Cz. 1.
Magazyn Weterynaryjny 17 (136), 783-786.

Witkowski L., Kaba J., Rzewuska M., Kita J. 2009. Rodokokoza źrebiąt – rozpoznawanie i leczenie. Cz. 2.
Magazyn Weterynaryjny, 18 (141), 46-48.

Witkowski L., Rzewuska M., Rzewuska D., Kizerwetter-Świda M., Frymus T., Kita J. 2011. Zakażenia
Rhodococcus equi u zwierząt i ludzi. Wiadomości Lekarskie 4, 306-309.

Witkowski L., Kaba J., Rzewuska M., Nowicki M., Szaluś-Jordanow O., Kita J. 2012. Development of
ELISA test for determination of the level of antibodies against Rhodococcus equi in equine serum and
colostrum. Vet. Immunol. Immunopathol. 149, 280-285.

Cisek A.A., Rzewuska M., Binek M. 2013. Rhodococcus equi – identification and differentiation of the
strains. Proceedings of XIV Conference DIAGMOL “Molecular Biology in Diagnostics of Infectious
Diseases and Biotechnology”, 19.10.2013, WULS-SGGW in Warsaw, Poland, s. 53-56.

Cisek A.A., Rzewuska M., Witkowski L., Binek M. 2013. Antimicrobial susceptibility of Rhodococcus
equi isolated from wild boars. The 3rd Workshop on Microbiology in Health and Environmental Protection –
MIKROBIOT 2013, Łódź. Postępy Mikrobiologii 2013, 52 (supl. 1), s. 102.

Cisek A.A., Rzewuska M., Witkowski L., Binek M. 2014. Antimicrobial resistance in Rhododcoccus equi.
Acta Biochimica Polonica 61(4), 633-638.

Witkowski L., Rzewuska M., Takai S., Kizerwetter-Świda M., Kita J. 2016. Molecular epidemiology of
Rhodococcus equi in slaughtered swine, cattle and horses in Poland. BMC Microbiology 16:98.
- 33 -

Witkowski L., Rzewuska M., Takai S., Chrobak-Chmiel D., Kizerwetter-Świda M., Feret M, Gawryś M.,
Witkowski M., Kita J. 2016. Virulent Rhodococcus equi isolates from foals in Poland – pVapA
characteristics and plasmid new variant, 85-kb type V. 10th International Equine Infectious Diseases
Conference (Buenos Aires, Argentyna), in Journal of Equine Veterinary Science 39, pp. S86-S87.
oraz w publikacjach konferencyjnych (zał. 4, B.32, 34, 35, 40, 50, 51, 62, 70, 71, 78 i 89).
Charakterystyce szczepów R. equi wyizolowanych od różnych zwierząt poświęcone
były trzy prace magisterskie (mgr Eweliny Adamskiej, mgr Agaty Cisek oraz mgr Małgorzaty
Feret), których byłam promotorem (zał. 4, J.2, 5 i 7).
Ad 8) Z uwagi na coraz częściej notowane przez klinicystów problemy w zwalczaniu zakażeń
wywoływanych przez E. coli u zwierząt towarzyszących człowiekowi, podjęłam badania nad
tymi patogenami, ze szczególnym uwzględnieniem ich lekooporności. Badania wykonane
były na licznej kolekcji izolatów E. coli pochodzących z różnych zakażeń u psów i kotów.
Oznaczona została ich wrażliwość na najważniejsze grupy antybiotyków. Wśród szczepów
wyizolowanych w okresie siedmiu lat stwierdziłam narastanie oporności na antybiotyki
powszechnie stosowane w terapii zakażeń u małych zwierząt, w tym cefalosporyny. Dlatego
przeprowadziłam dalsze badania mające na celu ustalenie znaczenia beta-laktamaz o
rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) w oporności tych szczepów. Okazało się, że
tylko u niewielkiego odsetka badanych szczepów i jedynie pochodzących od psów, wykryto
te enzymy, a zatem w tym przypadku nie były one istotnym mechanizmem oporności na betalaktamy. Następnie określiłam typ ESBL u wytwarzających je szczepów poprzez analizę
sekwencji genów kodujących te enzymy. Ciekawym wynikiem było wykrycie u wszystkich
badanych szczepów genu kodującego beta-laktamazę TEM-116, sporadycznie występującą u
izolatów E. coli od psów. Poza lekowrażliwością, badana była również chorobotwórczość
testowanych szczepów E. coli. W tym celu techniką PCR wykrywano geny wybranych
czynników zjadliwości tych patogenów. W populacji szczepów E. coli wyizolowanych od
zwierząt towarzyszących człowiekowi wykryto geny kodujące Shiga toksynę 2, enterotoksynę
ciepłochwiejną II oraz enterotoksynę ciepłostałą EAST1, która była dominującym czynnikiem
zjadliwości badanych izolatów.
Problematyka związana z chorobotwórczością szczepów E. coli wyizolowanych od
psów i kotów była tematem prac magisterskich mgr Moniki Turkowskiej oraz mgr Pauliny
Mierzejewskiej, których byłam promotorem (zał. 4, J.3 i 4).
Zagadnienia dotyczące omówionych badań zostały przedstawione w pracach:

