Autoreferat - Wydział Chemii UMK

Transkrypt

Uniwersytet Mikołaja Kopernika
Wydział Chemii
Katedra Chemii Środowiska i Bioanalityki
Polimerowe, monolityczne fazy stacjonarne
do chromatografii – preparatyka,
charakterystyka i zastosowania
dr Michał Szumski
Autoreferat
Toruń, 2014
Załącznik 3A
do wniosku o nadanie stopnia doktora habilitowanego
1. Imię i nazwisko
Michał Zbigniew Szumski
2. Posiadane dyplomy i stopnie naukowe
1997 – magister chemii, specjalność – chemia środowiska, tytuł pracy dyplomowej:
Ekstrakcja w stanie nadkrytycznym (SFE) jako technika przygotowania próbek, promotor:
prof. dr hab. Bogusław Buszewski
2003 – doktor nauk chemicznych w dziedzinie chemii, tytuł rozprawy doktorskiej:
Miniaturyzacja układów chromatograficznych – preparatyka i zastosowania uniwersalnych
mikrokolumn w analityce, promotor: prof. dr hab. Bogusław Buszewski
3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu
1 października 1997 – 31 września 2000 – doktorant w Zakładzie Chemii Środowiska
1 października 2000 – 31 października 2004 – asystent w Zakładzie Chemii
Środowiska i Ekoanalityki
1 listopada 2004 – 31 października 2005 – stypendysta (post-doc) na Wydziale Chemii
Uniwersytetu w Umeå, Szwecja, opiekun: prof. dr Knut Irgum
1 listopada 2005 – 31 stycznia 2006 – asystent w Katedrze Chemii Środowiska
i Bioanalityki
1 lutego 2006 – nadal – adiunkt w Katedrze Chemii Środowiska i Bioanalityki
4. Zainteresowania naukowe
Chromatografia cieczowa, techniki elektromigracyjne, miniaturyzacja w chemii
analitycznej, polimery w technikach rozdzielania
5. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14
marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz
o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.)
5.1. Tytuł osiągnięcia
Polimerowe, monolityczne fazy stacjonarne do chromatografii
– preparatyka, charakterystyka i zastosowania
(Osiągnięcie stanowi jednotematyczny cykl publikacji od H1 do H10,
wymienionych w Załączniku 2A i których kopie znajdują się w Załączniku 4)
5.2. Autoreferat wraz z omówieniem osiągnięcia naukowego
W 1997 roku ukończyłem studia magisterskie na Wydziale Chemii UMK. Praca dyplomowa,
wykonana pod kierunkiem prof. dr. hab. Bogusława Buszewskiego, dotyczyła izolowania
węglowodorów aromatycznych z próbek stałych za pomocą ekstrakcji w stanie nadkrytycznym
(SFE). Wyniki mojej pracy zaprezentowałem na konferencji i ukazały się one drukiem
-2-
Załącznik 3A
w materiałach zjazdowych1. W tym samym roku, po zdaniu egzaminów wstępnych, zostałem
słuchaczem Studium Doktoranckiego na Wydziale Chemii UMK. Na przełomie listopada
i grudnia 1997 roku odbyłem miesięczny staż naukowy w Instytucie Chemii Analitycznej Czeskiej
Akademii Nauk w Brnie, w grupie dr. Jižiego Vejrosty, specjalisty w zakresie metod analitycznych
w stanie nadkrytycznym i współkonstruktora ekstraktora nadkrytycznego. Podczas pobytu w
Brnie, poza badaniami ściśle związanymi z SFE, zapoznałem się również, w bardzo
powierzchownym zakresie, z preparatyką mikrokolumn do chromatografii w stanie
nadkrytycznym (SFC) i mikrochromatografii cieczowej. W początkowym okresie studiów moja
działalność naukowa dotyczyła rozwijania nowych rozwiązań aparaturowych w SFE i badań
aplikacyjnych związanych z tą techniką. Między innymi, opracowałem nowego typu odbieralnik
do SFE, będący swoistym połączeniem SFE i SPE, użyteczny w izolowaniu węglowodorów
aromatycznych i fenoli. Poza tym, zajmowałem się także izolowaniem substancji zapachowych
z roślin za pomocą SFE. Dodatkowo, próbowałem swoich sił w preparatyce kolumn do
chromatografii, w tym kolumn o zmniejszonej średnicy (tzw. microbore columns, o średnicy 1 mm).
Rezultatem tych prac było zgłoszenie patentowe (patent PL-188141) oraz cztery publikacje2,3,4,5,6.
W 1998 roku uczestniczyłem (wraz z innymi pracownikami i doktorantami Wydziału
Chemii UMK) w dwutygodniowym kursie Advances in analytical chemistry, który odbywał się na
Uniwersytecie Technicznym w Eindhoven w Holandii. Kurs organizowany był w kierowanym
przez prof. Carla Cramersa Laboratorium Analizy Instrumentalnej, jednostce mającej istotne
osiągnięcia w zakresie technik separacyjnych. Biorąc pod uwagę bogate zaplecze aparaturowe tego
ośrodka, za radą mojego promotora, prof. Buszewskiego, rok później (w okresie styczeńkwiecień) udałem się ponownie do tej uczelni na trzymiesięczny staż w ramach programu
Tempus. Podczas pobytu w Eindhoven pracowałem nad preparatyką kolumn kapilarnych do
chromatografii cieczowej. Trudność zadania polegała na tym, że długie (30-35 cm) kolumny o
średnicy dc = 161 µm napełniałem fazą stacjonarną o średnicy ziaren dp = 3 µm. Żmudny proces
doboru warunków zaowocował wytworzeniem kolumn o bardzo dobrej przepuszczalności
i wysokiej sprawności (zredukowana wysokość równoważna półce teoretycznej wynosiła: h ≈ 2)
Przeprowadzone tam badania, zdobyte doświadczenie oraz studia literaturowe ostatecznie
skierowały moje zainteresowania naukowe na zagadnienia związane z miniaturyzacją w
technikach rozdzielania. Po powrocie do macierzystej uczelni, skompletowałem niezbędny
warsztat badawczy, pozwalający na wytwarzanie oraz ocenę chromatograficzną i
elektrochromatograficzną uzyskanych pakowanych kolumn kapilarnych (mikrozawór dozujący,
detektor UV-Vis wyposażony w celkę detekcyjną do pomiarów w kapilarach, program do
zbierania danych, zestaw do elektroforezy kapilarnej i elektrochromatografii). Dużą rolę odegrały
1
M. Szumski, A. Chmarzyński, B. Buszewski Wykorzystanie ekstrakcji w stanie nadkrytycznym do oznaczania WWA w
stałych matrycach środowiskowych, w: Wyznaczanie stref oddziaływania składowisk odpadów na podstawie
monitoringu; J. Lasa & Zb. Makles (red. nauk.) Wyd. CCNS Sp. z o.o. Kraków 1997 s. 36 – 47.
2
B. Buszewski, M. Szumski Odbieralnik analitów w ekstrakcji zwłaszcza w stanie nadkrytycznym, Patent Nr PL-188141.
3
B. Buszewski, M. Szumski, J. Vejrosta Ekstraktor nadkrytyczny SE-1 (Supercritical fluid extractor SE-1), Aparatura
Dydaktyczna i Badawcza (ADiB), 1 (1998) 12 - 18.
4
M. Szumski & B. Buszewski On-line SFE-SPE coupling as a selective trap for extract collection, Intern. Lab., 29(7)(1999)
20 – 25.
5
M. Ligor, M. Szumski, B. Buszewski Isolation and determination of flavour and fragrance components from natural products by
SPME/GC and SFE/GC methods, Intern. Lab. 30 (1)(2000) 22-25.
6
B. Buszewski, T. Buszewska, M. Szumski, J. Siepak Simultaneous determination of phenols and polyaromatic hydrocarbons
isolated from environmental samples by SFE-SPE-HPLC, Chem. Anal. (Warsaw), 47(6)(2002).
-3-
Załącznik 3A
tu granty NFOŚiGW (1999-2000) oraz UMK (2001). Nieco później, zaprojektowałem
i zbudowałem zestaw do wytwarzania kapilarnych polimerowych kolumn monolitycznych
(polimeryzacja termiczna), co było cennym uzupełnieniem posiadanego już sprzętu. Podczas
przygotowywania rozprawy doktorskiej badania moje obejmowały następujące obszary:
•
•
•
•
preparatyka pakowanych kolumn kapilarnych – przeprowadzone badania dotyczyły
oceny stosowalności różnych rozpuszczalników organicznych i ich mieszanin do
przygotowywania zawiesiny do napełniania kolumn o średnicach wewnętrznych od
100 µm do 1 mm. Wykazałem, że do średnicy ok. 320 µm kolumny można napełniać
w podobny sposób jak kolumny klasyczne, tj. stosując również rozpuszczalniki o
wysokiej lepkości (high viscosity slurry). Kolumny kapilarne o mniejszych średnicach
powinno się napełniać zawiesiną bazującą na rozpuszczalniku o niskiej lepkości, ale
takim, w którym cząstki fazy stacjonarnej nie ulegają aglomeracji.
badania przepływu elektroosmotycznego (wyrażonego jako ruchliwość
elektroosmotyczna, µEOF) w kolumnach kapilarnych (samodzielnie wytworzonych)
wypełnionych
adsorbentami
o
ściśle
zdefiniowanych
właściwościach
powierzchniowych – były to serie adsorbentów krzemionkowych (wytworzonych w
Katedrze Chemii Środowiska i Bioanalityki na bazie żelu krzemionkowego Kromasil)
z chemicznie związaną fazą C18 o różnej gęstości pokrycia, funkcyjności użytego
silanu oraz poddanych lub nie poddanych wtórnej silanizacji. Dodatkowo
przebadałem serię faz alkiloamidowych (tzw. fazy AP) o różnej długości łańcucha
węglowodorowego (od C1 do C18). Przeprowadzone w szerokim zakresie pH (2,5 –
9,5) i składu faz ruchomych (różna zawartość acetonitrylu) pomiary wykazały silną
zależność od pH i słabą zależność µEOF od aktywności silanolowej dla faz C18. Dla faz
alkiloamidowych przeprowadzone badania potwierdziły istnienie tzw. poduszki
hydrolitycznej, co w konsekwencji prowadziło do nieprzewidywalnych zachowań tych
faz w warunkach CEC7.
preparatyka monolitycznych faz stacjonarnych w kapilarach kwarcowych – badania
dotyczyły opracowania sposobu syntezy złóż monolitycznych na bazie metakrylanów
oktadecylu, laurylu i izobornylu. Szczególną uwagę zwróciliśmy na sposób
przygotowania kapilar do syntez. Wytworzone kolumny poddano ocenie
w warunkach mikro-HPLC i CEC. Kolumny udało się wytworzyć w ten sposób,
że cała kapilara zawierała monolit, z wyjątkiem miejsca detekcji. W ten sposób
uzyskano kolumnę zawierającą odcinki długi i krótki przedzielone okienkiem
detekcyjnym, a separacje można było prowadzić na jednym albo drugim, zmieniając
miejsce dozowania i biegunowość elektrod. Analizy takie posłużyły również
do potwierdzenia homogenności złoża na całej długości8,9.
badania aplikacyjne dotyczyły przede wszystkim zastosowania elektroforezy kapilarnej
do rozdzielania komórek bakteryjnych oraz oznaczania biotyny w preparacie
7
M. Szumski, B. Buszewski: Study of electroosmotic flow in packed capillary columns, J. Chromatogr. A 1032 (2004) 141148.
8
B. Buszewski, M. Szumski & Sz. Suś: Methacrylate-based monolithic columns for micro-HPLC and CEC, LC & GC
Europe, 15 (12) (2002) 782 – 798.
9
B. Buszewski, M. Szumski The study of bed homogeneity of methacrylate-based monolithic columns for micro-HPLC and CEC,
Chromatographia 60 (2004) 261-267.
-4-
Załącznik 3A
farmaceutycznym. W pierwszym przypadku z sukcesem zastosowano kapilarę pokrytą
poliakryloamidem w celu zatrzymania przepływu elektroosmotycznego,
co umożliwiło rozdzielenie czterech gatunków bakterii na krótkim odcinku kapilary
(Leff = 8,5 cm)10. Z kolei stosując technikę micelarnej chromatografii
elektrokinetycznej (MEKC) oznaczono biotynę we wprowadzanym na rynek
preparacie farmaceutycznym. Opracowana metodyka okazała się dużo mniej wrażliwa
na wpływ matrycy i szybsza w porównaniu do HPLC11.
Wspomniane publikacje7-11 oraz praca przeglądowa12 złożyły się na przygotowaną pod
kierunkiem prof. dr. hab. Bogusława Buszewskiego rozprawę doktorską zatytułowaną
Miniaturyzacja układów chromatograficznych – preparatyka i zastosowanie uniwersalnych mikrokolumn
w analityce, którą z wyróżnieniem obroniłem 12 lutego 2003 roku.
W dalszej działalności naukowej postanowiłem zgłębiać zagadnienia związane
z polimerowymi, monolitycznymi fazami stacjonarnymi przeznaczonymi przede wszystkim do
miniaturowych technik separacyjnych.
