Porównanie apoptozy występującej u kręgowców i bezkręgowców

Porównanie apoptozy występującej u kręgowców i bezkręgowców

Porównanie apoptozy występującej u kręgowców i bezkręgowców,
na przykładzie owadów, z uwzględnieniem jej
fizjologicznej roli w rozwoju organizmu
STRESZCZENIE
A
poptoza (z greckiego opadanie liści) jest to genetycznie zaprogramowana forma aktywnej śmierci komórkowej, pojawiającej się w pojedynczych komórkach lub w ich grupie. Jest to proces zachowany w ewolucji, występujący zarówno u bezkręgowców, jak i u
kręgowców, z tym że różnić może się czynnikami biorącymi w nim udział oraz kolejnością
zdarzeń. Podczas rozwoju wielokomórkowych organizmów apoptoza zachodzi w celu eliminacji zbytecznych, nieprawidłowych czy zainfekowanych komórek. Ten rodzaj śmierci,
powstały w toku ewolucji, pozwala utrzymać określoną liczbę komórek w różnych stadiach
rozwojowych w stanie równowagi. W przebiegu apoptozy u kręgowców wyróżniono kilka
podstawowych szlaków, różniących się pierwszą fazą prowadzącą do aktywacji enzymów
wykonawczych, kaspaz. Rodzina tych enzymów jest najważniejszym elementem sprawczym
programowanej śmierci komórki, a identyfikowane są one u różnych zwierząt począwszy
od gąbek po kręgowce wyższe. W niniejszej pracy skupiono się głównie na porównaniu
przebiegu apoptozy występującej u kręgowców, z tą obserwowaną u bezkręgowców, ze
szczególnym naciskiem na występowanie tego procesu u owadów (Diptera i Lepidoptera)
oraz na wykorzystywaniu przez owady apoptozy jako strategii obronnej uruchamianej po
wtargnięciu patogenu.
WPROWADZENIE
Zjawisko programowanej śmieci komórki zwanej apoptozą jest przedmiotem
licznych badań i rozważań naukowców z różnych dziedzin nauki. Wynika to
z faktu ważnej roli, jaką odgrywa ten proces w prawidłowym rozwoju każdego
organizmu. Równowaga w organizmie zależy nie tylko od stopnia namnażania
się komórek, ale również od ich uśmiercania, a każda komórka organizmu jest
tak zaprogramowana, aby po otrzymaniu odpowiedniego sygnału popełnić „samobójstwo”. Programowana śmierć komórki po raz pierwszy została opisana u
płazów podczas metamorfozy, zaś termin apoptoza został wprowadzony przez
Kerr i współpracowników w 1972 roku [1]. Natomiast w 2002 roku została przyznana Nagroda Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny trzem naukowcom
(S. Brenner, H.R. Horvitz i J.E. Sulston) za wyjaśnienie genetycznej regulacji tego
procesu u Caenorhabditis elegans.
Nie zawsze jednak mamy do czynienia z prawidłowo przebiegającą apoptozą. Dość często jej występowanie jest konsekwencją zmian patologicznych w
organizmie lub zaburzenia jej etapów, co może prowadzić do rozwoju stanów
chorobowych. Uważa się, iż powstawanie nowotworów jest nie tylko wynikiem
nagromadzenia mutacji w genach, ale również brakiem zdolności komórek do
samounicestwiania się po otrzymaniu odpowiedniego sygnału. Ograniczenie
apoptozy może prowadzić do szeregu chorób związanych z nadmierną proliferacją komórek (niektóre nowotwory) czy chorób autoimmunizacyjnych (np.
stwardnienie rozsiane, toczeń rumieniowaty, reumatoidalne zapalenie stawów)
[2].
Marta Ligęza-Żuber*
Mieczysława Irena Boguś
Pracownia Fizjologii, Instytut Parazytologii
PAN, Warszawa
Pracownia Fizjologii, Instytut Parazytologii
PAN, ul. Twarda 51/55, 00-818 Warszawa; tel.:
(22) 697 89 73, e-mail: martaligeza@twarda.
pan.pl
*
Artykuł otrzymano 26 lutego 2014 r.
Artykuł zaakceptowano 30 maja 2014 r.
Słowa kluczowe: owady, kręgowce, bezkręgowce, apoptoza, kaspazy, szlaki apoptozy
Wykaz skrótów: AIF (ang. apoptosis inducing
factor) — czynnik indukujący apoptozę; Bcl-2
— rodzina białek regulujących apoptozę (białka hamujące jak i promujące apoptozę); CAD
(ang. Caspase-activated DNase) — endonukleaza
tnąca DNA; DD (ang. death domain) — domena śmierci; DISC (ang. death-inducing signaling
complex) — kompleks sygnału indukującego
śmierć; FADD (ang. Fas associated death domain)
— cytoplazmatyczne białko adaptorowe; IAP
(ang. inhibitor of apoptosis proteins) — czynnik hamujący apoptozę; ICAD (ang. inhibitor
of Caspase Activated DNase) — inhibitor endonukleazy CAD; RIP (ang. receptor interacting
protein) — kinaza ser/thr, białko adaptorowe;
TNF (ang. tumor necrosisfactor) — czynnik
martwiczy nowotworów; TRADD (ang. TNFR1-associated deathdomain) — cytoplazmatyczne białko adaptorowe
Istnieje wiele czynników zewnętrznych mogących indukować apoptozę takich jak: promieniowanie gamma i ultrafioletowe (UV), leki przeciwnowotworowe, wolne rodniki, ciepło, hipoksja. Te same czynniki w wyższych dawkach lub
podczas dłuższej ekspozycji na komórki mogą wywoływać nekrozę, drugi typ
śmierci komórek zwany również śmiercią martwiczą.
