Scientific Review in Pharmacy - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Transkrypt

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073
Farmaceutyczny
www.fpn.info.pl
Cena 24,50 zł
Przegląd Naukowy
Miesięcznik
PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH
IC Value - Current 4,55
MNiSW 4
ROK VII (XI)
Nr 2/2010 (61)
Scientific Review in Pharmacy
Nieprzestrzeganie zaleceń lekarskich
jako problem współczesnej farmakoterapii
Sekrecja interleukiny-6 (IL-6) 0
przez transformowane komórki nabłonkowe
jelita grubego
traktowane lipopolisacharydami bakterii
Desulfovibrio desulfuricans
Zastosowanie spektroskopii EPR
do badań wolnych rodników
w termicznie sterylizowanym chlortalidonie
Ocena aktywności dehydrogenazy mleczanowej
komórek linii A549 pod wpływem oddziaływania
holoksanu i wolnozmiennego pola
elektromagnetycznego – in vitro
Molekularne mechanizmy działania leków
immunosupresyjnych
Diagnostyka molekularna achondroplazji
ISSN 1425-5073
Analiza molekularna polimorfizmu
szczepów Staphylococcus spp.
izolowanych ze środowiska szpitalnego
1
Redaktor Naczelny / Editor-in-Chief:
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk
Farmaceutyczny
Adres redakcji / Editorial Adress:
Przegląd Naukowy
Miesięcznik
ul. Jedności 8 , 41-200 Sosnowiec, Polska / Poland
Tel. +48 32 364 11 50, +48 514 342 345
Fax. + 48 32 364 11 58
E-mail: [email protected]
Index Copernicus 3,66
MNiSW 4
Konsultacyjna Rada Naukowa / Scientific Board
Przewodniczący / Head:
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - Sosnowiec
Członkowie / Members:
Prof. dr hab. Edward Bańkowski - Białystok
Prof. dr Karmela Barišić - Zagreb, Chorwacja
Prof. dr hab. Jerzy Brandys - Kraków
Prof. dr Vitalis Briedis - Kaunas, Litwa
Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska - Łódź
Prof. dr Benito Del Castillo Garcia - Madrid, Hiszpania
Prof. dr. Lionel Buéno - Toulouse, Francja
Prof. dr hab. Kazimierz Głowniak - Lublin
Prof. dr hab. Edmund Grześkowiak - Poznań
Prof. dr Filiz Hincal - Ankara, Turcja
Prof. dr. Michael Horowitz - Adelaide, Australia
Prof. dr med. Kinga Howorka - AKH, UW, Wien, Austria
Prof. dr hab. Renata Jachowicz - Kraków
Prof. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - Lublin
Prof. dr hab. Krzysztof Jonderko - Sosnowiec
Prof. dr hab. Marcin Kamiński - Katowice
Prof. dr Vesna Kuntić - Belgrade, Serbia
Prof. dr hab. Jan Pachecka - Warszawa
Prof. dr hab. Jerzy Pałka - Białystok
Prof. dr hab. Janusz Pluta - Wrocław
Prof. dr hab. Janusz Solski - Lublin
Prof. dr Hiroshi Suzuki - Tokyo, Japonia
Prof. dr hab. Yanusz Wegrowski - Reims, Francja
Prof. dr hab. Marek Wesołowski - Gdańsk
Prof. dr Mira Zečević - Belgrade, Serbia
Sekretarz Naukowy / Scientific Board Secretary:
Dr n. med. Robert D. Wojtyczka
Członkowie Kolegium Redakcyjnego / Members of Editorial Board:
Dr n. farm. Paweł Olczyk
Dr n. biol. Małgorzata Kępa
Mgr Anna Szeremeta
Mgr Agnieszka Jura – Półtorak
Dr n. hum. Anna Kierczak
Wydawca / Publisher:
Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego
Adres Wydawcy / Publisher Adress:
Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego
ul. Wiśniowa 25/2, 43-300 Bielsko-Biała, Polska / Poland
tel. +48 33 817 28 79, fax +48 33 817 36 31
Prezes / President: dr n. med. Adam Kwieciński (Ph.D. M.D.)
Marketing Manager:
Opracowanie graficzne / Graphics:
Agnieszka Romańska
Robert Cyganik
Nakład: do 7 000 egz. / Print run: up to 7000 copies
Skład / Technical Editor:
Jerzy Partyka
Farmaceutyczny Przegląd Naukowy jest współfinansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego.
Scientific Review in Pharmacy is financially supported by Ministry of Science and Higher Education.
Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego. Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawach
z 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja zastrzega sobie prawo dostosowania
nadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe jedynie za zgodą
wydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcja
nie odpowiada.
All published papers in Scientific Review in Pharmacy are protected by copyright
laws (according to Law Gazette NO 24, item. 83). Board of Editors reserves the
rights to harmonize the papers obtained to journal rules and requirements. Reprints
are allowed only after Publisher agreement. Board of Editors are not responsible for
advertisements and reader letters.
Zdj. Zygmunt Wieczorek
Szanowni Państwo,
Koleżanki i Koledzy,
Drodzy Czytelnicy
Oddajemy w Państwa ręce drugi w bieżącym roku numer Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego.
Z przyjemnością informuję, iż punktacja naszego czasopisma w ocenie Index Copernicus Journal Evaluation
Report znowu wzrosła w ostatnim czasie, osiągając wartość 4.55. Wprawdzie wzrost to niewielki od ostatniej,
sprzed dwóch miesięcy oceny, ale dogłębna analiza ankiety ewaluacyjnej wykazała, iż możemy ubiegać się o podwyższenie tej oceny, nawet o ułamek punktu. Poczyniliśmy
też inne jeszcze kroki – poczekamy na efekty – by wspiąć
się na wyższy szczebelek ewaluacyjnej drabiny. Wiadomo
wprawdzie, iż to nie punkty – same w sobie – stanowią
o wartości czasopisma, lecz zamieszczane w nim prace, ale
wiemy też, że na uznanie pracować trzeba długo i mozolnie.
Wszystko przed nami. Tak więc, pracujmy razem dla nas
samych, by Farmaceutyczny Przegląd Naukowy znalazł się
w zaszczytnym towarzystwie najlepszych polskich czasopism.
W niniejszym numerze zapraszamy w imieniu Organizatorów do udziału w niezwykłej uroczystości obchodów
90-lecia szacownego Jubilata, jakim jest wspaniały, dla wszystkich otwarty i przyjazny, o znaczących osiągnięciach dla polskiej i międzynarodowej farmacji, Wydział Farmaceutyczny
Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego
w Poznaniu. Rocznicowe uroczystości, zaplanowane na
17 – 18 czerwca br., uświetnione będą Ogólnopolską Konferencją Naukową p.t. „Postęp w ocenie jakości substancji
i produktów leczniczych”. Zgodnie z życzeniem Prze-
wodniczących Komitetu Organizacyjnego, Pani Profesor
dr hab. Anny Jelińskiej oraz Pana Profesora dr hab. Edmunda Grześkowiaka – Dziekana Wydziału Farmaceutycznego Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu, a jednocześnie
Członka Konsultacyjnej Rady Naukowej naszego czasopisma, wybrane prace, prezentowane na Konferencji, będą
w formie pełnotekstowych prac drukowane w Farmaceutycznym Przeglądzie Naukowym. A zatem, zapraszam serdecznie
w imieniu Organizatorów do uczestnictwa nie tylko w tych
szczególnych uroczystościach Uczelni – jak miło, że od nas
starszej, ale jednocześnie – do czynnego uczestnictwa w tak
ważnej dla środowiska farmaceutycznego Konferencji. Życzymy organizatorom i Dostojnemu Jubilatowi wspaniałych
i udanych obchodów rocznicowych, a uczestnikom Konferencji jak i Organizatorom tego Przedsięwzięcia – owocnych i pełnych sukcesów naukowych obrad.
Tradycyjnie zachęcam do lektury prac zamieszczonych
w niniejszym numerze Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego, o zróżnicowanej tematyce, choć skupiającej się wokół
różnych aspektów nauk farmaceutycznych i medycznych.
Życząc owocnej lektury oraz ciepłych i serdecznych myśli o naszym Farmaceutycznym Przeglądzie Naukowym,
serdecznie Państwa pozdrawiam,
Redaktor Naczelny
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk
Farmaceutyczny
Przegląd Naukowy
Miesięcznik
Index Copernicus 3,66
MNiSW 4
Nr 2 / 2010
Spis treści
jako problem współczesnej farmakoterapii0
Non-adherence to treatment regimen
as a contemporary pharmacotherapy problem
Sekrecja interleukiny-6 (IL-6) 0
przez transformowane komórki nabłonkowe jelita grubego
traktowane lipopolisacharydami bakterii Desulfovibrio desulfuricans 0
Interleukin-6 (IL-6) secretion by malignant epithelial colorectal cells treated
with Desulfovibrio desulfuricans lipopolysaccharides0
Application of EPR spectroscopy to examination
of free radicals in thermally sterilized chlortalidone
Zastosowanie spektroskopii EPR do badań wolnych rodników
komórek linii A549 pod wpływem oddziaływania holoksanu
i wolnozmiennego pola elektromagnetycznego – in vitro 0
Assessment of activity of lactase dehydrogenase in cell culture
effected by A549 of holoxan and low-frequency electromagnetic field – in vitro study0
8
15
21
26
Molekularne mechanizmy działania leków immunosupresyjnych
Molecular mechanisms of immunosuppressive drugs activity
30
Molecular diagnostics of achondroplasia
37
izolowanych ze środowiska szpitalnego0
Analysis of molecular polymorphism of Staphylococcus spp.
strains isolated from hospital environment0
40
Rejestracja uczestników (w holu Centrum
Kongresowo-Dydaktycznego)
Rejestracja uczestników (w holu Centrum
Kongresowo-Dydaktycznego)
45
15
Standardy kształcenia na Wydziałach Farmaceutycznych w Polsce
Wykład 2:
Historia Wydziału Farmaceutycznego Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
prof. dr hab. E. Grześkowiak,
dr hab. Anita Magowska
Wykład 1:
Uroczyste otwarcie obchodów jubileuszu 90lecia Wydziału Farmaceutycznego Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Konferencja Dziekanów
15
Komunikat 1
Komunikat 2
Dyskusja
Spotkanie towarzyskie
1630 – 1645
1645 – 1715
1900
Wykład 2
Wykład 1
Otwarcie Konferencji
1615 – 1630
15 – 16
45
1515 – 1545
Sesja 1.
1500 – 1515
Konferencja „Postęp w ocenie jakości
substancji i produktów leczniczych”
1200 – 1400
1015 – 1100 Wystąpienia Gości
945 – 1015
9 –9
9 –9
15
00
(Centrum Kongresowo-Dydaktyczne,
ul. Przybyszewskiego 37a, 60-356 Poznań)
Sesja Jubileuszowa: godz. 900 – 1400
800 – 900
Czwartek 17 czerwca 2010 roku
1500 – 1800
Środa 16 czerwca 2010 roku
Program Konferencji
Wykład 5
Dyskusja
930 – 1000
1000 – 1030
1030 – 1100
Komunikat 6
1215 – 1230
Przerwa na lunch
1300 – 1330
1330 – 1430
15
Zakończenie obrad
ul. Grunwaldzka 6 Poznań 60-780
60-780 Poznań
Tel. 0-61 8546650, fax. 061-8546652
Katedra i Zakład Chemii Farmaceutycznej
Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego
w Poznaniu
Dr Przemysław Zalewski, tel. 061 8546649
[email protected]
Dr Agnieszka Sobczak, tel. 061 8546644
[email protected]
Biuro konferencji
Prof. UM dr hab. Edmund Grześkowiak
Prof. UM dr hab. Anna Jelińska
Przewodniczący Komitetu
Organizacyjnego
Dokładny program będzie podany w Komunikacie nr 3
16 – 16
00
Sesja 4 (Posterowa) 1430 - 1600
Komunikat 8
Dyskusja
1245 – 1300
12 – 12
Komunikat 7
Komunikat 5
1200 – 1215
45
Komunikat 4
1145 – 1200
30
Komunikat 3
1130 – 1145
Sesja 3.
Wykład 3
Wykład 4
900 – 930
Sesja 2.
(Collegium Stomatologicum
ul. Bukowska 70, 60-812 Poznań)
Piątek 18 czerwca 2010 roku
www.chefa.ump.edu.pl/konferencja
Poznań 17-18 czerwca 2010
Pod patronatem honorowym JM Rektora
Uniwersytetu Medycznego
im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Prof. dr hab. Jacka Wysockiego
Postęp w ocenie jakości substancji
i produktów leczniczych
Ogólnopolską Konferencję Naukową
oraz
Uroczystość 90-lecia
Wydziału Farmaceutycznego
Uniwersytetu Medycznego
im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
zapraszają na
Polskie Towarzystwo Farmaceutyczne
w Poznaniu
Katedra i Zakład Chemii Farmaceutycznej
Komisja Analizy Leku
Komitetu Terapii i Nauk o Leku PAN
w Poznaniu
Dziekan Wydziału Farmaceutycznego
Komunikat nr 2
Streszczenia
Streszczenie pracy wraz z tytułem, rysunkami, wzorami chemicznymi i wykresami zamieszczonymi w tekście w formie gotowej do
publikacji nie może przekroczyć jednej strony
formatu A4. Streszczenia powinny być przygotowane w edytorze Microsoft Word 2003
lub nowszej wersji, zachowanym jako plik
z rozszerzeniem *.doc.
Streszczenia należy przesłać do 31 stycznia
2010 roku, w załączniku na adres: [email protected] lub wydrukowane oraz w
wersji elektronicznej pocztą na adres biura
konferencji z dopiskiem "Konferencja Streszczenie".
Wymagania redakcyjne streszczeń
Noclegi
Na życzenie uczestników organizatorzy rezerwują pokoje 1-2 osobowe w pobliżu miejsca obrad, w:
� Centrum Kongresowym Instytutu Ochrony
Roślin, ul. Miczurina 20A
(pokój 1-os. 215 zł, 2-os. 275 zł)*
� Hotelu Gromada, ul. Babimojska 7
(pokój 1-os. 195 zł, 2-os. 250 zł)*
� Hotelu 222, ul. Grunwaldzka 222
(pokój 1-os. 180 zł, 2-os. 220 zł)*
* Ceny hoteli mogą ulec zmianie.
Zgłoszenia
Udział w konferencji należy zgłosić do 31
stycznia 2010 roku poprzez wypełnienie
formularza zgłoszeniowego i przesłanie go
pocztą na adres biura konferencji z dopiskiem
"Konferencja - Zgłoszenie" lub w załączniku
na adres:
[email protected] z dopiskiem „Konferencja – zgłoszenie”
Opłata
Jeżeli dotyczy
**
Właściwe zaznaczyć
� udział w konferencji – 200 zł, płatne do
28.02.2010;
� emerytowani pracownicy nauki, doktoranci, studenci – 50 zł, płatne do 28.02.2010.
.......................................................................................................................
Uczestnik zjazdu �
Emerytowany pracownik nauki �
Student, Doktorant �
Nocleg: 16/17.06.2010 � 17/18.06.2010 �
Miejsce zakwaterowania: Hotel 222 �
Centrum Kongresowe � Hotel Gromada �
Pokój: 1 os. � 2 os. �
Imię i Nazwisko współlokatora**
Tytuł naukowy (student)....................................
Imię i Nazwisko.................................................
Adres..................................................................
Telefon kontaktowy...........................................
Email................................................................
Miejsce pracy.....................................................
...........................................................................
TAK NIE
Poster *
Komunikat* TAK NIE
*
Edytor tekstu - Microsoft Word 2003 lub nowsza wersja,
Czcionka - Times New Roman CE,
Tytuł streszczenia - 14 pkt,
Autorzy (imię, nazwisko) - 12 pkt, kursywa,
Katedra, Uczelnia, Instytut - 11 pkt,
Tekst streszczenia - 11 pkt,
Marginesy: prawy i lewy - 4,25 cm, górny i
dolny - 5,25 cm, wyrównanie dwustronne,
wcięcie 0,55.
Odstęp między wierszami - pojedynczy.
Organizatorzy pragną przypomnieć, że
Autorzy ponoszą odpowiedzialność za
poprawność przesłanego streszczenia,
które nie będzie korygowane.
Wpłat należy dokonywać na konto Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego
w Poznaniu, ul.Fredry 10, 61-701 Poznań;
numer konta:
BH w Warszawie o/Poznań
56 1030 1247 0000 0000 4771 8000
tytułem "Konferencja Farmacja 2010"
Ogólnopolska konferencja naukowa „Postęp w ocenie jakości substancji i produktów leczniczych”
Poznań, 17-18 czerwca 2010
FORMULARZ ZGŁOSZENIOWY
Farm Przegl Nauk, 2010,2, 8-14
jako problem współczesnej farmakoterapii
Non-adherence to treatment regimen
as a contemporary pharmacotherapy problem
1
Marcin Skotnicki, 2 Agnieszka Skotnicka, 2 Edmund Grześkowiak, 1 Janina Lulek
Katedra i Zakład Technologii Postaci Leku, Wydział Farmaceutyczny,
Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
2
Katedra i Zakład Farmacji Klinicznej i Biofarmacji, Wydział Farmaceutyczny
Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
1
Streszczenie
Zalecenie stosowania leku jest najczęstszą interwencją
medyczną w krajach wysoko rozwiniętych. Przy założeniu, że lek został odpowiednio dobrany przez lekarza do
jednostki chorobowej, jednym z najważniejszych czynników wpływających na skuteczność farmakoterapii jest
przestrzeganie przez pacjenta zaleceń lekarza. Zjawisko
to jest szczególnie istotne w przypadku chorób przewlekłych, gdzie nieprzestrzeganie przez pacjenta zaleceń
lekarskich może prowadzić do pogorszenia jego stanu
zdrowia, zwiększenia częstości wizyt w poradniach specjalistycznych, wzrostu kosztów leczenia i ostatecznie
do przedwczesnego zgonu. Spośród czynników wpływających na nieprzestrzeganie zaleceń lekarskich, istotną
rolę odgrywają przekonanie pacjenta o potrzebie leczenia oraz wiedza na temat choroby i zaleconej farmakoterapii. Jednym z najważniejszych działań prowadzących
do poprawy przestrzegania zaleceń terapeutycznych jest
odpowiednia edukacja pacjentów przez lekarzy, personel
pielęgniarski i farmaceutów. Zwrócenie uwagi na zjawisko niedostatecznego przestrzegania zaleceń lekarskich
i uwzględnienie problemu w codziennej praktyce pracowników służby zdrowia może przyczynić się do zwiększenia bezpieczeństwa i skuteczności farmakoterapii,
a w konsekwencji do poprawy jakości życia pacjentów.
Abstract
Medication prescribing is the most common medical intervention in developed countries. Assuming the correct
drug for the condition has been prescribed, one of the
most important factors leading to pharmacotherapy effectiveness is adherence to medication. Adherence to treatment regimens is important to achieve optimal disease
management particularly in chronic conditions, where
non-adherence to medical treatments leads to worse health
outcomes, increased number of clinic visits, increased
healthcare expenditures and even early deaths. Among the
various factors associated with adherence patient beliefs
and knowledge about the condition and recommended
pharmacotherapy are the most influential set of factors.
One of the most important interventions leading to adherence improvement is patient education provided by physicians, nursing staff and pharmacists. The growing interest
in understanding the causes of non-adherence and applying successful interventions in the everyday practice may
facilitate the increase of patient level of adherence and
increase the safety and efficacy of pharmacotherapy and
finally improve patients quality of life.
Key words: medication non-adherence, pharmacotherapy, patient education, intervention
Słowa kluczowe: non-adherence, farmakoterapia, edukacja pacjenta, interwencja
Zalecenie stosowania leku jest najczęstszą interwencją
medyczną w krajach wysoko rozwiniętych [1]. Przy założeniu, że lek został odpowiednio dobrany przez lekarza
do jednostki chorobowej, jednym z najważniejszych czynników wpływających na skuteczność farmakoterapii jest
przestrzeganie przez pacjenta zaleceń lekarza. Jest rzeczą
oczywistą, iż lek nie stosowany lub stosowany niewłaściwie
nie wykazuje pożądanego działa terapeutycznego. Badania
kliniczne z użyciem placebo, dotyczące wpływu przestrzegania zaleceń na śmiertelność, wykazały znaczny spadek ry-
8
zyka śmiertelności wraz ze wzrostem stopnia przestrzegania
zaleceń [1, 2]. Szacuje się, że ponad połowa pacjentów nie
stosuje się do zaleceń farmakoterapeutycznych [3, 4]. Niski
stopień przestrzegania zaleceń lekarskich może ograniczyć
skuteczność opieki zdrowotnej na wielu etapach procesu leczenia i w konsekwencji uniemożliwić osiągnięcie zaplanowanego celu terapeutycznego, przyczyniając się do wzrostu
nakładów na służbę zdrowia poprzez wzrost liczby pacjentów hospitalizowanych [5-7]. Dlatego też przestrzeganie zaleceń lekarskich jest punktem kluczowym dla skutecznej te-
rapii oraz pozostaje istotnym wyzwaniem dla pracowników służby zdrowia, szczególnie w przypadku terapii
schorzeń o charakterze przewlekłym,
wymagających długotrwałej i regularnej farmakoterapii. Poznanie i zrozumienie przyczyn nieprzestrzegania
zaleceń lekarskich przez pacjentów
oraz wskazanie sposobów ich poprawy wydaje się być priorytetem
w nowoczesnym systemie opieki
zdrowotnej.
Podstawowe terminy związane ze
zjawiskiem nieprzestrzegania zaleceń
lekarskich to:
compliance - zgodność stosowania się pacjenta do zaleceń
lekarza w zakresie prowadzo- Ryc. 1. Czynniki wpływające na przestrzeganie zaleceń lekarskich (adherence).
nej terapii;
adherence - zgodność stosowania się do zaleceń oraz współpraca pacjenta zagrożenia zdrowia i nie motywuje pacjenta do kontynuacji
z lekarzem w zakresie prowadzonej terapii (uwzględ- leczenia [9]. Niezamierzone non-adherence jest najczęściej
konsekwencją zapominania o przyjmowaniu leku, złożonienie woli pacjenta);
concordance - czynny udział pacjenta w terapii, nego schematu dawkowania i ilości zażywanych leków,
współdecydowanie pacjenta o przebiegu terapii np. trudności z przyjmowaniem leku czy współistniejących
zaburzeń widzenia oraz ograniczenia funkcji poznawczych
wspólne ustalanie diety;
persistence - wytrwałość pacjenta w kontynuowaniu [1, 10, 11]. Niezamierzone nieprzestrzeganie zaleceń lekarskich jest zjawiskiem znacznie bardziej powszechnym i wyzaleconej terapii.
stępuje sześć razy częściej niż zamierzone [1].
Non-adherence może przejawiać się szeregiem odstępstw
Terminy te obejmują zarówno przestrzeganie zaleceń
dotyczących farmakoterapii jak i przestrzeganie zaleceń od zaleconego przez lekarza postępowania i polegać na:
- stosowaniu leku w innym celu niż został on przepidotyczących wszelkich innych instrukcji udzielonych przez
sany, np. zastosowanie antybiotyku w leczeniu przelekarza (np. dieta czy aktywność fizyczna). Ze względu na
ziębienia;
to, iż farmakoterapia stanowi jeden z istotniejszych elemen- zastosowaniu leku z wykorzystaniem niewłaściwej
tów procesu leczenia, powyższe terminy często odnosi się
drogi podania, np. stosowanie iniekcji doustnie;
wyłącznie do stosowania leków. Zgodność (compliance)
- wystąpieniu interakcji leku z innymi lekami lub prostosowanej przez pacjenta terapii z zaleceniami lekarskimi
duktami spożywczymi, w wyniku której zmienia się
jest najbardziej elementarnym określeniem związanym ze
efekt terapeutyczny, np. zażycie bisfosfonianów po
zjawiskiem przestrzegania zaleceń lekarskich, jednak nie
posiłku;
uwzględnia aktywnego uczestnictwa pacjenta w procesie
- pomijaniu kolejnej dawki leku, np. omijaniu dawki
leczenia. Zaakceptowanie terapii i współpraca (adherence)
leków hipotensyjnych, ze względu na dobre samopoczy też czynny udział pacjenta w planowaniu terapii (conczucie i właściwe ciśnienie tętnicze pacjenta;
cordance) mają dużo większy wpływ na osiągniecie celu
- stosowaniu leku o niewłaściwej porze dnia, np. stoterapeutycznego niż bierne stosowanie się do zaleceń lekarsowaniu simwastatyny o innej porze niż wieczorem;
skich (compliance) [8].
- „wakacjach lekowych” tj. przerwaniu stosowania
Nieprzestrzeganie zaleceń lekarskich i brak współpraleku na okres kilku dni przez pacjenta, który na co
cy pacjenta z lekarzem (non-adherence) może być zachodzień przyjmuje lek systematycznie; zjawisko to
waniem świadomym lub nieświadomym. Z zamierzonym
związane jest z ze świętami lub wydarzeniami zakłónieprzestrzeganiem zaleceń lekarskich mamy do czynienia
cającymi codzienny rytm życia pacjenta;
wówczas, gdy pacjent świadomie i dobrowolnie nie przyj- przestrzeganiu zaleceń lekarskich o typie „białego
muje zaleconego leku, samodzielnie zmienia zalecony schefartucha”, czyli na lepszym przestrzeganiu zaleceń
mat dawkowania lub świadomie stosuje lek niewłaściwie.
w okresie około terminu wizyty u lekarza i gorszym
Zamierzone nieprzestrzeganie zaleceń lekarskich i brak
pomiędzy terminami wizyt kontrolnych.
współpracy pacjenta z lekarzem wynika głównie z negatywnego stosunku pacjenta do procesu leczenia czy też z braku
Niestosowanie się do zaleceń lekarskich jest zjawiskiem
przekonania o konieczności terapii oraz samooceny stanu
zdrowia. Zamierzone nieprzestrzeganie zaleceń lekarskich powszechnym, zależnym od wielu czynników. Wyróżnia się
występuje często w przypadku chorób przewlekłych takich pięć głównych przyczyn prowadzących do wystąpienia nonjak nadciśnienie czy osteoporoza, gdyż asymptomatyczny adherence (Ryc. 1). Istotnym czynnikiem wpływającym na
przebieg choroby powoduje niski poziom postrzeganego non-adherence jest sytuacja ekonomiczna pacjenta i system
9
Farm Przegl Nauk, 2010, 2
nia leków jest zjawiskiem powszechnym, któremu poświęca się coraz
większą uwagę. Z przeprowadzonych
badań wynika, iż w przypadku cukrzycy typu 2 jedynie u 28% pacjentów osiągany jest cel terapeutyczny,
tj. prawidłowa kontrola poziomu glukozy we krwi [3]. W przypadku nadciśnienia tętniczego wyniki polskich
badań epidemiologicznych NATPOL
Plus pokazują, że efektywność leczenia hipotensyjnego wynosiła jedynie
12%, regularnie przyjmowało zalecone leki tylko 62% chorych, 19% od
czasu do czasu, a pozostali pacjenci
nie przyjmowali przepisanego leku
w ogóle [15].