Monolityczne materiały do technik rozdzielania są efektem rozwoju metod
chromatograficznych zarówno w kierunku opracowywania nowych faz stacjonarnych,
jak i miniaturyzacji układów chromatograficznych. W klasycznym ujęciu celem miniaturyzacji jest
stosowanie kolumn chromatograficznych o coraz mniejszych średnicach13. O ile w chromatografii
gazowej przejście od kolumn pakowanych do kapilarnych o otwartym przekroju dokonało się już
w latach pięćdziesiątych XX wieku, to z powodu wielu problemów technicznych miniaturyzacja
w chromatografii cieczowej opóźniona została o mniej więcej 20-30 lat14. Wprowadzenie do
powszechnego użycia precyzyjnie wykonanych i wytrzymałych kapilar kwarcowych (fused silica)
stało się punktem wyjścia do szybkiego rozwoju zarówno elektroforezy kapilarnej jak i do
opracowania sposobów wytwarzania kolumn kapilarnych o coraz mniejszych średnicach
przeznaczonych do mikro-wysokosprawnej chromatografii cieczowej (µ-HPLC), chromatografii
w stanie nadkrytycznym (SFC) i elektrochromatografii (CEC). Mikrokolumny pakowane są
miniaturową wersją kolumn klasycznych (za takie uważa się kolumny o średnicy wewnętrznej,
dc w zakresie 2-6 mm) w tym sensie, że mniejsza jest ich średnica wewnętrzna, natomiast
stosowane były, i nadal są, te same fazy stacjonarne. Fazy te to w zdecydowanej większości
przypadków materiały krzemionkowe, o średnicy ziaren (dp) w zakresie od 1,5 do 10 µm. Długość
kolumny kapilarnej przeznaczonej do chromatografii cieczowej determinowana jest, ze względu
na przepuszczalność, przez średnicę ziaren, natomiast w przypadku elektrochromatografii, gdzie
przepływ elektroosmotyczny nie jest związany ze spadkiem ciśnienia, ziarna mogą być mniejsze
przy zachowaniu „klasycznej” długości kolumny (nawet dp = 1 µm przy długości 25-30 cm).
Zasadnicze wady stosowania takich kolumn są następujące: słaba (choć należałoby raczej
powiedzieć: nieprzewidywalna) wytrzymałość związana z koniecznością stosowania
10
B. Buszewski, M. Szumski, E. Kłodzińska, H. Dahm Separation of Bacteria by capillary electrophoresis, J. Sep. Sci. 11
(2003) 1045 - 1049.
11 R.M. Gadzała-Kopciuch, M. Szumski, B. Buszewski Determination of Biotin in pharmaceutical preparation by means of
HPLC or MEKC, J. Liq. Chromatogr. & Rel. Technol., 26 (2) (2003) 191 - 201.
12 M. Szumski, B. Buszewski State of the art in miniaturized separation techniques, Crit. Rev. Anal. Chem. 32 (2002) 1–46.
13 J.P.C. Vissers, H.A. Claessens, C.A. Cramers Microcolumn liquid chromatography – instrumentation detection and applications,
J. Chromatogr A 779 (1997) 1-28.
14 D. Ishii Introduction to microscale high performance liquid chromatography, VCH Publishers, Weinheim 1988.
-5-
Załącznik 3A
wewnętrznych spieków oraz trudności związane z ich wytwarzaniem w formie kapilarnej
(konieczność stosowania układów wysokociśnieniowych do ich preparatyki) lub czipowej.
Trudności te stały się główną przyczyną opracowywania materiałów monolitycznych15,16,17,
których definicję sformułować można następująco12: złoże monolityczne to ciągła, jednolita struktura
porowata, w postaci szkieletu połączeń, sporządzona poprzez polimeryzację lub zespolenie w inny sposób
materiału wewnątrz kapilary (spieczenie, osadzenie, skompresowanie) posiadająca własności chromatograficzne.
A
B
C
Rysunek 1. Przekroje kolumn kapilarnych: A – kolumna pakowana, B – kolumna monolityczna
polimerowa, C – kolumna monolityczna krzemionkowa.
Za najważniejsze zalety monolitycznych faz stacjonarnych uważa się18,19,20,21:
•
•
•
•
•
większą homogenność w porównaniu do złóż pakowanych ze względu na brak
konieczności stosowania spieków wewnętrznych;
większą przepuszczalność, czego rezultatem jest niższe ciśnienie wsteczne
podczas przepływu fazy ruchomej;
dowolną długość, ze względu na wytwarzanie in situ, czyli w
kapilarze/rurce/kanale czipu;
wiele sposobów wytwarzania opartych na polimeryzacji, polikondensacji,
przemianach zol-żel;
w przypadku złóż monolitycznych polimerowych – łatwość uzyskania złóż
o założonych własnościach powierzchniowych i/lub topografii powierzchni
(rozkład ładunku, grup funkcyjnych, porów) bezpośrednio lub poprzez późniejszą
modyfikację powierzchni złoża;
15
F. Svec Organic polymer monoliths as stationary phases for capillary HPLC, J. Sep. Sci. 27 (2004) 1419-1430.
S. Eeltink, W.M.C. Decrop, G.P. Rozing, P.J. Schoenmakers, W.T. Kok Comparison of the efficiency of microparticulate
and monolithic capillary columns, J. Sep. Sci. 27 (2004) 1431-1440.
17 F. Svec My favorite materials: Porous polymer monoliths, J. Sep. Sci. 32 (2009) 3-9.
18 F. Svec Organic polymer monoliths as stationary phases for capillary HPLC, J. Sep. Sci. 27 (2005) 1419-1430.
19 [H6] M. Szumski, B. Buszewski Preparation and application of monolithic beds in separation of selected natural biologically
important compounds, J. Sep. Sci. 30 (2007) 55-66.
20 [H5] M. Szumski, E. Kłodzińska, R. Jarmalavičienė, A. Maruška, B. Buszewski Considerations on influence of charge
distribution on determination of biomolecules and microorganisms and tailoring the monolithic (continuous bed) materials for
bioseparations, J. Biochem. Biophys. Methods 70 (2007) 107-115.
21 R. Bakry, C.W. Huck, G.K. Bonn Recent applications of organic monoliths in capillary liquid chromatographic sparation of
biomolecules, J. Chromatogr. Sci. 47 (2009) 418-431.
16
-6-
Załącznik 3A
•
„biokompatybilność” materiałów polimerowych jako użyteczność w rozdzielaniu
wielu związków biologicznie aktywnych – aminokwasów, peptydów, białek,
kwasów nukleinowych, organicznych i in21,22.
Poza wyżej wspomnianymi zaletami bardzo często wymienia się prosty sposób
wytwarzania kolumn monolitycznych, w tym sensie, że w większości przypadków nie są
potrzebne żadne skomplikowane/drogie urządzenia23. Przedyskutowane przeze mnie
w publikacjach H5 i H6 sposoby/procedury wytwarzania złóż monolitycznych nie zawsze są
proste, a na końcowy sukces wpływać może wiele czynników.
Monolityczne złoża do technik separacyjnych można ogólnie podzielić na następujące
grupy :
19
•
•
•
•
złoża nieorganiczne (głównie krzemionkowe);
złoża organiczne (polimerowe);
złoża „organiczno-nieorganiczne”;
złoża węglowe.
Zalety i wady każdego z typów monolitów można rozpatrywać z kilku punktów widzenia:
a) czy synteza jest nieskomplikowana?, b) czy wielkość porów można w prosty sposób
kontrolować?, c) czy łatwo można uzyskać pożądane własności powierzchniowe?, d) czy
uzyskana monolityczna faza stacjonarna jest stabilna w różnych warunkach (ciśnienie/przepływ
elektroosmotyczny/różne rozpuszczalniki/pH)19?
Złoża krzemionkowe opracowano jako monolityczną wersję klasycznych ziarnistych
krzemionkowych faz stacjonarnych24,25,26,27. Ich niezaprzeczalną zaletą jest szeroka wiedza na
temat modyfikacji powierzchni, co czyni je przewidywalnymi podczas prowadzenia procesu
chromatograficznego różnorodnych analitów. Synteza monolitów krzemionkowych jest
wieloetapowa. Kluczowy jest etap przejścia zol-żel oraz trawienie w celu wytworzenia
mezoporów. Typowa mieszanina „polimeryzacyjna” to wodny roztwór alkoksysilanów,
poli(tlenku etylenu) – PEO, mocznika i kwasu octowego. PEO pełni rolę porotwórczą
i odpowiada za utworzenie dużych porów przepływowych, natomiast mocznik ulega rozkładowi
termicznemu z wytworzeniem amoniaku, który trawi mezopory w szkielecie krzemionkowym.
Końcowy produkt charakteryzuje się tzw. bimodalną strukturą porów, w której wyróżnić można
duże pory przepływowe (0,5-8 µm) oraz szkielet o wielkości 0,3-5 µm zawierający pory o średnicy
5-25 nm. Wielkości te zależą od warunków prowadzenia reakcji i proporcji substratów
22
J. Krenkova, F. Svec Less common applications of monoliths: IV. Recent developments in immobilized enzyme reactors for
proteomics and biotechnology, J. Sep. Sci. 32 (2009) 706-718.
23 F. Svec Porous polymer monoliths: Amazingly wide variety of techniques enabling their preparation, J. Chromatogr. A 1217
(2010) 902-924.
24 H. Minakuchi, K. Nakanishi, N. Soga, N. Ishizuka, N. Tanaka Effect of skeleton size on the performance of
octadecylsilylated continuous porous silica columns in reversed-phase liquid chromatography J. Chromatogr. A 762 (1997)135–
146.
25 K. Nakanishi, H. Minakuchi, N. Soga, N. Tanaka Structure design of double-pore silica and its application to HPLC J. SolGel Sci. Technol. 13 (1998) 163–169.
26 H. Minakuchi, K. Nakanishi, N. Soga, N. Ishizuka, N. Tanaka Effect of domain size on the performance of
octadecylsilylated continuous porous silica columns in reversed-phase liquid chromatography J. Chromatogr. A 797 (1998)
121–131.
27 K. Cabrera Recent advances in silica-based monolithic HPLC columns, LC-GC, April, 2008.
-7-
Załącznik 3A
w mieszaninie. Monolityczne krzemionkowe fazy stacjonarne są jedynymi skomercjalizowanymi
kolumnami do klasycznej HPLC i sprzedawane są przez firmę Merck pod nazwą handlową
Chromolith27. Wadą jest skomplikowany sposób ich wytwarzania, szczególnie w wersji kapilarnej.
Należy również wspomnieć o ograniczonej stosowalności w szerokim zakresie pH
i niekorzystnych oddziaływaniach z wieloma analitami (podobnie jak jest to w przypadku
tradycyjnych, ziarnistych krzemionkowych faz stacjonarnych).
Wspomniane wyżej monolityczne złoża węglowe nie mają praktycznego znaczenia, ze
względu na skomplikowany sposób wytwarzania oraz bardzo niską sprawność28.
Biorąc pod uwagę dane literaturowe i potencjalne możliwości wykorzystania największe
znaczenie mają materiały polimerowe, do których zaliczyć można również wspomniane wyżej
złoża „organiczno-nieorganiczne”29,30. Te ostatnie bazują na metakrylanie 3(trimetoksysylilopropylu) (γ-MAPS), dwufunkcyjnym monomerze, zawierającym zdolne do
polimeryzacji grupy metakrylowe oraz ulegające przemianom zol-żel grupy metoksysylilowe.
Preparatyka takich złóż polega na przeprowadzeniu wstępnego procesu zol-żel, po którym
nastepuje etap fotopolimeryzacji. Z tego powodu materiały takie nazywane są również PSG
(photopolymerized sol-gel monoliths). W warunkach HPLC wykazują zachowanie układu faz
odwróconych, a ze względu na obecność grup silanolowych można je modyfikować podobnie jak
materiały krzemionkowe, w celu uzyskania pożądanych własności powierzchniowych.
Przedmiotem moich zainteresowań są materiały polimerowe do technik separacyjnych,
które stanowią ostatnią, najszerszą grupę materiałów monolitycznych. Ich niewątpliwą zaletą jest
prosty, w ogólnym zarysie, sposób preparatyki, który obejmuje następujące etapy:
•
•
•
•
•
•
modyfikację ścianki kapilary;
sporządzenie mieszaniny polimeryzacyjnej;
wprowadzenie mieszaniny do kapilary;
polimeryzację inicjowaną termicznie, fotochemicznie lub w inny sposób;
płukanie złoża w celu usunięcia nieprzereagowanych związków;
ocenę własności uzyskanej kolumny/własności złoża monolitycznego.
Podczas preparatyki polimerowych materiałów do chromatografii postawiłem sobie
następujące cele badawcze:
• dogłębnie zbadanie i wybór optymalnej metody modyfikacji wewnętrznej ścianki
kapilary;
• zbadanie wpływu temperatury na własności chromatograficzne kolumn
wytwarzanych drogą fotopolimeryzacji;
• opracowanie sposobu wytwarzania monolitycznych złóż polimerowych i ich
zastosowanie do izolowania oraz rozdzielania związków biologicznie aktywnych;
28
C. Liang, S. Dai, G. Guiochon A Graphitized-Carbon Monolithic Column, Anal. Chem. 75 (2003) 4904-4912.
M.T. Dulay, J.P. Quirino, B.D. Bennett, M. Kato, R.N. Zare Photopolymerized Sol−Gel Monoliths for Capillary
Electrochromatography, Anal. Chem. 73 (2001) 3921-3926.
30 M. Kato, K. Sakai-Kato, T. Toyo’oka, M.T. Dulay, J.P. Quirino, B.D. Bennett, R.N. Zare Effect of preparatory
conditions on the performance of photopolymerized sol–gel monoliths for capillary electrochromatography, J. Chromatogr. A 961 (2002)
45-51.
29
-8-
Załącznik 3A
•
•
modyfikację powierzchni krzemionki warstwą polimerową o kontrolowanej
grubości i homogennym pokryciu nośnika do chromatografii oddziaływań
hydrofilowych (HILIC);
znalezienie alternatywnego (w stosunku do powszechnie stosowanych) sposobu
oceny porowatości złoża monolitycznego w kapilarze kwarcowej.