Komórki apoptotyczne ulegają wielu charakterystycznym zmianom podczas
procesu apoptozy, począwszy od reorganizacji cytoszkieletu, po kurczenie się
komórek, fałdowanie błony komórkowej i formowanie ciałek apoptotycznych,
kondensację chromatyny (pyknoza), oraz fragmentację DNA [3]. W przypadku
apoptozy zawartość komórek nie wydostaje się na zewnątrz i nie dochodzi do
odczynów zapalnych. W warunkach fizjologicznych, komórki podlegające temu
typowi śmierci są fagocytowane przez makrofagi lub komórki sąsiadujące. W
Postępy Biochemii 60 (3) 2014
333
siadają zewnątrzkomórkowe domeny
bogate w reszty cysteiny oraz cytoApoptoza
Nekroza
plazmatyczną domenę, zbudowaną z
proces aktywny, zależny od ATP
proces pasywny, niezależny od ATP
80 reszt aminokwasowych, zwaną doproces regulowany i enzymatyczny
proces nie regulowany
meną śmierci (DD, ang. heath domain).
pojedyncze komórki lub mała ich grupa
często grupy komórek
kurczenie się komórek
komórki pęcznieją
Domena ta odgrywa kluczową rolę w
pyknoza, karioreksis
karioloza, pyknoza, karioreksis
przekazywaniu sygnału unicestwiania
błona komórkowa nienaruszona
zniszczenie błony komórkowej
komórki z jej powierzchni do wnętrza.
zatrzymanie cytoplazmy w ciałkach apoptotycznych wypływ cytoplazmy
Przykładami takich grup ligandów i
brak odczynu zapalnego
obecność odczynu zapalnego
ich receptorów są FasL/FasR, TNF-α/
TNFR1, Apo3L/DR3, Apo2L/DR4,
hodowli zaś, gdy brakuje komórek fagocytujących, komórki
Apo2L/DR5 [9,10]. Najlepiej scharakapoptotyczne ulegają wtórnej martwicy [4].
teryzowanymi modelami zewnętrznej sygnalizacji apoptozy są modele FasL/FasR i TNF-α/TNFR1. Przyłączenie do
Alternatywnym do apoptozy typem śmierci komórek
receptora odpowiedniego liganda indukuje jego aktywację
jest nekroza. Jest to proces bierny nie wymagający nakłaoraz zmianę struktury (trymeryzację receptora). Aktywne
dów energii. Dotyczy on głównie grup komórek, które pod
receptory łączą się z cytoplazmatycznymi białkami adaptowpływem szkodliwych czynników pęcznieją i tracą ciągłość
rowymi FADD (ang. Fas associated Heath domain), TRADD
błon komórkowych. Występującemu podczas nekrozy roz(ang. TNFR1-associated death domain) lub RIP (ang. receptor
padowi organelli komórkowych jak i ostatecznie całych
interactin protein) poprzez oddziaływania między ich domekomórek towarzyszy występowanie odczynów zapalnych,
nami śmierci DD. To prowadzi do powstania kluczowego
których brak w przypadku apoptozy (Tab. 1).
„kompleksu śmierci” zwanego DISC, a następnie do autokatalitycznej aktywacji prokaspazy-8 lub -10. Aktywacja
To czy komórka zostanie uśmiercona na drodze apoptoprokaspaz zapoczątkowuje działanie kaspaz wykonawzy czy nekrozy zależy również od typu i natężenia szkoczych, co jest pierwszym etapem procesu degradacyjnego
dliwych czynników, rodzaju, stanu rozwojowego i cech fiw komórce (Ryc. 1) [11,12].
zjologicznych tkanki [4,5]. Omawiając te dwa typy śmierci
Tabela 1. Porównanie morfologicznych cech apoptozy i nekrozy (na podstawie [4], zmodyfikowano).
komórki warto wspomnieć tu również o procesie pośrednim pomiędzy nimi, a mianowicie o nekroptozie (tzw. programowanej nekrozie). Przechodzenie apoptozy w nekrozę
może być tu spowodowane hamowaniem lub niedoborem
kaspaz, a kluczową rolę w tym procesie odgrywają białka
oddziałujące z receptorem Fas czyli kinazy RIP (1 i 3). Nekroptoza morfologicznie zbliżona jest do nekrozy, choć jest
procesem nieprzypadkowym i przebiega dokładnie określonym szlakiem sygnałowym. Proces ten jest istotnym mechanizmem śmierci komórki zaangażowanym w zwalczaniu infekcji wirusowych oraz chorób neurodegeneracyjnych
[6].
APOPTOZA U KRĘGOWCÓW
Apoptoza jako proces śmierci programowanej jest ściśle regulowana, wymaga aktywacji wielu genów i nakładu energii. Dotychczas stosunkowo dobrze poznano dwa
główne szlaki apoptozy, tj. szlak zewnętrzny/receptorowy
związany z błoną komórkową oraz szlak wewnętrzny/mitochondrialny przebiegający z udziałem mitochondriów.
Istnieje również szlak pseudoreceptorowy zwany apoptozą zależną od perforyn/grazymów (Ryc. 1) [7]. Poza tymi
najlepiej poznanymi szlakami apoptozy wyróżnia się także
inne jej mechanizmy. Przykładem może tu być apoptoza indukowana stresem czy szlak sfingomielinowo-ceramidowy
[8].
ZEWNĘTRZNY SZLAK APOPTOZY —
ZALEŻNY OD RECEPTORÓW BŁONOWYCH
Ta ścieżka sygnalizacyjna związana jest z aktywacją receptorów znajdujących się w błonie komórkowej. Receptory te należą do tzw. rodziny receptorów śmierci, których
przedstawicielem jest czynnik martwicy nowotworów
(TNF, ang. tumor necrosis factors). Receptory z tej grupy po-
334
WEWNĘTRZNY SZLAK APOPTOZY —
ZALEŻNY OD MITOCHONDRIÓW
Aktywacja wewnętrznego szlaku apoptozy pochodzi
od różnych sygnałów komórkowych. Jednym z nich jest
brak określonych czynników: hormonów czy cytokin, co
prowadzi do wadliwego działania systemu supresji programu śmierci, doprowadzając w konsekwencji do apoptozy. Czynniki, które indukują apoptozę swoją obecnością
to promieniowanie UV, toksyny, hipertermia, hipoksja, infekcja wirusowa czy wolne rodniki. Wszystkie te czynniki
powodują zmiany w wewnętrznej błonie mitochondrialnej
prowadzące do otwarcia porów w błonie, utraty mitochondrialnego potencjału błonowego oraz uwolnienia dwóch
grup proapoptotycznych białek z przestrzeni międzybłonowej do cytosolu. Pierwsza grupa proapoptycznych białek
składa się z cytochromu c, Smac/DIABLO i z proteaz serynowych Omi/HtrA2. Białka te aktywują ścieżkę apoptozy
zależną od kaspaz. Cytochrom c wiąże i aktywuje Apaf-1
oraz prokaspazę-9 tworząc „apoptosom”. Smac/Diablo i
Omi/HtrA2 indukują apoptozę poprzez hamowanie aktywności IAP (ang. inhibitor of apoptosis proteins) [13].