Jedną z miar adherence jest wyrażony
Ryc. 2. Porównanie adherence w wybranych chorobach przewlekłych [zmodyfikow procentach „współczynnik posiadawane wg 17].
nia leku” (ang. Medication Possession
Ratio, MPR), oznaczający liczbę dni,
służby zdrowia, aczkolwiek zjawisko to obserwuje się nie w których chory posiada niezbędny dla terapii lek w stosuntylko w krajach rozwijających się, ale również wysoko ku do czasu trwania terapii [16]. Współczynnik ten odzwierrozwiniętych, z dobrze funkcjonującym systemem opie- ciedla systematyczność realizacji recept i porównuje czas,
ki zdrowotnej. Jednym z problemów wynikającym z kon- na jaki leki zostały przepisane z czasem pomiędzy realizacją
strukcji systemu opieki zdrowotnej jest zbyt krótki czas recept. Przyjmuje się, że pacjenci stosują się do zaleceń leprzeznaczony na wizytę lekarską, nie pozwalający leka- karza, jeśli adherence wynosi od 80% do 120%. Porównanie
rzowi na kompleksowe wyjaśnienie pacjentowi problemów adherence dla wybranych chorób przewlekłych przedstazwiązanych z wdrożoną terapią. Znaczące zwiększenie wiono na rycinie 2. W celu określenia skali problemu opraskuteczności terapii stwierdza się wtedy, gdy w efekcie cowano szereg metod pomiaru stopnia przestrzegania zalewspółpracy z lekarzem, pacjent dostrzega związek przyczy- ceń lekarskich. Pośród dostępnych metod przydatne i łatwe
nowo-skutkowy pomiędzy leczeniem farmakologicznym, w stosowaniu wydają się być liczenie tabletek, zbieranie
a własnym stanem zdrowia [12]. Natomiast u pacjenta, z aptek(i) pacjenta danych odnośnie realizacji recept czy
który nie współpracuje z lekarzem i niedostatecznie rozu- wywiad z pacjentem. Jednakże każda z nich może być obarmie celowość prowadzonej terapii, obserwuje się obniże- czona błędem, nie dając wiarygodnego i tym samym satysnie efektywności leczenia, co skutkuje większą liczbą po- fakcjonującego wyniku. Dane otrzymane z apteki odnośnie
wikłań nieleczonej choroby i zwiększa śmiertelność. Inną realizacji recept nie zawsze są dostępne (np. w Polsce nie
ważną przyczyną non-adherence związaną z systemem prowadzi się imiennych kartotek pacjentów z historią stoopieki zdrowotnej jest proceda te "jajca" z kolorem bior się sowanych leków) oraz świadczą wyłącznie o zrealizowaniu
z tego, że autorzy nie przysyłaj rycin w tiffie czy eps-eura recepty, a nie zastosowaniu leku. Wywiad z pacjentem jest
wydawania leków w aptekach ogólnodostępnych. Wyniki metodą opierającą się na założeniu, iż pacjent nie ukryje inbadań wskazują, że nie wszyscy pacjenci zapamiętują ust- formacji o niezastosowaniu leku. Metoda ta w przypadku nienie przekazane zalecenia lekarza i/lub dostatecznie rozu- których pacjentów może być trudna w realizacji, ze względu
mieją informacje zawarte w ulotce przylekowej [13, 14]. na obawę pacjenta dotyczącą negatywnej oceny ze strony
Brak obowiązku opatrzenia leku wydanego z apteki etykietą lekarza czy ze względu na stan pacjenta, np. uzależnienie
z informacją na temat dawkowania, sposobu przyjmowa- od leku. Liczenie tabletek i porównanie ze schematem dawnia oraz zaleconych środków ostrożności zwiększa ryzyko kowania świadczy wyłącznie o wyjęciu leku z opakowania
wystąpienia non-adherence. Przyczyną nieprzestrzegania oraz nie daje informacji o porze, w której lek został zażyty.
zaleceń lekarskich jest również sam pacjent, np. jego prze- W ostatnich latach w USA i Kanadzie wprowadzono elekkonanie o potrzebie leczenia czy styl życia. Jak wspomnia- troniczne systemy monitorowania przyjmowania leków (np.:
no, nieprzestrzeganie zaleceń i brak współpracy pacjenta MEMS® - Medication Event Monitoring System). Stosowane
z lekarzem może być zachowaniem zamierzonym lub nieza- przez pacjenta wtórne opakowanie leku posiada urządzenie
mierzonym. Poszczególne czynniki wpływające na oba typy elektroniczne rejestrujące każde pobranie leku z opakowanon-adherence przedstawiono w tabeli I. Spośród szeregu nia. Opakowanie dzięki oprogramowaniu umożliwia odtwoprzyczyn nieprzestrzegania zaleceń terapeutycznych naj- rzenie historii wyjęcia leku, co jednak nie jest jednoznaczne
częstszymi są zapominanie o konieczności przyjęcia leku, z jego zażyciem. Sposobami, które pozwalają potwierdzić
chwilowy brak objawów choroby, zbyt wysoki koszt leków, przyjęcie leku są metody, polegające na monitorowaniu
brak wiary w skuteczność terapii oraz efekty uboczne zwią- stężenia lub badaniu obecności leku lub/i jego metabolitów
zane ze stosowaniem leku.
w płynach ustrojowych pacjenta [18-20]. Ponadto dzięki
Nieprzestrzeganie zaleceń lekarskich odnośnie stosowa- analizie farmakokinetycznej można oszacować zastosowa-
10
Tab. I. Przyczyny nieprzestrzegania zaleceń lekarskich dotyczących stosowania
leków
i 30-75% przyjęć do szpitala [23-25].
Wyniki międzynarodowego badania
non-adherence w cukrzycy typu 2
Przyczyny nieprzestrzegania zaleceń lekarskich dotyczących stosowania leków
wykazały, iż całkowity koszt leczeNiezamierzone
Zamierzone
nia populacji 10 milionów chorych
Trudno akceptowalna przez pacjenta
Zapominanie o przyjęciu leku
wynosi około 29 miliardów dolarów,
postać leku
Złożony schemat leczenia
Droga podania
stanowiących około 5% całkowitych
Występowanie działań niepożądanych
wydatków na służbę zdrowia w każDuża liczba leków
i reakcji ubocznych
dym z krajów. Całkowity koszt opieki
Charakter schorzenia
Opakowanie leku
zdrowotnej nad pacjentami z cukrzyNiezrozumienie zalecenia lekarza odnośnie
cą typu 2 jest średnio 1,5 razy więkCena leku
stosowania leku
szy niż prognozowany średni koszt
Ustna forma instrukcji odnośnie farmakoterapii Brak zaufania pacjenta do lekarza
opieki na statystycznego obywateBrak wiary w skuteczność terapii
la. Ponadto koszt tej opieki wzrasta
Niedostateczna wiedza na temat
Czynniki socjo-demograficzne (płeć, wiek,
2 do 3,5 krotnie w przypadku rozwifarmakoterapii
wykształcenie, styl życia)
nięcia się mikro- i makroangiopatii
Dobre samopoczucie podczas terapii
(asymptomatyczny przebieg choroby)
u pacjenta. Niekontrolowana cukrzyca
Czas trwania terapii
w sposób pośredni wpływać może
Brak zainteresowania ze strony lekarza lub farmaceuty właściwym przyjmowaniem leku
również na gospodarkę poprzez
przez pacjenta
zmniejszenie produktywności, zwiękLiczba lekarzy prowadzących
szenie absencji pracowników, wzrost
Schorzenia towarzyszące
odsetka przejść na renty czy wcześniejsze emerytury [26-28]. Koszty
non-adherence w nadciśnieniu tętniczym sięgają niemal 13% całkowitych wydatków na służbę zdrowia, zaś
poprawa adherence w tak powszechnym schorzeniu jak nadciśnienie mogłaby się przyczynić między innymi
do poprawy sytuacji ekonomicznej
służby zdrowia [3]. Konsekwencje
kliniczne non-adherence to przede
wszystkim wzrost zachorowalności, niepowodzenie wdrożonej terapii, zaostrzenie przebiegu choroby,
20% wzrost częstości występowania możliwych do uniknięcia reakcji
niepożądanych, zwiększenie częstości wizyt lekarskich, hospitalizacji,
a nawet śmierć pacjentów [14, 29,
Ryc. 3. Karta Przypominająca dla pacjenta wydawana w aptece.
30]. Ponadto niski adhernece wiąże
ny schemat dawkowania. Metoda ta jest jednak inwazyjna się ze wzrostem lekooporności, zwłaszcza antybiotykoopori kosztowna, stąd nie może być stosowana rutynowo. Opisane ności czy oporności na leki przeciwwirusowe stosowane
metody zazwyczaj nie są stosowane samodzielnie, dla wia- w terapii HIV/AIDS. Non-adherence w terapii HIV/AIDS
rygodnej oceny non-adherence wykorzystuje się informacje może prowadzić do gwałtownego wzrostu replikacji wirusa
uzyskane z co najmniej dwóch metod pomiarowych np. wy- i powstania zmutowanych szczepów opornych na leki [31].
Nieprzestrzeganie zaleceń lekarskich wielokrotnie obserwiadu z pacjentem oraz liczenia tabletek.
Brak współpracy pacjenta z lekarzem i brak zgod- wuje się w terapii gruźlicy, gdzie niski stopień adherence
ności stosowanej terapii z zaleceniami może wiązać się jest podstawową przyczyną niepowodzenia terapii, nawrotu
z poważnymi konsekwencjami zdrowotnymi dla pacjen- choroby oraz wzrostu wytwarzania lekooporności, co wiąże
ta. Nieprzestrzeganie zaleceń lekarskich stanowi utraconą się ze wzrostem zagrożenia epidemiologicznego dla całego
możliwość powrotu do zdrowia pacjenta jak i utratę części społeczeństwa [32]. Non-adherence może prowadzić również
środków wydatkowanych na leczenie. Konsekwencje spo- do rozwinięcia lekozależności, a szczególnie uzależnienia od
łeczno-ekonomiczne non-adherence szczególnie w przy- benzodiazepin czy opioidów.
Identyfikacja problemu nieprzestrzegania zaleceń lekarpadku schorzeń przewlekłych są bardzo poważne. Nonadherence dotyczy 50% wszystkich stosowanych leków, skich odnośnie stosowania leków oraz wskazanie jego etioktórych bezpośredni koszt w USA wynosi około 300 mi- logii jest punktem wyjścia dla skutecznej eliminacji tego
liardów dolarów rocznie [21, 22]. Non-adherence wiąże się zjawiska. Jedną z najważniejszych metod niezależnie od
z możliwą do uniknięcia śmiercią około 125 tysięcy cho- podłoża non-adherence jest odpowiednia edukacja pacjenta
rych, co stanowi 10% wszystkich przypadków hospitalizacji przez lekarza, personel pielęgniarski czy farmaceutę.
11
Tab. II. Sposoby poprawy stopnia przestrzegania zaleceń lekarskich
Sposoby poprawy adherence
Interwencje społeczno-ekonomicze
Reforma systemu finansowania opieki zdrowotnej (np. specjalne ubezpieczenia, fundacje)
Działalność stowarzyszeń wspierających określone grupy chorych (np. organizacje wspierające chorych na
AIDS, astmę)
Współpraca pracowników służby zdrowia w opiece nad pacjentem (lekarz, farmaceuta, pielęgniarka)
Kampanie medialne na temat chorób cywilizacyjnych i propagujące samoświadomość społeczeństwa
Edukacja i motywowanie pracowników służby zdrowia w zakresie poprawy adherence
Interwencje terapeutyczne
Uproszczenie schematu dawkowania (np. postaci leku o przedłużonym uwalnianiu, preparaty złożone)
„Szkolenia lekowe” pacjenta (ang. drug coaching) dotyczące stosowanych leków
Modyfikacja postaci lub sposobu przyjmowania leku (np. syrop dla pacjentów mających trudności z
połykaniem tabletek, dodatki smakowe dla leków o nieprzyjemnym smaku, zastosowanie postaci leku
wygodniejszej w użyciu np. inhalatora „easyhaler” czy komory inhalacyjnej (Volumatic® czy AeroChamber®))
Monitorowanie adherence u pacjenta
Interwencje w zakresie zachowań pacjenta
Edukacja pacjenta na temat choroby i jej terapii
Proste pisemne instrukcje dotyczące stosowania leku (np. etykiety apteczne, karty przypominające)
Przypominanie o przyjęciu leku (np. budzik)
Przygotowywanie leków zgodnie ze schematem dawkowania (np.: kasetki na leki, czy systemy dawkowania
przygotowywane przez farmaceutów ang. Medication Compliance Aids)
Dostosowanie godzin przyjmowania leków do codziennych czynności
Wprowadzenie samokontroli objawów choroby przez pacjenta (np.: pomiar ciśnienia tętniczego u pacjentów
z nadciśnieniem tętniczym czy wartości szczytowego przepływu wydechowego (PEF) u pacjentów z astmą)
macja o czasie i sposobie zażycia
leku (np. etykiety apteczne czy
Karta Przypominająca (Ryc. 3)).
Główne sposoby poprawy stopnia
przestrzegania zaleceń lekarskich
przedstawiono w tabeli II. Metaanaliza w zakresie wpływu edukacji pacjenta z cukrzycą w zakresie
samokontroli wykazała niemal
natychmiastową poprawę kontroli glikemii. Badanie to wykazało
ponadto, iż korzyść z edukacji
pacjenta zaczyna się zmniejszać
w okresie od 1 do 3 miesięcy od
interwencji i następuje stopniowy powrót do dawnych nawyków.
Sugeruje to, iż edukacja pacjenta
powinna być jednym z podstawoRyc. 4. Wpływ SMS(ów) o charakterze edukacyjno-przypominającym na stopień wych elementów kompleksowej
kontroli ciśnienia tętniczego (RR < 140/90 mm Hg) wśród pacjentów z nadciśnie- opieki nad pacjentem, w tym opieniem tętniczym leczonych sartanem [36].
ki farmaceutycznej prowadzonej
w aptekach ogólnodostępnych
[35]. Badanie przeprowadzone
Przekonanie pacjenta o potrzebie terapii, wyjaśnienie przez Wizner i wsp. wykazało, że wysyłanie pacjentom
zasad dawkowania oraz zachęcanie pacjenta do zwięk- z nadciśnieniem tętniczym leczonych sartanem, cotygoszenia jego zaangażowania w proces leczenia znacząco dniowych wiadomości SMS o charakterze edukacyjnym
zwiększa adherence [14, 33, 34]. Innymi metodami po- i przypominającym o zaleceniach lekarskich przyczyniło
prawiającymi adherence są: korzystanie przez pacjen- się do istotnego klinicznie obniżenia ciśnienia tętniczego
tów z tzw. kasetek na leki, kojarzenie przyjmowania krwi poprzez zwiększenie stopnia przestrzegania zaleceń
leków z codziennymi czynnościami czy pisemna infor- lekarskich (Ryc. 4) [36].
12
Skutki poprawy adherence mają nie tylko wymiar ekonomiczny obniżając koszty opieki zdrowotnej, ale również
wymiar kliniczny, polegający na lepszej kontroli choroby
i dolegliwości pacjenta oraz wymiar humanistyczny tj.
wzrost satysfakcji pacjenta, lekarza i innych pracowników służby zdrowia ze skutecznie prowadzonej terapii.
Bezpośrednie korzyści ekonomiczne wynikające z poprawy
przestrzegania zaleceń lekarskich dotyczących stosowania
leków to obniżenie kosztów hospitalizacji o 62%, obniżenie
o 48,9 % całkowitych nakładów na służbę zdrowia, ograniczenie o 45% liczby wizyt na izbach przyjęć oraz o 13% wizyt w poradniach specjalistycznych [21]. Poza korzyściami
wynikającymi z poprawy adherence u pacjentów nie można
nie wspomnieć o możliwych negatywnych skutkach tego
zjawiska. Pacjenci, u których non-adherence przejawia się
niedodawkowaniem leku, po wdrożeniu zaleconych dawek
mogą doświadczyć objawów ubocznych, np. w przypadku
leczenia nadciśnienia tętniczego po zastosowaniu zaleconej
dawki i schematu dawkowania inhibitora ACE może wystąpić hipotonia ortostatyczna.
Jedną z najczęstszych przyczyn odpowiedzialnych za
nieskuteczność farmakoterapii jest niedostateczne przestrzeganie przez pacjentów zaleceń lekarskich. Zjawisko to
jest szczególnie istotne w przypadku chorób przewlekłych,
gdyż w efekcie prowadzi ono do pogorszenia stanu zdrowia
pacjentów, zwiększenia częstotliwości wizyt w placówkach
ochrony zdrowia, wzrostu kosztów leczenia, a w skrajnych
przypadkach liczby zgonów. Identyfikacja problemu nieprzestrzegania zaleceń lekarskich i nieprawidłowości w przyjmowaniu leków przez pacjenta są koniecznymi warunkami dla
prowadzenia skutecznej i bezpiecznej farmakoterapii. Lekarz
niebędący świadomym istniejącego problemu, niepotrzebnie
zwiększa dawki leków czy włącza nowe leki zwiększając tym
samym ryzyko wystąpienia objawów ubocznych, reakcji niepożądanych i powikłań terapii. Zwrócenie uwagi na zjawisko
non-adherence i uwzględnienie problemu w codziennej praktyce farmaceutów i lekarzy może przyczynić się do poprawy
bezpieczeństwa i skuteczności farmakoterapii, a w konsekwencji do poprawy jakości życia pacjentów.
Piśmiennictwo:
1. Sahm L, McCurtain A. Adherence to prescribed medication - factors leading to non-adherence and how pharmacist intervention can facilitate improved adherence. Ir
Pharm J 2008; 86: 137-140.
2. Granger BB i wsp. Adherence to candesartan and placebo and outcomes in chronic heart failure in the CHARM
programme: double-blind, randomized, controlled clinical trial. Lancet 2005; 366: 2005-2011.
3. World Health Organization. Adherence to long-term therapies: evidence for action. Geneva, Switzerland: WHO
2003. http://www.who.int/chp/knowledge/publications/
adherence_introduction.pdf (stan z 07.12.2009).
4. Haynes RB, McDonald HP, Garg AX. Helping patients
follow prescribed treatment: clinical applications. JAMA
2002; 288: 2880-2883.
5. Littenberg B, McLean CD, Hurowitz L. The use of adherence aids by adults with diabetes: a cross-sectional
survey. BMC Fam Pract 2006; 5 (7): 1.
6. Wasserfallen J i wsp. Rate, type, and cost of adverse
drug reactions in emergency department admissions. Eur
J Intern Med 2001; 12: 442-447.
7. Col N, Fanale JE, Kronholm P. The role of medication
noncompliance and drug reactions in hospitalizations of
the elderly. Arch Intern Med 1990; 150: 841-845.
8. Wawrzyniak A, Horst-Sikorska W. Motywacja pacjenta a
przestrzeganie zasad terapii w chorobach przewlekłych.
Forum Medycyny Rodzinnej 2008; 2: 420–423.
9. Rossini M i wsp. Determinants of adherence to osteoporosis treatment in clinical practice. Osteoporosis Int
2006; 17: 914-921.
10.Osterberg L, Blaschke T. Adherence to medication. N
Engl J Med 2005; 353: 487-497.
11.Howell G. Nonadherence to medical therapy in asthma: risk factors, barriers, and strategies for improving. J
Asthma 2008; 45: 723-729.
12.O’Malley AS, Forrest CB, Mandelblatt J. Adherence of
low-income women to cancer screening recommendations. J Gen Intern Med 2002; 17: 144-154.
13.Atreja A, Bellam N, Levy SR. Strategies to enhance patient adherence: making it simple. MedGenMed 2005;
7: 4.
14.Martin LR i wsp. The challenge of patient adherence.
Ther Clin Risk Manag 2005; 1: 189-199.
15.Zdrojewski T i wsp. Arterial hypertension in Poland in
2002. J Hum Hypertens 2004; 18: 557-562.
16.Andrade SE i wsp. Methods for evaluation of medication
adherence and persistence using automated databases.
Pharmacoepidemiol Drug Saf 2006; 15: 565–574.
17.Briesacher BA i wsp. Comparison of drug adherence rates among patients with seven different medical conditions. Pharmacotherapy 2008; 28 :437-443.
18.Vitolins MZ i wsp. Measuring adherence to behavioural
and medical interventions. Control Clin Trials 2000; 21:
188-194.
19.Farmer KC. Methods for measuring and monitoring medication regimen adherence in clinical trials and clinical
practice. Clin Ther 1999, 21: 1074-1090.
20.Eidlitz-Markus T i wsp. Use of the urine colour test to
monitor compliance with isoniazid treatment of latent
tuberculosis infection. Chest 2003, 123: 736-739.
21.Kane S, Shaya F. Medication non-adherence is associated with increased medical health care costs. Dig Dis Sci
2008; 53: 1020-1024.
22.Bender BG, Rand C. Medication non-adherence and
asthma treatment cost. Curr Opin Allergy Clin Immunol
2004; 4: 191-195.
23.Vermeire E i wsp. Patient adherence to treatment: three
decades of research. A comprehensive review. J Clin
Pharm Therap 2001; 26: 331-342.
24.LaFleur J, Oderda GM. Methods to measure patient
compliance with medication regimens. J Pain Palliat
Care Pharmacother 2004; 18: 81-87.
25.McDonnell PJ, Jacobs MR. Hospital admissions resulting from preventable adverse drug reactions. Ann Pharmacother 2002; 36: 1331-1336.
26.Hepke KL, Martus MT, Share DA. Costs and utilization
associated with pharmaceutical adherence in a diabetic
population. Am J Manag Care 2004; 10: 144-151.
13
27.American Diabetes Association. Economic costs of diabetes in the U.S. in 2007. Diabetes Care 2008; 31: 596615.
28. Liebl A i wsp. Complications, co-morbidity, and blood glucose control in type 2 diabetes mellitus patients
in Germany-results from the CODE-2 study. Exp Clin
Endocrinol Diabetes 2002; 110: 10-16.
29.Knapp M i wsp. Non-adherence to antipsychotic medication regimens: associations with resource use and costs. Br J Psychiatry 2004; 184: 509-516.
30.Gurwitz JH i wsp. Incidence and preventability of adverse drug events among older persons in the ambulatory
setting. JAMA 2003; 289: 1107-1116.
31.Rathbun RC i wsp. Impact of an adherence clinic on behavioral outcomes and virologic response in treatment
of HIV infection: a prospective, randomized, controlled
pilot study. Clin Ther 2005; 27: 199-209.
data otrzymania pracy: 15.01.2010 r.
data akceptacji do druku: 18.02.2010 r.
Adres do korespondencji:
mgr farm. Marcin Skotnicki
Katedra i Zakład Technologii Postaci Leku
Wydział Farmaceutyczny
Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiego
ul. Grunwaldzka 6, 60-780 Poznań
tel. +48 61 854 66 55
email: [email protected]
14
32.Munro SA i wsp. Patient adherence to tuberculosis treatment: a systematic review of qualitative research. PLoS
Med 2007; 24; 4: e238.
33.Jahng KH i wsp. Preferences for medical collaboration:
patient-physician congruence and patient outcomes. Patient Educ Couns 2005; 57 :308-314.
34.Veazie PJ, Cai S. A connection between medication adherence, patient sense of uniqueness, and the personalization of information. Med Hypotheses 2007; 68 :335342.
35. Norris SL i wsp. Self-management education for adults
with type 2 diabetes: a meta-analysis of the effect on glycemic control. Diabetes Care 2002; 25: 1159-1171.
36.Wizner B i wsp. Zwiększenie skuteczności terapii hipotensyjnej u pacjentów z nadciśnieniem tętniczym dzięki
edukacji przez SMS. Nadciśnienie tętnicze 2009; 13:
147-157.
Sekrecja interleukiny-6 (IL-6)
przez transformowane komórki nabłonkowe jelita grubego
traktowane lipopolisacharydami bakterii
Desulfovibrio desulfuricans
Interleukin-6 (IL-6) secretion by malignant epithelial colorectal cells
treated with Desulfovibrio desulfuricans lipopolysaccharides
Beata Parfiniewicz1, Ludmiła Węglarz1, Marzena Jaworska-Kik2 , Alicja Zajdel2
Katedra i Zakład Biochemii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
2
Katedra i Zakład Biofarmacji Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,
1
Streszczenie
Nabłonek jelita grubego jest ważną częścią śluzówkowego układu immunologicznego. Zaburzenie mechanizmów
tolerancji wobec mikroflory jelitowej prowadzi do chronicznych schorzeń zapalnych jelit, które w znaczącym
stopniu predysponują do rozwoju nowotworów jelita grubego. Dużą rolę w patogenezie nowotworów tej tkanki na
tle zapalnym przypisuje się interleukinie-6 (IL-6). Jednym
z czynników stymulujących komórki do sekrecji IL-6 jest
lipopolisacharyd bakterii Gram-ujemnych (LPS). Badania wykonane w ramach niniejszej pracy służyły ocenie
wpływu endotoksyny wyizolowanej ze szczepu jelitowego bakterii Desulfovibrio desulfuricans na sekrecję IL-6
przez transformowane kolonocyty linii Caco-2. W tym
celu hodowle komórek linii Caco-2 poddano działaniu
różnych stężeń LPS (10, 50 i 100 µg/ml) przez 1, 6, 12 i 24
godziny a następnie stężenie IL-6 oznaczano w mediach
hodowlanych metodą ELISA. Ilość wydzielanej cytokiny
odniesiono do ilości całkowitego białka komórkowego.