Pierwszym etapem, być może nawet kluczowym dla dalszego powodzenia preparatyki
polimerowych kapilarnych kolumn monolitycznych, jest modyfikacja wewnętrznej powierzchni
kapilary kwarcowej. Jej celem jest umieszczenie na wewnętrznej powierzchni kapilary grup
winylowych, które umożliwią kowalencyjne związanie polimerowego złoża monolitycznego
z kapilarą. Najczęściej stosowanym do tego celu reagentem jest dwufunkcyjny odczynnik
metakrylan 3-(trimetoksysylilopropylu) (w żargonie laboratoryjnym nazywany także γ-MAPS, co
jest związane z dawniej stosowaną nazwą γ-metakryloksypropylotrimetoksysilan), którego grupa
trimetoksysylilowa reaguje z grupami silanolowymi kapilary kwarcowej, natomiast grupa
metakrylowa powinna pozostać wolna. Innym, rzadziej stosowanym reagentem jest metakrylan
glicydylu, który reaguje z silanolami z otwarciem pierścienia epoksydowego. Nieprzereagowane
wolne grupy metakrylowe służą jako miejsca związania (anchoring sites) polimerowego złoża.
Związanie takie ma na celu zwiększenie wytrzymałości mechanicznej kolumny (faza stacjonarna
jest chemicznie związana z kapilarą), wyeliminowanie efektów przyściennych oraz polepszenie
powtarzalności wytwarzania takich kolumn. Z kapilary niemodyfikowanej złoże polimerowe
może zostać wypchnięte pod wpływem ciśnienia fazy ruchomej. Jeżeli z kolei modyfikacja nie
będzie przeprowadzona właściwie, mogą mieć miejsce takie niekorzystne efekty, jak np.
zapchanie kapilary przez spolimeryzowany γ-MAPS albo też częściowe lub całkowite
niezwiązanie polimeru z kapilarą, co powoduje powstanie przestrzeni martwych między
polimerem a ścianką. Sprawność takiej kolumny jest wówczas niska.
W literaturze dotyczącej preparatyki polimerowych złóż monolitycznych do roku 2004
w zasadzie tylko dwie publikacje odnosiły się do znaczenia etapu modyfikacji ścianki kapilary i
oceny tego etapu w sposób ilościowy8,31. Badania w tym zakresie, przeprowadzone przeze mnie
przy okazji syntez złóż monolitycznych MIP, opisane zostały w publikacji H132. Publikacje
mojego współautorstwa8,32 wzbudziły zainteresowanie tą tematyką przez grupę prof. Knuta
Irguma z Uniwersytetu w Umeå w Szwecji. Konsekwencją było zaproszenie mnie do odbycia
stażu podoktorskiego w tej jednostce, w celu rozwiązania problemów z kowalencyjnym
wiązaniem polimerów do wewnętrznych powierzchni kapilar i rurek kwarcowych. Mój roczny
(1 listopada 2004 – 31 października 2005) pobyt w Umeå rozpocząłem od szeroko zakrojonych
studiów na temat różnych metodyk modyfikacji ścianki kapilary w celu kowalencyjnego wiązania
złóż monolitycznych. W publikacji H233 wyróżnione zostały dwa etapy modyfikacji: trawienie
(etching) oraz silanizacja (silanization). Celem trawienia jest rozwinięcie powierzchni oraz
zwiększenie ilości grup silanolowych, natomiast silanizacja to właściwe przyłączenie γ-MAPSu.
Podczas badań przetestowane zostały najbardziej reprezentatywne, spotykane w literaturze
31
I. Gusev, X. Huang, C. Horvath Capillary columns with in situ formed porous monolithic packing for micro high-performance
liquid chromatography and capillary electrochromatography; J. Chromatogr. A 855 (1999) 273-290.
32 [H1] M. Szumski, B. Buszewski Molecularly imprinted polymers: A new tool for separation of steroid isomers, J. Sep. Sci. 27
(2004) 837-842.
33
[H2] J. Courtois, M. Szumski, E. Byström, A. Iwasiewicz, A. Shchukarev, K. Irgum A study of surface modification
and anchoring techniques used in the preparation of monolithic micro-columns in fused silica capillaries, J. Sep. Sci. 29 (2006) 14-24.
-9-
Załącznik 3A
procedury (są to procedury z 75 artykułów zacytowanych w publikacji H2): trzy metodyki
trawienia oraz jedenaście metodyk silanizacji (tabela 1).
Tabela 1. Zestawienie badanych procedur trawienia i silanizacji kapilar kwarcowych do preparatyki polimerowych
kolumn monolitycznych, według publikacji H2.
Akronim
procedury
cNaOH
[M]
Temperatura
[°C]
Czas
[min]
Przemywanie HCl
Suszenie
E1
E2
E3
1
1
0.2
23
120
23
30
180
30
0.1M, 30 min
Nie
0.2M, 30 min
N2 RT, 1 h
Suszarka 120°C, 1 h
N2 RT, 1 h
Kwas
γ-MAPS
Temperatura Czas DPPH Przemywanie
PrzechowyAkronim
Rozpuszczalnik [% v/v] Woda octowy
Suszenie
[ºC]
[h] [% w/v]
wodą
wanie
procedury
(pH)
SM1
SM2
MeOH
MeOH
50
50
Nie
Nie
-
RT
RT
24
24
–
–
Tak
Nie
N2
N2
SE
EtOH
20
5%
5
RT
1
–
Nie
N2
ST1
ST2
Toluen
Toluen
10
10
Nie
Nie
-
RT
120
2
24
–
0.02
Nie
Nie
N2
N2
SW1
SW2
Woda
Woda
0.4
0.4
Tak
Tak
3
3
RT
60
1
20
–
–
Tak
Tak
–
N2
SD1
SD2
DMF
DMF
50
50
Nie
Nie
-
120
120
6
6
0.02
0.02
Nie
Nie
N2
120 °C Eksykator
SA1
SA2
Aceton
Aceton
50
50
Nie
Nie
-
RT
RT
24
0.5
–
–
Nie
Tak
80 °C
N2
24h RT
W wodzie
RT – temperatura pokojowa (room temperature), DPPH - difenylopikrylohydrazyl
Trzy główne metodyki trawienia wykorzystywały roztwory NaOH o różnych stężeniach
(0,2 i 1 mol/L), przez różny czas (30 i 180 min) i w różnych temperaturach (23°C i 120°C).
Metody silanizacji różniły się rodzajem zastosowanego rozpuszczalnika (metanol, etanol, toluen,
woda z kwasem octowym (metoda zol-żel), DMF, aceton), stężeniem γ-MAPS, temperaturą oraz
czasem prowadzenia procesu. W związku z tym, że badań tego typu nikt wcześniej nie prowadził,
zdecydowałem, że skuteczność metodyk oceniana będzie na trzy sposoby poprzez wyznaczenie:
•
•
•
kąta zwilżania (θ) metodą wzniesienia kapilarnego wody8,32,34;
stosunku powierzchniowego stężenia atomów O/Si oraz C/Si metodą
spektroskopii fotoelektronowej XPS;
skuteczności związania polimeru z kapilarą za pomocą testu przylegania (adhezji).
Wyznaczenie kąta zwilżania dla wody jest prostym sposobem oceny hydrofobowości
ścianki kapilary. Z wzniesienia kapilarnego wody obliczyć można kosinus kąta zwilżania.
Modyfikacja za pomocą γ-MAPSu powoduje wzrost hydrofobowości wewnętrznej powierzchni
kapilary, co skutkuje niższym poziomem wzniesienia kapilarnego i wyższą wartością kąta
zwilżania. Za Gusev i współ.31 przyjęto, że θ > 70° świadczy o dobrym pokryciu powierzchni
34
X. Huang, C. Horváth Capillary zone electrophoresis with fluid-impervious polymer tubing inside a fused-silica capillary, J.
Chromatogr. A 788 (1997) 155-164.
- 10 -
Załącznik 3A
odczynnikiem modyfikującym. Drugą z metod oceny były pomiary XPS. Biorąc pod uwagę fakt,
że wiązka promieniowania rentgenowskiego w aparacie XPS skupiana była w punkcie o średnicy
ok. 100 µm, oczywistym jest, że pomiarów nie można było dokonywać w kapilarach o tak małej
średnicy. Z tego powodu do badań wybrano specjalnie zamówioną partię kapilar o średnicy
wewnętrznej 1 mm i zewnętrznej 1,3 mm. Podczas badań opracowałem sposób postępowania
podczas przygotowywania kapilar do pomiarów XPS (wymóg zachowania absolutnej czystości
narzędzi, fiolek oraz kolejności wykonywanych czynności), z których to pomiarów część
przeprowadziłem samodzielnie pod nadzorem dr. Shchukareva (Uniwersytet w Umeå),
a aktywnie uczestniczyłem (przygotowywałem na miejscu kapilary i mocowałem ich fragmenty do
stolików pomiarowych) podczas pozostałych. Wyznaczone za pomocą XPS stosunki atomowe
O/Si (po trawieniu) i C/Si (po silanizacji) pozwoliły na porównanie efektywności badanych
metodyk. Zwiększenie stosunku C/Si oraz istnienie pasm pochodzących od atomów węgla z grup
–COO świadczyło o przyłączeniu γ-MAPS do powierzchni kwarcu. Praktycznym sposobem
weryfikacji skuteczności silanizacji był opracowany i wykonany przeze mnie tzw. test przylegania
(adhezji) (szczegóły opisane są w publikacji H2). Test ten polega na próbie wypchnięcia
nieporowatego korka polimerowego z badanej kapilary za pomocą rozpuszczalnika (acetonitrylu)
tłocznego przez pompę HPLC i rejestrowaniu zmian ciśnienia. Korek ten, o długości 2 mm,
wytwarzany był poprzez fotopolimeryzację w badanej kapilarze (trawionej i/lub silanizowanej),
z której usunięto fragment zewnętrznej warstwy poliimidowej. Przeprowadziłem serię wstępnych
polimeryzacji z wykorzystaniem różnych monomerów, z których najlepszy okazał się
dimetakrylan 1,6-heksanodiolu. W porównaniu z innymi monomerami nie ulegał on
zauważalnemu skurczowi, a w jego strukturze nie było widocznych pęknięć. Wyniki testu adhezji
(wykresy zależności narostu i zmian ciśnienia w czasie) pozwoliły na sformułowanie tezy, że
modyfikowane kapilary mogą różnić się chropowatością (roughness).
Rysunek 2. Profile narostu ciśnienia (w MPa) w czasie (w minutach) podczas testu adhezji. Rysunki
dolne (C i D) wskazują na chropowatość powierzchni – powolne lub skokowe wypychanie korka
polimerowego, według H233.
Aby zweryfikować postawioną hipotezę, wykonaliśmy z dr Agnieszką Iwasiewicz (obecnie
Uniwersytet w Cambridge) pomiary za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM). Do tych
pomiarów przygotowałem kapilary w ten sposób, że pirolitycznie usuwałem zewnętrzną warstwę
- 11 -
Załącznik 3A
poliimidową, po czym przeprowadzałem trawienie całości kapilary (zewnętrzną i wewnętrzną
część) w odpowiednich warunkach. Celem takiego postępowania było zmodyfikowanie
zewnętrznej powierzchni badanej rurki, co umożliwiało przeprowadzenie pomiarów (ze względu
na promień krzywizny i wymiary nie ma możliwości dokonania pomiarów AFM na powierzchni
wewnętrznej). Uzyskane wyniki świadczą o tym, że trawiona kapilara zyskuje na chropowatości
powierzchni w porównaniu z kapilarą świeżą. Ponadto okazało się, że chropowatość ta może być
na tyle wysoka, że test adhezji był pozytywnie zaliczany (korek wytrzymywał ciśnienie
przynajmniej 25 MPa) przez kapilary niesilanizowane, z tym, że wyższą chropowatość miały
kapilary trawione wysokich temperaturach. Spośród zbadanych metodyk silanizacji wyróżniały się
te, w których rozpuszczalnikiem był toluen (wysokie wartości θ, C/Si oraz zaliczony test adhezji)
oraz etanol i DMF (nieco niższe wartości θ i C/Si).
Zauważono również, że wykorzystywany w niektórych procedurach DPPH8,31,32,34
(inhibitor polimeryzacji) może utracić swą skuteczność po długim okresie przechowywania
(zjawiska tego nie opisano wcześniej w literaturze). Skutkiem tego jest polimeryzacja γ-MAPSu
podczas silanizacji, co prowadzić może nawet do zapchania kapilary (opisano to w publikacjach
H1 i H2). Zaznaczyć należy, że z praktycznego punktu widzenia, wysoki stopień pokrycia γMAPSem może (ale nie zawsze musi) być niekorzystny. Zdarzyć się może bowiem, że podczas
syntezy złoża monolitycznego w kapilarze o małym przekroju silnie silanizowana ścianka może
wiązać znaczną ilość monomerów z mieszaniny polimeryzacyjnej, czego skutkiem jest relatywnie
gruba warstwa polimerowa na ściance, w której sąsiedztwie znajduje się prawie pusta (lub o
bardzo dużych porach) przestrzeń, natomiast główna część porowatego złoża zlokalizowana jest
w centralnej części kapilary. Przeprowadzone badania pomogły wyjaśnić ten bardzo często
obserwowany efekt.
Rysunek 3. Porównanie wyników badań dla wszystkich testowanych procedur modyfikacji
powierzchni. Kąt zwilżania wyznaczono z pomiarów wzniesienia kapilarnego, stosunek C/Si lub
O/Si z pomiarów XPS, ciśnienie - z testu przylegania, według H233.
- 12 -
Załącznik 3A
Za optymalną i jednocześnie szybką metodykę uznano przeprowadzenie trawienia za
pomocą 1M NaOH przez 3h i w temperaturze 120°C oraz silanizacji za pomocą 10% roztworu
γ-MAPS w toluenie przez 2h i w temperaturze pokojowej (Rysunek 3). Procedurę tę z sukcesem
stosowałem w dalszych badaniach dotyczących różnych aspektów preparatyki polimerowych złóż
monolitycznych. Poza prawidłowo przeprowadzoną modyfikacją ścianki kapilary na jakość
polimerowych kolumn kapilarnych wpływ mają przede wszystkim te czynniki, które pozwolą
kontrolować porowatość i własności chromatograficzne otrzymywanego polimeru porowatego35.