Drugą grupą proapoptotycznych białek uwalnianych
z mitochondriów są AIF, endonukleaza G oraz CAD. AIF
przemieszcza się do jądra i powoduje fragmentację DNA na
odcinki o długości 50-300 kpz oraz peryferyczną kondensację chromatyny jądrowej. Ten wczesny stan kondensacji
chromatyny nazywany jest „I fazą” kondensacji. Endonukleaza G również przemieszcza się do jądra komórkowego,
gdzie tnie chromatynę na oligonukleosomowe fragmenty
DNA. AIF i endonukleaza G działają na drodze niezależnej
od kaspaz. Czynnik CAD jest wydzielany przez mitochondria i ulega translokacji do jądra komórkowego po uaktywnieniu przez kaspazę-3. W jądrze komórkowym przy jego
www.postepybiochemii.pl
Rycina 1. Ścieżki apoptozy (na podstawie [7] z własnymi modyfikacjami).
udziale dochodzi do fragmentacji DNA. Ten późniejszy,
bardziej zbity stan chromatyny nazywany jest „II fazą” kondensacji chromatyny [14,15].
Kontrola i regulacja tej ścieżki apoptozy zachodzi przy
udziale białek z rodziny Bcl-2. Białko supresorowe p53 posiada kluczową rolę w regulacji całej rodziny Bcl-2. Białka te
zarządzają przepuszczalnością błony mitochondrialnej regulując uwalnianie cytochromu c, więc mogą być zarówno
pro- jak i antyapoptotyczne. Do tej pory zidentyfikowano
25 genów dla białek Bcl-2, część z nich ma właściwości promujące apoptozę, podczas gdy inne potrafią hamować ten
proces (Ryc. 1) [16].
SZLAK APOPTOZY ZALEŻNY
OD PERFORYN/GRANZYMU
Jest to ścieżka apoptozy polegająca na wydzielaniu przez
limfocyty cytotoksyczne T i/lub komórki NK molekuł zdolPostępy Biochemii 60 (3) 2014
nych do formowania porów (perforyn) w komórkach docelowych (nowotworowych lub zainfekowanych wirusami) i
przenoszenia przez nie cytotoksycznych granul. Głównymi
składnikami tych granul są proteazy serynowe granzym A
i granzym B. Granzym B tnie białka w miejscu reszty kwasu asparaginowego, dzięki czemu aktywuje prokaspazę-10
i czynnik ICAD. Możliwe jest również, że granzym B może
wykorzystać mitochondrialną ścieżkę do wzmocnienia sygnału śmierci poprzez cięcie Bid i uwolnienie cytochromu c.
Granzym B może również bezpośrednio aktywować kaspazę-3. Granzym A aktywuje apoptozę na drodze niezależnej
od kaspaz poprzez aktywację DNAzy, która doprowadza
do degradacji DNA (Ryc. 1) [17,18].
Większość ścieżek apoptozy łączy się w punkcie zwanym
fazą wykonawczą, czyli finalną częścią procesu apoptozy.
Faza wykonawcza polega głównie na aktywacji kaspaz
wykonawczych. Kaspazy aktywują cytoplazmatyczne en-
335
donukleazy odpowiedzialne za degradację materiału genetycznego, zaś aktywowane proteazy tną białka jądra komórkowego i białka cytoszkieletu. Do kaspaz wykonawczych
zaliczamy kaspazę-3,-6 i -7. Kaspazy te rozcinają cytokeratynę, PARP, białka cytoszkieletu jak np. alfa fodrynę, białka
jądra komórkowego NuMa i inne, które odpowiedzialne są
za morfologiczne i biochemiczne zmiany w apoptotycznych
komórkach [19].
Rozpoczęcie fagocytozy apoptotycznych komórek jest
ostatnim etapem fizjologicznej apoptozy. Asymetria fosfolipidów i przesunięcie fosfatydyloseryny na zewnątrz
błony komórkowej jest znakiem rozpoznawczym tej fazy.
Ta translokacja może być związana ze szlakami Fas oraz z
aktywnością kaspazy-8 i -3. Dzięki obecności fosfatydyloseryny w zewnętrznej błonie komórek apoptotycznych, stają
się one łatwo rozpoznawalne dla komórek fagocytujących
przez co mogą być szybko usunięte, dzięki czemu nie dochodzi do stanu zapalnego [20].
KASPAZY — KLUCZOWE ENZYMY APOPTOZY
Kaspazy należą do rodziny proteaz cysteinowych. Związek tych enzymów z apoptozą po raz pierwszy został zademonstrowany w 1993 roku [21]. Kaspazy działają jako
najważniejszy czynnik destrukcji komórkowej u wszystkich
Metazoa. Obecnie u ssaków zidentyfikowano 14 kaspaz,
z których 12 ma swe odpowiedniki u ludzi [22]. Biorąc pod
uwagę budowę domeny proteazowej kaspazy można podzielić na trzy grupy: grupa I to kaspazy 1, 4, 5, 11, 13 i 14,
grupa II to kaspazy 2, 9 zaś pozostałe, kaspazy 3, 6, 7, 8, 10
należą do III grupy [23]. Jeśli chodzi o ich funkcje to kaspazy
1, 4, 5, 11, 12, 13 i 14 są kaspazami prozapalnymi aktywującymi cytokiny, kaspazy 9, 8, 2 i 10 są kaspazami inicjatorowymi, zaś 3, 6, 7 są kaspazami wykonawczymi (kaspazy
efektorowe).
Jak większość proteaz, kaspazy syntetyzowane są jako
proenzymy o bardzo niskiej lub zerowej aktywności. Strukturalnie prokaspazy posiadają dwie podjednostki, dużą 20
kDa oraz małą 10 kDa. W niektórych prokaspazach obecny jest krótki łącznik pomiędzy tymi dwiema jednostkami.