W badaniach potwierdzono zdolność transformowanych
komórek linii Caco-2 do konstytutywnej sekrecji IL-6
utrzymującej się na stałym poziomie. LPS badanego
szczepu bakteryjnego w stężeniach 10, 50 i 100 µg/ml
przez 1, 6, 12 i 24 godziny nie wykazał działania stymulującego komórki Caco-2 do wydzielania IL-6.
Abstract
Colon epithelium is an important part of mucosal immunity system. It is known that disturbance of tolerance
mechanisms of the tissue for microorganisms may result
in various types of chronic enteritis. In the most cases,
the inflammatory states of colon could evolved in colon
cancer progression. Moreover, the predominant role in
the pathogenesis of colon cancer is assigned to interleukin-6 (IL-6). IL-6 is an inflammatory cytokine secreted by
various types of cells in response to lipopolysaccharides
(LPSs) of Gram-negative bacteria. To evaluate the effects
of D. desulfuricans – derived endotoxins on IL-6 induction, LPS isolated from intestinal strain were used to stimulate malignant epithelial colorectal Caco-2 cells. They
were treated with LPS of concentrations 10, 50, 100 µg/
ml for 1, 6, 12 and 24 hours. The level of IL-6 in culture
medium was measured by enzyme-linked immunosorbent
assay. The concentration of IL-6 was related to the amount
of total cell protein. It was found that colorectal Caco-2
cells constitutively secrete IL-6 which is unaffected by
cell treatment with LPS at the concentrations used.
Keywords: IL-6, LPS, D. desulfuricans, Caco-2 cells
Słowa kluczowe: IL-6, LPS, D. desulfuricans, komórki
Caco-2
Wstęp
Błona śluzowa przewodu pokarmowego stanowi główną
drogę penetracji czynników zakaźnych i potencjalnie szkodliwych. Organizm człowieka wykształcił wiele nieswoistych i swoistych mechanizmów chroniących błonę śluzową jelit przed zagrożeniami z zewnątrz. Badania dotyczące
funkcji i metabolizmu nabłonka jelita grubego wykazały, że
jest on ważną częścią śluzówkowego układu immunologicznego. Komórki nabłonkowe jelita posiadają zdolność przetwarzania i prezentacji antygenów limfocytom T, a w wyniku stymulacji wykazują ekspresję cząsteczek HLA klasy II
i molekuł adhezyjnych. Badania doświadczalne ostatnich lat
dowiodły również, że komórki tej tkanki są zdolne do se-
15
Jednym z czynników stymulujących komórki do sekrecji IL-6 jest lipopolisacharyd
bakterii Gram-ujemnych. Lipopolisacharyd (LPS, endotoksyna) jest obecny w zewnętrznej
otoczce tych bakterii i pełni
w ich życiu wiele ważnych
funkcji. Jest on czynnikiem antygenowym, warunkuje właściwości chorobotwórcze bakterii,
chroni je przed antybiotykami
i mechanizmami obronnymi
makroorganizmu. LPS oddziałuje na różne komórki organizmu, stymulując je do sekrecji
określonych mediatorów reakRyc. 1. Sekrecja IL-6 przez komórki Caco-2 nie traktowane LPS bakterii D. desulfuri- cji zapalnej, takich jak cytokiny
(TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, ILcans w różnych czasach prowadzenia hodowli.
10), chemokiny, wolne rodniki
tlenowe, cząsteczki adhezyjne, eikozanoidy, tlenek azotu
i czynnik aktywujący płytki
– PAF [7, 8, 9, 10]. Stymulujący wpływ LPS na wydzielanie
cytokin prozapalnych przez
immunokompetentne komórki
krwi oraz komórki śródbłonka
naczyń i mięśni gładkich został
potwierdzony w wielu badaniach,. Bakteryjny LPS będący
produktem flory jelitowej może
przyczyniać się do nasilenia
nieswoistego zapalenia jelit.
Jamy ciała człowieka tworzą
korzystne środowisko dla bakterii beztlenowych. Większość
Ryc. 2. Sekrecja IL-6 przez komórki Caco-2 traktowane LPS bakterii D. desulfuricans tych bakterii, które biorą udział
w zakażeniach mieszanych jest
o stężeniu 10 µg/ml w różnych czasach prowadzenia hodowli.
częścią prawidłowej flory bakteryjnej ludzi. Gatunki z rodzaju
krecji takich cytokin jak IL-8, IL-6, TGFβ-1, leukotrienów Bacteroides dominują u dwóch trzecich zdrowych dorosłych,
i białek układu dopełniacza [1, 2, 3].
a u pozostałej jednej trzeciej przeważają gatunki z rodzaju
Kolonocyty znajdują się w ciągłym kontakcie z hete- Bifidobacterium. Ponadto, badania mikrobiologiczne wykarogennymi populacjami mikroorganizmów komensalnych zały obecność w ludzkiej mikroflorze jelitowej gatunku Dezasiedlających przewód pokarmowy. W warunkach fizjo- sulfovibrio desulfuricans, który należy do heterogennej grupy
logicznych komórki błony śluzowej wykazują tolerancję bakterii redukujących siarczany (BRS). Rola tego gatunku
wobec tych bakterii, są jednak zdolne do indukcji reakcji w przewodzie pokarmowym człowieka nie jest do tej pory
zapalnej w odpowiedzi na bakterie patogenne. Zaburzenie w pełni wyjaśniona, lecz ostatnio spekuluje się, że gatunek
mechanizmów tolerancji wobec mikroflory jelitowej pro- ten może stanowić jedną z przyczyn nieswoistych zapaleń jewadzi do chronicznych schorzeń zapalnych jelit, takich jak lita grubego [11, 12, 13].
choroba Crohna czy wrzodziejące zapalenie jelita grubego,
Operacje chirurgiczne, niedobory immunologiczne jak
które w znaczącym stopniu predysponują do rozwoju nowo- również nowotwory należą do najważniejszych czynników
tworów jelita grubego [4].
predysponujących do zakażeń bakteriami beztlenowym. ZaDużą rolę w patogenezie nowotworów jelita grube- każenia beztlenowcami związane z procesami nowotworogo na tle zapalnym przypisuje się plejotropowej cytokinie wymi występują wtedy, gdy guz nacieka powierzchnię błon
IL-6, której podwyższony poziom obserwuje się w przebiegu śluzowych i ogarnia obecne tam drobnoustroje [14].
wielu przewlekłych chorób zapalnych i nowotworów. Liczne
Celem prezentowanych badań była ocena sekrecji IL-6 przez
badania wskazują na udział tej cytokiny we wzroście, progre- kolonocyty linii Caco-2 pod wpływem endotoksyny wyizolowasji oraz powstawaniu przerzutów raka jelita grubego [5, 6].
nej ze szczepu jelitowego bakterii Desulfovibrio desulfuricans. 16
4750, który zapewniał warunki
stałej temperatury (37oC), stałej
wilgotności powietrza wynoszącej 95% i atmosferę powietrza wzbogaconą w 5% CO2.
Przed właściwym doświadczeniem, komórki linii Caco-2
hodowano w polistyrenowych
naczyniach o powierzchni 25
cm2, wyposażonych w filtry
bakteriologiczne (Nunc EasyFlasks™ Nunclon™Δ, Nalge
Nunc International), a ich pasażowanie odbywało się z zastosowaniem 0,25% roztworu
trypsyny (GIBCO BRL) z dodatkiem 1 mM EDTA × 4Na
Ryc. 3. Sekrecja IL-6 przez komórki Caco-2 traktowane LPS bakterii D. desulfuricans (Life Technologies).
W badaniach zastosowano
LPS wyizolowany metodą ekstrakcji wodno-fenolowej z wykorzystaniem lizozymu z hodowli
szczepu jelitowego DV-A/94
bakterii Desulfovibrio desulfuricans prowadzonej w Katedrze
i Zakładzie Biofarmacji Śląskiego Uniwersytetu Medycznego.
Naważkę liofilizowanego
LPS Desulfovibrio desulfuricans
DV-A/94 rozpuszczono w wodzie apirogennej, dejonizowanej
uzyskując roztwór wyjściowy,
z którego następnie przygotowano roztwory o końcowych stężeniach LPS: 10 µg/ml, 50 µg/
ml i 100 µg/ml,. wykonując odpowiednie rozcieńczenia pozbawioną surowicy pożywką RPMI
Ryc. 4. Sekrecja IL-6 przez komórki Caco-2 traktowane LPS bakterii D. desulfuricans
1640 z antybiotykami.
W
celu
oceny
sekrecji IL-6 przez komórki liBadania analizujące wpływ endotoksyny pochodzącej nii Caco-2 pod wpływem LPS bakterii Desulfovibrio
z D. desulfuricans na funkcje immunologiczne komórek na- desulfuricans DV-A/94, komórki wysiewano na 24błonkowych jelita grubego mają istotne znaczenie w kon- dołkową płytkę (firmy Nunc) w liczbie 1×105 komóretekście oceny aktywności biologicznej szczepu jelitowego k/1,9 cm2. Przez pierwsze trzy doby komórki hodowano
tych bakterii, co może przyczynić się do poznania roli ga- w pożywce RPMI 1640 z dodatkiem surowicy bydlęcej, petunku D. desulfuricans w ekosystemie przewodu pokarmo- nicyliny i streptomycyny, a następnie pożywkę wymieniono
wego człowieka.
na medium o podobnym składzie lecz pozbawione surowicy, i prowadzono w nim hodowlę przez następną dobę.
Materiał i metody
W piątej dobie, do hodowli komórek wprowadzono pożywkę RPMI 1640 z antybiotykami i 10 mM buforem Hepes
Badania przeprowadzono z wykorzystaniem linii ko- (Sigma) oraz z LPS bakterii D. desulfuricans o stężeniach:
mórkowej Caco-2, wywodzącej się z gruczolakoraka jelita 10 µg/ml, 50 µg/ml i 100 µg/ml. Kontrolę stanowiły komórgrubego (human colon adenocarcinoma), która została za- ki nie traktowane LPS.
kupiona w German Collection of Microorganisms and Cell
Materiał do analizy tj. medium hodowlane i lizaty koCultures Dept. Human Animal Cell Cultures.
mórkowe zbierano po 1, 6, 12 i 24 godzinach od momenKomórki hodowano standardowo w pożywce RPMI 1640 tu wprowadzenia do hodowli LPS. Medium hodowlane po
(Sigma) z dodatkiem10% bydlęcej surowicy płodowej FBS odwirowaniu zamrażano w -70oC. Oznaczenia stężeń IL-6
(GIBCO BRL) oraz antybiotyków, tj. penicyliny (Sigma) w medium hodowlanym przeprowadzono za pomocą zestai streptomycyny (Sigma) w inkubatorze firmy Nuaire NU- wu „Quantikine – Human IL-6 Immunoassay” (firmy R&D
17
Systems), a otrzymane wyniki wyrażono w pg/ml, w oparciu o krzywą kalibracyjną sporządzoną dla wzorca badanej
cytokiny dołączonego do zestawu.
Lizaty komórek uzyskano po potraktowaniu komórek
przyczepionych do dna dołków 0,2% roztworu SDS (dodecylosiarczan sodu). Lizaty zamrożono w -70oC, a następnie
oznaczano w nich stężenie białka komórkowego zgodnie
z protokołem zamieszczonym w specyfikacji odczynnika
Bradforda (Sigma) w modyfikacji dla płytek 96-dołkowych.
Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 595 nm
przy pomocy czytnika MRX Revelation (firmy Dynex,
oprogramowanie DYNEX™ Software wersja 4.25). Stężenie białka w poszczególnych próbkach wyznaczono na podstawie krzywej wzorcowej.
Stężenia IL-6 (pg/ml) odniesiono do całkowitego białka
komórkowego (mg/ml), wyrażając wyniki w pg na mg białka komórkowego (pg/mg).
Analiza statystyczna
Statystyczną ocenę wyników przeprowadzono dla modelu z powtarzanymi wynikami (trzykrotne powtórzenia)
z wykorzystaniem średniej arytmetycznej (x), odchylenia
standardowego (SD) oraz jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA). W przypadkach gdy ANOVA dała wynik
statystycznie istotny porównań wielokrotnych dokonywano
testem Duncana. Testy wykonano na poziomie istotności
α = 0,05 z użyciem programu Statistica 7.0.
Wyniki
Przeprowadzone porównanie stężeń IL-6 w hodowli
kontrolnej w zależności od czasu trwania doświadczenia
wykazało, że komórki nabłonkowe jelita grubego linii Caco-2 są zdolne do wydzielania tej cytokiny na stałym poziomie przy braku jakiegokolwiek bodźca (Rys.1).
Wprowadzenie do hodowli kolonocytów LPS wyizolowanego ze szczepu jelitowego bakterii D. desulfuricans spowodowało zmniejszenie sekrecji tej cytokiny w porównaniu
z hodowlą nie traktowaną endotoksyną bakteryjną. Zmiany
w wydzielaniu IL-6 zależały od stężenia LPS jak również
od czasu jego oddziaływania na komórki Caco-2 (Rys. 2-4).
Stężenie IL-6 w hodowlach zawierających 10 µg/ml LPS
w 1, 6, i 24 godzinie doświadczenia (1h, 6h, 24h) utrzymywało się na stałym poziomie, jedynie po 12 godzinach
oddziaływania (12h), nastąpiło znamienne statystycznie
zmniejszenie jej wydzielania (Rys. 2). W hodowlach prowadzonych w obecności LPS o stężeniu 50 i 100 µg/ml stwierdzono zmniejszenie wydzielania IL-6 w 1 i 6 godzinie (1h
i 6h) inkubacji w porównaniu z sekrecją komórek kontrolnych. Natomiast w 12 i 24 godzinie (12h i 24h) ilość IL-6
stopniowo zwiększała się nie przekraczając jednak w sposób statystycznie istotny sekrecji konstytutywnej (Rys. 1-4)
Stwierdzono, że żadne z zastosowanych stężeń LPS nie spowodowało wzrostu sekrecji IL-6 w porównaniu z sekrecją
komórek nie traktowanych endotoksyną badanych bakterii.
Poziom sekrecji IL-6 po 24 godzinach nie wykazywał
istotnych statystycznie różnic utrzymując się na poziomie
zbliżonym do konstytutywnego, bez względu na zastosowane stężenie LPS (Rys. 2-4).
18
Dyskusja
LPS ujawnia swą aktywność biologiczną w chwili pojawienia się w krwiobiegu jako efekt infekcji spowodowanej
bakteriami pochodzącymi najczęściej ze środowiska zewnętrznego. Oddziaływanie LPS z komórkami krwi stymuluje je do efektywnego zwalczania infekcji, czego krytyczną
konsekwencją może być wstrząs septyczny. W przeciwieństwie do komórek krwi, komórki nabłonkowe jelita stale,
a zatem także w warunkach fizjologicznych narażone są na
kontakt z endotoksynami bakterii Gram-ujemnych mikroflory jelitowej [4].
Badania nad wyjaśnieniem mechanizmu obniżonej wrażliwości jelitowych komórek nabłonkowych na LPS bakterii
komensalnych przy jednoczesnej potencjalnej zdolności do
odpowiedzi na bakterie patogenne wykazały, że komórki te
potrafią różnicować złożone populacje bakterii w oparciu
o indukowaną przez nie oraz ich produkty modulację ekspresji genów związanych z odpowiedzią immunologiczną.
Stwierdzono ponadto, iż kolonocyty, mimo że nie wykazują konstytutywnej ekspresji błonowego receptora CD14, są
zdolne do indukcji jego ekspresji w odpowiedzi na wysokie
stężenia LPS. Ponadto LPS może oddziaływać na nabłonek jelitowy za pośrednictwem rozpuszczalnego receptora
sCD14. Drugi składnik powierzchniowego kompleksu receptorowego rozpoznającego LPS, TLR-4 wykazuje niski
poziom konstytutywnej ekspresji w komórkach nabłonkowych
jelita czyniąc je potencjalnie zdolnymi do natychmiastowej odpowiedzi. Infekcja bakteriami patogennymi indukuje zarówno
ekspresję białka MD-2, jak i nasila ekspresję receptora TLR-4.
Istnieje również możliwość oddziaływania niezależnego od
receptorów, na drodze niespecyficznych oddziaływań hydrofobowych z fosfolipidami błon komórkowych, co ma miejsce
w przypadku wysokich stężeń LPS [7, 8, 15, 16].
Aktywność LPS wobec komórek nabłonkowych jelita
grubego przebadano na wielu liniach komórkowych a uzyskane wyniki były rozbieżne. Badając wpływ endotoksyny
E. coli na sekrecję IL-8 wykazano iż w przypadku komórek linii HT-29 odpowiedź w postaci nasilenia sekrecji była
znaczna, natomiast komórki linii Caco-2 okazały się niewrażliwe na stymulację. Jednak kiedy komórki linii Caco-2
poddano preinkubacji z maślanem sodu, produktem fermentacji bakteryjnej obecnym w świetle jelita, zyskiwały one
zdolność odpowiedzi na LPS. Podobny efekt uzyskano działając na nie silnie prozapalną cytokiną IL-1β. Wyniki tych
badań świadczą o tym, że komórki linii Caco-2 wymagają
dodatkowego bodźca aby zareagować na LPS [15, 16].
Komórki linii Caco-2 wykorzystano do badań również
w niniejszej pracy. Wykazują one najwyższy stopień zróżnicowania spośród dostępnych immortalizowanych linii
komórkowych, dzięki czemu najbardziej przypominają prawidłowe, dojrzałe enterocyty. Należy jednak pamiętać iż nie
są idealnym modelem fizjologicznego nabłonka jelitowego,
gdyż wywodzą się z tkanki nowotworowej [2, 15, 17].
Do stymulacji komórek użyto lipopolisacharydu wyizolowanego ze szczepu jelitowego bakterii D. desulfuricans.
Są to Gram-ujemne bakterie z grupy bakterii redukujących
siarczany. Zostały zidentyfikowane w przewodzie pokarmowym wielu ssaków, w tym również człowieka. Ich rola
w mikroflorze jelitowej nie jest dobrze poznana, są jednak
podejrzewane o udział w patogenezie nieswoistych zapaleń
jelita grubego [1, 9, 18].
Dotychczas przeprowadzono niewiele badań in vitro dotyczących aktywności biologicznej LPS pochodzącego od
D. desulfuricans. Wykorzystywano w tym celu różne komórki jak fibroblasty, komórki śródbłonka, komórki jednojądrzaste krwi oraz komórki nabłonkowe jelita grubego. Wykazano
hamujący, zależny od stężenia wpływ LPS tych mikroorganizmów na proliferację i aktywność metaboliczną fibroblastów. Stwierdzono także zdolność wywoływania apoptozy
tych komórek, za pośrednictwem białka Fas i kaspazy-3.
W komórkach śródbłonka zaobserwowano zwiększenie sekrecji IL-6 i IL-8 oraz zwiększenie ekspresji molekuł adhezyjnych
VCAM-1 i E-selektyny w odpowiedzi na endotoksynę D. desulfuricans. W odniesieniu do komórek jednojądrzastych krwi
wykazano wyższą aktywność mierzoną poziomem sekrecji
TNF-α tej endotoksyny w porównaniu z LPS bakterii E. coli
i S minnesota. Badania na kolonocytach linii Caco-2 polegały
na analizie wpływu endotoksyn bakteryjnych na sekrecję IL-8.
LPS D. desulfuricans okazał się niewystarczającym bodźcem
stymulującym te komórki do sekrecji IL-8. Jednakże preinkubacja komórek z maślanem sodu prowadziła do nasilenia wydzielania IL-8 co potwierdziło wcześniejsze obserwacje dotyczące wpływu LPS E. coli na tę linię komórkową [1, 18].
Badania przeprowadzone w niniejszej pracy służyły ocenie wpływu jaki endotoksyna D. desulfuricans wywiera na
sekrecję IL-6. IL-6 jest plejotropową cytokiną zaangażowaną w odpowiedź zapalną i immunologiczną organizmu. Do
głównych czynników stymulujących wytwarzanie IL-6 należą: IL-1, IFN, TNF-α, lipopolisacharydy bakteryjne (LPS)
oraz wirusy DNA i RNA. Wykazano również, że stężenie
osoczowe IL-6 zwiększa się wraz ze stopniem zaawansowania, dojrzałości histologicznej oraz głębokością naciekania
ściany jelita przez guz nowotworowy [5, 19, 20].
Jej rola w patogenezie raka jelita grubego nie jest jednoznaczna. IL-6 może zarówno pobudzać proliferację komórek
nowotworowych, hamować ich apoptozę, sprzyjać powstawaniu przerzutów i indukować angiogenezę w obrębie guza,
jak również może mobilizować układ immunologiczny do
walki z nowotworem zwiększając aktywność komórek cytotoksycznych [5, 6].
Transformowane komórki nabłonkowe jelita Caco-2
wykazują konstytutywną sekrecję IL-6 na niewielkim poziomie, co zostało potwierdzone w przeprowadzonych badaniach. Nie wykazano natomiast zwiększonego wydzielania tej cytokiny pod wpływem zastosowanych stężeń LPS.
Stwierdzono nieznaczne obniżenie sekrecji w pierwszych
godzinach oddziaływania badanej endotoksyny na komórki, po czym sekrecja IL-6 uzyskiwała wartości charakterystyczne dla hodowli kontrolnych. W przypadku najwyższego zastosowanego stężenia LPS (100 µg/ml) widoczna była
wyraźna tendencja w kierunku nasilania się sekrecji IL-6
wraz z wydłużaniem czasu ekspozycji komórek na LPS, nie
można więc wykluczyć możliwego dalszego zwiększania
się stężenia tej cytokiny w kolejnych godzinach inkubacji.
Przeprowadzone badania wskazują jednak, że produkty bakteryjne takie jak endotoksyny lipopolisacharydowe mogą wpływać na procesy immunologiczne i zapalne
w nabłonku jelitowym poprzez modyfikowanie sekrecji IL-6
przez komórki nabłonkowe.
Wnioski
1. Komórki nabłonkowe jelita grubego linii Caco-2 posiadają zdolność konstytutywnej sekrecji
IL-6.
2. Lipopolisacharyd szczepu DV-A/94 bakterii Desulfovibrio desulfuricans wywołuje zmiany w wydzielaniu interleukiny-6 przez komórki Caco-2 zależne
od jego stężenia i czasu oddziaływania.
3. LPS szczepu jelitowego bakterii Desulfovibrio desulfuricans w stężeniach 10, 50 i 100 µg/ml przez
1; 6; 12; i 24 godziny nie wykazał działania stymulującego komórki Caco-2 do wydzielania IL-6
powyżej poziomu obserwowanego w hodowli kontrolnej.
Piśmiennictwo
1. Węglarz L i wsp. Phytic acid modulates in vitro IL-8
and IL-6 release from colonic epithelial cells stimulated
with LPS and IL-1β. Dig Dis Sci 2007; 52: 93-102.
2. Jung HC i wsp. A distinct array of proinflammatory cytokines is expressed in human colon epithelial cells in
response to bacterial invasion. J Clin Invest 2001; 107:
27-30.
3. Lasek W. Układ odpornościowy związany z błonami
śluzowymi. W: Immunologia. Red. Jakóbisiak M. Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa 2000, 336-354.
4. Lan JG i wsp. Different cytokine response of primary
colonic epithelial cells to commensal bacteria. World J
Gastroenterol 2005; 11: 3375-3384.
5. Atreya R, Neurath MF. Involvement of IL-6 in the pathogenesis of inflammatory bowel disease and colon
cancer. Clin Rev Allergy Immunol 2005; 28: 187-195.
6. Schneider MR i wsp. Interleukin-6 stimulates clonogenic growth of primary and metastatic human colon carcinoma cells. Cancer Lett 2000; 151: 31-38.
7. Łukasiewicz J, Ługowski C. Biologiczna aktywność
lipopolisacharydu. Post Hig Med Dośw 2003; 57:
33-53.
8. Saluk-Juszczak J, Wachowicz B. Aktywność prozapalna
lipopolisacharydu. Post Biochem 2005; 51: 280-287.
9. Węglarz L i wsp. Effect of endotoxins isolated from Desulfovibrio desulfuricans soil and intestinal strain on
the secrection of TNF-α by human mononuclear cells.
Pol J Environ Stud 2006; 15: 615-622.
10. Tichaczek-Goska D, Cisowska A. Wybrane właściwości
lipopolisacharydów bakterii Gram-ujemnych zawierających mannan w łańcuchu O-swoistym. Adv Clin Exp
Med 2007; 16: 105-112.
11. Aoki KA: Study of endotoxemia in ulcerative colitis
and Crohn’s disease. Acta Med Okoyama 1978; 32:
147-158.
12. Goldstein EJC i wsp. Desulfovibrio desulfuricans bacteremia and review of human Desulfovibrio infections.
J Clin Microbiol 2003; 41: 2752-2754.
13. Węglarz L i wsp. Desulfovibrio desulfuricans lipopolysaccharides induce endothelial cell IL-6 and IL-8 secretion and E-selectin and VCAM-1 expression. Cell Mol
Biol Lett 2003; 8: 991-1003.
19
14. Steed LL, Bene VD. Zakażenia bakteriami beztlenowymi. W: Mikrobiologia i choroby zakaźne. Virella G Red.
Heczko PB. Wydawnictwo Urban and Partner. Wrocław
2000, 523-530.
15. Funda DP i wsp. CD14 is expressed and released as soluble CD14 by human intestinal epithelial cells in vitro:
Lipopolysaccharide activation of epithelial cells revisited. Infect Immun 2001; 69: 3772-3781.
16. Cario E i wsp. Lipopolysaccharide activates distinct
signaling pathways in intestinal epithelial cell lines
expressing Toll-like receptors. J Immunol 2000; 164:
966-972.
17. Nanthakumar NN i wsp. Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis. Proc Natl Acad Sci
USA. 2000; 97: 6043-6048.