Jak wspomniano wyżej, polimerowe kolumny monolityczne wytwarzać można na drodze
polimeryzacji termicznej oraz fotopolimeryzacji. Są to najczęściej stosowane metody, aczkolwiek
znane są również polimeryzacje inicjowane promieniowaniem gamma oraz z wykorzystaniem
mikrofal. Do najważniejszych czynników wpływających na wielkość porów złoża monolitycznego
zalicza się36,37,38,39,40:
•
•
•
•
•
roztwór porotwórczy – jest to rozpuszczalnik lub częściej mieszanina
rozpuszczalników, którego rodzaj i ilość determinują wielkość i rozkład porów w
złożu monolitycznym syntetyzowanym w danych warunkach. Dodatek dobrego
rozpuszczalnika polimeru powoduje powstawanie mniejszych porów i odwrotnie
– większa ilość słabego rozpuszczalnika powoduje powstanie porów
większych36,37,38,40.
stosunek ilości monomeru funkcyjnego do sieciującego – większa ilość
monomeru sieciującego powoduje powstawanie mniejszych porów37,38.
ilość inicjatora – większa ilość inicjatora powoduje powstanie mniejszych
porów37,40.
temperatura – podczas polimeryzacji termicznych wzrost temperatury oznacza
wytworzenie większych ilości wolnych rodników (z rozpadu inicjatora) co
przekłada się na powstanie mniejszych porów38,40.
ilość energii dostarczonej przez promieniowanie – dla fotopolimeryzacji istnieje
pewien zakres energii, w którym jej wzrost daje efekt mniejszych porów. Energia
zbyt mała nie spowoduje zainicjowania polimeryzacji lub tylko częściową
polimeryzację; energia zbyt duża prowadzi do degradacji polimeru41.
Powyższe ogólne prawidłowości spełnione są dla polimeryzacji termicznej i dla
polimeryzacji inicjowanej fotochemicznie, z tym, że dla tego ostatniego procesu nieznane były w
35
J. Urban, P. Jandera Polymethacrylate monolithic columns for capillary liquid chromatography, J. Sep. Sci. 31 (2008) 25212540.
36 F. Svec, E.C. Peters, D. Sýkora, J.M.J. Fréchet Design of the monolithic polymers used in capillary electrochromatography
columns, J. Chromatogr. A 887 (2000) 3-29.
37 C. Viklund, E. Ponten, B. Glad, K. Irgum, P. Horstedt, F. Svec "Molded" macroporous poly(glycidyl methacrylate-cotrimethylolpropane trimethacrylate) materials with fine controlled porous properties: preparation of monoliths using photoinitiated
polymerization, Chem. Mater. 9 (1997) 463-471.
38 C. Viklund, F. Svec, J.M.J. Frechet, K. Irgum Monolithic,"molded", porous materials with high flow characteristics for
separations, catalysis, or solid-phase chemistry: control of porous properties during polymerization, Chem. Mater. 8 (1996) 744-750.
39 E.C. Peters, M. Petro, F. Svec, J.M.J. Frechet Molded rigid polymer monoliths as separation media for capillary
electrochromatography. 1. Fine control of porous properties and surface chemistry, Anal. Chem. 70 (1998) 2288-2295.
40 F. Svec, J.M.J. Frechet Temperature, a simple and efficient tool for the control of pore size distribution in macroporous polymers,
Macromolecules 28 (1995) 7580-7582.
41 V. Augustin, A. Jardy, P. Gareil, M.-C. Hennion In situ synthesis of monolithic stationary phases for electrochromatographic
separations: Study of polymerization conditions, J. Chromatogr. A 1119 (2006) 80-87.
- 13 -
Załącznik 3A
literaturze badania dotyczące wpływu temperatury na jakość fotopolimeryzowanych złóż
monolitycznych. Dostępne dane mówiły jedynie o przeprowadzeniu fotopolimeryzacji
w temperaturze pokojowej (najczęściej)42,43,44,45,46,47 albo niskiej (rzędu -20°C) np. podczas
preparatyki polimerów z odciskiem cząsteczkowym48,49. Biorąc pod uwagę fakt, że struktura złoża
zależy od rozpuszczalności polimeru w roztworze porotwórczym (moment separacji faz)
postawiłem tezę, że wpływ temperatury na strukturę fotopolimeryzowanych złóż powinien być
zauważalny. Wobec braku doniesień na ten temat postanowiłem przeprowadzić serię syntez w
różnych temperaturach stosując ten sam skład mieszaniny polimeryzacyjnej i zbadać własności
chromatograficzne otrzymanych kolumn. W związku z tym, że w literaturze brak było opisów
sposobu przeprowadzenia takiego procesu, w pierwszym etapie badań zaprojektowałem
i zbudowałem zestaw umożliwiający fotopolimeryzację kolumn kapilarnych w kontrolowanych
warunkach termicznych. Zestaw składał się z kilku połączonych ze sobą funkcjonalnie
elementów. Główną część stanowiła komora, w której górnej części zamocowane zostały cztery
15-watowe świetlówki UV (λ = 365 nm). W dolnej części umieściłem specjalnie zaprojektowany
aluminiowy wymiennik ciepła, w którym, w termostatowanej płytkiej kąpieli (stosowano czysty
metanol lub wodę), przeprowadzano fotopolimeryzację w kapilarach oraz małych fiolkach.
Wymiennik ciepła podłączony został do termostatu-kriostatu, co umożliwiło przeprowadzanie
procesu w zakresie temperatur od -15°C do +75°C. Zmierzona w miejscu prowadzenia
polimeryzacji irradiancja wynosiła 1900 µW/cm2. Szczegółowo zestaw ten i sposób postepowania
opisałem w publikacji H1050. Kapilarne kolumny monolityczne zostały zsyntetyzowane
w kapilarach kwarcowych pokrytych warstwą poliimidu przezroczystą dla promieniowania UV
(kapilary z serii TSU firmy Polymicro). Modelowa mieszanina polimeryzacyjna składała się z
metaktylanu butylu (BMA) i dimetakrylanu glikolu etylenowego (EDMA) jako monomerów
(odpowiednio funkcyjnego i sieciującego), mieszaniny 1-butanodiolu, 1-propanolu i wody jako
roztworu porotwórczego oraz eteru metylowego benzoiny (BME) jako inicjatora.
Otrzymane kolumny kapilarne różniły się znacząco zarówno jeśli chodzi o ich
przepuszczalność jak i sprawność. Najwyższe przepuszczalności (Rysunek 4) zaobserwowałem
dla kolumn wytworzonych w niskich temperaturach (-15°C i -10°C). Zauważyć należy pewną
tendencję do pogarszania się przepuszczalności ze wzrostem temperatury (chociaż najgorsze pod
42
M. Bedair, Z. El Rassi Capillary electrochromatography with monolithic stationary phases, J. Chromatogr. A 1013 (2003) 3545.
43 L. Geiser, S. Eeltink, F. Svec, J.M.J. Fréchet Stability and repeatability of capillary columns based on porous monoliths of
poly(butyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate), J. Chromatogr. A 1140 (2007) 140-146.
44 B. Gu, Z. Chen, C.D. Thulin, M.L. Lee Efficient Polymer Monolith for Strong Cation-Exchange Capillary Liquid
Chromatography of Peptides, Anal. Chem. 78 (2006) 3509-3518.
45 B. Gu, Y. Li, M.L. Lee Polymer Monoliths with Low Hydrophobicity for Strong Cation-Exchange Capillary Liquid
Chromatography of Peptides and Proteins, Anal. Chem. 79 (2007) 5848-5855.
46 D. Lee, F. Svec, J.M.J. Fréchet Photopolymerized monolithic capillary columns for rapid micro high-performance liquid
chromatographic separation of proteins, J. Chromatogr. A 1051 (2004) 53-60.
47 W. Li, D.P. Fries, A. Malik Sol–gel stationary phases for capillary electrochromatography, J. Chromatogr. A 1044 (2004) 2352.
48 L. Schweitz, L.I. Andersson, S. Nilsson Capillary electrochromatography with molecular imprint-based selectivity for enantiomer
separation of local anaesthetics, J. Chromatogr. A 792 (1997) 401-409.
49 L. Schweitz, L.I. Andersson, S. Nilsson Rapid electrochromatographic enantiomer separations on short molecularly imprinted
polymer monoliths, Analytica Chimica Acta 435 (2001) 43-47.
50 [H10] M. Szumski, Bogusław Buszewski Effect of temperature during photopolymerization of capillary monolithic columns, J.
Sep. Sci. 32 (2009) 2574-2581.
- 14 -
Załącznik 3A
tym względem okazały się kolumny wytworzone w temperaturze 0°C i +20°C). Ponadto, dla
kolumn preparowanych „na zimno” wykresy zależności F = f(∆P) charakteryzowały się
nieznacznie lepszą liniowością, co świadczyć może o ich większej homogenności. Na korzyść
warunków niskotemperaturowych świadczą również sprawności otrzymanych kolumn – najlepsze
kolumny to te z zakresu od -15°C do +10°C. Kolumny fotopolimeryzowane w temperaturach
+50°C i powyżej były praktycznie nieprzepuszczalne i charakteryzowały się znaczną
niehomogennością złóż, co zauważyłem obserwując je pod mikroskopem optycznym. W ich
strukturze widoczne były losowo rozmieszczone obszary polimeru i przestrzeni martwych H1018.
Rysunek 4. Ocena przepuszczalności – porównanie zależności natężenia przepływu, F, od
przyłożonego ciśnienia, P, dla kapilarnych kolumn monolitycznych fotopolimeryzowanych w
różnych temperaturach, według H10.
Znaczące różnice jakości tych kolumn zaobserwowano podczas rozdzielania (w warunkach µHPLC) testowej mieszaniny alkilobenzenów (Rysunek 5). Zauważyć można, że w miarę wzrostu
temperatury fotopolimeryzacji rozdzielczość zmieniała się w sposób znaczący. Przykładowo,
pomimo identycznej sprawności kolumn preparowanych w temperaturach -10°C i + 10°C
i zbliżonych przepuszczalności, ta ostatnia wykazała się znacznie gorszą rozdzielczością,
a kolumny wytworzone w temperaturach wyższych można uznać za bezużyteczne.
- 15 -
Załącznik 3A
Rysunek 5. Przykładowe chromatogramy rozdzielenia mieszaniny tiomocznika (znacznik t0) i
alkilobenzenów przeprowadzonych na monolitycznych kolumnach kapilarnych syntetyzowanych
przez fotopolimeryzację w różnych temperaturach, według H10.
Skonstruowany podczas tych badań zestaw do fotopolimeryzacji, otrzymane rezultaty
oraz zdobyte doświadczenie wykorzystywane są do chwili obecnej przez współpracowników
z Katedry Chemii Środowiska i Bioanalityki podczas wytwarzania nowych polimerów, przede
wszystkim materiałów sorpcyjnych z odciskiem cząsteczkowym (MIP). Temperatura
fotopolimeryzacji może być użytecznym (choć z reguły nie decydującym) parametrem
kontrolowania własności otrzymywanych nowych materiałów chromatograficznych.
Przykładowo, opisane powyżej kolumny różniły się w zauważalny sposób hydrofobowością
(oznacza to, że powierzchnia tych polimerów musiała charakteryzować się różną ilością grup
butylowych pochodzących od BMA), opisaną równaniami zależności logarytmu współczynnika
retencji od ilości alkilowych atomów węgla w kolejnych alkilobenzenach.
Możliwość modyfikacji właściwości powierzchniowych polimerowych materiałów
monolitycznych przy zachowaniu ich korzystnych właściwości hydrodynamicznych umożliwia
wykorzystanie bazowego szkieletu polimerowego jako nośnika nowej fazy chemicznie związanej.
Zmiana własności monolitycznego złoża polimerowego związana jest z istnieniem
powierzchniowych grup funkcyjnych pochodzących od użytych monomerów. Przykładowe,
opisywane w literaturze modyfikacje powierzchni mogą być następujące:
• szeroko stosowanym monomerem jest metakrylan glicydylu, którego grupę
epoksydową można poddać reakcji otwarcia pierścienia z przyłączeniem np.
aminy. Reakcje tego typu są wykorzystywane do przyłączenia białek do złoża
monolitycznego, w celu uzyskania przepływowego reaktora enzymatycznego22.
• szczepienie monolitu bazowego poprzez wykorzystanie nieprzereagowanych grup
winylowych. Przykładem może być szczepienie złoża poli(trimetakrylanu
trimetylolpropanu) (poliTRIM) warstwą polimeru z odciskiem cząsteczkowym51.
• modyfikacje złóż polistyrenowych w celu zmiany ich hydrofobowości lub
porowatości (np. tzw. hipersieciowanie czyli sieciowanie wtórne)52,53.
51
J. Courtois, G. Fischer, B. Sellergren, K. Irgum Molecularly imprinted polymers grafted to flow through poly(trimethylolpropane
trimethacrylate) monoliths for capillary-based solid-phase extraction, J. Chromatogr. A 1109 (2006) 92-99.