Rzewuska M. 2009. Antybiotykooporność Gram-ujemnych pałeczek wytwarzających beta-laktamazy.
Życie Weterynaryjne 84 (3), 199-205.
- 34 -

Turkowska M., Rzewuska M., Zdanowski R., Lewicki S., Suska M. 2013. Rozdział „Charakterystyka
głównych typów chorobotwórczych szczepów Escherichia coli” w pracy zbiorowej „Biologia Medyczna.
Wybrane zagadnienia” pod red. Skopińskiej-Różewskiej E., Siwickiego A.K. i Zdanowskiego R.; SPW
Edycja, Olsztyn 2013.

Rzewuska M., Czopowicz M., Kizerwetter-Świda M., Chrobak D., Błaszczak B., Binek M. 2015.
Multidrug resistance in Escherichia coli strains isolated from infections in dogs and cats in Poland (2007 –
2013). The Scientific World Journal vol. 2015, article ID 408205, 8 pages.

Rzewuska M., Stefańska I., Kizerwetter-Świda M., Chrobak-Chmiel D., Szczygielska P., Leśniak M.,
Binek M. 2015. Characterization of extended-spectrum-β-lactamases produced by Escherichia coli strains
isolated from dogs in Poland. Pol. J. Microbiol. vol 64, No 3, 285-288.
oraz w publikacjach konferencyjnych (zał. 4, B. 39, 48, 54, 72 i 74).
Ad 9) Zakażenia gronkowcowe należą do jednych z częściej występujących chorób
bakteryjnych u zwierząt. Mimo, iż gronkowce są bakteriami bardzo dobrze poznanymi, wiele
kwestii związanych z ich chorobotwórczością, rozprzestrzenieniem, a także taksonomią
pozostaje jeszcze do wyjaśnienia. Badania, w których uczestniczę, dotyczą głównie
charakterystyki fenotypowej i genotypowej izolatów Staphylococcus spp. od zwierząt
towarzyszących człowiekowi oraz od ptaków. Szczególnie zaangażowana jest w nie dr Dorota
Chrobak-Chmiel (Katedra Nauk Przedklinicznych WMW SGGW), która na temat
gronkowców przygotowała pracę licencjacką pod moim kierunkiem (zał. 4, J.8), a następnie
pracę
magisterską
pod
opieką
dr
Magdaleny Kizerwetter-Świdy
(Katedra
Nauk
Przedklinicznych WMW SGGW). Także jej praca doktorska, której promotorem był prof. dr
hab. Marian Binek, poświęcona była tym bakteriom. Prowadzone przez nasz zespół badania
obejmują szeroki zakres zagadnień dotyczących gronkowców tj. lekowrażliwość i zjadliwość
izolatów, występowanie poszczególnych gatunków u różnych gospodarzy, a także
problematykę prawidłowej klasyfikacji szczepów, przede wszystkim z tzw. Staphylococcus
intermedius group - SIG (S. pseudintermedius, S. intermedius i S. delphini). Ich wyniki
zostały opublikowane w następujących pracach:

Kizerwetter-Świda M, Rzewuska M., Binek M. 2007. Oporność na antybiotyki gronkowców izolowanych
od zwierząt. Monografia PTM „Świat człowieka światem drobnoustrojów” pod red W. Hryniewicz, s. 5967.

Kizerwetter-Świda M., Chrobak D., Rzewuska M., Binek M. 2009. Antibiotic resistance patterns and
occurrence of mecA gene in Staphylococcus intermedius strains of canine origin. Polish Journal of
Veterinary Sciences Vol. 12, No. 1, 9-13.