Zapalne i inicjatorowe kaspazy posiadają prodomeny złożone z ok. 100 reszt aminokwasowych (mogą być nieznaczne różnice w długości pomiędzy tymi prodomenami) zaś
efektorowe kaspazy posiadają na aminowym końcu prodomenę złożoną z 30 reszt aminokwasowych. Te prodomeny
posiadają charakterystyczne fragment tj. DED (ang. death
effector domain), CARD (ang. caspase recruiment domain) oraz
DID (ang. death inducing domain). Kaspazy są endopeptydazami aktywowanymi proteolitycznym cięciem przez inne
kaspazy lub autokatalizą z udziałem kofaktorów. Kaspazy
efektorowe nie mogą same się aktywować, więc inicjatorowe kaspazy muszą je ciąć [24]. Aktywacja efektorowych
kaspaz jest procesem wieloetapowym. Kaspaza 8 przecina
prokaspazy 3, 4, 7 i 9. Kaspaza 10 aktywuje 3, 7, 8 zaś kaspaza 9 odpowiednio 3 i 7. Czasami kaspazy aktywowane
są poprzez własne, aktywne formy w powielającej się pętli,
co prowadzi do wzmocnienia sygnału śmierci. Prokaspazy
1, 7 i 8 obecne są w cytosolu, prokaspaza 3 znajdowana jest
zarówno w cytosolu jak i w mitochondriach, zaś prokaspaza
2 obecna jest w cytosolu oraz w jądrze [25] (Ryc. 2).
Aktywne kaspazy rozpoznają czteropeptydowe sekwencje w swoich substratach. Każda reszta aminokwasowa
znajdująca się w tym tetrapeptydzie została nazwana P1,
P2, P3 i P4. Kaspazy tną białka łącząc się z wiązaniem peptydowym na karboksylowym końcu P1. Obecność reszty
kwasu asparaginowego w pozycji P1 jest niezbędna dla rozpoznania miejsca cięcia przez wszystkie kaspazy. W domenie katalitycznej wszystkich kaspaz znajduje się zachowana
w ewolucji sekwencja aminokwasowa QACXG, zawierająca
resztę cysteinową odpowiadającą za funkcje katalityczne
enzymu. Mutacja prowadząca do zmiany w reszcie cysteinowej powoduje inaktywację tych enzymów [26,27]. W kaskadzie proteolitycznych cięć, kaspazy inicjatorowe są aktywowane jako pierwsze, co następnie owocuje aktywacją
kaspaz efektorowych oraz cięciem różnych komórkowych
białek. Prowadzi to do charakterystycznych zmian w komórkach apoptotycznych — fragmentacji DNA i tworzenia
się ciałek apoptycznych [28].
SUBSTRATY DLA KASPAZ
Rycina 2. Schematyczna budowa prokaspazy i aktywnej kaspazy. D — miejsce cięcia, ł — łącznik (na podstawie
[27] z własnymi modyfikacjami).
336
Śmierć komórki na drodze apoptozy jest wynikiem cięcia wielu białek
niezbędnych do jej funkcjonowania.
Jednym z pierwszych substratów dla
kaspaz, zidentyfikowanym w 1994
roku była polimeraza poly (ADP-rybozy) (PARP) biorąca udział w naprawie
DNA [29]. Cięcie białek podczas apoptozy jest specyficzne dla poszczególnych komórek, ponieważ zmienne są
poziomy produkcji tychże enzymów
w różnych komórkach. Ustalono, że
p-aktyna jest cięta przez kaspazy w
barwiaku (guzie chromochłonnym) i
w komórkach nowotworowych jajników, podczas gdy w innych komórkach ta aktywność nie jest spotykana.
Miejsca cięcia przez kaspazy nie są
zachowane w ewolucji różnych gatunków. Kaspazy degradują szereg białek
www.postepybiochemii.pl
komórkowych pełniących różne fizjologiczne funkcje. Degradacji podlegają białka zaangażowane w syntezę RNA,
jego cięcie i składanie (ang. splicing), adhezję komórek,
cykl komórkowy, syntezę, cięcia i naprawy DNA, wiązanie
DNA, transkrypcję, sygnalizację za pośrednictwem białek
G, syntezę, degradację i modyfikacje białek, metabolizm
wapnia, c-AMP, c-GMP i lipidów. Wiele białek strukturalnych obecnych w jądrze, ER, aparacie Golgiego oraz cytoszkielecie jest również ciętych przez kaspazy.
Indukcja apoptozy powoduje zmiany w procesie fosforylacji wielu białek, chociaż nie ma dowodów na to, że
kinazy są niezbędne podczas programowanej śmierci komórek. Mogą być one jednak zaangażowane w przekazywanie lub powielanie sygnałów podczas szlaków apoptozy,
tak aby utrzymywać równowagę pomiędzy komórkami
żyjącymi i tymi uśmiercanymi. Niektóre cytokiny, takie jak
interleukina 1β, interleukina-6, IFN-γ też mogą być substratami dla kaspaz. Fosfatazy białkowe, kalcyneuryna, PP2A
są również rozcinane przez te enzymy. Zaskakującym jest
natomiast fakt, że zarówno proapoptotyczne białka Apaf-1,
Bad, Bax, jak i antyapoptotyczne białka (Bid, Flip, Bcl-2) są
również degradowane przez kaspazy.
APOPTOZA U BEZKRĘGOWCÓW
CAENORHABDITIS ELEGANS
Spośród bezkręgowców organizmem najlepiej poznanym i zbadanym pod kątem apoptozy jest nicień C. elegans.
U dorosłej formy tego organizmu jest tylko 1090 somatycznych komórek, z których dokładnie 131 ulega programowanej śmierci podczas całego rozwoju osobniczego, co oznacza, że apoptoza jest procesem niezbędnym i ściśle kontrolowanym genetycznie [30]. Programowana śmierć komórki
u tego nicienia kontrolowana jest przez 4 geny: ced- 3,-4,-9
oraz egl-1. CED-3 jest homologiem kaspazy 3 u ssaków, a
działa zarazem jako kaspaza inicjująca i wykonawcza. Po aktywacji tejże kaspazy dochodzi do cięcia cytoszkieletu oraz
białek biorących udział w syntezie ATP i w metabolizmie.