18. Dzierżewicz Z i wsp. Aktywność biologiczna endotoksyn izolowanych ze szczepów bakterii Desulfovibrio
desulfuricans. Ann Acad Med Siles 2005; 59: 9-16.
19. Łukaszewicz M, Mroczko B, Szmitkowski M. Znaczenie kliniczne interleukiny 6 (IL-6) jako czynnika rokowniczego w chorobie nowotworowej. Pol Arch Med
Wewn 2007; 117: 5-6.
20. Legrand-Poels S, Schoonbroodt S, Piette J. Regulation
of interleukin-6 gene expression by pro-inflammatory
cytokines in a colon cancer cell line. Biochem J 2000;
349: 765-773.
dr n. biol. Beata Parfiniewicz
Katedra i Zakład Biochemii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,
ul. Narcyzów 1, 41-200 Sosnowiec
Tel. + 48 32 364 10 72
e-mail: [email protected]
20
Application of EPR spectroscopy to examination
of free radicals in thermally sterilized chlortalidone
Zastosowanie spektroskopii EPR do badań wolnych rodników
Magdalena Zdybel, Barbara Pilawa, Magdalena Kościelniak-Ziemniak,
Daria Czyżyk, Jakub Adamczyk
Katedra i Zakład Biofizyki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,
Abstract
Paramagnetic properties of chlortalidone sterilized at
160 oC (120 minutes), 170 oC (60 minutes), and 180 oC
(30 minutes) were examined by an X-band (9.3 GHz)
electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy.
The aim of this work was to determine concentrations
and properties of free radicals formed during thermal
sterilization of chlortalidone. The optimal conditions of
thermal sterilization of this drug were searched. The firstderivative EPR spectra were recorded with microwave
power of 0.7-70 mW. For all the studied thermally treated
samples broad asymmetrical EPR spectra were measured.
Lineshape of the spectra, and their parameters: amplitude, linewidth, g-factor, were analysed. Changes of lineshape of the spectra with microwave power indicate that
complex paramagnetic centers system exist in the tested
drug. Strong dipolar spin-spin interactions exist in thermally sterilized chlortalidone. Fast spin-lattice relaxation
processes exist in chlortalidone sterilized at 160 oC and
170 oC, and slow spin-lattice relaxation characterizes the
drug heated at 180 oC. Concentrations of free radicals in
the heated chlortalidone were ~1017-1018 spin/g. The lowest amount of free radicals was formed in chlortalidone
during sterilization at 180 oC. Sterilization at 180 oC during 30 minutes is so recommended for chlortalidone.
Key words: chlortalidone, thermal sterilization, paramagnetic centers, free radicals, EPR spectroscopy
Streszczenie
Właściwości paramagnetyczne chlortalidonu sterylizowanego w temperaturach 160 oC (120 minut), 170 oC (60 minut) i 180 oC (30 minut) zbadano za pomocą spektroskopii
elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) na
pasmo X (9.3 GHz). Celem pracy jest określenie koncentracji i właściwości wolnych rodników generowanych
podczas sterylizacji termicznej chlortalidonu. Poszukiwano optymalnych warunków sterylizacji termicznej tego
leku. Widma EPR w postaci pierwszej pochodnej rejestrowano z wykorzystaniem mocy mikrofalowej z zakresu
0.7-70 mW. Dla wszystkich badanych próbek poddanych
obróbce termicznej mierzono szerokie asymetryczne widma EPR. Analizowano kształt widm oraz ich parametry:
amplitudę, szerokość linii i współczynnik rozszczepienia
spektroskopowego g. Zmiany kształtu widm z mocą mikrofalową wskazują na złożony charakter układu centrów
paramagnetycznych w testowanych próbkach leku. Silne
oddziaływania dipolowe spin-spin występują w termicznie
sterylizowanym chlortalidonie. Szybkie procesy relaksacji spin-sieć zachodzą w chlortalidonie sterylizowanym w
160 oC i 170 oC, a wolna relaksacja spin-sieć zachodzi w
leku ogrzewanym w 180 oC. Koncentracja wolnych rodników w ogrzewanym chlortalidonie jest rzędu 1017-1018
spin/g. Najmniejsza ilość wolnych rodników powstaje
w chlortalidonie podczas sterylizacji w temperaturze
180 oC. Sterylizacja w temperaturze 180 oC przez 30 minut jest więc zalecana dla chlortalidonu.
Słowa kluczowe: chlortalidon, sterylizacja termiczna,
centra paramagnetyczne, wolne rodniki, spektroskopia
EPR
Introduction
Free radicals are the very active molecules containing
unpaired electrons [1-3], which may be responsible for
damage of cells and tissues [1, 3, 4]. Free radicals play an
important role during iniciation, promotion and termination
phases of lipid peroxidation [1]. Lipid peroxidation modifies unsaturated lipid acids in tissues [1]. Free radicals of
sterilized drugs may interact with implants and change their
chemical structure or stability.
Optimal process of drug sterilization should not produce
high amount of free radicals in the sample. High temperature or radiation are the main physical factors which interact
on drug during sterilization [5]. Both thermal [6-9] and radiative [9-11] sterilization form free radicals in drugs. The
amount of free radicals depends on conditions of steriliza-
21
Cl
O
HO
S
NH
O
NH2
Fig. 1. Chemical structure
of chlortalidone [16].
O
Methods
B2
A2
A1
B1
Fig. 2. The EPR spectrum of chlortalidone sterilized at
160 oC (120 minutes) with marked the analysed parameters
of its lineshape.
tion. The aim of this work was to examine effect of conditions of thermal sterilization on free radicals concentration
and paramagnetic properties of chlortalidone. Chlortalidone
was sterilized at different temperatures and times of heating according to the valid norms [12-15]. The temperature
and time of thermal sterilization which produces the lower
amount of free radicals were searched. Concentration of
free radicals and complex character of paramagnetic system in thermally sterilized chlortalidone were determined.
Spin-spin and spin-lattice interactions in chlortalidone were
studied. Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was used as the experimental technique. EPR studies
of paramagnetic properties of thermally sterilized chlortalidone are not known from the others scientific works.
Material and methods
Material
Samples of chlortalidone sterilized at three different
temperatures were examined. Chemical structure of chlortalidone is presented in Figure 1 [16].
Tab. I. Effect of conditions of sterilization on free radical
concentration (N) and linewidth (ΔBpp) of EPR spectra of
chlortalidone. Data for EPR spectra measured with microwave power of 2.2 mW. T, t – temperature and time of sterilization, respectively
Conditions of sterilization
T = 160 oC, t = 120 min.
T = 170 oC, t = 60 min.
T = 180 oC, t = 30 min.
22
Chlortalidone is a diuretic and antihypertensive drug
[16]. It belongs to group of thiazides. Chlortalidone decreases the reabsorption of sodium in renal tubule. It increases the
excretion of sodium, chloride, water, potassium and magnesium [17, 18]. Chlorthalidone is indicated in the management of hypertension, diabetes insipidus, idiopathic edema
and edema associated with failure of heart, kidneys, lung
and in preeclamptic toxaemia [16-18].
N x 1017
[spin/g]
17.5
1.6
1.5
ΔBpp
[+0.02 mT]
1.03
0.87
0.73
Thermal sterilization was performed according to the
Norms [12-15] about this process. Chlortalidone as powdered sample was sterilized at temperatures 160 oC during
120 minutes, 170 oC during 60 minutes, and 180 oC during
30 minutes in hot air oven.
The spectra were recorded by the use of EPR spectrometer produced by RADIOPAN Firm (Poznań). Magnetic
modulation was 100 kHz. Microwave frequency from Xband (9.3 GHz) was measured by MCM 101 recorder of
EPRAD Firm (Luboń-Poznań). EPR spectra were measured
in the wide range of microwave power from 0.7 mW to 70
mW. Amplitudes (A) and linewidth (ΔBpp) of the spectra
were analysed. The following parameters of lineshape of the
EPR spectra were determined: A1/A2 and B1/B2 (Fig. 2).
g-Factor was obtained from the resonance condition according to the formula [19, 20]: g = hν/μBBr,
where: h – Planck constant, ν – microwave frequency, μB
– Bohr magneton, Br – resonance magnetic induction.
Free radical concentration (N) in the samples was determined as follow:
N = Nu[(WuAu)/Iu][I/(WAm)],
where: Nu - the number of paramagnetic centers in ultramarine (the reference), W, Wu - are the receiver gains for
sample and ultramarine, A, Au - are the amplitudes of ruby
signal for the sample and ultramarine, I, Iu - are the integral
intensities for the sample and ultramarine, and m - is the
mass of the sample. A ruby crystal was permanently placed
in the resonance cavity, and it was used as the secondary
reference during measurements of the concentration.
Continuous microwave saturation of EPR lines was applied to examination of spin-lattice relaxation processes [19,
20].
Results and discussion
Spectroscopic studies pointed out that thermally sterilized chlortalidone is paramagnetic. EPR spectra were obtained for this drug sterilized at all the tested temperatures.
The EPR spectrum of chlortalidone sterilized at 160 oC (120
minutes), is presented in Figure 2. The mentioned above
spectra were recorded with low microwave power of 2.2
mW to avoid their microwave saturation. Free radical concentrations (N) and linewidth (ΔBpp), are presented in Table
I.
The EPR spectra of thermally sterilized chlortalidone are
the very broad and asymmetrical lines. Linewidths of the
EPR spectra were in the range 0.73-1.03 mT (Table I). Dipolar
2,5
2
1
0,5
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
M/M 0
1,6
B1 / B2
1,2
0,8
0,4
0
0
b)
0,2
0,4
0,6
0,8
1
M/M 0
Fig. 3. Influence of microwave power on parameters
of lineshape (a) A1/A2, (b) B1/B2 for EPR spectra of
chlortalidone sterilized at 160 oC during 120 minutes. M,
Mo – microwave power used during the measurement of the
spectrum and total microwave power produced by klystron
(70 mW), respectively.
spin-spin interactions are responsible for such broadening of
these lines [19, 20]. Unpaired electrons of free radicals are
located in external magnetic field of electromagnet and additionally in magnetic field of magnetic moments of neighboring dipoles. This effect broadens excited energy levels of
unpaired electrons and as the result it broadens their resonance absorption curves [19, 20]. Strong dipolar interactions
are possible for low distances between free radicals in the
samples [19, 20]. The strongest dipolar interactions and the
lowest distances between free radicals exist in chlortalidone
sterilized at temperature 160 oC during 120 minutes. For this
sample the broadest EPR spectra were measured (Table I).
The weakest dipolar interactions exist in chlortalidone sterilized at temperature 180oC during 30 minutes with the relatively narrowest EPR spectrum (Table I).
Asymmetry of the EPR spectra of thermally sterilized
chlortalidone strongly depends on microwave power using
during their measurements. Changes of the analysed parameters of lineshape A1/A2 and B1/B2, of the EPR spectra of
chlortalidone heated at temperatures 160 oC, 170 oC, and
180 oC with increasing of microwave power are shown in
Figures 3-5, respectively. Asymmetry of EPR lines resulted
from the existence of several types of free radicals in the
sample changes with microwave power [19]. EPR lines of
the individual groups of free radicals changes with increasing of microwave power differently. Changes of amplitudes
2,5
2
1,5
A1 /A2
0
a)
1
0,5
0
0
a)
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0,6
0,8
1
M/M 0
1,6
1,2
B1 / B2
A1 /A2
1,5
and linewidths of the component lines are responsible for
evolution of lineshape of the resultant spectra with microwave power. Such effects do not appear for single EPR lines
of one type of free radicals. As was expected in the studied
chlortalidone during thermal sterilization breaking of different chemical bonds occurs and more than one type of free
radicals appears. Because of superposition of the low distanced component lines in the resultant EPR spectra of chlortalidone, the numerical deconvolution of these curves was
not done. The information presented in this work are related
to the whole free radicals system in the samples. Complex
character of paramagnetic centers system was also stated for
the other thermally sterilized drugs [6-9].
Changes of amplitudes (A) and linewidths (ΔBpp) of the
EPR spectra of chlortalidone sterilized at 160oC, 170oC, and
180 oC, with increasing of microwave power are compared
in Figures 6 and 7, respectively. Amplitudes of EPR lines
of the drug heated at 160 oC and 170 oC, increase with increasing of microwave power (Fig. 6). EPR lines of the drug
heated at 180 oC begin to saturate (Fig. 6). Linewidths increase with increasing of microwave power (Fig. 7). Correlations between both amplitudes and linewidths and microwave power (Fig. 6, 7) are characteristic for homogeneously
broadened EPR spectra [19, 20]. It can be then concluded
that in the sterilized drug free radicals are homogenously
distributed and the sterilization process interacted on the
0,8
0,4
0
0
b)
0,2
0,4
M/M 0
Fig. 4. Influence of microwave power on parameters of
lineshape (a) A1/A2, (b) B1/B2 for EPR spectra of chlortalidone
sterilized at 170 oC during 60 minutes. M, Mo – microwave
power used during the measurement of the spectrum and
total microwave power produced by klystron (70 mW),
respectively.
23
2
3
2,5
1,5
A [a. u.]
A1 /A2
2
1
180 ºC
170 ºC
160 ºC
1,5
1
0,5
0,5
0
0
0,2
0,4
a)
0,6
0,8
0
0,2
0,4
M/M 0
0,4
1
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
M/M 0
Fig. 5. Influence of microwave power on parameters of
lineshape (a) A1/A2, (b) B1/B2 for EPR spectra of chlortalidone
sterilized at 180 oC during 30 minutes. M, Mo – microwave
power used during the measurement of the spectrum and
total microwave power produced by klystron (70 mW),
respectively.
whole samples. Isolated spin packed do not exist in the samples [19, 20].
EPR spectra of chlortalidone sterilized at 160oC and
170oC do not saturate at the used microwave powers (Fig. 6),
so fast spin-lattice relaxation processes exist in the samples.
Microwave saturation of EPR signals appear after inversion
of the amount of unpaired electrons on the ground and the
excited energy levels [19, 20]. During saturation the higher
amount of unpaired electrons are located on the excited energy levels. EPR lines of chlortalidone sterilized at 180oC
reached the maximal amplitudes at the lowest microwave
power, so slow spin-lattice relaxation processes exist in this
sample.
g-factors near 2 indicate that mainly oxygen free radicals
exist in the studied samples. The high spin-orbit coupling of
unpaired electrons in free radicals with unpaired electrons
located on oxygen atoms is responsible for these g-values
[19]. Oxygen free radicals were also find in thermally sterilized dexamethasone [6], diclofenac [7] and ampicyline [8].
The high amount of free radicals (~1017-1018 spin/g) exist
in thermally sterilized chlortalidone (Table I). High amounts
of free radicals were also obtained for thermally sterilized
dexamethasone [6], diclofenac [7] and ampicyline [8]. The
lowest amount of free radicals exist in chlortalidone sterilized at temperature 180 oC during 30 minutes (Table I). The
toxic free radical interactions of the chlortalidone sterilized
at 180 oC during 30 minutes with tissues will be lower than
the interactions of this drug sterilized at 170 oC during 60
minutes and 160 oC during 120 minutes. For chlortalidone
the sterilization temperature of 180 oC and time of 30 minutes is the best from paint of view of the low free radicals
content in the drug. The performed studies of free radicals in
thermally treated chlortalidone indicate usefulness of electron paramagnetic resonance spectroscopy to determine optimal conditions of drug sterilization. Both microbiological
and free radicals tests are very important for pharmacological safety of drugs.
2
1,5
� Bpp [mT]
Δ
0,8
24
0,8
Fig. 6. Influence of microwave power on amplitude (A) of
EPR line of chlortalidone sterilized at 160 oC during 120
minutes (●), 170 oC during 60 minutes (▲), and 180 oC
during 30 minutes (■). M, Mo – microwave power used
during the measurement of the spectrum and total microwave
power produced by klystron (70 mW), respectively.
1,2
b)
0,6
1/2
(M/M 0 )
1,6
B1 /B2
0
1
180 ºC
170 ºC
160 ºC
1
0,5
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1/2
(M/M 0 )
Fig. 7. Influence of microwave power on linewidths (ΔBpp)
of EPR line of chlortalidone sterilized at 160 oC during
120 minutes (●), 170 oC during 60 minutes (▲), and
180 oC during 30 minutes (■). M, Mo – microwave power used
during the measurement of the spectrum and total microwave
power produced by klystron (70 mW), respectively.
Conclusions
EPR studies of thermally sterilized chlortalidone pointed
out that:
1) Stable paramagnetism characterizes chlortalidone
heated at 160 oC, 170 oC, an d 180 oC.
2) Free radicals system of chlortalidone reveals complex
character. Lineshape of EPR spectra of this drug strongly changes with increasing of microwave power.
3) Continuous microwave saturation of EPR spectra of
the chlortalidone indicates homogeneous distribution
of free radicals in the sample.
4) Strong dipolar spin-spin interactions exist in chlortalidone with broad EPR lines.
5) Fast spin-lattice relaxation processes exist in chlortalidone heated at 160 oC and 170 oC, and slow
spin-lattice relaxation exist in chlortalidone heated at
180 oC.
6) Thermal sterilization at 180oC during 30 minutes
may be used for chlortalidone, because of the lowest
free radicals concentration in the product.
Acknowledgements
This study was supported by Medical University of Silesia in Katowice (Grant no: KNW 1-142/09).
References
1. Bartosz G. Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie. Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa 2006.
2. Rozancew EG, Szolle WD. Chemia organiczna wolnych
rodników. Państwowe Wydawnictwo Naukowe. Warszawa 1985.
3. Pryor W. Ed. Free radicals in biology. Academic Press.
New York, San Francisco, London 1976.
4. Podbielska H, Sieroń A, Stręk W. Red. Diagnostyka i terapia fotodynamiczna. Urban & Partner. Wrocław 2004.
5. Janicki S, Fiebig A, Sznitowska M. Farmacja stosowana.
Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 2008.
6. Kościelniak M, Pilawa B, Wilczyński S. Application of
EPR spectroscopy to examination of thermally sterilized
dexamethasone. Eng Biomater 2008; XI(81-84): 55-57.
7. Ramos P i wsp. Effect of heating at 180oC on paramagnetic properties of diclofenac – EPR studies. Eng Biomater 2009; XII(87): 7-12.
8. Krztoń A i wsp. FT-IR and EPR studies of changes of
chemical structure of ampicyline during thermal sterilization. Eng Biomater 2009; XII(89-91): 153-156.
9. Wilczyński S i wsp. Comparison of free radicals properties in radiosterilized and thermal sterilized streptomycin. Eng Biomater 2009; XII(89-91): 170-172.
10.Wilczyński S i wsp. Formation of paramagnetic center
in sterilized gentaminin and neomycin irradiated by protons. Pol J Environ Stud 2006; 15(4A): 216-218.
11.Wilczyński S i wsp. Free radicals properties of gamma
irradiated solid forms of drugs. Eng Biomater 2008;
XI(81-84): 52-55.
12.Farmakopea Polska VIII. PTFarm. Warszawa 2009.
13.PN-EN 556-1. Sterylizacja wyrobów medycznych - Wymagania dotyczące wyrobów medycznych określanych
jako STERYLNE - Część 1: Wymagania dotyczące finalnie sterylizowanych wyrobów medycznych. Polski
Komitet Normalizacyjny. Warszawa 2002.
14.PN-EN 556-2. Sterylizacja wyrobów medycznych - Wymagania dotyczące wyrobów medycznych określanych
jako STERYLNE - Część 2: Wymagania dotyczące wyrobów medycznych wytwarzanych w warunkach aseptycznych. Polski Komitet Normalizacyjny. Warszawa
2005.
15.PN-EN ISO 11138–4. Sterylizacja produktów stosowanych w ochronie zdrowia - Wskaźniki biologiczne
- Część 4: Wskaźniki biologiczne dla procesów sterylizacji suchym gorącym powietrzem. Polski Komitet Normalizacyjny. Warszawa 2008.
16.Zejc A, Gorczyca M. Red. Chemia leków. Wydawnictwo
Lekarskie PZWL. Warszawa 2002.
17.Podlewski J, Chwalibogowska-Podlewska A. Leki
współczesnej terapii. Encyklopedia dla lekarzy i farmaceutów. Medical Tribune Polska. Warszawa 2009.
18.Janiec W. Red. Kompendium farmakologii. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 2005.
19.Stankowski J, Hilczer W. Wstęp do spektroskopii rezonansów magnetycznych. Wydawnictwo Naukowe PWN.
Warszawa 2005.
20.Eaton GR, Eaton SS, Salikhov KM. Foundations of
modern EPR. World Scientific. Singapore, New Yersey,
London, Hong Kong 1998.
dr n. med. Magdalena Zdybel
Katedra i Zakład Biofizyki
ul. Jedności 8, 41-200 Sosnowiec
tel. + 48 32 364 11 62
25
komórek linii A549 pod wpływem oddziaływania holoksanu
i wolnozmiennego pola elektromagnetycznego – in vitro
Assessment of activity of lactase dehydrogenase in cell culture
effected by A549 of holoxan and low-frequency electromagnetic field
– in vitro study
Renata Polaniak1*, Rafał Jakub Bułdak2 , Iga Kwiecień1 , Ewa Birkner1
1
2
Zakład Biochemii Ogólnej Katedry Biochemii w Zabrzu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach
Katedra i Zakład Fizjologii w Zabrzu Śląskiego Uniwersytet Medycznego w Katowicach
Streszczenie
Abstract
Choroby nowotworowe są obecnie jednym z najistotniejszych problemów współczesnej medycyny. Preparatem
stosowanym w chorobach nowotworowych jest holoksan,
lek cytostatyczny, należący do związków alkilujących,
o mechanizmie działania podobnym do cyklofosfamidu. Celem przeprowadzonego eksperymentu była ocena
oddziaływania holoksanu i wolnozmiennego pola elektromagnetycznego na aktywność LDH [EC 1.1.1.27]
w medium hodowlanym gruczolakoraka płuc linii A549
in vitro w różnych dawkach i określonym przedziale czasowym. LDH jest enzymem katalizującym ostatni etap
glikolizy oraz traktowany jest jako marker przeżywalności
komórek nowotworowych. Hodowlę prowadzono na linii
gruczolakoraka płuc A549, w warunkach standartowych.
Komórki potraktowano dwoma stężeniami holoksanu: 10
µg/ml medium i 40 µg/ml medium oraz poddano oddziaływaniu pola elektromagnetycznego. Grupę kontrolną stanowiły kolonie komórek nowotworowych nie zawierające
w medium hodowlanym cytostatyku. Medium zbierano
po 24 godzinach eksperymentu i oznaczano aktywności
dehydrogenazy mleczanowej w grupie kontrolnej oraz
grupach badanych.
Na podstawie wyników uzyskanych w przeprowadzonych
badaniach można stwierdzić że holoksan w zastosowanych dawkach i przedziale czasowym oraz wolnozmienne
pole elektromagnetyczne wpływa na zaburzenia procesów
metabolicznych komórek gruczolakoraka płuc linii A549
hodowanych in vitro.
Investigations were carried out on the effect of different
holoxane concentrations and influence of extremely low
frequency electromagnetic field on the lactase dehydrogenase, LDH, activity of aquamous cell carcinoma line
A549 in vitro at different time intervals.
The observation of experimental and control colonies of
human line A549 was performed during 24 hours.
The strongest inhibitory effect of holoxane on the activity
of dehydrogenase lactase of cell carcinoma colonies was
obtained for the drug concentration of 40 µg/ml after 24
hours.
Our results strongly suggest that ELF-MF treatment on
A549 carcinoma cell line statistically significantly changes culture medium enzymes activities in determined conditions. The alterations in investigated enzymes activities
are also present in cytostatic (holoxan) pretreated cells. In
conclusion, there is an influence of extremely low frequency electromagnetic field on biochemical transmutations in
A549 murine squamous carcinoma cell line colonies dependent on time of exposure and dose of electromagnetic
field and time of exposure to holoxan.
Słowa kluczowe: gruczolakorak płuc, hodowla komórkowa, dehydrogenaza mleczanowa, pole elektromagnetyczne
26
Key words: squamous cell carcinoma, cell culture, LDH,
electromagnetic field
Wstęp
Choroby nowotworowe są obecnie jednym z najistotniejszych problemów współczesnej medycyny. Preparatem często stosowanym w chorobach nowotworowych jest
holoksan, lek cytostatyczny, należący do grupy związków
alkilujących. Proces alkilacji polega na zastąpieniu atomu
wodoru grupą alkilową, np. metylową lub etylową. Jego
mechanizm działania jest podobny do cyklofosfamidu
i podobnie jak trofosfamid jest jego pochodną. Działanie
holoksanu jest niezależne od fazy cyklu komórkowego,
powodując powstawanie wiązań mostkowych pomiędzy
dwiema nićmi DNA [1]. Jak wszystkie cytostatyki alkilujące, hamuje wzrost komórek, ich podział, czynności i aktywność mitotyczną. W działaniu leczniczym i toksycznym,
wykazuje zdolność do zaburzeń mitozy i podziału komórek
szybko rosnących. Słabiej działa mielotoksycznie a silniej
neurotoksycznie od cyklofosfamidu [2]. Metabolizowany
jest w wątrobie do 4-hydroksyifosfamidu, który rozkłada się
do akroleiny i ifosfamidu musztard, jako formy aktywnej.
Jego metabolity są wydalane z moczem, głównie w postaci czynnej. Okres półtrwania tego preparatu wynosi około
7 godzin [1]. Stosowany jest w leczeniu paliatywnym różnych nowotworów. Podczas leczenia mogą jednak wystąpić
między innymi zaburzenia ze strony układu pokarmowego,
czynności krwiotwórczej, supresja szpiku oraz upośledzenie
pęcherza moczowego i wątroby, a także wykazuje niepożądane działanie kardio- i pneumotoksyczne. Stosowany równocześnie z napromienianiem nasila reakcję popromienną.
Prowadzenie hodowli komórkowych in vitro jest obecnie
bardzo rozpowszechnionym modelem badawczym [3, 4].