- 16 -
Załącznik 3A
Monolityczne złoża polistyrenowe syntetyzowane są z diwinylobenzenu (DVB) jako
monomeru sieciującego oraz styrenu (STY) jako monomeru funkcyjnego. Czasami cześć styrenu
zastąpiona jest innymi monomerami, np. chlorkiem 4-winylobenzylowm (celem jest późniejsza
hydrofilizacja złoża lub przeprowadzenie hipersieciowania), kwasem metakrylowym (w celu
wytworzenia przepływu elektroosmotycznego w warunkach CEC) czy 4-oktylostyrenem (w celu
wzrostu charakteru hydrofobowego fazy stacjonarnej). Jako roztwory porotwórcze stosuje się
najczęściej 1-oktanol, 1-dekanol, 1-dodekanol albo mieszaniny 1-dodekanol/toluen,
1-dekanol/THF, formamid/1-propanol. Niemodyfikowane złoża polistyrenowe mają charakter
hydrofobowy i mogą być stosowane bezpośrednio w chromatografii cieczowej lub
elektrochromatografii w odwróconym układzie faz31. Ich własności powierzchniowe mogą być
jednak nie wystarczające do rozdzielenia mieszaniny kwasów fenolowych – związków polarnych,
częściowo zjonizowanych o dużym znaczeniu biologicznym54. W celu poprawy selektywności
takich złóż wobec wymienionych analitów, w publikacji H7 zaproponowałem zmodyfikowanie
ich powierzchni za pomocą alkilowych łańcuchów oktadecylowych (grupy C18). Ze względu na
charakter chemiczny materiałów polistyrenowych, grupy C18 można wprowadzić poprzez:
a) alkilowanie metodą Friedla-Craftsa (FC)55 albo b) poprzez szczepienie (GR od grafting),
np. metakrylanem oktadecylu. Bazowy monolit polistyrenowy zsyntetyzowany został z
mieszaniny o składzie (% obj.): 20% STY, 20%DVB, 40% 1-propanol, 20% formamid, oraz
AIBN (inicjator). Mieszaninę odgazowano poprzez barbotaż azotem przez 10 minut
i wprowadzono do kapilary (dc = 100 µm) zmodyfikowanej w sposób opisany wyżej. Syntezę
przeprowadzono w łaźni wodnej w temperaturze 65°C przez 24h. Po tym czasie monolity
przeznaczone do modyfikacji FC były płukane dichlorometanem i dimetyloformamidem,
pozostałe natomiast metanolem. Skład mieszaniny polimeryzacyjnej został tak dobrany, aby
otrzymana kapilarna kolumna monolityczna charakteryzowała się wysoką przepuszczalnością, co
było konieczne, aby w prosty sposób wprowadzić mieszaniny modyfikujące. Mieszaniny te
wprowadzano do kolumny w ten sposób, że umieszczano je w szklanych fiolkach zamkniętych
zakrętką (z otworem u góry) z uszczelką silikonowo-teflonową. Uszczelka ta została przebita
kapilarą kwarcową w dwóch miejscach i przez utworzone otwory wprowadzono wlot kolumny
kapilarnej oraz kapilarę przyłączoną do reduktora butli z azotem. Przykładając nadciśnienie azotu
ok. 0,8 MPa możliwe było wprowadzenie i przepłukiwanie złoża monolitycznego mieszaninami
reakcyjnymi, a mieszaniny te nie miały kontaktu ze środowiskiem zewnętrznym. Było to o tyle
istotne, że w przypadku przygotowywania mieszaniny alkilującej należy bezwzględnie zachować
warunki bezwodne, natomiast w przypadku szczepienia – warunki beztlenowe. Aby
przeprowadzić alkilowanie metodą FC zmieszano 25 mg bezwodnego chlorku glinu, 0,5 mL
nitrobenzenu i 0,5 mL 1-chlorooktadekanu. Reagenty te natychmiast zamknięto w fiolce
i zhomogenizowano poprzez barbotaż azotem. Po wprowadzeniu mieszaniny do kolumny
monolitycznej zatykano jej końce gumkami silikonowymi i umieszczano w łaźni wodnej (60°C)
52
M.P. Tsyurupa, V.A. Davankov Hypercrosslinked polymers: basic principle of preparing the new class of polymeric materials,
Reactive and Functional Polymers 53 (2002) 193-203.
53 J. Urban, F. Svec, J.M.J. Fréchet Hypercrosslinking: New approach to porous polymer monolithic capillary columns with large
surface area for the highly efficient separation of small molecules, J. Chromatogr. A 1217 (2010) 8212-8221.
54 [H7] Z. Kučerová, M. Szumski, B. Buszewski, P. Jandera, Alkylated poly(styrene-divinylbenzene) monolithic columns for
µ-HPLC and CEC separation of phenolic acids, J. Sep.Sci. 30 (2007) 3018-3026.
55 X. Huang, S. Zhang, G.A. Schultz, J. Henion Surface-alkylated polystyrene monolithic columns for peptide analysis in capillary
liquid chromatography−electrospray ionization mass spectrometry, Anal. Chem. 74 (2002) 2336-2344.
- 17 -
Załącznik 3A
na 16 h. Po reakcji złoże płukano nitrobenzenem, DMF, 1m HLC, wodą i acetonitrylem.
W przypadku szczepienia metakrylanem oktadecylu podstawowym problemem był odpowiedni
dobór warunków prowadzenia procesu (temperatura, czas reakcji) i skład mieszaniny
(rozpuszczalnik i zawartość monomeru). Warunki te zebrane są w poniższej tabeli:
Tabela 2. Skład mieszaniny szczepiącej, według H7.
Kolumna
L
[cm]
T
[°C]
Czas
[h]
Stężenie
OMA
Rozpuszczalnik
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
15,2
14,8
14,6
14,8
14,9
14,9
15,1
15,0
14,5
35,5
55
55
55
65
65
65
75
75
75
65
3
6
9
3
6
9
3
6
9
9
15
25
35
25
35
15
35
15
25
25
toluen
2-propanol
DMF
DMF
toluen
2-propanol
2-propanol
DMF
toluen
DMF
Rkw. galusowy/
kw. syryngowy
0,0
0,0
1,0
0,9
0,3
0,6
0,0
0,6
0,6
1,1
Kryterium wyboru optymalnych warunków prowadzenia szczepienia było uzyskanie
najlepszej rozdzielczości w warunkach µ-HPLC, biorąc jednakże pod uwagę akceptowalną
przepuszczalność kolumny kapilarnej. Najlepsze warunki uznałem te dla kolumny nr 4. Dla
zsyntetyzowanych kolumn wyznaczyłem wartości porowatości całkowitej εT, związanej z porami
przepływowymi (interstitial porosity, ε0) oraz porowatości wewnętrznej polimeru (inner porosity, εi).
Wielkości te, oraz obliczona przepuszczalność KF, pozwoliły na wyznaczenie średnicy porów
przepływowych dc oraz wielkości równoważnej średniej wielkości cząstek (dp,eq). Zebrane w tabeli
3 wielkości pokazują, że alkilowanie metodą Friedla-Craftsa nie spowodowało znaczących zmian
w charakterystyce kolumn, co oznacza, że przyłączenie łańcuchów oktadecylowych wytworzyło
jedynie cienką warstwę powierzchniową na polimerze. Z drugiej strony, szczepienie do wolnych
grup winylowych spowodowało wytworzenie warstwy na tyle grubej, że przepuszczalność
kolumny została zauważalnie pogorszona. Oznacza to, że nastąpić musiało szczepienie
oligomerów metakrylanu oktadecylu, albo też po szczepieniu następowała dalsza polimeryzacja
metakrylanu oktadecylu (było więc to „szczepienie na” – „grafting to”).
Tabela 3. Własności kolumn polistyrenowych: niemodyfikowanej UM,
alkilowanej FC i szczepionej GR, według H7.
Kolumna
UM
FC
GR
L [cm]
KF [cm2]
dp,eq [µm]
dc [µm]
εT
ε0
εi
37,3
2,15·10-9
3,92
3,22
0,706
0,661
0,045
35,6
2,02·10-9
3,97
3,15
0,702
0,653
0,049
35,5
1,24·10-9
4,10
2,57
0,655
0,598
0,057
Z punktu widzenia własności separacyjnych, w warunkach µ-HPLC nie zaobserwowałem
znaczących różnic między tymi kolumnami. Na rysunku 6 przedstawione są rozdzielenia trzech
kwasów fenolowych: galusowego, syryngowego i ferulowego w warunkach chromatografii
cieczowej.
- 18 -
Załącznik 3A
Rysunek 6. Przykładowe chromatogramy rozdzielenia mieszaniny kwasów fenolowych w
warunkach chromatografii cieczowej, kolumny polistyrenowe: A – niemodyfikowana,
B – modyfikowana FC, C – szczepiona GR, faza ruchoma: octan amonu przy pH 3.0, detekcja UV
przy λ = 214 nm, według H7.
W warunkach elektrochromatografii (CEC), w której do poruszania fazy ruchomej
względem stacjonarnej wykorzystuje się zjawisko przepływu elektroosmotycznego (EOF)
rozseparowałem na kolumnie FC cztery kwasy: galusowy, wanilinowy, syryngowy i ferulowy.
Było to możliwe dzięki uzyskaniu wyższych sprawności, co jest związane z płaskim profilem
przepływu elektroosmotycznego (Rysunek 7). Rozdzielenie nie było możliwe na kolumnie
szczepionej, ze względu na praktyczny brak EOF w warunkach prowadzenia procesu (5 mM
bufor fosforanowy, pH 2,5).
Podczas przeprowadzania powyższych badań zauważyliśmy, że przepływ
elektroosmotyczny o szybkości mającej znaczenie praktyczne, generowany był na fazie
stacjonarnej hydrofobowej oraz nie obdarzonej ładunkiem. Co więcej należy zauważyć, że przy
tej fazie ruchomej przepływ jest odwrócony. Istnienie EOF na fazie polistyrenowej było w
pewnym sensie potwierdzeniem wcześniej dokonanych obserwacji podczas rozdzielania bakterii
w warunkach elektroforezy kapilarnej, w kapilarach o modyfikowanej powierzchni wewnętrznej56.
Uznałem to zjawisko za warte dokładniejszego zbadania, a rezultaty opisałem w publikacji H957.
56
M. Szumski, E. Kłodzińska, B. Buszewski Separation of microorganisms using electromigration techniques, J. Chromatogr.
A 1084 (2005) 186-193.
57 [H9] M. Szumski, Z. Kučerova, P. Jandera, B. Buszewski Electroosmotic flow in monolithic poly(styrene-co-divinylbenzene)
capillary columns, Electrophoresis 30 (2009) 583-588.
- 19 -
Załącznik 3A
Rysunek 7. Przykładowe elektrochromatogramy rozdzielenia mieszaniny tiomocznika i kwasów
fenolowych w warunkach CEC, kolumny polistyrenowe: A – niemodyfikowana, B – modyfikowana
FC. Warunki CEC: U = -20 kV, dozowanie -5kV przez 3s, faza ruchoma bufor fosforanowy, c =
5mM, pH 2.5, detekcja UV przy λ = 214 nm. Rozdzielone anality: 1 – tiomocznik, 2 – kwas
galusowy, 3 – kwas wanilinowy, 4 – kwas syryngowy, 5 kwas ferulowy, według H754.
Przepływ elektroosmotyczny jest objętościowym przepływem cieczy w strukturach
kapilarnych, powstającym w wyniku utworzenia się podwójnej warstwy elektrycznej na ściankach
kanałów, na których zlokalizowane są grupy obdarzone ładunkiem. EOF jest zjawiskiem
obserwowanym np. w elektroforezie kapilarnej (ścianki kapilary kwarcowej mają ładunek ujemny
przy pH > 2,3) i wykorzystywanym w pompach elektroosmotycznych czy układach czipowych.
W CEC zjawisko to jest niezbędne do przeprowadzenia separacji, więc kolumny kapilarne do
CEC powinny zawierać takie fazy stacjonarne, które są zdolne do jego wytworzenia w żądanym
pH fazy ruchomej. Kolumny kapilarne pakowane wypełniane są zazwyczaj materiałami
krzemionkowymi, które, w zależności od chemicznie związanej fazy, generują EOF o różnej
prędkości i określonym kierunku. Fazy obdarzone ładunkiem ujemnym generują przepływ od
anody do katody (ruchliwość elektroosmotyczna, µEOF, ma wtedy znak „+”), natomiast te
o ładunku dodatnim – odwrotnie (µEOF ma wtedy znak „–”). Fazy stacjonarne dedykowane do
CEC mają często grupy funkcyjne, których ładunek nie zależy od pH, np. sulfonowe lub
czwartorzędowe amoniowe7,58. W publikacji H957 opisałem, że zjawisko EOF obserwowane było
przez różnych autorów w kapilarach kwarcowych powlekanych rozmaitymi polimerami lub
kapilarach polimerowych59,60, układach czipowych wykonanych z PDMS61 i w niektórych
kolumnach monolitycznych62. Istnienie EOF w przypadku powierzchni obojętnych tłumaczy się
adsorpcją jonowych składników buforu na ściankach kanału (przez kanał rozumie się kapilarę,
kanał czipu czy kanał przepływowy w złożu monolitycznym). W publikacji H754
zaobserwowałem w miarę szybki przepływ przy relatywnie niskich wartościach pH,
postanowiłem więc zbadać jak wygląda charakterystyka EOF dla wytworzonych kolumn
58 M. Szumski Techniki elektrochromatograficzne. Elektrochromatografia kapilarna w: B. Buszewski, E. Dziubakiewicz
i M. Szumski (red.) Techniki elektromigracyjne – teoria i praktyka, Wydawnictwo Malamut, (2012) Warszawa, s. 192-228.
59 H. Bayer, H. Engelhardt Capillary electrophoresis in organic polymer capillaries, J. Microcol. Sep. 8 (1996) 479-484.
60 W. Schuetzner, E. Kenndler Electrophoresis in synthetic organic polymer capillaries: variation of electroosmotic velocity and zeta
potential with pH and solvent composition, Anal. Chem. 64 (1992) 1991-1995.
61 G. Ocvirk, M. Munroe, T. Tang, R. Oleschuk, K. Westra, D.J. Harrison Electrokinetic control of fluid flow in native
poly(dimethylsiloxane) capillary electrophoresis devices, Electrophoresis 21 (2000) 107-115.
62 F.M. Okanda, Z.E. Rassi Affinity monolithic capillary columns for glycomics/proteomics: 1. Polymethacrylate monoliths with
immobilized lectins for glycoprotein separation by affinity capillary electrochromatography and affinity nano-liquid chromatography in
either a single column or columns coupled in series, Electrophoresis 27 (2006) 1020-1030.