Chrobak D., Kizerwetter-Świda M., Rzewuska M., Binek M. 2009. Pulsed-field gel electrophoresis of
Staphylococcus intermedius isolated from animals. Monografia z DIAGMOL X Konferencji “Biologia
molekularna w diagnostyce chorób zakaźnych i biotechnologii”, 28.11.2009, s. 64-67.
- 35 -

Chrobak D., Kizerwetter-Świda M., Rzewuska M., Binek M. 2009. Metycylinooporne szczepy
Staphylococcus intermedius występujące u psów jako potencjalny rezerwuar genu mecA. Post. Mikrobiol.
48, 4, 235-242.

Chrobak D., Kizerwetter-Świda M., Rzewuska M., Moodley A., Guardabassi L., Binek M. 2010.
Identification of Staphylococcus pseudintermedius strains isolated from animals in Poland. Proceedings of
XI Conference DIAGMOL, 27.11.2010, Warsaw, Poland, s. 59-62.

Chrobak D., Kizerwetter-Świda M., Rzewuska M., Binek M. 2011 Antibiotic resistance of canine
Staphylococcus intermedius group (SIG) - Practical implications. Polish Journal of Veterinary Sciences Vol.
14, No. 2, 213-218.

Chrobak D., Kizerwetter-Świda M., Rzewuska M., Moodley A., Guardabassi L., Binek M. 2011. Molecular
characterization of Staphylococcus pseudintermedius strains isolated from clinical samples of animal origin.
Folia Microbiol. 56, 415-422.

Kizerwetter-Świda M., Chrobak D., Rzewuska M., Antosiewicz A., Dolka B., Ledwoń A., Binek M. 2013.
Differentiation of coagulase-positive staphylococci isolated from pigeons. Proceedings of XIV Conference
DIAGMOL “Molecular Biology in Diagnostics of Infectious Diseases and Biotechnology”, 19.10.2013,
WULS-SGGW in Warsaw, Poland, s. 81-84.

Chrobak D., Kizerwetter-Świda M., Rzewuska M., Binek M. 2013. Staphylococcus pseudintermedius –
nowy, ale dobrze znany patogen. Życie Weterynaryjne 88 (8), 625- 628.

Kizerwetter-Świda
M.,
Chrobak
D.,
Rzewuska
M.,
Binek
M.
2013.
Kliniczne
znaczenie
metycylinoopornych szczepów Staphylococcus pseudintermedius w praktyce weterynaryjnej. Życie
Weterynaryjne 88 (10), 841-847.

Chrobak-Chmiel D., Kizerwetter-Świda M., Rzewuska M., Chojnacka B., Grzechnik A., Błaszczak B.,
Binek M. 2014. „Occurrence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus
pseudintermedius in dogs and cats in Poland”. Proceedings of XV Conference DIAGMOL „Molecular
biology in diagnostics of infectious diseases and biotechnology”, 25 October 2014, WULS-SGGW in
Warsaw, Poland, s. 79-81.

Kizerwetter-Świda M., Chrobak-Chmiel D.,
Rzewuska M., Binek M.
2015. Staphylococcus
pseudintermedius – trudno rozpoznawalny patogen. Post. Mikrobiol. 54 (2), 103-114.

Kizerwetter-Świda M., Chrobak-Chmiel D., Rzewuska M., Antosiewicz A., Dolka B., Ledwoń A.,
Czujkowska A., Binek M. 2015. Genetic characterization of coagulase-positive staphylococci isolated from
healthy pigeons. Pol. J. Vet. Sci. 18(3), 627-634.

Kizerwetter-Świda M., Chrobak D., Rzewuska M., Pławińska-Czarnak J., Binek M. 2015. Characterization
of Staphylococcus aureus isolated from meat processing plants. Proceedings of XVI Conference DIAGMOL
„Molecular biology in diagnostics of infectious diseases and biotechnology”, 28 November 2015, WULSSGGW in Warsaw, Poland, s. 87-91.