Hodowle są prowadzone na różnych liniach komórkowych:
hepatocytach, limfocytach, itp. [5-8]. Nowatorskim przedsięwzięciem naukowym opracowanym w Instytucie Badań
nad Promieniotwórczością w Monachium [9] i zmodyfikowanym w Zakładzie Biochemii Ogólnej w Zabrzu SUM jest
prowadzenie in vitro hodowli raka płaskonabłonkowego
AT478 w postaci megakolonii. Istnieją doniesienia naukowe
dotyczące zmian chorobowych związanych z występowaniem raków płaskonabłonkowych [10]. Istotny wydaje się
być wpływ leków, w tym leków o działaniu cytostatycznym,
na wzrost i przemiany metaboliczne badanych linii komórkowych in vitro, w tym właśnie holoksanu. Nie znaleziono
jednak w przeglądanym piśmiennictwie danych dotyczących
wpływu holoksanu lub innych preparatów cytostatycznych
na hodowle megakolonii raka płaskonabłonkowego A549
in vitro.
Celem przeprowadzonych badań była ocena wpływu
holoksanu i wolnozmiennego pola elektromagnetycznego
na aktywność dehydrogenazy mleczanowej, enzymu katalizującego ostatni etap glikolizy, w medium hodowlanym
gruczolakoraka płuc linii A549 in vitro w różnych dawkach
i określonym przedziale czasowym.
Materiał i metody
Hodowlę komórkową prowadzono na linii gruczolakoraka płuc A549. Jako podłoża hodowlanego użyto Dulbeco’s z L-glutaminą wzbogaconego płodową surowicą wołową. Hodowlę prowadzono w standartowych warunkach
temperatury i atmosfery wzbogaconej w dwutlenek węgla.
Do hodowli użyto butelek hodowlanych firmy Sarstedt [1].
Kolonie traktowano dwoma stężeniami holoksanu w ilości:
10 µg/ml i 40 µg/ml podłoża. Hodowlę kolonii prowadzono
wg standartowej procedury:
1. butelkę zawierającą odpowiednią ilość komórek
trypsynizowano mieszaniną trypsyny i EDTA przez
kilka minut;
2. następnie usuwano mieszaninę trypsynizującą i przepłukiwano komórki medium hodowlanym;
3. po przepłukaniu, mechanicznie uwalniano komórki
do medium wzbogaconego płodową surowicą wołową (FSC) o określonym stężeniu;
4. w butelkach hodowlanych w zaznaczonych miejscach nakrapiano zawiesinę komórek i inkubowano
w określonych parametrach eksperymentu [5].
Kolonie podzielono na 5 grup badanych:
1. B1 – komórki 30 min poddano ekspozycji na działanie pola/ 24 godz.;
2. B2 – komórki podawano działaniu 10 µg/ml medium
holoksanu/24 godz.;
3. B3 – komórki podawano działaniu 40 µg/ml medium holoksanu/24 godz.;
4. B4 – komórki podawano 30 min ekspozycji na pole
elektromagnetyczne i działaniu 10 µg/ml medium
holoksanu;
5. B5 – komórki podawano 30 min ekspozycji na pole
elektromagnetyczne i działaniu 40 µg/ml medium
holoksanu.
Grupę kontrolną (K) stanowiły kolonie, hodowane
w medium z surowicą bez dodatku holoksanu i nie narażone na działanie pola elektromagnetycznego. W badaniach
zastosowano pole elektromagnetyczne o maksymalnej wartości MRS wynoszącej 0,14 mT (o częstotliwości od 3 Hz
do 3 kHz), wytwarzane przez urządzenie MRS 2000 firmy
MediConsult [6].
Po 24 godzinach od podania preparatu zbierano medium
i oznaczano aktywność dehydrogenazy mleczanowej, LDH,
metodą kinetyczną. Aktywność enzymu określano w próbach
badanych w stosunku do próby kontrolnej (nie zawierającej
w medium holoksanu) w IU/ml medium hodowlanego.
Wyniki
Wyniki badań zmian aktywności LDH w testowanych
komórkach pod wpływem holoksanu i pola elektromagnetycznego zamieszczono w Tab. I i na Ryc. 1.
Pod wpływem oddziaływania holoksanu w zastosowanych dawkach i przedziale czasowym oraz pola elektromagnetycznego stwierdzono istotny statystycznie spadek
aktywności LDH w grupach eksponowanych na sam cytostatyk, w porównaniu do grupy poddanej działaniu pola
elektromagnetycznego i kontroli. Przy czym zaobserwowano, że pod wpływem pola aktywność LDH wzrosła, nie
tylko w porównaniu do grup eksponowanych na cytostatyk (B2 i B3), ale także w stosunku do kontroli. Natomiast
w grupie badanej poddanej działaniu większej dawki cytostatyku (B3) aktywność LDH spadła w porównaniu do wszyst-
27
Tab. 1. Porównanie aktywności LDH w grupach badanych vs. kontroli testem t-Studenta (*p<0,05; **p<0,01;
***p<0,001)
K
średnia
101,67
±SD
±12,98
B1
111,35
*
B2
61,32
**
B3
37,47
**
B4
62,55
**
±6,28
±4,85
±2,88
±1,81
140
Aktywność LDH [IU/ml]
120
K
B1
100
80
K
B1
B2
B2
B4
B3
60
40
B3
B5
B4
B5
20
0
grupy badawcze
Ryc. 1. Aktywność LDH w grupach badanych i grupie kontrolnej.
kich pozostałych grup badanych i grupy kontrolnej (Ryc.1,
Tab. I).
Porównano aktywności LDH w grupach badanych poddanych oddziaływaniu holoksanu i pola elektromagnetycznego (grupy B4 i B5) w stosunku do grupy badanej eksponowanej tylko na działanie pola elektromagnetycznego
oraz grupy kontrolnej. Także tutaj stwierdzono znamienny
wzrost aktywności LDH w grupie narażonej na działanie
pola elektromagnetycznego w stosunku do grupy kontrolnej
i pozostałych grup badanych (Tab. I).
W grupie badanej B5 (komórki poddane oddziaływaniu większej dawki cytostatyku i pola magnetycznego)
nastąpił spadek aktywności dehydrogenazy mleczanowej
w stosunku do kontroli i pozostałych grup badanych.
Porównując aktywności LDH w grupach badanych poddanych oddziaływaniu holoksanu w zastosowanych dawkach (grupy badane B2 i B3) i grupach poddanych ekspozycji na cytostatyk i pole magnetyczne (B4 i B5), stwierdzono
spadek aktywności enzymu w grupach badanych z zastosowaną większa dawką holoksanu (40 µg/ml medium holoksanu). Zarówno w grupie eksponowanej na sam cytostatyk,
jaki w grupie badanej cytostatyku i pola magnetycznego
(Ryc.1, Tab. I).
Dyskusja
Proces glikolizy, proces przemian węglowodanów, stanowi podstawę metabolizmu komórki nowotworowej. Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) jest enzymem katalizującym ostatni etap glikolizy, czyli jej aktywność wskazuje na
zaawansowanie uszkodzenia komórki nowotworowej. LDH
jest wskaźnikiem przeżywalności komórek nowotworowych, chorób kardiologicznych i chorób wątroby [6].
W piśmiennictwie znaleziono prace dotyczące aktywności całkowitego LDH w nowotworach badanych in vivo [11].
Dehydrogenazę mleczanową oznaczano w czerniaku [20],
gdzie obok białka S100, któro jest jednym z istotniejszych
28
B5
37,20
**
±4,08
markerów tego nowotworu [14], LDH należało do standardowych wskaźników [8]. Podobnie, w pracy dotyczącej
autotransplantacji komórek krwiotwórczych w chłoniaku
Hodgkina [12]. Na podstawie uzyskanych wyników badań,
stosując kombinację chemioterapii i chemioradioterapii
w chłoniaku Hodgkina uzyskano wyleczenie chorych w 80%.
Liczba chorych opornych na chemioterapię lub z nawrotem
choroby po pierwotnie pozytywnej reakcji na zastosowane
leczenie wynosiła jedynie 20% [13-17]. W pracy tej, autorzy
traktują aktywność LDH, jako jeden z głównych czynników
prognostycznych. Aktywność LDH traktowano jako ważny parametr w ocenie przydatności naczynio-ośrodkowego
czynnika wzrostu (VEGF) w diagnostyce płynu opłucnowego. W wyniku badań stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy VEGF a LDH w płynie opłucnowym. [13, 14].
Do nowotworów w przebiegu których, istotne znaczenie
ma aktywność LDH należy drobnokomórkowy rak płuca
[15]. Schorzenie to jest jednym z najbardziej złośliwych nowotworów, szybko uodparniający się na stosowane leczenie.
LDH jest ogromnie ważnym czynnikiem prognostycznym
w leczeniu tego nowotworu, natomiast podzielone są opinie autorów mówiące o wykorzystaniu oznaczenia aktywności LDH jako czynnika predykcyjnego w stosunku do
zastosowanego leczenia [18, 19]. Badania wykazały istotny
statystycznie związek pomiędzy aktywnością LDH a odpowiedzią na pierwotne leczenie chemiczne. Autorzy sugerują
związek pomiędzy aktywnością badanego enzymu a długością przeżyć pacjentów chorych na drobnokomórkowego
raka płuca [4].
W badaniach przedstawionych w niniejszej pracy oceniano aktywność całkowitej dehydrogenazy mleczanowej
pod wpływem oddziaływania holoksanu i wolnozmiennego pola elektromagnetycznego w mediach komórkowych
gruczolakoraka płuc linii A549. Stwierdzono, że cytostatyk
w zastosowanych dawkach i przedziale czasowym powoduje spadek aktywności badanego enzymu, przy czym dawka
40 µg/ ml medium hodowlanego wywołuje znamiennie statystycznie większy spadek aktywności LDH, aniżeli dawka 10 µg/ml medium. Natomiast pole elektromagnetyczne
o zastosowanym natężeniu wpływa na wzrost aktywności
LDH. Przy czym zaobserwowano, że w grupach badanych
poddanych oddziaływaniu pola elektromagnetycznego i cytostatyku w zastosowanych dawkach również dochodzi do
spadku aktywności LDH.
Podobne wyniki uzyskano w pracy dotyczącej wpływu
cisplatyny i wolnozmiennego pola elektromagnetycznego
na aktywność enzymów przemian biochemicznych komórek
linii AT478, w tym LDH [5, 6]. Zaobserwowany efekt wywołany działaniem pola na komórki linii AT478 sugerował
hamujący wpływ pola elektromagnetycznego. Jednak dla
komórek linii A549, w zastosowanym natężeniu i przedziale czasowym nie miał istotnego znaczenia metabolicznego.
Należy przypuszczać, że spadek aktywności LDH w komór-
kach linii A549, traktowanych polem elektromagnetycznym
i holoksanem był związany z działaniem cytostatyku.
Badania laboratoryjne dotyczące szczególnie wskaźników przeżywalności komórek nowotworowych (LDH jest
enzymem należącym do tej grupy parametrów biochemicznych) są istotnym źródłem informacji o zaawansowaniu
i możliwości nawrotów choroby [20]. Jednak dopiero badania prowadzone na hodowlach komórkowych in vitro umożliwiły dokładniejsze przeanalizowanie wpływu czynników
fizykochemicznych na przemiany metaboliczne układów
biologicznych.
Wnioski
W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że holoksan w zastosowanych dawkach i przedziale czasowym
hamuje proces glikolizy komórki nowotworowej gruczolakoraka płuc linii A549 hodowanego in vitro. Natomiast
uzyskane wyniki sugerują, że zastosowane pole elektromagnetyczne nie wpływa w zasadniczy sposób na metabolizm
komórki nowotworowej linii A549, aczkolwiek istotne statystycznie aktywności LDH stwierdzone pod wpływem oddziaływania pola i cytostatyku świadczą o zaburzeniu przemian metabolicznych badanej linii.
Piśmiennictwo
1. Polaniak R i wsp. Wpływ holoksanu na wzrost hodowli megakolonii raka płaskonabłonkowego in vitro. Dign
Lab 2001; 37: 289-293.
2. Lind M. Growth factor of bone healing. Effects on osteoblats, osteomies, and implants fixation. Acta Ortop
Scand 1998; supl. 283: 2-37.
3. Kulpa J, Kołodziejski L, Wójcik E. CYFRA21-1, SCC-Ag,
CEA i NSE przed operacją radykalną z powodu płaskonabłonkowego raka płuca. Diagn Lab 1999; 35(4): 593-599.
4. Polaniak R i wsp. Assestment of some metabolic enzymes activity in AT478 cell culture – in vitro study, of
cisplatin and extremely low-frequency magnetic field.
Diagn Lab 2006; 42: 445-454.
5. Polaniak R i wsp. Effecct of holowane on the activity of
LDH of squamous cell carcinoma in vitro. Farm Przegl
Nauk 2006; 1(1): 35-39.
6. Beck E i wsp. Influence of electromagnetic field on murine aquamous cell in vitro.12th Nordic Baltic Conference on Biomedical Engineering and Medical Physics (ISBEMP), IFMBE Proceedings, 2002; vol. 2: 142-143.
7. Brochez L, Naeyaert J-M. Serological markers for melanoma.Br J Dermatol 2000; 143: 256-268.
8. Bonfrer JM, Korse CM. Monitoring malignant melanoma with the S-100B tumor marker. Recent Results Cancer Res 2001; 158: 149-157.
9. Tarnawski R, Kummermehr J, Trott KR. The radiosensitivity of recurrent clones of a irradiated murine squamous cell carcinoma in the in vitro megacolony system.
Radiotherapy and Oncology 1998; 46: 209-214. (2006)
10.Leporowska E i wsp. Application of biochemical tumor
markers in the diagnostics and monitoring of melanoma.
Wsp Onkol 2006; 10: 303-308.
11.Stella-Hołowiecka B i wsp. Wpływ wrażliwości na leczenie i resztkowej masy nowotworowej na wyniki autotransplantacji komórek krwiotwórczych w chłoniaku
Hodgkina – doświadczenie jednoośrodkowe u 173 pacjentów. Wsp Onkol 2006; 10: 303-308.
12.L ongo DL i wsp. Conventional-dose salvage combination chemotherapy in patients relapsing with
Hodgkin’s disease after combination chemotherapy:
the low probability for cure. J Clin Oncol 1992; 10:
210-218.
13.Cheng D i wsp. Vascular endothelial growth factor
(VEGF) in pleural fluid. Chest 1999; 116: 760–765.
14.Jankowska R, Porębska I, Dyła T. Ocena stężenia naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF) w
wysiękach opłucnowych pochodzenia nowotworowego
i gruźliczego – wyniki wstępne. Pneumonol Alergol Pol
2002; 70: 258–264.
15.Brużewicz Sz i wsp. Zmiany aktywności dehydrogenazy
mleczanowej w osoczu chorych na drobnokomórkowego raka płuc w trakcie leczenia chemicznego pierwszego
rzutu. Onkol Pol 2006; 9(1): 5-8.
16.de Gramot A i wsp. Powtórne zastosowanie oksaliplatyny jest związane z poprawą przeżycia w zaawansowanym raku okrężnicy i odbytnicy. J Clin Oncol 2007; 25:
3224–3229.
17.Chua YJ, Steer C, Yip D. Recent advances in management of small cell lung cancer. Cancer Treat Rev 2004;
30: 521-543.
18.Buccheri G, Ferrigno D. Prognostic factors of small cell
lung cancer. Hematol Oncol Clin North Am 2004; 18:
445-460.
19.Ando S i wsp. The prognostic value of both neuron-specyfic enolase (NSE) and Cyfra-21-1 in small cell lung
cancer. Anticancer Res 2004; 24: 1941-1946.
20.Lim SC i wsp. Comparison of Tc-99m sestamibi, serum neuron-specific enolase and lactase dehydrogenase as predictors of response to chemotherapy in small
cell lung cancer. Cancer Biother Radiopharm 2000; 15:
381-386.
dr Renata Polaniak
Zakład Biochemii Ogólnej SUM
ul. Jardana 19; Zabrze 41-808
tel.: + 48 32 272 23 18
29
Molekularne mechanizmy działania leków immunosupresyjnych
Molecular mechanisms of immunosuppressive drugs activity
Sławomir Smolik, Ludmiła Węglarz
Katedra i Zakład Biochemii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu,
Streszczenie
Leki immunosupresyjne, wprowadzone do lecznictwa
w latach 80-tych, są cennymi związkami umożliwiającymi utrzymanie pacjentów po transplantacji organów
w stanie obniżonej odporności, co ogranicza ryzyko ostrego odrzutu przeszczepu i poprawia rokowanie krótkoterminowe. Poniższa praca omawia molekularne mechanizmy działania i charakteryzuje farmakologicznie główne
klasy nowoczesnych leków immunosupresyjnych. Inhibitory kalcyneuryny, cyklosporyna i takrolimus, przyczyniły się do udanych transplantacji organów, jednakże
ich nefrotoksyczność jest uważana za niezależny czynnik
odrzutu przeszczepu i śmiertelności. mTOR jest kinazą serynową-treoninową biorąca udział w szlaku kinazy
3-fosfoinozytolu odgrywającego kluczową rolę w regulacji procesów transkrypcji i translacji. Inhibitory kinazy
mTOR, sirolimus i everolimus, są molekułami o działaniu
immunosupresyjnym, które posiadają także właściwości
przeciwnowotworowe, co łączy się z mniejszą częstością
procesów nowotworzenia. Mykofenolan mofetilu jest
silnym, selektywnym, niekompetycyjnym i odwracalnym inhibitorem dehydrogenazy monofosforanu inozyny zdolnym do hamowania proliferacji limfocytów T i B
i redukującym migrację monocytów do miejsca odrzutu
przeszczepu. Brequinar i lefunomid są lekami immunosupresyjnymi hamującymi dehydrogenazę dihydroorotanową i ograniczającymi syntezę de novo monofosforanu
urydyny.
Słowa kluczowe: inhibitory kalcyneuryny, inhibitory kinazy mTOR, mykofenolan mofetilu
Wstęp
Obserwowany w ostatnich latach intensywny rozwój
transplantologii nie byłby możliwy bez wprowadzenia do
lecznictwa nowoczesnych i bezpiecznych leków immunosupresyjnych. Ich często przypadkowe odkrycie zapoczątkowało szczegółowe badania szlaków molekularnych uruchamianych w komórkach osób poddanych terapii immunosupresyjnej, co zaowocowało wprowadzeniem na rynek
farmaceutyczny nowych pochodnych o mniejszej toksyczności i wykorzystaniem ich działań plejotropowych. Rozwój farmakologii leków immunosupresyjnych stał się możliwy wskutek poznania kaskady wydarzeń molekularnych
związanych z reakcją odrzutu przeszczepu.
30
Abstract
Immunosuppressive drugs, introduced in the 1980s, have
been recognized as valuable agents for maintaining immunosuppression in solid organ transplantation because of
their capacity of limitation the risk of acute rejection and
improvement of short-term outcomes. This review focuses
on the molecular mechanism of action and pharmacological characteristics of the main class of modern immunosuppressive drugs. Calcineurin inhibitors, cyclosporine
and tacrolimus, have a potent impact on the successive
of organ transplantation, however, their nephrotoxicity
is an independent risk factor for graft loss and mortality.
Mammalian target of rapamycin (mTOR) is a serine-threonine kinase member of the cellular phosphatidylinositol
3-kinase pathway playing a critical role in regulating of
transcription and translation. Inhibitors of mTOR, sirolimus and everolimus, are immunosuppressive molecules
which have also antioncogenic properties and they are
associated with a lower incidence of malignancies. Mycophenolic mofetil is a potent, selective, noncompetitive
and reversible inhibitor of inosine-5’-monophosphate dehydrogenase which inhibits proliferation of T and B lymphocytes and reduces the recruitment of monocytes into
the sites of graft rejection. Brequinar and leflonomide are
immunosuppressive agents which inhibit dihydroorotate
dehydrogenase and reduce uridine monophosphate de
novo synthesis.
Key words: calcineurin inhibitors, mTOR kinase inhibitors, mycophenolic mofetil
Molekularne mechanizmy
reakcji odrzucenia przeszczepu
W pierwszym etapie procesu odrzucania przeszczepu
uczestniczą komórki APC (ang. antigen presenting cells) narządu dawcy rozpoznające i przetwarzające antygeny głównego układu zgodności tkankowej MHC (ang. major histocompatibility complex) oraz prezentujące je jako kompleks
peptydowy limfocytom T biorcy [1] (Ryc. 1). Następująca
po tym aktywacja limfocytów T wymaga dwóch sygnałów.
Pierwszy z nich powstaje w wyniku oddziaływania peptydów prezentowanych przez cząsteczki MHC z układem
receptorowym TCR-CD3 limfocytu T. Sygnał ten wymaga
jednak kostymulacji przez cząsteczki adhezyjnyjne CD22
Ryc. 1. Szlaki molekularne aktywowane w limfocytach T prowadzące do reakcji odrzutu przeszczepu.
i CD45 indukujące aktywność fosfatazy tyrozynowej (PTPazy) wpływającej na aktywność kinaz tyrozynowych Fyn
i Lck [2]. Kinazy te związane odpowiednio z cząsteczkami
CD3 i białkiem korepresorowym CD4 aktywują w wyniku fosforylacji fosfolipazę C, co prowadzi do hydrolizy jej
substratu fosfatydyloinozytolo-(4,5)-bisfosforanu (PIP2) do
1,4,5 trifosfoinozytolu (IP3) zwiększającego wewnątrzkomórkowe stężenie jonów Ca2+ oraz diacyloglicerolu (DAG)
aktywującego kinazę białkową C (PKC). Jony Ca2+ aktywują kalcyneurynę, tj. zależną od kalmoduliny fosfatazę serynowo-treoninową, która aktywuje czynnik transkrypcyjny
NF-ATc wiążący się z regionami promotorowymi genów
wielu cytokin, przede wszystkim IL-2. PKC fosforyluje inhibitor czynnika transkrypcyjnego NFκB (IκB), co uwalnia
go w formie zdolnej do aktywacji procesów transkrypcyjnych. IL-2 wiąże się ze swoim receptorem na limfocytach T
i uruchamia transdukcję sygnału proliferacji i różnicowania
limfocytów T do komórek cytotoksycznych [3]. Transdukcja
sygnału odbywa się z udziałem kinazy mTOR, która aktywuje
kinazę S6k i kinazy zależne od cyklin, powodujące przejście
komórek z fazy G1 do fazy S cyklu komórkowego [4].
Kierunki farmakologicznego działania
leków immunosupresyjnych
Zahamowanie aktywności układu immunologicznego przebiega na drodze różnych mechanizmów: poprzez
zmniejszenie liczby limfocytów T, na skutek zmian strukturalnych w tkankach limfatycznych, poprzez zmianę kierunku migracji oraz funkcji limfocytów T. Hamowanie aktywności limfocytów T leży u podłoża mechanizmu działania
stosowanych obecnie leków immunosupresyjnych. Związki
te mogą blokować kalcyneurynę (takrolimus, cyklosporyna), zmieniać transkrypcję genów kodujących cytokiny
(glikokortykosteroidy) lub hamować funkcję kluczowej
kinazy mTOR (sirolimus, everolimus). Nowe nadzieje budzą ponadto leki będące selektywnymi inhibitorami syntezy
nukleotydów (mykofenolan mofetilu, brequinar, leflunimid)
stanowiące drugą generację leków antyproliferacyjnych.
Leki selektywnie blokujące funkcję
limfocytów T i zmniejszające syntezę IL-2
Do związków tych zalicza się inhibitory kalcyneuryny
(cyklosporyna i takrolimus) oraz inhibitory kinazy mTOR
(sirolimus i everolimus).
Cyklosporyna to cykliczny peptyd liczący jedenaście
reszt aminokwasowych otrzymany z ekstraktów grzyba Tolypocladium inflatum wyizolowanego z próbki ziemi w Norwegii [5]. Jej mechanizm działania związany jest z oddziaływaniem na szlak sygnalizacyjny aktywujący z transkrypcję
genów kodujących cytokiny, przede wszystkim interleukinę
2 (IL-2) w limfocytach T (Ryc.2). Cyklosporyna wiąże się
z cyklofiliną tworząc kompleks blokujący działanie kalcyneuryny odpowiedzialnej za defosforylację cytoplazmatycznego składnika jądrowego czynnika aktywowanego
limfocytami T (NF-ATc). Ufosforylowany czynnik NFATc nie może łączyć się z czynnikiem jądrowym NF-ATn
i oddziaływać z regionem promotorowym genu kodującego
IL-2. Efektem działania cyklosporyny jest więc zmniejszenie ekspresji w limfocytach T IL-2, która jest niezbędnym
czynnikiem proliferacji i dojrzewania tych komórek oraz
stymulacji ekspresji interferonu γ, kluczowego aktywatora
makrofagów [6] (Rys. 2).
Cyklosporyna wykazuje znacznie większą skuteczność
i selektywność działania w porównaniu do azatiopryny; jej
zastosowanie dało pozytywne wyniki kliniczne u chorych po
przeszczepie nerek, serca, wątroby i płuc. Lek ten zmniejsza częstość epizodów odrzutu przeszczepianego narządu
i pozbawiony jest wielu działań niepożądanych typowych
dla leków starej generacji [7].
Głównym działaniem niepożądanym terapii cyklosporyną jest jej toksyczność związana ze znacznym zapotrzebowaniem niektórych tkanek (mózg, serce i nerki) na kalcyneurynę. Najgroźniejszym działaniem niepożądanym terapii cyklosporyną jest jej nefrotoksyczność i skłonność do
wywoływania nefropatii [8]. Mechanizm nefrotoksyczności
leku wiąże się z podwyższoną ekspresją TGF-β, odpowiedzialnego za zmiany włóknieniowe w nerkach pacjentów
31
Ryc. 2. Kierunki działania leków zmniejszających transkrypcję genu interleukiny 2. CsA - cyklosporyna, CpN
- kalcyneuryna, CaN - kalmodulina, FK506 - takrolimus, SRL - sirolimus
po przeszczepie, produkcją wolnych rodników oraz nasiloną apoptozą. Ponadto lek ten hamuje syntezę IL-2 i IFN-γ
przez limfocyty Th1, słabiej natomiast hamuje syntezę IL-4,
IL-5 i IL-7 przez limfocyty Th-2. Stwierdzono, że na nasilenie działań niepożądanych wpływ ma także wiek dawcy,
długość okresu niedotlenienia w trakcie zabiegu przeszczepu oraz osobnicza zmienność stężeń leku u pacjentów [9].