- 20 -
Załącznik 3A
polistyrenowych UM, FC i GR, w różnych warunkach pH. W tym celu przygotowałem serię
buforów o stężeniu c = 5 mM i pokrywających szeroki zakres pH: fosforan pH 2.5, cytrynian pH
3.5, octan pH 4.0 i 5.0, MES pH 6,0, fosforan pH 6,5, HEPES pH 7,0 i 7,5, BICINE pH 7,9,
TAPS pH 8,0, boran pH 9,5. Badania polegały na mierzeniu tEOF (substancja testowa: tiomocznik)
przy kolejnych buforach o wzrastającym pH i wyliczaniu ruchliwości elektroosmotycznej µEOF,
której wymiarem jest [cm2/V·s]. W związku z tym, że dla badanych krzemionkowych faz
stacjonarnych obserwuje się histerezę (odmienny przebieg profili EOF przy pH wzrastającym
i malejącym, co przedstawia rysunek 8), badania zostały przeprowadzone przy rosnącym
a następnie malejącym pH.
Rysunek 8. Przykładowy wykres charakterystyki EOF pokazujący histerezę dla
krzemionkowej fazy stacjonarnej C18 o niskiej gęstości pokrycia i poddanej wtórnej silanizacji.
Warunki CEC: U = 15 kV, dozowanie 5kV przez 1s, faza ruchoma: 70/30 ACN/bufor,
detekcja UV przy λ = 200 nm. Substancja testowa: tiomocznik, według H957.
W celu uniknięcia błędów i uzyskania akceptowalnego obrazu charakterystyki EOF
postępowano w następujący sposób: kolumnę kapilarną płukano za pomocą pompy buforem
o najniższym pH aż u jej wylotu przestałem obserwować pęcherzyki gazu, następnie kolumnę
umieszczano w aparacie do CEC i płukano przy ciśnieniu 10 bar przez kolejne 15 min. stosując
ten sam bufor. Po tym, stosując świeży bufor przeprowadzano 10 pomiarów EOF, zmieniono
bufor na świeży i przeprowadzono kolejne dwie serie pomiarowe zmieniając bufor na świeży po
10 eksperymentach. Po przeprowadzeniu 30 pomiarów zmieniano bufor na kolejny, o wyższym
pH i postępowano analogicznie (już nie stosując pompy do płukania wstępnego). Po
przeprowadzeniu serii pomiarowej „w górę” (rosnące pH) przeprowadzano badania stosując
kolejne bufory o coraz niższym pH (seria „w dół”). Każdy punkt na poniższych wykresach
(Rysunek 9) jest więc średnią z 30 pomiarów. Względne odchylenia standardowe zawierały się
w granicach od 0.3 do 4.8%. Z danych zaprezentowanych na rysunku 9 widać, że polistyrenowe
złoża monolityczne generują EOF zależny w pewnym stopniu od pH, a przebiegi „w górę” i „w
dół” różnią się znacznie. Jednocześnie zauważyć należy, że szybkość przepływu
elektroosmotycznego jest znaczna, jeśli porównać ją z krzemionkową fazą stacjonarną (Rysunek
8). Widać również, że kierunek EOF może się odwrócić dla faz UM i FC i następuje to mniej
więcej w podobnym zakresie pH fazy ruchomej. Obserwacja odwróconego EOF przy niskich
wartościach pH jest potwierdzeniem wyników zaprezentowanych w publikacji H754.
- 21 -
Załącznik 3A
4,00
4,00
FC
3,00
2,00
2,00
-1
2 -1
pH
0,00
2
3
4
5
6
7
8
-1,00
9
10
D own
Up
1,00
-4
2 -1
-4
1,00
E OF
µ
µ E OF [x 10 c m s V ]
3,00
-1
[x 10 c m s V ]
PS
pH
0,00
2
3
4
5
6
7
8
9
10
-1,00
D own
Up
-2,00
-2,00
-3,00
-3,00
4,00
GR
3,00
1,00
-4
2 -1
-1
µ E O F [x 10 c m s V ]
2,00
pH
0,00
2
3
4
5
6
7
8
9
10
-1,00
D own
Up
-2,00
-3,00
Rysunek 9. Profile EOF otrzymane dla monolitycznych faz polistyrenowych:
niemodyfikowanej (PS), alkilowanej (FC) i szczepionej (GR). Warunki CEC: U = 20 kV
biegunowość dodatnia lub ujemna, dozowanie 3 kV przez 1s, detekcja UV przy λ = 200 nm.
Substancja testowa: tiomocznik, według H957.
Próbę wyjaśnienia przebiegu tych profili EOF przedyskutowano w pracy H957.
Szczególnie interesująca jest słaba zależność (w porównaniu np. z materiałami krzemionkowymi)
EOF od pH, a zależności te przypominają znane z literatury profile uzyskane dla silnych
wymieniaczy jonowych (materiałów kationowymiennych). W związku z tym, że materiały
polistyrenowe są silnie hydrofobowe, podejrzewałem, że węglowodorowe fragmenty cząsteczek
buforów będą wykazywały pewne powinowactwo do powierzchni polimeru orientując się
grupami polarnymi w kierunku przeciwnym do powierzchni fazy stacjonarnej, co dałoby
wypadkowy ładunek ujemny. Aby to zobrazować, przeprowadziłem proste modelowanie
z wykorzystaniem programu HyperChem. Utworzyłem losowo zbudowaną, modelową niewielką
cząsteczkę polistyrenu i w jej sąsiedztwie umieściłem osiem cząsteczek buforu MES i dwadzieścia
cząsteczek wody. Układ poddany został optymalizacji geometrycznej (in vacuo) z uwzględnieniem
istnienia wiązań wodorowych. Zauważyłem, że cząsteczki wody nie były odpychane od
powierzchni polistyrenu, a orientowały się atomami tlenu w jego kierunku. Jednocześnie
cząsteczki MES, swoimi grupami morfolinowymi kierowały się do powierzchni PS (czyli tak jak
przypuszczałem wstępnie) ale tylko wtedy, gdy między pierścieniami aromatycznymi a MES
znajdowały się cząsteczki wody (co było pewnym zaskoczeniem) – Rysunek 10. Cząsteczki
buforu były odpychane jeżeli nie było między nimi a polimerem przynajmniej dwóch – trzech
cząsteczek wody. Podobne modelowanie przeprowadzono dla fazy alkilowanej FC i okazało się,
że pomimo istnienia łańcuchów węglowodorowych powierzchnia polistyrenowa jest wciąż
dostępna dla cząsteczek wody i buforu MES, ale zależało to od układu łańcuchów C18. Łańcuchy
te, jeżeli nie miały w sąsiedztwie innego łańcucha, „kładły się” wyprostowane na powierzchni PS
- 22 -
Załącznik 3A
pozostawiając dostęp do polimeru z obydwu stron. Jeżeli natomiast łańcuchy były blisko siebie,
tworzyły ze sobą splątany kłębek na powierzchni, ale dostęp do polistyrenu również nie był
zakłócony.
Rysunek 10. Hipotetyczne przedstawienie adsorpcji jonów buforu na powierzchni
polistyrenu, z lewej - obraz po optymalizacji układu, z prawej – hipotetyczna dwuwarstwa
cząsteczek buforu wyjaśniająca zwalnianie EOF i jego odwrócenie przy niskich wartościach
pH, według H9.
Można zatem stwierdzić, że dzięki adsorpcji jonów buforu (z udziałem wody) utworzył
się swoisty wymieniacz jonowy. Spowolnienie przepływu, a nawet jego odwrócenie w serii
eksperymentów „w dół” wytłumaczyć można zaadsorbowaniem się jonów buforu o przeciwnym
ładunku, czyli zawierających grupę aminową (np. BICINE na TAPS lub MES). Schematycznie
zaproponowany mechanizm przedstawia rysunek 10.
Oprócz przedstawionych powyżej sposobów preparatyki i chemicznej modyfikacji
powierzchni, należy również wspomnieć o możliwości celowego, fizycznego kształtowania
powierzchni złóż monolitycznych do spełniania określonych celów analitycznych. Takie „szyte
na miarę” (tailored) materiały mogą mieć różną postać. Szczególnymi przypadkami są tu polimery
z odciskiem cząsteczkowym (pamięć kształtu i orientacji grup funkcyjnych) oraz tzw. materiały
o ograniczonym dostępie (RAM – restricted access media) charakteryzujące się selektywnością jeśli
chodzi o wielkość cząsteczek. Oba typy materiałów mogą być niezwykle użyteczne
w selektywnym izolowaniu biologicznie aktywnych substancji przeprowadzanych w mikroskali.
Materiały z odciskiem cząsteczkowym to materiały sorpcyjne zawierające w swojej
strukturze miejsca aktywne (cavities) o kształcie i rozmieszczeniu grup funkcyjnych
komplementarnych do cząsteczek, na które materiał ten ma być selektywny63. Większość
opisywanych we współczesnej literaturze materiałów to polimery (molecularly imprinted polymers –
MIPs), chociaż istnieje także znacząca liczba publikacji dotyczących preparatyki materiałów
krzemionkowych (molecularly imprinted silica – MISs), które, z historycznego punktu widzenia,
opracowano jako pierwsze (Polyakov, 193164). Materiały z odciskiem cząsteczkowym wytwarzane
są w ten sposób, że ich syntezę przeprowadza się w obecności związku, na który adsorbent ten
63
B. Sellergren (red.) Molecularly imprinted polymers: Man-made mimics of antibodies and their applications in analytical
chemistry, Elsevier, Amsterdam (2001).
64 M.V. Polyakov Adsorption properties and structure of silica gel Zhurnal fizicheskoi khimii 2 (1931) 799–804.
- 23 -
Załącznik 3A
ma być selektywny. Po syntezie, po usunięciu takiego szablonu w materiale zostają miejsca
selektywne na szablon lub cząsteczki podobne (np. takie, których fragment będzie tożsamy,
w sensie wzajemnej orientacji grup funkcyjnych, z szablonem)65. Wśród współczesnych metod
preparatyki MIPów wyróżnić można trzy najważniejsze sposoby:
• podejście kowalencyjne – przeprowadza się syntezę szablonu z monomerami
funkcyjnymi i taki tymczasowy kompleks poddaje polimeryzacji w odpowiednich
warunkach (rozpuszczalnik, monomer sieciujący), po czym hydrolizuje
tymczasowe wiązania i wypłukuje szablon. Chociaż sposób ten daje
najdoskonalsze odwzorowania szablonu, nie zawsze jest możliwy do
przeprowadzenia66.
• materiały z grupami chelatującymi – do polimeru wiązany jest kompleks metalu,
który wspomaga późniejsze rozdzielanie enancjomerów67.
• podejście niekowalencyjne – najczęściej stosowane, polega na dodatku do
mieszaniny polimeryzacyjnej szablonu, który po polimeryzacji usuwa się
(wypłukuje). Kształt i orientacja grup funkcyjnych w miejscach aktywnych
polimeru są efektem oddziaływań monomerów funkcyjnych z szablonem:
odziaływań jon-jon, jon-dipol, dipol-dipol, wiązania wodorowe.
Chociaż w przypadku wielu związków możliwe jest wytworzenie skutecznych,
selektywnych MIP, to jest to często związane z występowaniem odpowiedniej ilości i lokalizacją
w cząsteczce grup funkcyjnych, co pozwoli na rozróżnienie danego analitu od związków
podobnych (np. rozróżnienie izomerów optycznych). Przykładem związków o niewielkiej różnicy
strukturalnej, ale wykazujących odmienne działanie biologiczne i stosowanych do różnych celów
farmaceutycznych są 17-α-estradiol i 17-β-estradiol.
Rysunek 11. Różnice w strukturach 17-α-estradiolu (po lewej) i 17-β-estradiolu (po prawej).
Dla uproszczenia nie uwidoczniono atomów wodoru.
Anality te różnią się położeniem grupy hydroksylowej i atomu wodoru przy atomie węgla
o lokancie 17. Postanowiłem sprawdzić, czy synteza MIP z użyciem jednego z tych analitów jako
szablonu pozwoli na uzyskanie materiału zdolnego do rozróżnienia tej subtelnej różnicy
65 G. Vasapollo, R.D. Sole, L. Mergola, M.R. Lazzoi, A. Scardino, S. Scorrano, G. Mele Molecularly imprinted polymers:
present and puture prospective, International Journal of Molecular Sciences 12 (2011) 5908-5945.
66 H. Yan, K. Row Characteristic and synthetic approach of molecularly imprinted polymer, International Journal of Molecular
Sciences 7 (2006) 155-178.
67 Y. Fujii, K. Matsutani, K. Kikuchi Formation of a specific co-ordination cavity for a chiral amino acid by template synthesis of a
polymer Schiff base cobalt(III) complex, J. Chem. Soc., Chem. Commun. (1985) 415-417.
- 24 -
Załącznik 3A
w strukturze. W publikacji H1 opisałem syntezę monolitycznej polimerowej fazy stacjonarnej
z odciskiem cząsteczkowym 17-β-estradiolu. Podczas badań przetestowano dużą liczbę mieszanin
polimeryzacyjnych bazujących na kwasie metakrylowym jako monomerze funkcyjnym i EDMA
lub TRIM jako monomerach sieciujących oraz szerokiej gamie roztworów porotwórczych.
Doświadczenie praktyczne wyniesione z tych eksperymentów pozwoliło mi na sformułowanie
trzech kolejnych kroków wyboru roztworu porotwórczego:
a) musi być zapewniona pełna mieszalność wszystkich składników
(monomery+roztwór porotwórczy+szablon).
b) jeśli punkt a) był spełniony, przeprowadzano wstępne polimeryzacje we fiolkach
o pojemności ok. 3 mL. W idealnym przypadku objętość powstałego polimeru
powinna być mniej więcej równa objętości użytej mieszaniny polimeryzacyjnej
(monomery+roztwór porotwórczy+szablon). Świadczyło to o tym, że polimer nie
nie osiada podczas polimeryzacji.
c) trzecim kryterium była obserwacja górnej części polimeru we fiolce. Jeśli
widoczny był „szklisty” nieporowaty polimer, sugerowało to, że polimer mógł
powodować zapychanie kapilary, z uwagi na brak homogenności. Rzeczywiście,
podczas polimeryzacji występowała dużą zbieżność tej obserwacji
z wytwarzaniem kolumn nieprzepuszczalnych (zapchanych).