CED-4 to homolog adaptorowego białka ssaków APAF-1,
niezbędny do aktywacji CED-3. CED-9 to antyapoptotyczne białko należące do rodziny białek Bcl-2. Mutacja w genie
kodującym to białko (utrata właściwej funkcji) prowadzi do
śmierci organizmu we wczesnym etapie rozwoju w wyniku niekontrolowanej, nadmiernej śmierci komórek. Białko
EGL-1 również należy do rodziny białek Bcl-2, a dokładnie
jest homologiem BH3, i ma działanie proapoptotyczne [31].
Co do udziału mitochondriów w procesie apoptozy u C.
elegans ciągle są wysuwane sprzeczne teorie, jedna z nich
mówi, że białko CED-4 nie posiada domeny wiążącej go
z cytochromem c, a aktywacja CED-3 w warunkach in vitro zachodzi przy użyciu czystych białek CED oraz EGL-1
bez udziału czynników mitochondrialnych. Jednakże jest
również szereg doniesień potwierdzających rolę białek mitochondrialnych w apoptozie u tego nicienia. Stwierdzono
na przykład, że homologi endonukleazy i AIF ssaków są
uwalniane po aktywacji apoptozy przez EGL-1z tych organelli komórkowych do cytosolu, gdzie dochodzi następnie
do degradacji DNA, prowadząc w konsekwencji do śmierci
komórki. Podczas apoptozy widoczny jest również rozpad
mitochondriów [32,33].
Postępy Biochemii 60 (3) 2014
DROSOPHILA SP.
Drugim przedstawicielem bezkręgowców starannie
przebadanym jest owad Drosophila melanogaster. Apoptoza u przedstawicieli rodzaju Drosophila przebiega w sposób znacznie bardziej złożony w porównaniu z nicieniem
C. elegans. Aktywacja programowanej śmierci komórkowej
u tego organizmu jest głównie zależna od trzech proapoptotycznych białek: RPR (ang. reaper), GRIM oraz HID (ang.
head involution defective). Te białka na swym aminowym
końcu posiadają charakterystyczny zbudowany z 14 reszt
aminokwasowych region zwany motywem RGH (ang.
Reaper, Grim, Hid) lub motyw IBM (ang. inhibitor of apoptosis
(IAP)-bindingmotif). Dzięki obecności tych regionów białka
te zdolne są do łączenia się i do hamowania aktywności
inhibitorów kaspaz (IAP), przez co promują apoptozę. Co
więcej, RPR i GRIM na końcu karboksylowym posiadają region 15 reszt aa, którym podczas apoptozy mogą łączyć się
z mitochondrium pośrednicząc w programowanej śmierci
komórki niezależnie od motywów RGH. Białko HID formując heterodimer z RPR również może być przenoszone do
mitochondrium indukując tym samym apoptozę [34].
Jak wspomniano powyżej, u muszki owocowej kluczowymi regulatorami apoptozy są białka hamujące apoptozę
(IAPs), DIAP1 i DIAP2. Białka te posiadają domenę łączącą zarówno kaspazy jak i białka RGH. W komórkach, które
otrzymały sygnał do samounicestwienia dochodzi do nadprodukcji tych proapoptotycznych białek, a co za tym idzie
konkurują one z kaspazami o miejsce łączenia się z białkami
DIAP. Uwolnienie kaspaz wywołuje ich aktywację i proteolityczną degradacją białek komórki, co prowadzi do jej
śmierci.
Ważną różnicą pomiędzy apoptozą u C.elegans, D. melanogaster i ssaków jest udział mitochondriów w tym procesie
oraz rola białek Bcl-2. U ssaków w komórkach apoptotycznych dochodzi do wzrostu przepuszczalności błony mitochondrialnej i do uwalniania proapoptotycznych białek, zaś
u nicieni oraz u Drosophila sp. wiadomo, że mitochondria na
pewno są związane z tym procesem, jednakże ich dokładna
rola nie jest jeszcze poznana [35,36].
Ciekawym spostrzeżeniem jest również fakt, iż w procesie apoptozy zachodzącym in vitro w liniach komórkowych
Drosophila S2 i BG2 mitochondria nie odgrywają żadnej roli.
Wyniki badań nad linią komórkową S2 wykazały, że aktywacja kaspaz zachodzi jedynie przy udziale czynników
cytoplazmatycznych, a uwalnianie cytochromu c nie przyspiesza tego procesu [37]. Jednakże podczas różnicowania
spermatyd cytochrom c odgrywa ważną rolę w aktywacji
kaspaz i może również aktywować prokaspazę-3 w lizatach
z embrionów Drosophila sp. [38].
U Drosophila sp. zostało zidentyfikowanych siedem kaspaz, w tym białko DCP-2/DREDD (homolog kaspazy 8),
którego rola w procesie apoptozy nie została dotychczas
wyjaśniona oraz białko DRONC (główna kaspaza, homolog
kaspazy 9). Choć większość komórek Drosophila sp. wykazuje ciągłą aktywację DRONC przeżywają one, ponieważ
istnieje produkcja wielu białek tj. DIAP1 (ang. Inhibitor of
Apoptosis Protein 1), które hamują aktywność tej kaspazy
337
LEPIDOPTERA
Istnienie apoptozy u
owadów z rzędu Lepidoptera zostało scharakteryzowane już w
latach 60. na przykładzie ich metamorfozy
(przepoczwarczania
się). Badania prowadzono głównie z użyciem jedwabnika morwowego (Bombyx mori),
oraz Manduca sexta. U
barciaka
większego
(Galleria mellonella) zaobserwowano apoptozę komórek jelita środkowego podczas metamorfozy, co związane
jest z przejściem od
aktywnego żerowania
w okresie larwalnym
do całkowitego zaprzestania pobierania
pokarmu i wody przez
motyle [42]. Podobnie
u Heliothis virescens
zanik jelita środkowego u larw na drodze
apoptozy wiąże się z
nadprodukcją kaspaz
podczas przepoczwarczania się.