Badania ostatnich lat wykazały, że zarówno cyklosporyna jak i takrolimus zdolne są do pobudzenia receptora dla
TGF-β niezależnie od szlaku kalcyneuryny, poprzez wzrost
produkcji reaktywnych form tlenu i aktywację latentnego
TGF-β, co prowadzi do uruchomienia kaskady białek Smad
i ekspresji genów odpowiedzialnych za procesy włóknieniowe w nerkach [10].
Prowadzone badania mają na celu ograniczenie nefrotoksyczności cyklosporyny. Stwierdzono, że podawanie
wraz z lekiem małych dawek przeciwciał anty-TGF-β (1 mg/
kg.m.c) ograniczało stopień uszkodzenia nerek bez zmiany
działania immunosupresyjnego. Zastosowanie natomiast
większych dawek przeciwciał skierowanych przeciw TGF-β
(2,5 mg/kg.m.c) redukowało zarówno efekt immunosupresyjny jak i nefrotokstyczność cyklosporyny [11]. Podobny
efekt związany z hamowaniem apoptozy w komórkach nerek
32
oraz obniżeniem ekspresji TGF-β zaobserwowano u szczurów, które wraz z cyklosporyną otrzymywały kolchicynę
w dawce 30 mg/kg.mc. [12]. Nefrotoksyczność leku ograniczyło także zastosowanie chimerycznego, rozpuszczalnego
białka złożonego z domeny zewnątrzkomórkowej receptora dla TGF-β typu II i fragmentu Tc immunoglobuliny IgG
podawanego drogą elektroporacji do mięśni szkieletowych
myszy leczonych cyklosporyną [13].
Podobny do cyklosporyny mechanizm działania posiada takrolimus (FK506). Ten antybiotyk makrolidowy wyodrębniony ze Streptomyces tsukubaensis posiada zdolność
wiązania się z białkiem FKBP (ang. protein binding FK506)
i tworzenia kompleksu blokującego działanie kalcyneuryny,
co w konsekwencji uniemożliwia wniknięcie do jądra komórkowego czynnika NF-ATc i inicjację transkrypcji IL-2
(Rys. 2) Tak więc oba leki, mimo iż łączą się z różną cząsteczką docelową (cyklofilina i FKBP), hamują funkcję limfocytów T w podobny sposób [14].
Wieloośrodkowe badania europejskie wykazały, że
w grupie 545 pacjentów po przeszczepie wątroby częstość
epizodów odrzutu w grupie poddanej terapii takrolimusem
wynosiła 43,4% i była niższa niż w grupie kontrolnej leczonej cyklosporyną (53.6%). W grupie badanej zaobserwo-
wano jednak większą częstość powikłań neurologicznych
i nefrologicznych. Podobne wyniki otrzymano w badaniach
populacji liczącej 478 chorych. Zaobserwowano także występowanie hipertriglicerydemii, zaburzeń oddychania oraz
rytmu serca [15].
Inhibitory kinazy mTOR
Kinazy białkowe to grupa enzymów zaangażowana
w wiele kluczowych reakcji komórkowych, w tym reakcji
będących odpowiedzią na uszkodzenia, naprawę lub rekombinację DNA. Szczególne znaczenie ma szlak z udziałem kinazy 3-fosfatydyloinozytolu (PI3-k) oraz kinazy białkowej
B (Akt), które aktywują kaskadę innych kinaz, między innymi kinazę mTOR (ang. mammalian target of rapamycin).
mTOR o masie cząsteczkowej 289 kDa to kinaza serynowo-treoninowa, odgrywająca kluczową rolę w fosforylacji
kinazy rybosomalnej S6k, kinazy zależnej od cyklin (cdk)
i białka wiążącego czynnik 4E (4EBP) biorącego udział w
translacji [16]. Obecnie znane są dwa związki hamujące
mTOR - sirolimus i everolimus [17].
Sirolimus to antybiotyk makrolidowy odkryty w 1973
w próbce gleby pochodzącej z najodleglejszego miejsca
na ziemi - Wyspy Wielkanocnej wyodrębniony z bakterii
Streptomyces higroscopicus. Ze względu na miejsce odkrycia sirolimus nazywany jest także rapamycyną od Rapa Nui
tj. polinezyjskiej nazwy Wyspy Wielkanocnej. Po początkowym stwierdzeniu jego zdolności do hamowania wzrostu niektórych typów nowotworów, zainteresowanie tym
związkiem uległo zmniejszeniu. Ponowny „renesans” sirolimusu w medycynie nastąpił z chwilą rozpoczęcia badań dotyczących jego wpływu na układ immunologiczny. Związek
ten wiąże się z białkiem FKBP (tym samym z którym łączy
się takrolimus), jednak skutki jego molekularnego działania różnią się od efektów cyklosporyny i takrolimusu (Ryc.
2). Sirolimus ma zdolność hamowania bardzo wielu szlaków sygnalizacyjnych z udziałem cytokin. Kompleks tego
leku z białkiem FKBP inhibuje fosfatydylozależną kinazę
mTOR, niezbędną do aktywacji kinaz p70S6k i p34cdc2 [18,
19]. Kinaza p70S6k jest kluczowym enzymem warunkującym aktywność białka rybosomalnego S6 biorącego udział
w translacji. Kinaza p34cdc2 w kompleksie z cykliną E zwiększa aktywność białka p27kip, pełniącego funkcję inhibitora
zarówno kinaz zależnych od cyklin (cdk), jak i czynnika inicjującego translację eIF-4F. Zahamowanie aktywności tych
enzymów przez sirolimus skutkuje zablokowaniem cyklu
komórkowego limfocytów T na etapie przejścia z fazy G1
do fazy S. Szereg ośrodków klinicznych wykazało właściwości immunosupresyjne sirolimusu w połączeniu z cyklosporyną [20] i/lub mycofenolanem mofetilu [21] lub glikokortykosteroidami [22].
Everolimus to pochodna sirolimusa z dodatkową grupą
hydroksyetylową wiążącą się również z białkiem FKBP.
Wykazano jego silne immunosupresyjne działanie w połączeniu z niskimi dawkami cyklosporyny u pacjentów
po przeszczepie serca i nerek. Interesującą właściwością
leku jest interakcja synergistyczna z cyklosporyną, która
zwiększa efekt inhibicji od 10 do 1000 razy w porównaniu
z efektami działania każdego z leków z osobna. Głównym
skutkiem niepożądanym działania preparatu jest hipertrigli-
cerydemia oraz trombocytopenia, nie wpływa on jednak na
funkcje nerek, wątroby i ciśnienie krwi. Zastosowanie terapii skojarzonej sirolimus/cyklosporyna zwiększa wskaźnik
przeżycia do 97% w obserwacji rocznej, w porównaniu do
70% przeżycia obserwowanego przy terapii cyklosporyna/
prednizolon [23,24].
Obecnie podkreśla się zdolność inhibitorów kinazy
mTOR do wywierania poza immunosupresją innych działań
plejotropowych czyniących te związki bardzo użytecznymi
w transplantologii. Istotne działanie sirolimusu związane jest
z jego zdolnością do redukcji grubości śródbłonka naczyń
krwionośnych i zapobieganiem chorobom naczyń krwionośnych u chorych po przeszczepie serca. Choroby naczyń
krwionośnych stanowią główną przyczynę dysfunkcji przeszczepianego narządu u biorców nerek i serca. Rozwijające
się zmiany naczyniowe są skutkiem proliferacji komórek
mięśni gładkich w przeszczepianym narządzie, co doprowadza do ich okluzji i ograniczenia przepływu krwi [25]. Zastosowanie inhibitorów kinazy mTOR prowadzi do zablokowania sygnału proliferacji, co może powstrzymać rozwój
zmian naczyniowych. Działanie to tłumaczy się wpływem
tych związków na receptory VEGF oraz zdolnością sirolimusu do wiązania się ze specyficznymi receptorami dla
naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i czynnika wzrostu
fibroblastów (FGF) [26]. Sirolimus uwalniany stopniowo ze
stentów naczyniowych chroni skutecznie przed rozwojem
zmian naczyniowych i restenozą [27].
Pacjenci poddani transplantacjom są szczególnie narażeni na ryzyko nowotworzenia będące konsekwencją długotrwałej immunosupresji. Zastosowanie inhibitorów kinazy
mTOR może hamować rozwój niektórych typów nowotworów poprzez blokowanie podziału komórek na etapie fazy
G1. Właściwości przeciwnowotworowe sirolimusu zostały
odkryte ponad 20 lat temu, jednak szybko zaprzestano dalszych ich badań z uwagi na zainteresowanie właściwościami
immunosupresyjnymi tego leku [28]. Obecnie jego działanie przeciwnowotworowe stało się ponownie przedmiotem
uwagi naukowców ze względu na fakt, że wiele czynników
wzrostu może aktywować kinazy Akt i PI3-k, co z udziałem
kinazy mTOR prowadzi do proliferacji komórek nowotworowych [29]. Szlak Akt i PI3-k w warunkach fizjologicznych
jest hamowany przez produkt genu supresorowego PTEN,
a wiele typów nowotworów może powstać w wyniku modyfikacji tego szlaku lub utraty genu PTEN [30, 31]. Inhibitory
kinazy mTOR mogą także hamować rozwój nowotworów na
drodze innych mechanizmów. Sirolimus poprzez hamowanie szlaku PI3-k-Akt-mTOR, hamuje działanie VEGF, działa więc antyangiogennie, co uniemożliwia przerzutowanie
komórek nowotworowych. Podkreśla się także zdolność inhibitorów kinazy mTOR do hamowania angiogenezy na zasadzie stymulacji syntezy czynnika indukowanego hipoksją
HIF (ang. hypoxia inducible factor) [32]. Szereg przeprowadzonych do chwili obecnej badań wskazuje na możliwość
hamowania nowotworzenia u biorców przeszczepów przez
użycie inhibitorów kinazy mTOR. Dwuletnia obserwacja
pacjentów po przeszczepie nerek otrzymujących sirolimus
w terapii skojarzonej z cyklosporyną wykazywała znacząco mniejszą częstość występowania nowotworów skóry
w porównaniu z grupą kontrolną otrzymującą tylko cyklosporynę [33]. Metaanaliza 30 000 osób po przeszczepie ne-
33
rek wykazała, że chorzy leczeni sirolimusem z połączeniu
z cyklosporyną mają o połowę mniejsze względne ryzyko
zmian nowotworowych w porównaniu z chorymi leczonymi
inhibitorami kalcyneuryny bez sirolimusu [33].
Najnowsze badania sugerują również działanie przeciwwirusowe inhibitorów kinazy mTOR, związane z hamowaniem przejścia stanu latencji wirusa CMV w stan aktywny
zdolny do infekcji. Infekcja wywołana tym wirusem rozpoczyna się od jego wiązania się z receptorem EGF, co aktywuje szereg szlaków sygnalizacyjnych, w tym kaskadę
reakcji indukowaną przez kinazę PI3-k. Szlak PI3-k/Akt
poprzez aktywację kinaz Akt, kinaz zależnych od cyklin
i kinazy S6k odgrywa kluczową rolę w procesach transkrypcji i translacji umożliwiających replikację CMV. Ponadto
aktywacja szlaku PI3-k w zainfekowanych monocytach
umożliwia im migrację przez śródbłonek, co odgrywa decydującą rolę w rozprzestrzenianiu się wirusa w organizmie
człowieka. Dlatego zastosowanie związków zaburzających
transdukcję sygnału z udziałem kinazy PI3-k lub oddziałujących z receptorem EGF może prowadzić do hamowania
replikacji CMV [34, 35]. Aktywność przeciwnowotworową
everolimusu potwierdziły badania wieloośrodkowe, które
wykazały, że pacjenci otrzymujący ten lek i cyklosporynę
wykazywali mniejszą częstość infekcji CMV w porównaniu
do grupy otrzymującej cyklosporynę i azatioprynę [23]. Zastosowanie everolimusu u 492 pacjentów po transplantacji
nerek leczonych tym lekiem (w dwóch różnych dawkach)
i w kombinacji z niską dawką cyklosporyny spowodowało
infekcje CMV jedynie u 2.6% osób [24].
Leki blokujące receptory IL-2
Działanie biologiczne IL-2 odpowiedzialne jest za inicjację reakcji odrzucania przeszczepu. Z tego względu postępowanie farmakologiczne ma na celu zmniejszenie ekspresji genu tej cytokiny w limfocytach T lub blokowanie jej
receptorów. Do chwili obecnej wprowadzono do lecznictwa
dwa leki oddziałujące bezpośrednio na IL-2 lub jej receptor,
tj. bazyliksymab i daklizumab. Bazyliksymab to chimeryczne mysio-ludzkie przeciwciało monoklonalne posiadające zdolność blokady podjednostki α receptora dla IL-2 na
limfocytach T. Daklizumab to humanizowane przeciwciało
monoklonalne blokujące receptor dla IL-2 na limfocytach T.
Wykazano skuteczność obu leków w zmniejszaniu częstości
odrzutu przeszczepów nerek. Związki te mogą być stosowane we wczesnej fazie po przeszczepie nerek w miejsce
nefrotoksycznych inhibitorów kalcyneuryny (takrolimus lub
cyklosporyna) [36, 37, 38].
Leki blokujące niespecyficznie syntezę
nukleotydów
Do grupy tej zalicza się inhibitory syntezy puryn (mykofenolan mofetilu) i inhibitory syntezy pirymidyn (brequinar
i leflunomid). Mykofenolan mofetilu to ester morfolinowy
kwasu mykofenolowego, który jest produkowany przez
kilka gatunków grzyba z rodzaju Penicillium. W wątrobie związek ten ulega hydrolizie do aktywnego metabolitu
–kwasu mykofenolowego, który niekompetycyjnie i odwracalnie hamuje aktywność dehydrogenazy monofosforanu
34
inozyny (IMP) typu I i II, biorącej udział w syntezie DNA
w fazie S cyklu komórkowego [39]. Enzym ten przekształca IMP, produkt syntezy puryn de novo do monofosforanu
guanozyny (GMP) oraz uczestniczy w szlaku rezerwowym
typu salvage syntezy puryn przebiegającym ze znacznie
mniejszą szybkością niż synteza puryn de novo. W czasie
aktywacji limfocytów T ekspresja obu typów dehydrogenazy monofosforanu inozyny wzrasta około dziesięciokrotnie
[40]. Lek nie wpływa na syntezę cytokin, zmniejsza jednak
liczbę limfocytów i monocytów w ognisku zapalnym. Leki
starej generacji (np. azatiopryna) w przeciwieństwie do mykofenolanu mofetilu hamują aktywność enzymów biorących
udział w syntezie nukleotydów de novo.
Zastosowanie mykofenolanu mofetilu u 491 osób po
przeszczepie nerki w dawce 2 lub 3 gramy na dobę w połączeniu z cyklosporyną i prednizonem wykazało znaczny spadek odsetka epizodów odrzutu przeszczepu wynoszący w grupie kontrolnej (placebo) 46,4% , w grupie
otrzymującej lek 17% i 13,8 % (odpowiednio dla dawki
2 i 3 g/dobę). Wykazano, że lek ten obniża częstość i nasilenie ostrych incydentów przeszczepu, ale ma niewielki wpływ
na częstość reakcji odrzutu w obserwacji długoterminowej.
Zaobserwowano ponadto mniejszą nefrotoksyczność leku
w porównaniu z azatiopryną, jeśli użyto go w skojarzeniu
z cyklosporyną lub takrolimusem [41].
Brequinar to pochodna difluorochinolonu o właściwościach przeciwnowotworowych i immunosupresyjnych wynikających z niekompetycyjnego hamowania
dehydrogenazy dihydroorotanowej, przekształcającej
kwas dihydroorotowy w kwas orotowy. Przemiana ta
jest kluczowa dla syntezy urydyny i cytydyny niezbędnych do syntezy DNA i RNA. Wstępne wyniki badań
klinicznych sugerują, że połączenie leku z cyklosporyną i prednizolonem zmniejsza częstość reakcji odrzutu
po przeszczepach [42, 43].
Leflunomid to pochodna izoksazolowa o działaniu przeciwzapalnym, antyproliferacyjnym, immunosupresyjnym
i immunomodulacyjnym. Lek ten hamuje aktywację limfocytów T przez blokowanie kinaz tyrozynowych z rodzin Lck
i Fyn (Ryc. 1). Kinazy te uczestniczą w transdukcji sygnału
pochodzącego od wielu czynników wzrostu jak np. IL-2,
IL-3 i TNF-α ale nie IL-1. Efekty takie jednak obserwuje
się w stężeniach większych niż terapeutyczne. Za główny
mechanizm działania uznaje się hamowanie IL-4 i jej receptora oraz hamowanie syntezy pirymidyn poprzez blokowanie dehydrogenazy dihydrorotanowej i ograniczenie syntezy
de novo rybonukleotydu monofosforanu urydyny. Lek stosowany jest również w leczeniu reumatoidalnego leczenia
stawów. Ponadto wykazano jego zdolność do zapobiegania
infekcjom wirusem cytomegalii poprzez zablokowanie łączenia się tegumentu z nukleokapsydem. [44].
Ograniczenie stosowania klinicznego leków zarówno
starej i nowej generacji blokujących syntezę nukleotydów
wynika z ich niespecyficznego działania na różne typy proliferujących komórek. Leki te nie tylko chronią organizm
przed skutkami działania cytotoksycznego limfocytów T,
ale także hamują fizjologiczne funkcje szpiku kostnego
i komórek przewodu pokarmowego. Żaden z leków tej grupy nie jest wskazany do prewencji odrzutu przeszczepu. Jedynie bardziej selektywne działanie mykofenolanu mofetilu
czyni go użytecznym w uzupełnieniu standardowej terapii
cyklosporyną i prednizonem.
Poznanie molekularnych mechanizmów reakcji odrzutu
przeszczepu umożliwiło szerokie zastosowanie nowych leków immunosupresyjnych w transplantologii i ograniczenie
ich działań niepożądanych. Jednocześnie znajomość czynników transkrypcyjnych i cytokin, na które leki te wpływają
pozwoliło na ich zastosowanie w leczeniu innych chorób takich jak łuszczyca, atopowe zapalenie skóry, choroba Crohna i zapalenie spojówek [45].
Piśmiennictwo
1. Murase N i wsp. Multilineage hematopoietic reconstruction superalethaly irradiated rats by syngeneic
whole organ transplantation with particular reference to
the liver. Transplantation 1996; 61: 1-4.
2. Weiss A, Littman D. Signal transduction by lymphocyte
antigen receptors. Cell 1994; 76: 263-274.
3. Malissen B, Schmitt-Verhulst A. Transmembrane signalling through the T-cell-receptor-CD3 complex. Curr
Opin Immunol 1993; 5: 324-233.
4. Hay N, Sonenberg N. Upstream and downstream of
mTOR. Genes Dev 2004; 18: 1926-45
5. Borel J i wsp. Biological effects of cyclosporin A: a
new antilymphocytic agent. Agents Actions 1976; 6:
468-475.
6. Liu J i wsp. Calcineurin is a common target of cyclophilin-cyclosporin A and FKBP- FK506 complexes.
Cell 1991; 66: 807-815.
7. Magnasco A i wsp. Cyclosporin and organ specific toxicity: clinical aspects, pharmacogenetics and perspectives. Curr Clin Pharmacol 2008; 3: 166-173.
8. Naesens M, Kuypers D, Sarwal N. Calcineurin inhibitor nephrotoxicity. Clin J Am Soc Nephrol 2009; 4:
481-508.
9. Andre N, Roquelaure B, Conrath J. Molecular effects of
cyclosporine and oncogenesis: a new model. Med Hypotheses 2004; 63: 647-652.
10. Akool el-S i wsp. Molecular mechanisms of TGFbeta
receptor-triggered signaling cascades rapidly induced
by the calcineurin inhibitors cyclosporin A and FK506.
J Immunol 2008; 181: 2831-2845.
11. Khanna A i wsp. Expression of TGF-beta and fibrogenic genes in transplant recipients with tacrolimus
and cyclosporine nephrotoxicity. Kidney Int 2004; 62:
2257-2263.
12. Disel U i wsp. Effect of colchicine on cyclosporine
nephrotoxicity, reduction of TGF-beta overexpression, apoptosis, and oxidative damage: an experimental animal study. Transplant Proc. 2004; 36:
1372-1376.
13. Xiu J i wsp. Suppression of cyclosporine a nephrotoxicity in vivo by transforming growth factor beta receptorimmunoglobulin G chimeric protein. Transplantation
2004; 15, 77: 1433-1442.
14. Kino T i wsp. FK-506, a novel immunosuppressant isolated from a Streptomyces. Fermentation, isolation, and
physico-chemical and biological characteristics. J Antibiot 1987; 40: 1249-1255.
15. Morris-Stiff i wsp. Conversion of renal transplant recipients from cyclosporin to low-dose tacrolimus for refractory rejection. Transpl Int 1998; 11: 78-81.
16. Schmelzle T, Hall N. TOR, a central controller of cell
growth. Cell 2000; 103: 253-262.
17. Kovarik i wsp. Everolimus therapeutic concentration
range defined from a prospective trial with reduced-exposure cyclosporine in de novo kidney transplantation.
Ther Drug Monit 2004; 26: 499-505.
18. Kunz J i wsp. Target of rapamycin in yeast, TOR2, is an
essential phosphatidylinositol kinase homolog required
for G1 progression. Cell 1993; 73: 585-596.
19. Morice W i wsp. Rapamycin-induced inhibition of p34cdc2
kinase activation is associated with G1/S-phase growth arrest in T lymphocytes. J Biol Chem 1993; 268: 3734-3738.
20. Kahan B. The synergistic interactions in vitro and in
vivo of brequinar sodium with cyclosporine or rapamycin alone and in triple combination. Transplantation
1993; 55: 894-900.
21. Flechner S i wsp. Kidney transplantation without calcineurin inhibitor drugs: a prospective, randomized trial
of sirolimus versus cyclosporine. Transplantation 2002;
74: 1070-1076.
22. Groth C i wsp. Sirolimus (rapamycin)-based therapy in
human renal transplantation: similar efficacy and different toxicity compared with cyclosporine. Sirolimus European Renal Transplant Study Group. Transplantation
1999; 67: 937-938.
23. Eisen H i wsp. Everolimus for the prevention of allograft
rejection and vasculopathy in cardiac transplant recipients. N Engl J Med 2003; 349: 847-858.
24. Vitko S i wsp. Everolimus with optimal dosing in renal
transplant recipient: 6 month safety and efficacy results of
two randomized trials. Am J Transplant 2004; 4: 626-635.
25. Keck B i wsp. Worldwide thoracic organ transplantation
L a report from the UNOS /ISHLT International Registry for thoracic organ transplantation. Clin Transplant
1999; 13: 35-49.
26. Wang X i wsp. Epidermal growth factor receptor is a cellular receptor for human cytomegalovirus. Nature 2003;
424: 456-461.
27. Mancini D i wsp. Use of rapamycin slows progression of
cardiac transplantation vasculopathy. Circulation 2003;
108: 48-53.
28. Douros J, Suffness M. New antitumor substances of natural origin. Cancer Treat Rev 1981; 8: 63-67.
29. Sawyers C. Will mTOR inhibitor make it as cancer drug
? Cancer Cell 2003; 4: 343-348.
30. Brennan P i wsp. Phosphatidyloinositol 3-kinase is essential for the proliferation of lymphoblastoid. Oncogene 2002; 21: 1263-1271.
31. Neshat M i wsp. Enhanced sensivity of PTEN deficient
tumors to inhibition of FRAP/mTOR. Proc Natl Acad
Sci USA 2001; 98: 10314-10319.
32. Zhong H i wsp. Modulation of hypoxia-inducible factor
1alpha expression by the epidermal growth factor/phosphatidylinositol 3-kinase/PTEN/AKT/FRAP pathway
in human prostate cancer cells: implications for tumor
angiogenesis and therapeutics. Cancer Res 2000; 60:
1541-1545.
35
33. Mathew T, Kreis H, Friend P. Two -years incidence of
malignancy in sirolimus –treated renal transplant recipients : results from five multicenter studies. Clin Transplant 2004; 18: 446-449.
34. Smith M i wsp. HCMV activates PI3K in monocytes
and promotes monocyte motility and transendothelial
migration in a PI3-K – dependent manner. J Leukoc
Biol 2004; 76: 65-76.
35. Evers D i wsp. 3,4,5–trihydroxy-trans-stilbene (resveratrol) inhibits human cytomegalovirus replication ad virus induced cellular signaling. Antiviral Res 2004; 63:
85-95.
36. Ponticelli C i wsp. A randomized, double-blind trial of
basiliximab immunoprophylaxis plus triple therapy in
kidney transplant recipients. Transplantation 2001; 15:
1261-1267.
37. Pescovitz M i wsp. Safety and pharmacokinetics of daclizumab in pediatric renal transplant recipients. Pediatr
Transplant 2008; 12: 447-455.
38. Vega O i wsp. Basiliximab vs. limited-dose daclizumab (2 mg/kg) administered in single or two separated
doses in kidney transplantation. Rev Invest Clin 2008;
60: 82-86.
39. Platz K i wsp. RS-61443 – a new, potent immunosuppressive agent. Transplantation1991; 51: 27-31.
40. Eugui E i wsp. Lymphocyte-selective cytostatic and immunosuppressive effects of mycophenolic acid in vitro:
role of deoxyguanosine nucleotide depletion. Scand J
Immunol 1991; 33: 161-173.
41. Fisher R i wsp. Four-year follow-up of a prospective
randomized trial of mycophenolate mofetil with cyclosporine microemulsion or tacrolimus following liver
transplantation. Clin Transplant 2004;18: 463-472.
42. Mclean L i wsp. Multiple inhibitor analysis of the brequinar and leflunomide binding sites on human dihydroorotate dehydrogenase. Biochemistry 2001; 40: 21942200.
43. Baumgartner R i wsp. Dual binding mode of a novel
series of DHODH inhibitors. J Med Chem 2006; 23:
1239-1247.