Kizerwetter-Świda M., Chrobak-Chmiel D., Rzewuska M., Binek M.
2016. Resistance of canine
methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius strains to pradofloxacin. J. Vet. Diagn. Invest. 28(5):
514-518.
oraz przedstawione w publikacjach konferencyjnych (zał. 4, B.44, 53, 63-66, 75 i 81).
- 36 -
Ad 10) Diagnostyka laboratoryjna zakażeń powodowanych przez Mycobacterium spp. u psów
i kotów jest trudna, nie tylko z uwagi na właściwości tych drobnoustrojów, ale także na często
nietypowy obraz kliniczny tych zakażeń. Do szczególnie problematycznych należy
laboratoryjne rozpoznanie mykobakterioz, które wywoływane mogą być przez szczepy
gatunków atypowych, bardzo słabo poznanych i często bardzo trudnych do wyhodowania in
vitro. W takich przypadkach prątki w materiale klinicznym można najczęściej wykryć
wyłącznie metodami molekularnymi, które pozwalają na ustalenie przynależności do rodzaju
Mycobacterium, ale nie zawsze na identyfikację gatunku. Większość takich przypadków
badanych przeze mnie dotyczyła zakażeń u kotów z objawami przypominającymi trąd koci
(dane nie opublikowane). Natomiast w diagnostyce zakażeń prątkami gruźliczymi, na ogół z
powodzeniem
stosowane
są
metody
konwencjonalne
równocześnie
z
metodami
molekularnymi. Opis jednego z ciekawszych przypadków zakażenia M. tuberculosis u psa,
diagnozowanego przez dr Olgę Szaluś-Jordanow (Katedra Chorób Małych Zwierząt z Kliniką
WMW SGGW), którym się zajmowałam, został przedstawiony w pracy:

Szaluś-Jordanow O., Augustynowicz-Kopeć E., Czopowicz M., Olkowski A., Łobaczewski A., Rzewuska
M., Sapierzyński R., Wiatr E., Garncarz M., Frymus T. 2016. Intracardiac tuberculomas caused by
Mycobacterium tuberculosis in a dog. BMC Veterinary Research 12:109.
Ad 11) Od wielu lat zajmuję się badaniem aktywności przeciwbakteryjnej różnych czynników
tj. antybiotyki, preparaty dezynfekujące, ekstrakty roślinne, nanocząsteczki. Badania te
wykonuję w ramach współpracy naukowej lub prac zleconych. W ostatnim czasie dużo uwagi
poświęciłam
oznaczaniu
działania
antybakteryjnego
biodegradowalnych
materiałów
kompozytowych, które mają być przeznaczone na gwoździe śródszpikowe. Badania te
prowadzę we współpracy z dr Anną Morawską-Chochół i dr Barbarą Szaraniec z Katedry
Biomateriałów Wydziału Inżynierii Materiałowej i Ceramiki Akademii Górniczo-Hutniczej w
Krakowie. Przebadałam we wstępnych doświadczeniach materiały o różnym składzie, w tym
zawierające gentamicynę. Okazało się, że w zależności od budowy mogą one w różnym
stopniu hamować wzrost testowanych bakterii. Wyniki tych doświadczeń zostały
przedstawione w pracach:

Szaraniec B., Rzewuska M., Gryń K., Morawska-Chochół A., Chłopek J. 2013. Resorbable polylactide
composites with antimicrobial activity. 25th European Conference on Biomaterials, September 8th-12th,
2013 Madrid, Spain.

Morawska-Chochół A., Domalik-Pyzik P., Chłopek J., Szaraniec B., Sterna J., Rzewuska M., Boguń M.,
Kucharski R., Mielczarek P. 2014. Gentamicin release from biodegradable poly-L-lactide based composites
for novel intramedullary nails. Materials Science and Engineering C vol. 45, 15-20.
- 37 -