Z przetestowanych mieszanin warunki powyższe spełniło siedem, z których jedna,
zawierająca kwas metakrylowy i TRIM w stosunku molowym 1:2 i toluen jako roztwór
porotwórczy, zapewniła otrzymanie przepuszczalnego złoża monolitycznego. Otrzymane
w warunkach CEC elektrochromatogramy pozwoliły na stwierdzenie, że nie jest co prawda
możliwe rozdzielenie mieszaniny obu badanych związków, natomiast zadozowane osobno
wykazywały zauważalnie różną retencję (Rysunek 12).
Rysunek 12. Schemat syntezy monolitycznego MIP na bazie 17-β-estradiolu jako szablonu
(po lewej) oraz różnice retencji 17-α-estradiolu i 17-β-estradiolu (po prawej) w warunkach
CEC. Warunki rozdzielania: Leff = 25 cm, Ltot = 33.5 cm, U = 25 kV, dozowanie 14 kV·s, faza
ruchoma 70/30 ACN/Tris pH = 8.0, c = 10 mM, według H1.
Materiały z odciskiem cząsteczkowym mogą być wykorzystywane w zastosowaniach
wymagających wysokiej selektywności analitów bardzo do siebie podobnych, np. enencjomerów.
- 25 -
Załącznik 3A
Jednak w wielu zadaniach analitycznych, w których oznacza się substancje biologicznie aktywne,
np. w płynach ustrojowych, dużo większe znaczenie ma oczyszczenie takiej matrycy od
przeszkadzających związków wielkocząsteczkowych, takich jak białka. Jednocześnie, przed
właściwym oznaczaniem anality należy zagęścić w celu zwiększenia ich stężenia powyżej granicy
wykrywalności aparatu pomiarowego. Szczególne znaczenie ma to w przypadku stosowania
elektroforezy kapilarnej lub innych miniaturowych technik analitycznych, w których wykorzystuje
się spektroskopowe metody detekcji, takie jak np. pomiar absorbancji w zakresie UV-Vis. Krótka
droga optyczna (średnica wewnętrzna kapilary, czyli 25-75 µm) powoduje, że uzyskiwane czułości
nie należą do najwyższych68. Aparat do elektroforezy kapilarnej, ze względu na możliwość
automatyzacji procesu rozdzielania i znikome zużycie odczynników koniecznych do analizy oraz
brak konieczności stosowania kolumn wypełnionych fazą stacjonarną jest dobrą bazą do
zbudowania prostego układu do oczyszczania-zagęszczania-oznaczania substancji biologicznie
aktywnych, np. leków, w relatywnie skomplikowanej matrycy jaką jest osocze. Bazując na danych
litaraturowych69,70,71, w publikacji H872 zaproponowałem zbudowanie układu, w którym
przyłączone do kapilary separacyjnej krótkie złoże (pełniące rolę mikrokolumienki SPE)
służyłoby do zagęszczania analitów przed właściwym rozdzielaniem CE. W układzie tym, jako
kapilarną kolumienkę SPME zastosowaliśmy monolityczny polimer typu RAM (restricted access
media). Materiały tego typu służą do zatrzymywania w przepływie (w celu wyizolowania) analitów
o niewielkich masach cząsteczkowych, podczas gdy anality o cząsteczkach większych nie są przez
to złoże zatrzymywane73,74. Aby proces taki miał miejsce, ścianki małych porów polimeru RAM
powinny charakteryzować się wysokim powinowactwem (np. wysoką hydrofobowością) do
analitów, natomiast powierzchnia zewnętrzna polimeru powinna być wybitnie hydrofilowa, co
uniemożliwi adsorpcję białek. Układ in-line SPME-CE, przedstawiony na rysunku 13,
zastosowany został do izolowania z surowicy składników aktywnych (leków) z preparatu
NeoCitramonum zawierającego kofeinę, paracetamol i kwas acetylosalicylowy. Dla porównania
efektywności działania RAM, próbę izolowania i oczyszczania przeprowadzono również
z zastosowaniem monolitycznego złoża o hydrofobowej powierzchni (SPME-RP). Aby uniknąć
adsorpcji białek i spowolnić przepływ elektoosmotyczny, wewnętrzne powierzchnie kapilar
kwarcowych do CE powleczone zostały hydrofilowym polimerem poliHEMA w dwuetapowej
procedurze modyfikacji. Izolowanie i oznaczenie leków przebiegało następująco: zmontowano
układ kapilar wraz z kolumienką i umieszczono w aparacie do CE, kapilary przepłukano kolejno
metanolem i buforem separacyjnym (5mM boran-foforan pH 8.5). Następnie przy ciśnieniu 4 bar
przez 1 minutę przez kapilarę przepuszczano próbkę, po czym przepłukano układ buforem
separacyjnym przy tym samym ciśnieniu przez 5 minut w celu wypłukania składników matrycy.
68
M. Szumski Aparatura w: B. Buszewski, E. Dziubakiewicz i M. Szumski (red.) Techniki elektromigracyjne – teoria
i praktyka, Wydawnictwo Malamut, (2012) Warszawa, s. 45-93.
69 N.A. Guzman, M.A. Trebilcock, J.P. Advis The use of a concentration step to collect urinary components separated by capillary
electrophoresis and further characterization of collected analytes by mass spectrometry, J. Liq. Chromatogr. 14 (1991) 997-1015.
70 M. Dong, R.P. Oda, M.A. Strausbauch, P.J. Wettstein, J.P. Landers, L.J. Miller Hydrophobic peptide mapping of clinically
relevant heptathelical membrane proteins by capillary electrophoresis, Electrophoresis 18 (1997) 1767-1774.
71 A.J. Tomlinson, L.M. Benson, N.A. Guzman, S. Naylor Preconcentration and microreaction technology on-line with capillary
electrophoresis, J. Chromatogr. A 744 (1996) 3-15.
72 [H8] R. Jarmalavičienė, M. Szumski, O. Kornyšova, E. Kłodzińska, D. Westerlund, S. Krawczyk, D. Mickevičius,
B. Buszewski, A. Maruška Coupling of solid-phase microextraction continuous bed (monolithic) capillaries with capillary zone
electrophoresis for direct analysis of drugs in biological fluids, Electrophoresis 29 (2008) 1753-1760.
73 K. Boos, A. Rudolphi The use of restricted-access media in HPLC. 1. Classification and review, LC-GC 15 (1997) 602-611.
74 A. Rudolphi, K. Boos The use of restricted-access media in HPLC. 2. Applications, LC-GC 15 (1997) 811-823.
- 26 -
Załącznik 3A
Zaadsorbowane anality wyeluowane zostały 80% metanolem (2 bary przez 1 minutę), po czym
włączany był prąd (30 kV) i następowało rozdzielenie analitów. W związku z tym, że aparat do
elektroforezy kapilarnej ma możliwość jedynie przykładania ciśnienia, bez pomiaru przepływu,
wielkość tę ustalano wagowo, zbierając odciek z wylotu kapilary separacyjnej. W ten sposób
możliwe było ustalenie czasu i ciśnienia potrzebnych do przeprowadzenia kolejnych etapów
analizy oraz ustalenie objętości dozowanej próbki.
Rysunek 13. Schemat budowy układu in-line SPME-CZE ze złożem monolitycznym RAM
do izolowania substancji biologicznie aktywnych z osocza zawierającego białka (1)
i elektroforetycznego rozdzielania kofeiny (2), paracetamolu (3) i kwasu acetylosalicylowego
(4). Etapy procesu: A – dozowanie próbki, B – przepłukiwanie kapilar buforem separacyjnym
(usuwanie matrycy), C – elucja 80% metanolem, D – włączenie napięcia, według H8.
Wyniki izolowania i rozdzielania składników aktywnych NeoCitramonum przedstawione
są na elektroferogramach na rysunku 13. Zauważyć można, że anality nie zostały wykryte
w przypadku zastosowania samej CE, bez wstępnego zagęszczania próbki, natomiast
przy zastosowaniu kolumienek SPME-RP i SPME-RAM piki analitów są widoczne, co świadczy
o ich zatrzymaniu na użytych adsorbentach. Zasadniczą różnicą jest tu jednak przebieg linii
podstawowej, który jednoznacznie świadczy o tym, że z kolumienki SPME-RP wszystkie białka
nie zostały wypłukane podczas etapu przemywania i powoli desorbowały się z polimeru podczas
etapu rozdzielania. W przypadku SPME-RAM nastąpiło całkowite pozbycie się matrycy
ze względu na brak powinowactwa białek do tego typu materiału sorpcyjnego. Zastosowanie
krótkiej kolumienki RAM pozwoliło na 1000-krotne obniżenie granicy wykrywalności analitów
w stosunku do samej analizy CE (przykładowo, dla kofeiny LODCE= 0.3 µg/mL, LODSPME-RAM/CE
= 0.3 ng/mL).
Pewną niedogodnością wytwarzania polimerowych materiałów sorpcyjnych (nie tylko
monolitycznych, ale także ziarnistych) o pożądanej porowatości i właściwościach
powierzchniowych jest to, że w większości przypadków dąży się do syntez jednoetapowych, a to
może powodować problemy ze znalezieniem odpowiedniego rozpuszczalnika porotwórczego.
Jednym z opisanych przeze mnie rozwiązań może być modyfikacja powierzchni poprzez, np.
szczepienie. Z drugiej strony, w celu wytworzenia polimerowej fazy można wykorzystać gotowe
nośniki, np. polimerowe albo krzemionkowe. Zaletą stosowania jest dostępność żeli
krzemionkowych o idealnie sferycznym kształcie cząstek, wąskim rozkładzie średnich średnic
- 27 -
Załącznik 3A
ziaren oraz wymaganej wielkości porów. Można stwierdzić bez wielkiej przesady, że modyfikacja
krzemionki rozmaitymi ligandami jest podstawą nowoczesnej chromatografii cieczowej.
Jedną z metod modyfikacji krzemionki, prowadzącą do utworzenia chemicznie
związanych faz stacjonarnych jest przyłączanie chloro- lub alkoksysilanów z wytworzniem wiązań
Si-O-C, które może być, niestety, niestabilne hydrolitycznie. Dużo bardziej stabilne jest
bezpośrednie połączenie Si-C. Modyfikację tego typu uzyskuje się stosując np. odczynniki
Grignarda75 albo opracowaną przez Peseka i Sandovala reakcję hydrosilylacji76,77. Trwałe wiązanie
krzem-węgiel może być szczególnie istotne w chromatografii oddziaływań hydrofilowych
(HILIC), gdzie wymogiem jest utrzymanie wysokiej zawartości wody w chemicznie związanej
fazie. Wymóg ten może być spełniony np. przy zastosowaniu chemicznie związanych
z krzemionką hydrofilowych polimerów. Ponadto, w celu uzyskania dobrych własności
chromatograficznych ziarna nośnika powinny być pokryte homogenną, zarówno w jeśli chodzi
o pokrycie powierzchni, jak i grubość warstwy takiej fazy. Stosując „zwykłą polimeryzację”
wolnorodnikową w obecności nośnika trudno jest uzyskać taki efekt z tego względu,
że propagacja łańcucha zachodzić może również w roztworze, z dala od powierzchni krzemionki.
Idealna sytuacja byłaby wtedy, gdyby każdy łańcuch polimerowy musiał zaczynać propagację
od powierzchni nośnika i wyeliminowane zostałyby propagacje w roztworze. Rozwiązaniem
mogłoby być zastosowanie polimeryzacji rodnikowej z przeniesieniem atomu (ATRP – atomtransfer radical polymerization) opracowanej przez Matyjaszewskiego i będącej przykładem
polimeryzacji żyjącej78.
Rysunek 14. Schemat polimeryzacji ATRP zastosowanej do przyłączenia polimeru (w tym
przypadku metakrylanu glicydylu) do powierzchni krzemionki, z utworzeniem wiązania Si-C.
według H3.
75
J.E. Lim, C.B. Shim, J.M. Kim, B.Y. Lee, J.E. Yie Dehydroxylation route to surface modification of mesoporous silicas by using
Grignard reagents, Angew. Chem. Int. Ed. 43 (2004) 3839-3842.
76 J.E. Sandoval, J.J. Pesek Synthesis and characterization of a hydride-modified porous silica material as an intermediate in the
preparation of chemically bonded chromatographic stationary phases, Anal. Chem. 61 (1989) 2067-2075.
77 J.E. Sandoval, J.J. Pesek Hydrolytically stable bonded chromatographic phases prepared through hydrosilylation of olefins
on a hydride-modified silica intermediate, Anal. Chem. 63 (1991) 2634-2641.