44. Waldman W i wsp. Novel mechanism of inhibition of cytomegalovirus by the experimental immunosuppressive
agent leflunomid. Transplantation 1999; 68: 814-825.
45. Akhavan A, Rudikoff D. Atopic dermatitis: systemic
immunosuppressive therapy. Semin Cutan Med Surg
2008; 27: 151-155.
Sławomir Smolik
Katedra i Zakład Biochemii
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
ul. Narcyzów 1
41-200 Sosnowiec
tel. + 48 32 364 10 73
36
Molecular diagnostics of achondroplasia
Paulina Borkowska, Jan Kowalski
Katedra i Zakład Genetyki Medycznej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,
Streszczenie
Achondroplazja jest najczęściej spotykaną nieletalną dysplazją szkieletową. Choroba dziedziczona autosomalnie
dominująco jest skutkiem mutacji punktowej w genie
kodującym receptor 3 dla czynnika wzrostu fibroblastów
– FGFR3. Badania w kierunku achondroplazji mogą być
prowadzone na etapie rozwoju prenatalnego, postnatalnego, a także jako element diagnostyki przedimplantacyjnej.
Stosowana w tym celu diagnostyka molekularna wykorzystuje metodę PCR-RFLP lub jej modyfikacje.
Słowa kluczowe: achondroplazja, mutacja punktowa, receptor 3 czynnika wzrostu fibroblastów (FGFR3), enzymy restrykcyjne
Achondroplazja zwana także chondrodystrofią lub
dwarfizmem jest najczęściej spotykaną, nieletalną (w układzie heterozygotycznym) dysplazją szkieletową. Częstość
jej występowania waha się pomiędzy 1/10000 a 1/30000
urodzeń i nie zależy od rasy lub płci [1]. W achondroplazji obserwujemy nieprawidłowe kostnienie śródchrzęstne,
w efekcie pojawiają się zaburzenia w rozwoju kości i karłowatość. Skróceniu ulegają przede wszystkim kość udowa
i kości przedramienia, co powoduje zaburzenie proporcji
ciała. Inne cechy charakterystyczne dla tej jednostki chorobowej to szpotowatość kończyn, ręka trójzębna, przykurcze w stawach, lordoza lędźwiowa, nieproporcjonalnie duża
głowa i wyraźnie zapadnięta nasada nosa [2].
Achondroplazja to choroba uwarunkowana genetycznie, dziedziczona autosomalnie dominująco, jednak w 90%
przypadków powstaje de novo. Prawdopodobieństwo urodzenia chorego potomstwa rośnie wraz z wiekiem ojca [3].
W przypadku obojga rodziców z achondroplazją prawdopodobieństwo powstania homozygoty z dwarfizmem wynosi
25%, jednak układ homozygotyczny jest letalny na etapie
rozwoju zarodkowego [4].
W 97% przypadków przyczyną achondroplazji jest pojedyncza mutacja punktowa, w genie kodującym receptor 3 dla
czynnika wzrostu fibroblastów - FGFR3 (fibroblast growth
factor receptor 3). Gen ten zlokalizowany jest w krótkim ramieniu chromosomu 4 (4p16.3), a mutacja pojawiająca się
w pozycji 1138 to substytucja typu tranzycji – w tym przypadku zamiana guaniny na adeninę. Pozostałe 3% przypadków achondroplazji związane jest z wystąpieniem mutacji
w tej samej pozycji, jednak jest to substytucja typu transwer-
Abstract
Achondroplasia is the most common non-lethal skeletal
dysplasia. This autosomal dominant disorder is caused by
point mutation in the gene encoding the type 3 receptor
for fibroblast growth factor FGFR3. Achondroplasia can
be diagnosed prenatally, postnatally or in blastomers before implantation. Molecular detection of achondroplasia
is based on typical PCR-RFLP method or modified PCRRFLP.
Key words: achondroplasia, point mutation, fibroblast
growth factor receptor 3 (FGFR3); restriction enzyme
sji –zamiana guaniny na cytozynę. Pojawiające się substytucje to mutacje zmiany sensu. W efekcie, w obu przypadkach,
w kodonie 380 glicyna zastępowana jest argininą (G380R),
a zmiana dotyczy transmembranowej domeny FGFR3 [5].
Celem opracowania i wdrożenia metod molekularnych
do diagnostyki postnatalnej achondroplazji była możliwość
wczesnego wykluczenia lub potwierdzenia choroby. Szybkie rozpoczęcie terapii ma niebagatelny wpływ na jakość
życia chorego. Badania molekularne wykrywające achondroplazję są także ważnym elementem badań prenatalnych
[6] i przedimplantacyjnych w przypadku rodzin z grupy ryzyka [7].
Pierwszym etapem diagnostyki postnatalnej choroby jest izolacja DNA z krwi pełnej przy użyciu gotowych
zestawów [4] lub izolacja z zastosowaniem standardowej
procedury [2]. Po przeprowadzeniu ekstrakcji dokonujemy
analizy ilościowej i jakościowej otrzymanego DNA. Kolejnym etapem jest przeprowadzenie reakcji PCR z użyciem
starterów (F: 5’AGGAGCTGGTGGAGGCTGA3’ R: 5’GGAGATCTTGTGCACGGTGG3’) flankujących region
podlegający mutacji. Produkt reakcji ma wielkość 164 pz
(Tab. I) [5].
Zastosowanie techniki PCR-RFLP z użyciem różnych
enzymów restrykcyjnych pozwala na zdiagnozowanie choroby oraz na określenie genotypu pacjenta. Produkt o wielkości 164 pz, jest trawiony enzymami SfcI lub MspI przy
odpowiednich dla danego enzymu warunkach termicznych
(Tab. I). Enzym SfcI trawi zmutowany produkt PCR na fragmenty o wielkości 109 pz i 55 pz pozwalając tym samym na
zdiagnozowanie genotypu G/A lub A/A. Enzym MspI tra-
37
Tab. I. Sekwencje starterów i warunki zastosowane do analizy RFLP w celu zdiagnozowania określonego typu mutacji
[5], zmodyfikowano wg [4]
PCR
Zastosowane startery
1
F: 5’AGGAGCTGGTGGAGGCTGA3’
R: 5’GGAGATCTTGTGCACGGTGG3’
2
F: 5’AGGAGCTGGTGGAGGCTGA3’
R: 5’GGAGATCTTGTGCACGGTGG3’
Wielkość
otrzymanego
produktu
164 pz
164 pz
Ryc. 1. Elektroforogram przedstawiający wynik trawienia
produktów PCR enzymami SfcI i MspI. Pacjenci 1 i 2 (przy
enzymie SfcI) to heterozygoty G1138A. Brak produktów trawienia enzymem MspI świadczy o braku genotypu G1138C
u któregokolwiek z pacjentów, zmodyfikowano wg [4].
wi zmutowany produkt PCR na fragmenty o długości 107
pz i 57 pz, pozwalając na zdiagnozowanie genotypu G/C
lub C/C. U żywo urodzonych pacjentów, oprócz wymienionych powyżej, znamiennych dla danego enzymu produktów trawienia, występuje także produkt o długości 164 pz
świadczący o heterozygotycznym genotypie (G/A lub G/C).
Zdrowy pacjent pozbawiony mutacji w obu allelach genu
FGFR3 w pozycji 1138 nie posiada miejsca uchwytu dla
żadnego z enzymów restrykcyjnych i reprezentuje genotyp
G/G. Wynik trawienia obserwowany jest na żelu agarozowym (Ryc. 1) [4].
Warunki trawienia
Zdiagnozowana
mutacja
SfcI: 37°C; 1 h
SfcI: 25°C; 16 h
Produkty: 109 pz; 55 pz
MspI: 37°C; 1 h
Produkty: 107 pz; 57 pz
G1138A
G1138C
Diagnostyka przedimplantacyjna w kierunku achondroplazji prowadzona jest w przypadku gdy u jednego lub
obu partnerów występuje choroba. Diagnostykę przedimplantacyjną przeprowadza się na polocytach, blastomerach lub komórkach trofodermy blastocysty. Biopsja ciałek kierunkowych i analiza zawartego w nich materiału
genetycznego pozwala wywnioskować czy dana komórka
jajowa po zapłodnieniu rozwinie się w zdrowy zarodek
[8].
Do diagnostyki achondroplazji wykorzystywane są
również blastomery. W celu uniknięcia błędnego rozpoznania należy pobrać dwa blastomery z każdego zarodka.
Przeprowadzając lizę blastomeru za pomocą komercyjnie dostępnych zestawów, DNA uwalniane jest z wnętrza
komórki. Prowadząc reakcję PCR na matrycy pozyskanej
z pojedynczej komórki wzrasta ryzyko kontaminacji próbki
obcym DNA. Ponadto rośnie prawdopodobieństwo wystąpienia zjawisk niepożądanych takich jak nierównomierna
amplifikacja alleli heterozygoty (efekt stochastyczny) lub
wypadanie alleli ADO (ang. allelic drop out). Dlatego też
przed przeprowadzeniem właściwej reakcji PCR prowadzi
się wstępną amplifikację całego genomu [7].
Kolejnym etapem jest przeprowadzenie właściwej reakcji
PCR z użyciem odpowiednich starterów flankujących region
podlegający mutacji np.: (F: 5’CTGTCGCTTGAGCGGGAAGC3’ R:
5’CCGAGGAGGAGCTGGTGGA3’).
W tym przypadku końcowym efektem reakcji jest produkt o długości 191 pz. Starter antysensowny zastosowany
w reakcji należy wyznakować sondą fluorescencyjną. Oprócz
reakcji PCR przeprowadzonej dla materiału badanego wy-
4800
3600
2400
1200
0
1B : digestion control
1R : size standard
1Y : heterorygous
2B : digestion control
2R : size standard
2Y : normal control
4800
3600
2400
1200
0
Ryc. 2. Elektroforogram produktu PCR locus G380 genu FGFR3. Standard wielkości Genescan Rox500 zaznaczony jako
puste piki. Próbka referencyjna kolor szary, próbka badana kolor czarny. Profil pierwszy – heterozygota G380R, profil drugi
zdrowa homozygota [7].
38
konywane są czynności analogiczne dla próbki referencyjnej (DNA limfocytów). Jedyną różnicą jest wyznakowanie
startera antysensownego inną sondą fluorescencyjną [7].
Otrzymane produkty PCR poddajemy działaniu enzymu
restrykcyjnego SfcI lub MspI z zastosowaniem odpowiednich warunków termicznych. Enzym SfcI trawi zmutowany
produkt PCR na fragmenty o długości 61 pz i 130 pz [7].
Przed przystąpieniem do analizy należy zmieszać równe objętości otrzymanych produktów PCR (próbki badanej
i referencyjnej). Podczas analizy rejestrowany jest sygnał od
fragmentów 130 pz i 191 pz ponieważ tylko jeden starter
w każdej z reakcji był wyznakowany fluorochromem. Na
podstawie otrzymanego elektroforogramu (Ryc. 2) określany jest genotyp pacjenta. Dzięki analizie próbki badanej
w odniesieniu do kontroli możliwa staje się także ocena wydajności reakcji PCR oraz stopnia wypadania alleli [7].
W rodzinach z grupy ryzyka, w których doszło do naturalnego zapłodnienia, metody molekularne są wykorzystywane do prenatalnego diagnozowania achondroplazji. Prawdziwa rewolucja w nieinwazyjnej diagnostyce prenatalnej
nastąpiła gdy okazało się, iż w matczynej krwi obwodowej
znajdują się komórki płodu. Stanowią one szczególnie cenny materiał do badań prenatalnych, gdyż zawierają DNA
innej wielkości niż DNA matki [6].
W celu przeprowadzenia analizy należy wyizolować
DNA z krwi obwodowej pobranej od matki. Po ekstrakcji,
DNA należy rozdzielić w 1% żelu agarozowym, a wiedząc,
iż DNA płodu ma wielkość 300 pz można dokładnie określić
jego umiejscowienie. Przy pomocy komercyjnie dostępnych
zestawów z żelu ekstrahowane jest DNA płodu [9]. Następnie, podobnie jak w przypadku innego materiału należy przeprowadzić reakcję amplifikacji z zastosowaniem odpowiednio dobranych starterów. Otrzymany produkt PCR trawiony
jest enzymem restrykcyjnym, a dzięki analizie znamiennych
produktów określany jest genotyp pacjenta [6].
Diagnostyka molekularna achondroplazji odgrywa
ogromne znaczenie na każdym z przedstawionych etapów
rozwoju. W przypadku diagnostyki przedimplantacyjnej
u rodzin z grupy ryzyka umożliwia wybór i implantację
zdrowego zarodka. W przypadku diagnostyki prenatalnej
umożliwia przerwanie ciąży na jej wczesnym etapie lub
daje szansę przyszłym rodzicom na oswojenie się z trudną,
niecodzienną sytuacją. W badaniach postnatalnych pozwala
na stuprocentowe potwierdzenie diagnozy postawionej na
podstawie cech fenotypowych i wczesne wdrożenie zróżnicowanych metod terapii.
Prawdziwą zaletą przytoczonych metod są niskie koszty
ich wykonania, dlatego też istnieje realna możliwość wdrożenia badań w kierunku achondroplazji do standardowych
procedur przedimplantacyjnych.
Piśmiennictwo
1. Baujat G i wsp. Achondroplasia. Best Pract Res Clin
Rheumat 2008; 22: 3-18.
2. Bellus GA i wsp. Achondroplasia is defined by recurrent
G380A mutations of FGFR3. Am J Hum Genet 1995;
56: 368–373.
3. Wilkin DJ, Szabo JK, Cameron R. Mutations in fibroblast
growth-factor receptor 3 in sporadic cases of achondroplasia occur exclusively on the paternally derived chromosome. Am J Hum Genet 1998; 63: 711–716.
4. Lale Satiroglu–Tufan N i wsp. Accurate diagnosis of
homozygous G1138A mutation in the fibroblast growth
factor receptor 3 gene responsible for achondroplasiia.
Tohoku J Exp Med 2006; 208: 103-107.
5. Shiang R i wsp. Mutations in the transmembrane domain of FGFR3 cause the most common genetic form of
dwarfism, achondroplasia. Cell 1994; 78: 335–342.
6. Li Y i wsp. Improved prenatal detection of a fetal point
mutation for achondroplasia by the use of size-fractionated circulatory DNA in maternal plasma-case report.
Prenat. Diagn. 2004, 24: 896-898.
7. Moutou C i wsp. Preimplantation genetic diagnosis for
achondroplasia: genetics and gynaecological limits and
difficulties. Hum Reprod 2003, 18: 509-514.
8. Braude P. Preimplantation genetic diagnosis and embryo
research – human developmental biology in clinical
practice. Int J Dev Biol 2001, 45: 607-611.
9. Li Y i wsp. Detection of Paternally Inherited Fetal Point
Mutations for β-Thalassemia Using Size-Fractionated
Cell-Free DNA in Maternal Plasma. JAMA 2005, 293.
Paulina Borkowska
Katedra i Zakład Genetyki Medycznej
ul. Ostrogórska 30, 41-200 Sosnowiec
tel: +44 32 364 14 01
39
izolowanych ze środowiska szpitalnego
Analysis of molecular polymorphism of Staphylococcus spp.
strains isolated from hospital environment
Robert D. Wojtyczka1, Małgorzata Kępa1, Danuta Idzik1, Krzysztof Jasik1, Jerzy Pacha1, Daniel Krakowian2,
Łukasz Marek2, Dominik Skiba2, Adam Kudelski2
Katedra i Zakład Mikrobiologii Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu,
Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach
2
Koło STN przy Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Wydziału Farmaceutycznego
z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach
1
Streszczenie
Zakażenia szpitalne stanowią złożony problem dla współczesnego lecznictwa i są przyczyną przedłużonego leczenia, rekonwalescencji, zwiększonych kosztów a nawet wielu zgonów wśród pacjentów hospitalizowanych.
W badaniach przedstawiono zastosowanie techniki PCR
RFLP z użyciem fragmentu genu 16S rRNA, ITS PCR
oraz MSSCP do analizy szczepów Staphylococcus spp.
izolowanych ze środowiska szpitalnego. W otrzymanych
wynikach badań analiza restrykcyjna obszaru 16S rRNA
z użyciem enzymów MspI i Hind III nie wykazała przydatności do badań pokrewieństwa wyizolowanych szczepów Staphylococcus spp. Większe zdolności różnicujące
otrzymano poprzez analizę odcinka znajdującego się między 16S rRNA i 23S rRNA, który cechował się dużym
polimorfizmem.
Analiza rejonu polimorficznego pomiędzy 16S rRNA
a 23S rRNA za pomocą techniki wielotemperaturowego
SSCP (MSSCP) wykazała bardzo duże zróżnicowanie
wyizolowanych szczepów, jednak otrzymany wzór prążkowy z uwagi na zbyt dużą liczbę prążków może utrudniać interpretację.
Abstract
Nosocomial infections pose very complicated problem for
nowadays. They are a reason for longer treatment, longer time of recovery, bigger costs of treatment and what
most important death of some hospitalized patients. In this
study following techniques: PCR RFLP using 16SrRNA
fragment, ITS PCR and MSSCP were used for analysis of
Staphylococcus spp. strains isolated form hospital milieu.
We showed that restriction analysis of the 16S rRNA digested with MspI and Hind III was not a proper techniques
for finding relationship between examine strains. Better
results we obtained after analysis much more polymorphic fragment found between 16S rRNA and 23S.
Multitemperature single strand conformation polymorphism technique (MSSCP) used to analysis selected polymorphic region showed big diversity of tested strains.
However multiply band patterns obtained in this analysis
cause problem in results interpretation.
Key words: MSSCP, PCR RFLP, Staphylococcus spp.,
16S rRNA, 16S – 23S rRNA
Słowa kluczowe: MSSCP, PCR RFLP, Staphylococcus
spp., 16S rRNA, 16S – 23S rRNA
Wstęp
Zakażenia szpitalne stanowią złożony problem dla
współczesnego lecznictwa i dotyczą wszystkich osób mających kontakt ze środowiskiem szpitalnym. Nie tylko pacjentów znajdujących się na oddziale, personelu medycznego,
ale także i osób przypadkowo znajdujących się w szpitalu
[1].
Zakażenia szpitalne są przyczyną przedłużonego leczenia i rekonwalescencji, zwiększonych kosztów ponoszonych
40
przez szpitale, a nawet wielu zgonów pacjentów w nich hospitalizowanych. Dane oparte na badaniach prospektywnych
wykazują od 10% do 30% śmiertelność wśród pacjentów
w wyniku zakażeń nabytych w trakcie ich pobytu w szpitalu.
W latach 90-tych trzy ziarenkowce Gram – dodatnie takie
jak: Staphylococcus aureus, koagulazoujemne gronkowce
i eneterokoki stanowiły aż 34% infekcji szpitalnych. Duży
problem stwarzają także szczepy wielolekooporne, których
leczenie jest utrudnione ze względu na ograniczone możliwości terapeutyczne [2]. Problem ten jest też widoczny
wśród szczepów metycylinoopornych gronkowca złocistego
(MRSA) jak u szczepów metycylinoopornych gronkowców
koagulazoujemnych (MRCNS).
Ważnym elementem ograniczającym przenoszeniu zakażeń szpitalnych jest odpowiednie monitorowanie środowiska szpitalnego wraz z odpowiednią techniką laboratoryjną.
Tradycyjna diagnostyka mikrobiologiczna oparta na analizie
cech fenotypowych, nie daje pełnych możliwości analizy
zróżnicowania szczepów izolowanych ze środowiska szpitalnego, dlatego poszukuje się coraz nowszych, dokładniejszych i o większej zdolności do różnicowania metod badawczych, opartych głównie na analizie molekularnej szczepów
poprzez analizę cech genotypowych bakterii. Do badań tych
używa się analiz wielu różnych fragmentów genów zarówno
tych konserwatywnych jak i wysoce zmiennych.
Analizę sekwencji genu 16S rybosomalnego RNA (16S
rRNA) używa się do identyfikacji gatunkowej bakterii
i wykonywania badań taksonomicznych. Bakteryjny gen
16S rRNA zwykle zawiera 9 wysokozmiennych obszarów
wykazujących znaczną różnorodność pomiędzy gatunkami
bakteryjnymi i może być on wykorzystywany do identyfikacji gatunkowej. Obszary wysokozmienne są flankowane
u wielu bakterii przez konserwatywne fragmenty, pozwalając na amplifikację techniką PCR (Polymerase Chain Reaction) sekwencji docelowych przy użyciu uniwersalnych
starterów [3].
W ostatnich latach coraz częściej w badaniach polimorfizmu znajduje technika ITS PCR (ang. Intergenic Transcribed Spacer PCR) gdzie amplifikowany jest obszar pomiędzy
genami kodującymi 16S i 23S rRNA. Ten wysokozmienny
obszar prawdopodobnie umożliwi typowanie szczepów
w obrębie gatunku [4, 5].
W badaniach pokrewieństwa szczepów coraz większe
znaczenie ma łączenie kilku technik biologii molekularnej
(PCR i RFLP, PCR i MSSCP) w celu zwiększenia czułości
i specyficzności prowadzonych badań.
Użycie techniki PCR, w połączeniu z techniką MSSCP
(Multitemperature Single Strand Conformation Polymorphism), która jest nową, szybką techniką do analizy polimorfizmów i mutacji występujących w DNA pozwoli prawdopodobnie na opracowanie szybkiej i wiarygodnej metody
diagnostycznej służącej do analiz zakażeń szpitalnych [6].
Mając na uwadze konieczność poszukiwania prostych
ale zarazem wysoce specyficznych technik analizy podobieństwa lub zróżnicowania szczepów izolowanych ze środowiska szpitalnego w naszych badaniach podjęto próbę
zastosowania techniki PCR RFLP, ITS PCR oraz MSSCP
w celu określenia ich przydatności do badania pokrewieństwa szczepów Staphylococcus spp. wyizolowanych ze środowiska szpitalnego.
Metodyka badań
Badania hodowlane
W wyniku przeprowadzonych badań czystości mikrobiologicznej środowiska szpitalnego wyizolowano 110
szczepów, które poddano analizie gatunkowej w kierunku
rodzaju Staphylococcus, zgodnie z obowiązującą metodyka
badań mikrobiologicznych. Wszystkie wyizolowane szczepy gronkowców zostały zidentyfikowane biochemicznie do
gatunku przy użyciu testów API Staph (BioMerieux France).
Do badan molekularnych wybrano 11 szczepów Staphylococcus spp. (Tab. I): 10 szczepów wyizolowanych ze
środowiska szpitalnego - 5 szczepów Staphylococcus epidermidis, 3 szczepów Staphylococcus aureus, 2 szczepów
Staphylococcua xylosus oraz szczepu wzorcowego Staphylococcus aureus ATCC 25923. Szczepy do dalszych badań
przechowywano w systemie VIABANK w temperaturze
-800C.
Izolacja DNA
Z namnożonych na agarze krwawym (24 h w 370C)
szczepów przeprowadzono izolację DNA za pomocą zestawu Genomic Mini (DNA-Gdańsk II s.c.) z dodatkiem lizostafiny (400u/ml) i lizozymu (18mg/ml). Stężenie wyizolowanego DNA określano metoda fluorymetryczna w aparacie Qubit Fluorymetr (Invitrogen). DNA do dalszych badań
przechowywano w temperaturze -200C.
Reakcja PCR
W kolejnym etapie badań przygotowano 2 pary starterów. Dla fragmentu genu 16S rRNA i dla rejonu zmiennego
pomiędzy genami 16S rRNA i 23S rRNA (Tab. II)
Tab. I. Identyfikacja gatunkowa szczepów użytych do analiz
Nr szczepu
1
2
3
4
5
6
identyfikacja
Staphylococcus xylosus
Staphylococcus aureus MSSA
Staphylococcus epidermidis
Nr szczepu
7
8
9
10
11
identyfikacja
Staphylococcus xylosus
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Tab. II. Sekwencje starterów użytych do reakcji PCR
starter
sekwencja
16S-f
16S-r
G1
L1
5’-TACATGCAAGTCGAGCGAAC-3’
5’-ACCTTCCGATACGGCTACCT-3’
5’-GAAGTCGTAACAAGG-3’
5’-CAAGGCATCCACCGT-3’
amplifikowany fragment
wielkość
amplimeru
16S rRNA
1482 pz
16S rRNA – 23S rRNA
zmienna
41
Amplifikację przeprowadzono w mieszaninie reakcyjnej
HotStarTaq Plus Master Mix (QIAGEN) zawierającej: 1u
polimerazy DNA HotStarTaqPlus, 1x bufor PCR z 15mM
MgCl2, po 200 μM mieszaniny dNTP, 1x CoralLoad Concentrate, po 0,1 μM odpowiednich starterów (Tab. II) i około
200 ng wyizolowanego DNA. Reakcje PCR przeprowadzono w termocyklerze MJ Mini Personal Thermal Cycer (BioRad) wg następującego profilu temperaturowego. Wstępna
denaturacja 950C w czasie 5 minut, a następnie 30 cykli
w układzie: denaturacja 950C w czasie 1 minuty, przyłączanie starterów – dla pary 16Sf i 16Sr 650C w czasie 1 minuty
oraz dla pary G1 i L1 540C w czasie 1 minuty, wydłużanie
starterów 720C przez 1 minutę. Amplifikację zakończono wydłużaniem końcowym w temperaturze 720C przez 10 minut.
Rozdział elektroforetyczny
Otrzymane amplimery rozdzielano w 3 % żelu agarozowym dla 16S rRNA – 23 rRNA oraz w 1,5% żelu agarozowym dla 16S rRNA z dodatkiem bromku etydyny (0.5 µg/
ml). Żele analizowano następnie z wykorzystaniem programu UVI-DocMW.
Ryc. 1. Analiza restrykcyjna produktu amplifikacji fragmentu genu 16S rRNA z użyciem enzymu MspI.
PCR – RFLP
Otrzymany produkt reakcji PCR z starterami dla fragmentu genu 16S rRNA poddano analizie z użyciem enzymów restrykcyjnych HindIII oraz MspI (Fermentas).