U Lepidoptera nadal
mało wiadomo o molekularnej ścieżce apoptozy. Odkrycie w 1990
Rycina 3. Ścieżki apoptozy u ssaków, Drosophila sp. i Lepidoptera (na podstawie [28] z własnymi modyfikacjami).
r. białka p35 (inhibitor
kaspaz) doprowadziło
oraz kaspazy Strica, które to u Drosophila sp. są kaspazami
do scharakteryzowainicjatorowymi. Z kolei DCP-1 (ang. Death caspase protein),
nia pierwszej kaspazy w tym rzędzie owadów. Kaspazą tą
DrICE (ang. Drosophila interleukin converting enzyme), DEjest Sf-caspase-1 wyodrębniona z linii komórkowej Sf9 (linia
CAY (ang. Death executioner caspase) i Damm pełnią funkcję
wyprowadzona z komórek jajnika Spodoptera frugiperda).
kaspaz wykonawczych . DARK (ang. Drosophila Apaf-1 relaLinia komórkowa Sf9 jest często badana w kierunku apopted killer) to białko działające jak odpowiednik Apaf-1 u ssatozy, ponieważ komórki Sf9 są wrażliwe na różne czynniki
ków [39]. Obecność receptorów pośredniczących w apopindukujące apoptozę takie jak infekcja wirusowa, światło
tozie u Drosophila sp. jest ciągle dyskutowana. Homolog
UV czy nadekspresja apoptotycznych genów. Sf-caspase-1
FADD (ang. Fas associated Heath domain) został wyizolowany
jest podobna do kaspazy 3 ssaków i DrICE u Drosophila sp.
[23] i wykazano, że działa on we współpracy z inicjatorową
Struktura krystaliczna tej kaspazy wykazuje również pokaspazą DREDD. Białko Eiger u Drosophila sp. jest homolodobieństwo w fałdowaniu się do kilku innych ludzkich
giem TNF ssaków, choć indukuje ono apoptozę na drodze
kaspaz (1,3,7,8,9). Jedyną różnicą jest inna orientacja aminiezależnej od DREDD (homolog kaspazy 8), co różni go od
nowego końca dużej podjednostki [43]. Kaspaza ta jest poTNF ssaków. Porównując ścieżki sygnalizacyjne wiodące do
dobna do efektorowych kaspaz, gdyż posiada krótką proapoptozy u Drosophila sp. z tymi zidentyfikowanymi u kodomenę i tnie substraty z odpowiednią sekwencją DEVD.
marów (Aedesa egypti, Anopheles gambiae) można stwierdzić,
Inne odpowiedniki tej kaspazy zostały zidentyfikowane u
iż jest to zjawisko, którego przebieg nie zmienił się znacząco
S. littoralis (Sl-caspase-1 zawiera krótką prodomenę i jest
w toku ewolucji, charakteryzuje się podobnymi etapami. Co
zaangażowana w proces apoptozy indukowanej promiewięcej, u innych gatunków należących do rodzaju Drosophiniami UV i infekcją bakulowirusami), Helicoverpa armigera
la zidentyfikowano dodatkowe, nowe kaspazy, choć ich rola
(Hearm caspase-1 z krótką prodomeną) i Trichloplusia ni.
nie jest jeszcze do końca określona [40,41].
Członkowie tej grupy kaspaz działają jak kaspazy efekto-
338
www.postepybiochemii.pl
rowe [44]. W 2012 roku została również scharakteryzowana
kaspaza występująca u G. mellonella. Kaspaza o nazwie Gm-caspase-1 bierze głównie udział w procesie metamorfozy
tego owada. Najnowsze badania nad sekwencją tego białka wykazały, iż jest ona identyczna w 75% z kaspazą Sl-1,
zaś z kaspazą-3 człowieka w 41% [45]. Dotychczas żadne
inne klasy kaspaz nie zostały opisane u Lepidoptera. Jednakże obecność i aktywacja kaspazy-1 sugeruje istnienie kaspaz inicjatorowych, co potwierdza blokowanie apoptozy
na „wyższym szczeblu” przez białka bakulowirusów (p49
i IAP). Ta domniemana kaspaza inicjatorowa nazywana
jest Sf-caspase X [41,46,47]. Badając ścieżki sygnalizacyjne
apoptozy indukowanej czynnikami stresowymi (światło
UV, infekcja wirusowa, inhibitory syntezy RNA/DNA) w
liniach komórkowych Lepidoptera dowiedziono, inaczej
niż u Drosophila sp., iż mitochondria są zaangażowane w ten
proces. Uwolnienie cytochromu c z mitochondriów aktywuje kaspazę inicjatorową oraz Sf-caspase-1(caspase3-like),
co zostało udowodnione na przykładzie indukcji apoptozy
światłem UV, czy też induktorami apoptozy pochodzenia
roślinnego (azadirachtyna, kamptotecyna) w linii komórkowej Sf9. Dodatek tych induktorów wywołuje uwolnienie
cytochromu c poprzez otwarcie porów w błonie mitochondrium, czemu towarzyszy wytwarzanie reaktywnych form
tlenu oraz utrata mitochondrialnego potencjału błonowego
[48,49]. Aktywacja kaspaz efektorowych zależna od obecności cytochromu c w cytosolu obserwowana jest również
w linii komórkowej Sl-1 (S.litura) czy IPLB-LdFB (Lymantria
dispar) [28,50,51]. Udział mitochondriów w procesie apoptozy czyni więc gatunki z rodzaju Lepidoptera podobne do
komórek ssaków, w których obserwujemy „wewnętrzną”
ścieżkę apoptozy (Ryc. 3).
ROLA APOPTOZY W OBRONIE PRZED INFEKCJAMI
Indukcja śmierci komórki na drodze apoptozy może być
jedną ze strategii obronnych organizmu, ponieważ prowadzi ona do eliminacji komórek chorych lub zainfekowanych
patogenami, a tym samym chroni organizm przed rozprzestrzenianiem się zakażenia bądź inwazją patogenów. Rola
apoptozy jako mechanizmu obronnego wiąże się z odkryciem u wirusów zwierzęcych białek biorących udział w
zaburzaniu szlaków tego procesu. Z dostępnych danych
wynika, iż genomy wielu wirusów zawierają sekwencje kodujące białka, które modulują apoptozę [52]. Wirusy wykorzystują różne strategie oddziaływania na szlaki apoptozy,
czasami celem jest pojedynczy etap tego procesu zaburzający dalszy jego przebieg np. blokowanie aktywacji kaspaz
lub ekspresja genów zmieniających cykl komórkowy. Małe
wirusy RNA potrafią inicjować gwałtowną, własną replikację oraz szybkie rozprzestrzenianie się infekcji w celu
uniknięcia apoptotycznej śmierci zainfekowanej komórki
gospodarza [53].