Domagalik-Pyzik P., Morawska-Chochół A., Rzewuska M., Szaraniec B., Chłopek J. 2015. Antibacterial
activity study of poly(L-lactide) composites for novel biodegradable intramedullary nails. Engineering of
Biomaterials (Inżynieria Biomateriałów) 133, 7-13.
Prowadzone przeze mnie obecnie badania są skoncentrowane przede wszystkim na
przeciwdrobnoustrojowym działaniu różnych substancji, z uwzględnieniem ich wpływu na
drobnoustroje w formie planktonicznej oraz biofilmu. Poza tym cały czas kontynuuję prace
badawcze w zakresie wszystkich wyżej omówionych zagadnień, w których aktywnie
uczestniczą pod moją opieką studenci przygotowujący swoje prace dyplomowe, a także
młodsi pracownicy naukowi Wydziału Medycyny Weterynaryjnej SGGW.
Mój dotychczasowy dorobek naukowy obejmuje 69 publikacji, o łącznym impact
factor 32.647 (według In Cites™ Journal Citation Report®, wrzesień 2016), w tym dla
publikacji stanowiących osiągnięcie naukowe impact factor wynosi 10.929, oraz 96 doniesień
prezentowanych na międzynarodowych i krajowych konferencjach naukowych, a także 10
publikacji w wydawnictwach monograficznych oraz 10 rozdziałów w podręcznikach.
c) Działalność dydaktyczna
Obecnie prowadzę zajęcia dydaktyczne z zakresu:
— Mikrobiologia weterynaryjna – dla studentów II roku Wydz. Med. Weterynaryjnej
SGGW;
— Diagnostyka mikrobiologiczna chorób skóry u psów i kotów – dla studentów III roku
Wydz. Med. Weterynaryjnej SGGW;
— Mikrobiologia – dla studentów II roku Wydz. Nauk o Zwierzętach SGGW;
— Mikrobiologia kliniczna – dla studentów II roku studiów magisterskich Wydz. Rolnictwa i
Biologii SGGW;
— Seminarium dyplomowe licencjackie – dla studentów III roku Wydz. Rolnictwa i Biologii
SGGW.
Przez długi czas prowadziłam również zajęcia z zakresu biologii molekularnej dla studentów
II roku Międzywydziałowego Studium Biotechnologii SGGW.
Prowadziłam też zajęcia dla słuchaczy:
— Specjalizacji „Choroby zwierząt nieudomowionych” – wykład „Wybrane zagadnienia z
bakteriologii weterynaryjnej dotyczące chorób zwierząt nieudomowionych” (2004 r.);
- 38 -
— Studiów podyplomowych „Weterynaryjna diagnostyka laboratoryjna” – zajęcia z zakresu
„Metod identyfikacji bakterii” oraz „Metod oznaczania lekowrażliwości bakterii” (2009 r.
i 2014 r.).
Jestem promotorem 15 prac dyplomowych (zał. 4, J):
— 6 prac magisterskich studentów Wydziału Rolnictwa i Biologii SGGW;
— 1 pracy magisterskiej studentki Międzywydziałowego Studium Biotechnologii SGGW;
— 8 prac licencjackich studentów Wydziału Rolnictwa i Biologii SGGW.
Jestem autorem lub współautorem 5 rozdziałów w podręczniku dla studentów (zał. 3, E. 5-9)
pt.: „Zarys klinicznej bakteriologii weterynaryjnej” pod redakcją K. Malickiego i M. Binka.
Wydawnictwo SGGW. Tom I i II, 2004. Podręcznik.
Rozdziały:
— Biochemiczne różnicowanie bakterii – metody współczesne. Rzewuska M.
— Badania ukierunkowane w zakresie krętków. Binek M., Rzewuska M.
— Badania ukierunkowane w zakresie gramujemnych pałeczek beztlenowych. Rzewuska M.
— Badania ukierunkowane w zakresie nieregularnych gramdodatnich bakterii. Binek M.,
Rzewuska M.
— Podłoża stosowane do izolacji i namnażania krętków. Binek M., Rzewuska M.
Wcześniejsza wersja była wydana (2001 – 2002 r.) jako skrypt pod tym samym tytułem,
jestem w niej współautorem 4 rozdziałów (zał. 3, E. 1-4).
Współpraca międzynarodowa w zakresie dydaktyki:
— współrealizator międzynarodowego grantu TEMPUS JEP-12248-97: Introduction of a
new post-graduate course in animal health, 1997-2000;
— współrealizator międzynarodowego grantu TEMPUS JEP-12309-97: Restructurisation of
the Warsaw Veterinary School Undergraduate Curriculum, 1997-2001;
— wyjazd szkoleniowy: Ecole Nationale Veterinaire de Nantes, Francja, 22 – 26. 11.2000;
— wyjazd szkoleniowy: Faculdade de Medicina Veterinaria, Lisbona, Portugalia, 27 31.01.2001.
- 39 -
- 40 -

autoreferat - Wydział Medycyny Weterynaryjnej

Transkrypt

Podobne dokumenty

więcej

01-oswiadczenie-zamawiajacego

XRB Komunikat - Zamknij Drzwi Zakażeniom Szpitalnym

UMO-2013/11/D/NZ8/00583 Interakcje między chrząszczami a

vidacell