W tym celu przygotowano mieszaninę reakcyjną zawierającą 10 μl produktu reakcji PCR, 18 μl jałowej wody dejonizowanej, 2 μl 10x buforu Hind III lub MspI oraz 1 μl
odpowiedniego enzymu. Analizę restrykcyjną prowadzono
w termobloku DR1 – Block DB30 (Techne) w następującym
układzie temperaturowym: 2 godziny w temperaturze 370C,
a następnie w celu przerwania trawienia w 800C przez 10
minut. Produkty trawienia poddano elektroforezie w 1,5%
żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (0.5 µg/ml).
Otrzymane fragmenty analizy restrykcyjnej analizowano
następnie z wykorzystaniem programu UVI-DocMW.
MSSCP
Analizę wielotemperaturowego SSCP przeprowadzono
dla produktu reakcji ITS PCR. Do analizy MSSCP pobrano
4μl produktu PCR i zmieszano z 8μl buforu denaturującego,
a następnie inkubowano przez 5 min w 95°C i schłodzono w lodzie. Fragmenty DNA z dodatkiem 3 μl buforu obciążającego były nanoszone na 8% żel poliakrylamidowy
z dodatkiem 5% glicerolu w buforze 1 x TBE. Elektroforezę
prowadzono w aparacie DNA Pointer System (Kucharczyk,
T.E.) przy stałym napięciu 1500 V w trzech wariantach temperaturowych: 350C, 150C, 50C. Otrzymane żele barwiono
metodą srebrową z użyciem zestawu Silver Stain (Kucharczyk, T.E.) zgodnie z dołączoną procedurą. Następnie żele
skanowano i poddawano analizie.
Wyniki badań
W wyniku amplifikacji DNA z parą starterów dla fragmentu genu 16S rRNA we wszystkich przypadkach uzy-
42
Ryc. 2. Analiza restrykcyjna produktu amplifikacji fragmentu genu 16S rRNA z użyciem enzymu HindIII.
skano jednorodne wzory amplimerów (1 prążek). Następnie przeprowadzono analizę restrykcyjną produktu amplifikacji z enzymami MspI i Hind III. Po przeprowadzeniu
analizy restrykcyjnej z użyciem enzymu MspI otrzymano
6 różnych fragmentów (ryc.1.), a zakres ich mas molekularnych po analizie w programie UVI DocMW wynosił
od 51 pz do 647 pz. Analiza restrykcyjna produktu PCR
z użyciem tego enzymu wykazała obecność takich samych profili elektroforetycznych dla wszystkich badanych szczepów.
Po trawieniu enzymem HindIII produktu amplifikacji
fragmentu 16S rRNA otrzymano 4 różne fragmenty (Ryc.2).
Zakres otrzymanych wielkości tych fragmentów wynosił od
351 pz do 1193 pz. W zależności od szczepu profil składał
się z 2 lub 3 charakterystycznych prążków. W wyniku tej
analizy podzielono wyizolowane szczepy na 3 grupy pod
względem podobieństwa ich profili elektroforetycznych.
W kolejnym etapie badań przeanalizowano otrzymane
nicowanie zarówno w liczbie jak i w wielkości otrzymanych
fragmentów.
W badaniach z użyciem techniki MSSCP otrzymano
wieloprążkowy wzór elektroforetyczny (Ryc.4). Otrzymane
wyniki uwidoczniły do kilkudziesięciu różnych fragmentów.
Z uwagi na tak dużą liczbę fragmentów analiza z użyciem
programu UVI DocMW stała się niemożliwa. Jednocześnie analizując otrzymany elektroforegram nie znaleziono
podobnych wzorów prążkowych w badanych szczepach co
może świadczyć o ich dużym zróżnicowaniu.
Dyskusja wyników
Ryc. 3. Elektroforeza produktów amplifikacji obszaru
zmiennego pomiędzy genami kodującymi 16S rRNA i 23S
rRNA.
Ryc. 4. Żel poliakrylamidowy analizy MSSCP fragmentu
pomiędzy genami 16S rRNA i 23S rRNA.
szczepy pod względem różnic w obszarze pomiędzy genami 16S rRNA – 23S rRNA.
Po amplifikacji regionu zmiennego ITS w wyniku elektroforezy otrzymano wieloprążkowy profil elektroforetyczny (Ryc.3). W zależności od szczepu profil składał się z 2, 3,
4 lub 5 głównych prążków. Wielkość otrzymanych fragmentów po analizie w programie UVI DocMW wynosiła od 317
pz do 701 pz. Duże podobieństwo wykazano w przypadku szczepów oznaczonych numerami 3 i 5 oraz szczepów
o numerach 8 i 10. Pozostałe szczepy wykazały duże zróż-
Wiele badań wykazało, że sekwencje obszaru zmiennego 16S rRNA mogą być przydatne do identyfikacji pojedynczych gatunków bakterii czy uwidaczniania różnic pomiędzy
ograniczoną liczbą gatunków i rodzajów. W powszechnym
użyciu są już szybkie metody, które wykrywają gatunkowo
specyficzne sekwencje w obrębie pojedynczych wysokozmiennych obszarów [2]. Otrzymane w badaniach wzory
prążkowe dla produktu amplifikacji genu 16S rRNA, nie
wykazują jednak polimorfizmu, który umożliwiłyby różnicowanie szczepów, a fragment 16S rRNA charakteryzował
się dużą konserwatywnością. W otrzymanych przez nas wynikach badań analiza restrykcyjna obszaru 16S rRNA z użyciem enzymów MspI i Hind III nie wykazała swojej mocy
różnicującej a zarazem i przydatności do badań pokrewieństwa wyizolowanych szczepów Staphylococcus spp. Słabe właściwości różnicujące tego genu przedstawiają także
w swoich badaniach Dewhirst F. i wsp., którzy próbowali
zastosować go do różnicowania szczepów z rodzaju Helicobacter [7]. W badaniach Heikens E. i wsp. stwierdzono, że
identyfikacja genotypowa oparta na fragmencie 16S rRNA
jest ograniczona przez ścisłe powiązanie gatunkowe szczepów Staphylococcus spp. [8].
Z przeprowadzonych analiz wynika, że większe zdolności różnicujące otrzymano poprzez analizę, nawet bez zastosowania enzymów restrykcyjnych, odcinka znajdującego
się pomiędzy genami kodującymi 16S rRNA i 23S rRNA,
który cechował się dużym polimorfizmem.
Otrzymane wyniki badań wykazują, że polimorfizm długości fragmentu znajdującego się pomiędzy 16S i 23S rRNA
pozwala na wstępną identyfikację i analizę filogenetyczną
szczepów bakterii z rodzaju Staphylococcus. Przydatność
techniki ITS PCR do badań wewnątrzgatunkowych potwierdzili w swoich badaniach Roth i wsp., którzy wykorzystali
tą technikę do badań wewnątrzgatunkowych i międzygatunkowych szczepów Mycobacterium spp. [9].
Po amplifikacji regionu zmiennego ITS w wyniku elektroforezy otrzymano wieloprążkowy profil elektroforetyczny
pozwalający na odróżnienie szczepów bez przeprowadzania
analizy restrykcyjnej, jednak w przypadku szczepów o numerach 8 i 10 oraz 3 i 5 zaobserwowano ich podobieństwo.
Wszystkie te szczepy należały do gatunku Staphylococcus
epidermidis. Przydatność analizy rejonu zmiennego do analizy próbek środowiskowych potwierdzają także w swoich
badaniach Sadeghifard i wsp. [10]. W badaniach Kretowa M. i Grones J., przedstawili także zdolności różnicujące
pomiędzy szczepami Acetobacter z zastosowaniem analizy
rejonu zmiennego pomiędzy 16S rRNA i 23S rRNA [11],
43
a Traček J i Teuber M. wykazali możliwość zastosowania
tego fragmentu do analizy polimorfizmu 57 badanych szczepów bakterii kwasu octowego [12].
Analiza rejonu polimorficznego pomiędzy 16S rRNA
a 23S rRNA za pomocą techniki wielotemperaturowego
SSCP (MSSCP) wykazała całkowite zróżnicowanie wyizolowanych szczepów, jednak otrzymany wzór prążkowy
z uwagi na zbyt dużą liczbę prążków znacznie utrudnił ich
interpretację.
W przeprowadzonych badaniach wykazano potrzebę
właściwego doboru techniki w zależności od zróżnicowania
badanych szczepów i ich pochodzenia.
Przeprowadzone badania wykazują ponadto konieczność
optymalizacji wykorzystanych technik w celu uzyskiwania
powtarzalności otrzymanych wyników. Brak optymalizacji
badań genetycznych może prowadzić do błędnych ich interpretacji, a jednocześnie ograniczać ich zastosowanie do
badań środowiska szpitalnego.
Wnioski
1. Zastosowana technika PCR RFLP z użyciem fragmentu genu 16S rRNA nie wykazała przydatności do
analizy szczepów Staphylococcus spp. wyizolowanych ze środowiska szpitalnego.
2. Technika ITS – PCR wykazała dużą przydatność do
analizy pokrewieństwa wyizolowanych szczepów
środowiskowych Staphylococcus spp.
3. Technika MSSCP jest najczulszą z badanych metod
analizy polimorfizmu szczepów, jednak z uwagi na
dużą liczbę otrzymanych prążków wymaga zastosowania do tej analizy krótszych fragmentów amplifikowanego fragmentu DNA.
Badania finansowano z tematu KNW – 1-052/08 i KNW
– 2-069/09
Piśmiennictwo
1. Fiedotow M, Denys A. Wybrana aspekty zakażeń szpitalnych. Pol Merk Lek 2006; 125: 484 – 488.
2. Krawczyk B. Diagnostyka molekularna w zakażeniach
szpitalnych. Post Microbiol 2007; 46: 367 – 378.
3. Chakravorty S, Helb D, Burday M, Connell N, Alland
DA. Detailed Analysis of 16S Ribosomal RNA Gene
Segments for the Diagnosis of Pathogenic Bacteria. J
Microbiol Methods 2007; 69: 330-339.
4. Daffonchio D, Cherif A, Brusetti L, Rizzi A, Mora D,
Boudabous A, Borin S. Nature of Polymorphisms in
16S-23S rRNA Gene Intergenic Transcribed Spacer Fingerprinting of Bacillus and Related Genera. Appl Environ Microbiol 2003; 69: 5128 – 5137.
5. Krawczyk B, Kur J. Diagnostyka molekularna w mikrobiologii. Wyd Politechniki Gdańskiej 2008, 85-91.
6. Kaczanowski R, Trzeciak L, Kucharczyk K. Multitemperature single stand conformation polymorphism. Electrophoresis 2001; 22: 3539 – 3535.
7. Dewhirst FE, Shen Z, Scimeca MS, Stokes LN, Boumenna T, Chen T, Paster BJ, Fox JG Discordant 16S
and 23S rRNA Gene Phylogenies for the Genus Helicobacter: Implications for Phylogenetic Inference and
Systematics. J Bacteriol 2005; 187: 6106-6118.
8. Heikens E, Fleer A, Paauw A, Florijn A, Fluit AC. Comparison of Genotypic and Phenotypic Methods for Species-Level Identification of Clinical Isolates of Coagulase-Negative Staphylococci. J Clin Microbiol 2005; 43:
2286-2290.
9. Roth A, Fischer M, Hamid ME, Michalke S, Ludwig W,
Mauch H. Differentiation of Phylogenetically Related
Slowly Growing Mycobacteria Based on 16S-23S rRNA
Gene Internal Transcribed Spacer Sequences. J Clin Microbiol 1998; 36: 139-147.
10.Sadeghifard N, GürtlerV, Beer M, Seviour RJ. The
Mosaic Nature of Intergenic 16S-23S rRNA Spacer Regions Suggests rRNA Operon Copy Number Variation in
Clostridium difficile Strains. Appl Environ Microbiol
2006; 72: 7311-7323.
11.Kretowa M, Grones J. Molecular Analysis of 16S – 23S
Spacer Regions of Acetobacter Species. Folia Microbiol
2005; 50: 288-292.
12. Traček J, Teuber M. Genetic and Restriction Analysis
of the 16S – 23S rDNA Internal Transcribed Spacer Regions of the Acetic Acid Bacteria. FEMS Microbiol Lett
2002; 208: 69-75.
dr n. med. Robert D. Wojtyczka
Katedra i Zakład Mikrobiologii Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach
41-200 Sosnowiec, ul. Jagiellońska 4,
tel: 32 364 16 22,
44
INFORMATION FOR AUTHORS AND GUIDELINES FOR THE PREPARATION OF
MANUSCRIPTS FOR THE SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY
1. SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY is a peer-reviewed
transdisciplinary journal covering the fields of pharmacy, medicine and related sciences. The journal publishes conference
reports and materials, conference announcements, as well as
letters to the Editor.
2. All manuscripts should be sent to the Editor, both in a printed
and an electronic form. Electronic versions of articles are to be
sent to [email protected] or supplied on
CD-ROM disks. Printed copies (together with tables, diagrams
and figures) should be addressed to:
3.
4.
5.
6.
7.
8.
41-200 Sosnowiec
ul. Jedności 8
Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345
Fax: +48 32 364 11 58
Disk label should contain the first name(s) and surname(s)
of the Author(s), and the title of the paper. Text and graphics
should be included in separate files. Do not paste pictures and
graphics to text files. The Editor advises to use Star Office,
Word, or Word Perfect. The acceptable graphics format is *.
TIFF, color: CMYK resolution: 300 dpi.
All submitted manuscripts are reviewed initially by the Editorin-Chief. The Authors are encouraged to suggest their reviewers, however the final selection of a reviewer is up to the Editorial Board. The Editor-in-Chief reserves the right to correct or
abbreviate the text (after the Author’s approval).
Authors are requested to resubmit the revised manuscript
within four weeks. Papers that are not resubmitted within
four weeks will be treated as a new submission.
The manuscript that has been rejected by the Scientific
Review in Pharmacy should not be resubmitted.
A cover letter should be included with the manuscript, containing a declaration that the manuscript has not been previously
published in print or electronic format and is not under consideration by another journal or electronic medium, signed by all
the Authors. It should also include written approval from the
head of the institution in which the study was conducted.
All human and animal research will have obtained ethical consent from the local Bioethical or Ethical Committee.
The material sent in and the review will remain among the
documentation of the Board of Editors.
Editor purchases, on the basis of exclusiveness, the whole
of the copyrights for the published papers (including the right
to publishing in print, on electronic media, such as CD-ROM
disks, and on the Internet). Reprinting the paper summaries is
allowed without any written permission of the Editor.
Instructions for authors:
8.1. Manuscript Page Setup
• Paper: white, A4 format.
• Margins: 2.5 cm (top, left, right, bottom)
• Font: Times New Roman, no smaller than 12 points.
• Text: Double-spaced, one side of the page only.
• Numbering: Insert page numbers at bottom right of each
page.
• Paragraphs: Indent first line 12.7 mm. Do not use an extra
line space between paragraphs.
• Subheads: All subheads should be flush with the left margin,
with one line above. Indent first line after a subhead. Use an
extra line space between the subhead and the text.
• Title or Heading of the article: boldface, on separate
line.
• Second-level subhead: boldface, on separate line.
• Third-level subhead: italic, on separate line.
8.2. Organization of Manuscript
• Title page should include: submission date and Author(s)
full names, i.e. first name(s) and surname(s), Authors’
full current affiliations (for papers with multiply authors,
please enumerate the authors and their affiliations in the
following way: Author1, Author2, etc; 1Affiliation, 2Affiliation,
etc.). Affiliations should contain the full name of the institution. One corresponding author must be designated for
papers with coauthors. At the bottom of the page the full
name, academic degrees/titles, and address of the corresponding author should be given, including the telephone
number, fax number and/or e-mail address. If research
has been funded, please indicate the source of funding
(including grant index/symbol, grant agencies, corporations, or sponsors).
• The second page should include an abstract (150-250
words). The abstract must be self-contained, and must not
require reference to the paper to be understood. The abstract should present objectives and scope of the study or
reasons for writing the paper. The methods and techniques
or approaches should be described only to the extent necessary for comprehension. The findings and conclusions
should be concise and informative. The abstract should
be followed by the key words consistent with the Medical
Subject Headings Index Medicus, and should not contain
unfamiliar terms that are not defined, undefined acronyms
and reference citations. Neither displayed equations or
lists should appear in the abstract.
• Body text should be organized as follows:
original paper - introduction, material and methods descriptions, research results, discussion;
review papers – free structure;
case studies – introduction (motivation for the study), case
descriptions, discussion of the characteristic symptoms,
treatment results etc.
• Figures (diagrams, drawings, color or black-and-white
photographs) should be put into a separate envelope. On
each figure there should be its number (Arabic numerals),
the name(s) of the author(s) paper title, and “top” marking.
Figure captions should be placed on separate pages and
numbered consecutively using Arabic numerals. Previously published visual materials should be supplied together
with the written consent of the Publisher for reprint.
• Tables, each on a separate page, should be numbered
using Roman numerals and preceded by their captions.
Table captions should be placed on separate pages, numbered using Roman numerals.
• The papers should not exceed the following limitations:
original and review work – 10 pages and others – 5 pages.
8.3. References to the works cited should be presented at the end of the paper and arranged according to the sequence
of citations in the body text. The acronyms for journal titles
should be used according to Index Medicus. Each entry,
starting with a new line, should be given a number and
must be presented as follows:
• journal citation:
Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypic
multisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117:
557-67.
If there are more than three authors, the name of the first
one should be given, followed by an ,,et al” annotation.
Komosińska-Vassev K et al. Graves’ disease-associated
changes in the serum lysosomal glycosidases activity and
glycosoaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003; 331:
97-102.
• the specific chapter:
Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. Biochemia
Harpera. Murray RK et al. Wydawnictwo Lekarskie PZWL.
Warszawa 1994, 59-69.
• monograph:
Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wroclaw
2004.
References to the works cited within the text should be numbered using Arabic numerals and placed between brackets,
e.g. [1]. The references should not exceed the following limitations: original work – 20, review – 30 and others – 10 bibliography entries.
45
REGULAMIN REDAGOWANIA PRAC W FARMACEUTYCZNYM PRZEGLĄDZIE NAUKOWYM
1. FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY publikuje recenzowane prace oryginalne – doświadczalne, kliniczne oraz poglądowe, z zakresu nauk: farmaceutycznych, medycznych i pokrewnych. Ponadto, czasopismo zamieszcza informacje na temat
konferencji, zjazdów i kongresów, jak również listy do Redakcji.
2. Manuskrypt w języku polskim lub angielskim należy przesyłać w formie elektronicznej na adres: kolegium.redakcyjne@
kwiecinski.pl (w wyjątkowych przypadkach na dysku CDROM) oraz – w jednym egzemplarzu wydruku komputerowego
(z tabelami, wykresami i rycinami) na adres Redakcji:
Farmaceutyczny Przegląd Naukowy
41-200 Sosnowiec
ul. Jedności 8
Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345
Fax: +48 32 364 11 58
Opis dysku powinien zawierać imię i nazwisko autora(ów)
i tytuł pracy. Teksty i grafiki powinny tworzyć osobne zbiory.
Nie należy umieszczać rycin i fotografii w plikach tekstowych.
Redakcja zaleca użycie edytorów tekstów: Star Office, Word,
Word Perfect. Akceptowany format dla grafiki to *.TIFF, kolor:
CMYK, rozdzielczość 300 dpi.
Manuskrypty podlegają ocenie przez recenzentów wyznaczonych każdorazowo przez Redaktora Naczelnego. Zachęca się
autorów do proponowania nazwisk recenzentów. Redakcja
zastrzega sobie prawo do ostatecznego wyboru recenzenta,
jak również dokonywania poprawek i skrótów tekstu (w porozumieniu z autorem).
Autorzy proszeni są o odesłanie poprawionego manuskryptu, zgodnie z uwagami recenzenta, w terminie nieprzekraczającym czterech tygodni. W przeciwnym razie
praca będzie traktowana jako nowa publikacja.
Manuskrypt, który został odrzucony przez recenzenta nie
może być ponownie przedkładany Redakcji Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego.
Do pracy należy dołączyć oświadczenie, że praca nie była
uprzednio publikowana ani nie została wysłana do redakcji
innego czasopisma. Ponadto, oświadczenie powinno zawierać również podpisy wszystkich autorów pracy oraz – zgodę
Kierownika Jednostki, skąd praca pochodzi, na zamieszczenie
publikacji w czasopiśmie.
Wszystkie badania prowadzone na ludziach lub zwierzętach, które
są przedmiotem pracy naukowej, opisanej w manuskrypcie, muszą
mieć akceptację, odpowiednio, Komisji Bioetycznej lub Etycznej.
Przesłane materiały wraz z recenzją pozostają w dokumentacji Redakcji.
Wydawca nabywa na zasadzie wyłączności ogół praw autorskich
do wydrukowanych prac (w tym prawo do wydania drukiem, na
nośnikach elektronicznych CD i innych oraz w Internecie). Dopuszcza się natomiast drukowanie streszczeń bez zgody Wydawcy.
Instrukcje dla autorów
8.1.Wymagania dotyczące przygotowania manuskryptu:
• Maszynopis powinien być drukowany jednostronnie, na
białym papierze formatu A4, z zachowaniem podwójnego
odstępu między kolejnymi wierszami.
• Marginesy – 2,5 cm (górny, lewy, prawy i dolny).
• Czcionka – styl: Times New Roman, rozmiar: 12 pt.
• Numeracja stron – kolejne numery stron, począwszy od
strony tytułowej powinny być umieszczone w prawym, dolnym rogu.
• Akapit – wcięcie akapitu 12,7 mm. Nie wprowadzać dodatkowych odstępów pomiędzy kolejnymi akapitami.
• Rozdział – wszystkie rozdziały powinny być wyrównane
do lewego marginesu. Pomiędzy danym rozdziałem a tekstem należy wprowadzić jeden odstęp.
• Tytuł pracy – powinien być napisany pogrubioną czcionką.
• Tytuł rozdziału – powinien być napisany pogrubioną
czcionką.
• Tytuł podrozdziału – powinien być napisany pochyloną
czcionką,
8.2 Układ manuskryptu
• Strona tytułowa powinna zawierać: imię i nazwisko autora(ów) w pełnym brzmieniu – w przypadku prac wieloośrodkowych przy nazwiskach autorów należy zaznaczyć afilia-
3.
4.
5.
6.
7.
8.
46
cję każdego z nich, w następujący sposób Autor1, Autor2,
…; 1Afiliacja, 2Afiliacja; tytuł pracy w języku polskim i angielskim, nazwę placówki naukowej skąd pochodzi praca.
U dołu strony należy podać imię i nazwisko oraz adres,
telefon i e-mail autora odpowiedzialnego za korespondencję, dotyczącą manuskryptu. W przypadku badań finansowanych prosimy o wskazanie źródła finansowania (w tym
numery dotacji grantów, dotacji agencji, dotacji spółek, lub
sponsorów).
• Druga strona manuskryptu powinna zawierać streszczenie (150-250 słów w języku polskim i angielskim), będące
autonomiczną częścią pracy, w której nie można umieszczać odnośników literaturowych. Streszczenie powinno
zawierać krótkie wprowadzenie, cel badania, podstawowe
procedury (wybór badanych osób lub zwierząt doświadczalnych, metody badań), główne wyniki oraz wnioski. Pod
streszczeniem należy umieścić słowa kluczowe w języku
polskim i angielskim, zgodnie z Medical Subject Headings
Index Medicus.
• Tekst manuskryptu powinien być podzielony na rozdziały,
według następującego schematu:
prace oryginalne – wstęp, materiał i metody, wyniki badań,
dyskusja oraz wnioski;
prace poglądowe – struktura dowolna, podzielona na rozdziały i podrozdziały;
prace kazuistyczne – wprowadzenie, opis przypadku/choroby, charakterystyczne objawy, rezultaty leczenia, itp.
• Ryciny (wykresy, rysunki, fotografie czarno-białe i kolorowe) powinny być umieszczone w osobnej kopercie, ponumerowane, opatrzone nazwiskiem autora i tytułem pracy,
z zaznaczeniem „góra”, „dół”. Opisy rycin należy podać na
oddzielnej stronie z numerami ilustracji podanymi cyframi arabskimi. Materiały ilustracyjne, poprzednio publikowane, należy zaopatrzyć w pisemną zgodę Wydawcy na
ponowną publikację.
• Tabele, umieszczone każda na osobnej stronie, należy ponumerować cyframi rzymskimi i opatrzyć tytułami
umieszczonymi nad tabelą. Opisy tabel należy podać na
oddzielnej stronie z numerami tabel, podanymi cyframi
rzymskimi.
• Zalecana objętość pracy oryginalnej i poglądowej powinna
wynosić 10, a pozostałych – 5 stron.
8.3 Piśmiennictwo powinno być ułożone wg kolejności cytowania w tekście pracy.
Skróty tytułów czasopism powinny być zgodne z Index
Medicus. Każda pozycja – pisana od nowego wiersza,
powinna być opatrzona numerem oraz zredagowana
zgodnie z niżej podanym przykładem:
• czasopismo naukowe:
np.: Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypic
multisystem fibrotic
disorder. J Clin Invest 2007; 117: 557-67.
Jeżeli autorów jest więcej niż trzech, wówczas należy podać nazwisko pierwszego z nich, z dopiskiem „i wsp.”.
np.: Komosińska-Vassev K i wsp. Graves’ disease-associated changes in the serum lysosomal glycosidases activity
and the glycosaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003;
331: 97-102.
• wydawnictwo zbiorowe:
np.: Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. W: Biochemia Harpera. Red. Murray RK i wsp. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 1994, 59-69.
• monografia:
np.: Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wrocław
2004.
Powołania w tekście, umieszczone w nawiasach kwadratowych, powinny być oznaczone cyframi arabskimi, np. [1].
Liczbę pozycji piśmiennictwa należy ograniczyć: w pracach
oryginalnych do 20, w poglądowych do 30 i w pozostałych do
10 pozycji.

Scientific Review in Pharmacy - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Transkrypt

Podobne dokumenty

Załącznik do pobrania. - Sekcja Rehabilitacji Kardiologicznej i

Energia odnawialna dla Warszawy 40% dofinansowania

Dekoracja ścienna LPS

Porfiria skórna późna

Wykrycie wirusa Usutu (USUV) w Niemczech

\grr-A - Inelo