Dowodem łączącym występowanie apoptozy z mechanizmami odporności u owadów jest rodzina wirusów zwana
bakulowirusami. Bakulowirusy, to wirusy DNA głównie
związane z rzędem Lepidoptera. Wywołują one gwałtowną
i rozprzestrzeniającą się apoptozę w komórkach owadzich
poprzedzoną replikacją bakulowirusów w cytoplazmie
gospodarza. Białka kodowane przez wirusy zapobiegają
szybkiej apoptozie komórek żywiciela co pozwala na naPostępy Biochemii 60 (3) 2014
mnożenie się patogenów (wirusów). Białkami tymi są IAP
oraz białka blokujące aktywacje kaspaz (P35 i P49). Te dane
świadczą o tym, iż apoptoza jest jednym z mechanizmów
eliminacji infekcji wirusowych [41,54].
PIŚMIENNICTWO
1. Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR (1972) Apoptosis: a basic biological
phenomenton with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J
Cancer 26: 239-257
2. Arends MJ, Wyllie AH (1991) Apoptosis: mechanism and roles in pathology. Int Rev Exp Path 32: 223-254
3. Lawen A (2003) Apoptosis-an introduction. BioEssays 25: 888-896
4. Sikora E (1994) Mechanizmy śmierci programowanej komórek (apoptozy). Postepy Biochem 40: 150-159
5. Zeiss CJ (2003) The apoptosis-necrosis continuum: insights from genetically altered mice. Vet pathol 40: 481-495
6. Christofferson DE, Yuan J (2010) Necroptosis as analternative form of
programmedcell death. Curr Opin Cell Biol 22: 263-268
7. Elmore S (2007) Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 35: 495-516
8. Stępień A, Izdebska M, Grzanka A (2007) Rodzaje śmierci komórki.
Postepy Hig Med Dosw 61: 420-428
9. Locksley RM, Killeen N, Lenardo MJ (2001) The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology. Cell 104: 487-501
10.Suliman A, Lam A, Datta R, Srivastava RK (2001) Intracellular mechanisms of TRIAL: apoptosis through mitochondrial-dependent and
-independent pathways. Oncogene 20: 2122-2133
11.Kischkel FC, Hellbardt S, Behrmann I, Gremer M, Pawlita M, Krammer
PH, Peter ME (1995) cytotoxicity-dependent APO-1(Fas/CD95)-associated proteins from a death-inducing signaling complex (DISC) with
the receptor. Embo J 14: 5579-5588
12.Kaźmierczuk A, Kiliańska ZM (2010) Rola białek szoku cieplnego w
apoptozie komórek. Postepy Hig Med Dosw 64: 273-283
13.Kromer G, Zamzami N, Susin SA (1997) Mitochondrial control of
apoptosis. Immunology Today 18: 44-51
14.Joza N, Susin SA, Daugas E, Stanford WL, Cho SK, Li CY, Sasaki T,
Elia AJ, Cheng HY, Ravagnan L, Ferri KF, Zamzami N, Wakeham A,
Hakem R, Yoshida H, Kong YY, Mak TW, Zuniga-Pflucker JC, Kroemer G, Penninger JM (2001) Essential role of mitochondrial apoptosis-inducing factor in programmed cell death. Nature 410: 549-554
15.Susin SA, Daugas E, Ravagnan L, Samejima K, Zamzami N, Loeffler
M (2000) Two distinct pathways leading to nuclear apoptosis. J Exp
Med 192: 571-580
16.Jóźwik Z, Marczak A (2006) Rola kanałów jonowych w procesie apoptozy. Postepy Biochem 52: 373-382
17.Pardo J, Bosquw A, Brehm R, Wallich R, Naval J, Angel A, Simon M
(2004) Apoptotic pathways are selectively activated by granzyme A
and/or granzyme B in CTL-mediated target cell lysis. JBC Home 167:
457
18.Trapani JA, Smyth MJ (2002) Functional significance of the perforin/
granzyme cell death pathway. Nat Rev Immunol 2: 735-747
19.Slee EA, Adrain C, Martin S (2001) Executioner caspase-3, -6 I -7 perform distinct, non redundant roles during the demolition phase of
apoptosis. J Biol Chem 276: 7320-7326
20.Fadok VA, de Cathelineau A, Daleke DL, Henson PM, Bratton DL
(2001) Loss of phospholipid asymmetry and surface exposure of phosphatidylserine is required for phagocytosis of apoptotic cells by macrophages and fibroblasts. J Biol Chem 276: 1071-1077
21.Yuan J, Shaham S, Ledoux S, Ellis HM, Horvitz HR (1993) The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian
interleukin-1 beta-converting enzyme. Cell 75: 641-652
22.Nicholson DW (1999) Caspase structure, proteolytic substrates, and
function during apoptotic cell death. Cell Death Differ 6: 1028-1042
23.Chang HY, Yang X (2000) Proteases for cell suicide: functions and regulation of caspases. Microbiol Mol Biol Rev 64: 821-846
339
24.Kumar S (1999) Mechanisms mediating caspase activation in cell death. Cell Death Differ 6: 1060-1066
the yellow fever mosquito, Aedesa egypti. Insect Biochem Mol Biol
40: 516-523
25.Colussi PA, Harvey NL, Kumar S (1998) Prodomain-dependent nuclear localization of the caspase-2 (Nedd2) precursor.A novel function for
a caspase prodomain. J Biol Chem 273: 24535-24542
41.Cooper DM, Mitchel-Foster K (2011) Death for survival: what do we
know about innate immunity and cell death in insects? ISJ 8: 162-172
26.Vaux DL, Strasser A (1996) The molecular biology of apoptosis. Proc
Natl Acad Sci USA 93: 2239-2244
27.Lavrik IN, Golks A, Krammer PH (2005) Caspases: pharmacological
manipulation of cell death. J Clin Invest 115: 2665-2672
28.Courtiade J, Pauchet Y, Vogel H, Heckel DG (2011) A comprehensive
characterization of the caspase gene family in insects from the order
Lepidoptera. BMC Genomics 12: 357
29.Lazebnik Y, Thornberry NA (1994) Caspases: enemies within. Science
281: 1312-1316
30.Horovitz HR (1999) genetic control of programmed cell death in the
nematode Ceanorhabditis elegans. Canser Res 59: 1701-1706
31.Lettre G, Hengartner MO (2006) Developmental apoptosis in C. elegans: a comple CEDnario. Develop Cell Biol 7: 97-108
32.Jagasia R, Grote P, Westermann B, Conradt B (2005) DRP-1-mediated
mitochondrial fragmentation during EGL-1-induced cell death in C.
elegans. Nature 433: 754-760
33.Yan N, Gu L, Kokel D, Chai J, Li W, Han A, Chen L, Xue D, Shi Y (2004)
Structural, biochemical, and functional analyses of CED-9 recognition
by the proapoptotic proteins EGL-1 and CED-4. Mol Cell 15: 999-1006
34.Sandu C, Ryoo HD, Steller H (2010) Drosophila IAP antagonists form
multimeric complexes to promote cell death. J Cell Biol 190: 1039-1052
35.Colin J, Garibal J, Mignotte B, Guénal I (2009) The mitochondrial TOM
complex modulates bax-induced apoptosis in Drosophila. Biochem
Biophys Res Commun 379: 939-943
36.Chen P, Rodriguez A, Erskine R, Thach T, Abrams JM (1998) Dredd, a
novel effector of the apoptosis activators reaper, grim, and hid in Drosophila. Dev Biol 201: 202-216
37.Means JC, Muro I, Clem RJ (2006) Lack of involvement of mitochondrial factors in caspase activation in a Drosophila cell-free system. Cell
Death Differ 13: 1222-1234
38.Arama E, Bader M, Srivastava M, Bergmann A, Steller H (2006) The
two Drosophila cytochrom c proteins can function in both respiration
and caspase activation. EMBO J 25: 232-243
39.Meier P, Silke J, Leevers SJ, Evan GI (2000) The Drosophila caspase
Dronc is regulated by DIAP1. EMBO J 19: 598-611
40.Bryant B, Ungerer M, Liu Q, Waterhouse R, Clem R (2010) A caspase-like decoy molecule enhances the activity of a paralogous caspase in
42.Uwo MF, Ui-Te K, Park P, Takeda M (2002) Replacement of midgut
epithelium in the greater wax moth, Galleria mellonella, during larval-pupalmoult. Cell Tissue Res 308: 319-331
43.Forsyth CM, Lemongello D, LaCount DJ, Friesen PD, Fisher AJ (2004)
Crystal structure of an invertebrate caspase. J Biol Chem 279: 70017008
44.Cooper DM, Granville DJ, Lowenberger C (2009) The insect caspases.
Apoptosis 14: 247-256
45.Khoa DB, Trang LTD, Takeda M (2012) Expression analyses of caspase-1 and related activities in the midgut of Galleria mellonella during
metamorphosis. Insect Molec Biol 21: 247-256
46.Manji GA, Friesen PD (2001) Apoptosis in motion. An apical, p35-insensitive caspase mediates programmed cell death in insect cells. J Biol
Chem 276: 16704-16704
47.Liu Q, Qi Y, Chejanovsky N (2005) Spodoptera littoralis caspase-1, a lepidopteran effector caspase inducible by apoptotic signaling. Apoptosis
10: 787-795
48.Sahdev S, Taneja TK, Mohan M (2003) Baculoviral p35 inhibits oxidant-induced activation of mitochondrial apoptotic pathway. Biochem Biophys Res Commun 307: 483-490
49.Huang J, Lv C, Hu M, Zhong G (2013) The mitochondria-mediate
apoptosis of lepidopteran cells induced by azadirachtin. PLoS ONE
8: 3
50.Malagoli D, Iacconi I, Marchesini E (2005) Cell death mechanisms in
the IPLB-dFb insect cell line: a nuclear located Bcl-2-like molecule as
a possible controller of 2-deoxy-D-ribosw-mediated DNA fragmentation. Cell Tissue Res 320: 337-343
51.Shan SG, Liu KY, Peng JX, Yao HC, Li Y, Hong HZ (2009) Mitochondria are involved in apoptosis induced by ultraviolet radiation in lepidopteran Spodoptera litura cell line. Insect Science 16: 485-491
52.Benedict CA, Norris PS, Ware CF (2002) To kill or be killed: viral evasion of apoptosis. Nat Immunol 3: 1013-1018
53.Kurokawa M, Koyama AH, Yasuoka S, Adachi A (1999). Influenza
virus overcomes apoptosis by rapid multiplication. Int J Mol Med 3:
527-530
54.Clem RJ (2005) The role of apoptosis in defense against baculovirus
infection in insects. Role of apoptosis in infection. Curr Top Microbiol
Immunol 289: 113-129
Comparison of apoptosis in vertebrates and invertebrates
(mainly in insects) with particular emphasis on physiological
role of this process in development of organisms
Marta Ligęza-Żuber*, Mieczysława Irena Boguś
Institute of Parasitology PAS, Department of Phisiology, 51 Twarda St., 00-818 Warsaw, Poland
*
e-mail: [email protected]
Key words: insects, vertebrates, invertebrates, apoptosis, caspases, apoptotic pathways
ABSTRACT
Apoptosis (from Greek „dropping off leaves”) is defined as active genetically programmed cell death, that may occur in single cell or group
of cells in organisms. This process is highly conserved among invertebrates and vertebrates but we can identify different components of the
apoptotic pathways or changes in mechanisms by which apoptosis is activated between species. Generally apoptosis plays a key role in normal
tissue development as well as in elimination of unwanted cells including damaged or infected cells. This type of cell death, conserved through
evolution, permits homeostasis maintenance on the right level. The mechanisms of apoptosis are very complex and sophisticated, in vertebrate
research indicates a few main pathways, differing in the first stage leading to the activation of executive enzymes — caspases. Caspases are essential for the initiation and regulation of apoptosis and a large number of these enzymes have been identified in various animals from sponges
to vertebrates. In these work we focused on comparison invertebrate and vertebrate pathways of apoptosis, especially in insects species (Diptera
and Lepidoptera). We investigate how these organisms use that kind of cells control as kind of immune response triggered by pathogen infection.
340
www.postepybiochemii.pl