78 K. Matyjaszewski, J. Xia Atom Transfer Radical Polymerization, Chem. Rev. 101 (2001) 2921-2990.
- 28 -
Załącznik 3A
W ATRP wzrost łańcucha związany jest z odszczepieniem atomu chlorowca
z reaktywnego końca łańcucha, co prowadzi do utworzenia rodnika i przyłączenia kolejnego
meru. Jednak ten typ polimeryzacji charakteryzuje się tym, że szybkość inicjowania jest dużo
szybsza (przynajmniej o jeden rząd wielkości) od szybkości reakcji propagacji. Konsekwencją są
powolne, ale równomierne wzrosty łańcucha, co może być szczególnie użyteczne w preparatyce
materiałów chromatograficznych o homogennym pokryciu powierzchni nośnika. Co więcej,
dzięki powolnej reakcji propagacji, monomery mogą wnikać do porów fazy stacjonarnej i tam
pokrywać ją równomierną, kontrolowaną warstwą. Aby można było zastosować ATRP w tym
właśnie celu, polimeryzacja powinna startować z powierzchni krzemionki (Rysunek 14). Oznacza
to, że do żelu krzemionkowego należy przyłączyć atom np. chloru, od odszczepienia którego
mogłaby rozpocząć się polimeryzacja79,80. Zadanie to, z pozoru proste, okazało się niezwykle
trudne do wykonania. Długotrwałe niepowodzenia spowodowały, że na bazie doświadczeń
opisanych w publikacji H2 zaproponowałem przeprowadzenie modelowych badań z użyciem
kapilar kwarcowych, których modyfikację można było przeprowadzić w komorze rękawicowej,
co opisałem w publikacji H381. W pierwszym etapie należało ocenić, czy atom chloru przyłącza
się w ogóle do powierzchni krzemionki. W tym celu kapilary o średnicy wewnętrznej 1 mm
zostały pozbawione powłoki poliimidowej (poprzez pirolizę w temperaturze 600°C) po czym
poddałem je trawieniu według opisanej wyżej (publikacja H2) procedury E2. Po przemyciu ich
wodą dejonizowaną i acetonem suszyłem je przez 1 h w 120°C i natychmiast przekładałem do
szczelnie zakręcanych, również wygrzanych fiolek, tak, aby zminimalizować ich kontakt
z powietrzem w laboratorium. Fiolki z kapilarami umieściłem w komorze rękawicowej
wypełnionej azotem i zaopatrzonej w śluzę oraz wewnętrzny osuszacz zapewniający cyrkulację
atmosfery wewnętrznej. W komorze umieszczono również wszystkie narzędzia i odczynniki
potrzebne do dalszej pracy, w tym wagę analityczną i stolik do próbek do XPS. Do dwóch fiolek
zawierających po dwie kapilary każda wlałem dwie mieszaniny chlorujące: chlorek
tionylu/chloroform 1:1 oraz tetrahydrofuranowy roztwór zawierający 1% chlorku tionylu i 0.1%
DMF. Reakcję przeprowadzałem przez 4 h w temp. pokojowej, po czym po jednej kapilarze
skruszyłem i największe kawałki umieściłem na stoliku pomiarowym XPS. Stolik ten przeniosłem
do transportowego worka rękawicowego (glove bag) wypełnionego azotem przyłączając go
szczelnie do śluzy komory i przedmuchując te elementy azotem, tak aby uniknąć kontaktu
badanego materiału z powietrzem. Worek został następnie przyłączony do śluzy wejściowej
aparatu XPS, po czym w aparacie tym umieszczono stolik z preparatem. Wraz
z dr. Shchukarevem (Uniwersytet w Umeå) wykonaliśmy pomiary i wykryliśmy pasmo należące
do atomu chloru przyłączonego do krzemionki modyfikowanej mieszaniną tetrahydrofuranową.
W następnym etapie serię kapilar poddałem chlorowaniu i przeznaczyłem je do zmodyfikowania
metakrylanem glicydylu. Mieszanina polimeryzacyjna składała się z 10 mg Cu, 75 mg CuBr, 111
mg 2,2’-bipirydyny i 40 mL formamidu i 20 mL GMA (por. Rysunek 1). Czynności te również
wykonywałem w komorze rękawicowej. Mieszaninę tę rozdzieliłem do fiolek zawierających
79
F.J. Xu, Q.J. Cai, E.T. Kang, K.G. Neoh Covalent graft polymerization and block copolymerization initiated by the chlorinated
SiO2 (SiO2−Cl) moieties of glass and oriented single crystal silicon surfaces, Macromolecules 38 (2005) 1051-1054.
80 F.J. Xu, Q.J. Cai, E.T. Kang, K.G. Neoh Surface-initiated atom transfer radical polymerization from halogen-terminated
Si(111) (Si−X, X = Cl, Br) surfaces for the preparation of well-defined polymer−Si hybrids, Langmuir 21 (2005) 3221-3225.
81 [H3] P. Hemström, M. Szumski, K. Irgum Atom-transfer radical graft polymerization initiated directly from silica applied to
functionalization of stationary phases for high-performance liquid chromatography in the hydrophilic interaction chromatography mode,
Anal. Chem. 78 (2006) 7098-7103.
- 29 -
Załącznik 3A
chlorowane kapilary, szczelnie je zakręciłem i przeprowadziłem reakcję polimeryzacji przez czas
od 10 do 640 minut. Po określonym czasie reakcję zatrzymywałem otwierając fiolkę (wpuszczenie
tlenu), płukałem kapilary, suszyłem i poddawałem je badaniom XPS. Poniżej (Rysunek 15)
przedstawiłem widmo fotoelektronowe dla kapilary chlorowanej i zmodyfikowanej GMA. Z
danych XPS dr Shchukarev wyznaczył grubości warstw polimerowych otrzymanych w różnym
czasie prowadzenia polimeryzacji. Dane te stały się podstawą do dalszego postępowania podczas
modyfikacji żelu krzemionkowego chlorkiem tionylu oraz preparatyki faz stacjonarnych
modyfikowanych GMA i innymi monomerami. Przykładowe rozdzielenie toluenu uracylu
i cytozyny na złożu poliGMA przed i po hydrolizie pierścienia epoksydowego pokazano
na rysunku 15. Przeprowadziłem również eksperymenty dotyczące wpływu dodatku miedzi
do mieszaniny polimeryzacyjnej, co pozwoliło na modyfikację pierwotnych procedur
polimeryzacyjnych. Dla krzemionki modyfikowanej GMA przeprowadzono różnicową analizę
grawimetryczną oraz wyznaczono powierzchnię właściwą metodą niskotemperaturowej
adsorpcji-desorpcji azotu. Zaobserwowaliśmy w tym wypadku spadek tego ostatniego parametru
z pierwotnych 165 m2/g do 95 m2/g.
Grubości warstw:
10 min - 6.5 A
20 min - 16.2 A
40 min - 13.5 A
80 min - 13.7 A
160 min - 14.2 A
320 min - 20.2 A
640 min - 27.6 A
Rysunek 15. Widma XPS kapilary kwarcowej chlorowanej i modyfikowanej GMA,
wyznaczone z XPS grubości warstw (z lewej). Rozdzielenie toluenu, uracylu i cytozyny
na niehydrolizowanej (grupy epoksydowe) oraz hydrolizowanej (grupy 2,3-propandiolowe)
fazie poliGMA. Warunki: kolumna 150x2.1 mm, faza ruchoma 80/20 ACN/25 mM octan
amonu, F = 0.15 mL/min, według H3.
Podstawową różnicą między ziarnistymi, pakowanymi złożami a monolitycznymi jest
sposób rozmieszczenia materiału fazy stacjonarnej w przekroju kolumny. W kolumnach
klasycznych wyróżnić można trzy regiony o różnej homogenności ułożenia ziaren, z których
najważniejszy jest region centralny, w którym zachodzi separacja82,83. Aby uniknąć efektów
przyściennych zaproponowano stosowanie „kolumn o nieskończenie wielkiej średnicy”, w
których jedynie znikoma część próbki osiągnąć może region przyścienny. Kolumny kapilarne
82
J.H. Knox, G.R. Laird, P.A. Raven Interaction of radial and axial dispersion in liquid chromatography in relation to the “infinite
diameter effect”, J. Chromatogr. A 122 (1976) 129-145.
83 J.H. Knox, J.F. Parcher Effect of the column to particle diameter ratio on the dispersion of unsorbed solutes in chromatography,
Anal. Chem. 41 (1969) 1599-1606.
- 30 -
Załącznik 3A
pakowane o średnicach mniejszych niż około 200 µm uważane są za kolumny luźno pakowane
(ma na to wpływ stosunek średnicy kolumny do średnicy ziaren) charakteryzujące się raczej
losowym niż homogennym ułożeniem ziaren. Pod tym właśnie względem złoża monolityczne
podobne są do pakowanych kolumn kapilarnych z tym, że w złożach monolitycznych pory
przepływowe mogą być równe lub większe od średnicy jednostki strukturalnej tworzącej fazę
stacjonarną
(por. rysunek 1)84. Po syntezie monolitycznych polimerowych materiałów do chromatografii
poddaje się je charakterystyce. W związku z tym że materiały monolityczne z założenia powinny
charakteryzować się tzw. bimodalną strukturą porów (duże pory przepływowe i wewnętrzna
struktura mezoporowata globul) najczęściej stosuje się następujące techniki85,86,:
• wyznaczanie powierzchni właściwej (SBET) – niskotemperaturowa adsorpcjadesorpcja azotu;
• wyznaczanie rozkładu porów – porozymetria rtęciowa (MIP – mercury intrusion
porosimetry);
• wyznaczanie rozkładu porów w warunkach chromatograficznych – odwrócona
chromatografia wykluczania (ISEC);
• skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM);
• mikroskopia sił atomowych (AFM);
• charakterystyka chromatograficzna (przepuszczalność, sprawność, rozdzielczość,
symetria pików).
Większość z tych metod jest szeroko akceptowana wśród badaczy, aczkolwiek nie są one
pozbawione pewnych zasadniczych wad. Pierwszym i najważniejszym problemem jest to,
że zakłada się identyczność porowatości materiału monolitycznego zsyntetyzowanego w kapilarze
kwarcowej, a więc w małej skali, i materiału wytworzonego w skali makroskopowej (bulk sample),
np. we fiolce, wykorzystując niezużytą mieszaninę polimeryzacyjną. Chromatograficzną metodą
wyznaczania rozkładu porów jest odwrócona chromatografia wykluczania (ISEC - inverse sizeexclusion chromatography), w której wykorzystuje się serię wzorców z reguły polistyrenowych o
szerokim zakresie mas cząsteczkowych. Z wyznaczonych parametrów retencji wyznaczyć można
rozkład porów, ale w pewnym określonym zakresie ok. 1 ÷ 700 nm, z zależności od dostępnych
wzorców i ich jakości – mała polidyspersja). Ponadto, tetrahydrofuran, który używany jest w
ISEC jako faza ruchoma może powodować pęcznienie niektórych polimerów, przez co wyniki
mogą być obarczone błędem.
Dobrym sposobem oceny danej kapilary monolitycznej mogłaby być obserwacja jej
przekroju i dokonanie pomiarów odległości między globulami. Teoretycznie można próbować
wykonać takie pomiary wykorzystując obraz SEM, pamiętać jednak należy, że nie zawsze można
wyodrębnić w prawidłowy sposób odległości między globulami polimeru. Ponadto, obraz SEM
często zależy od tego w jaki sposób zostanie przełamana kapilara z monolitem w środku (kolumn
84
P. Gzil, N. Vervoort, G.V. Baron, G. Desmet A computational study of the porosity effects in silica monolithic columns, J.
Sep. Sci. 27 (2004) 887-896.
85 H. Guan-Sajonz, G. Guiochon, E. Davis, K. Gulakowski, D.W. Smith Study of the physico-chemical properties of some
packing materials: III. Pore size and surface area distribution, J. Chromatogr. A 773 (1997) 33-51.
86 D.S. Peterson, T. Rohr, F. Svec, J.M.J. Fréchet Enzymatic microreactor-on-a-chip: protein mapping using trypsin immobilized
on porous polymer monoliths molded in channels of microfluidic devices, Anal. Chem. 74 (2002) 4081-4088.
- 31 -
Załącznik 3A
kwarcowych nie przecina się, a nacina, tworzy rysę i przełamuje jak szkło). Wpadłem więc na
pomysł, aby obserwacji i pomiarom poddać płaski „plasterek” złoża monolitycznego, czego
rezultatem jest publikacja H487. Ze względu na wielkość obserwowanych obiektów obserwacja
powinna wykorzystywać technikę transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Technika ta jest znana
i stosowana nie tylko w badaniach biologicznych, histologicznych ale także polimerów i
kompozytów polimerowych88. Była także stosowana do obserwacji (ale bez dalszych pomiarów
ilościowych) np. wymieniaczy jonowych. Hipotetycznego „plasterka” monolitu oczywiście nie
można wytworzyć, ponieważ w strukturze, jak wspomniano wyżej, więcej jest często porów
przepływowych niż fazy stacjonarnej (globul). Ponadto globule monolitu byłyby niewidoczne w
TEM bez wybarwienia. Tak więc zaproponowana przeze mnie metodyka powinna obejmować
następujące etapy:
• wybarwienie w celu zwiększenia kontrastu (zwiększenie gęstości elektronowej);
• utrwalenie struktury kapilarnego złoża monolitycznego w żywicy;
• usunięcie kapilary kwarcowej (HF) i pozostawienie samego monolitu;
• zatopienie monolitu w większym bloku żywicy;
• cięcie mikrotomem skrawków bloku z monolitem;
• obserwacja TEM;
• obróbka obrazu;
• pomiary odległości między globulami, obliczenie porowatości.
W pierwszym etapie poszukiwałem metody zatopienia w żywicy monolitu znajdującego
się w kapilarze kwarcowej. Po kilku próbach wybrałem żywicę Spurr typu „twardego”
(testowałem również żywicę LR White), którą, ze względu na porowatość próbki, należało
wtłaczać pod wysokim ciśnieniem. Wykorzystano tu pompę do HPLC, która tłocząc wodę
wpychała żywicę znajdującą się w rezerwuarze (długi odcinek kapilary o dc = 1 mm)
do przyłączonej do niej kolumny monolitycznej. Zestaw ten pokazałem na rysunku 16.
pompa
rezerwuar
z żywicą
kolumna
monolityczna
rezerwuar
z żywicą
kolumna
monolityczna
Rysunek 16. Układ do zatapiania kapilarnej kolumny monolitycznej w żywicy, wykorzystany
w badaniach do publikacji [H4].
87
[H4] J. Courtois, M. Szumski, F. Georgsson, K. Irgum Assessing the macroporous structure of monolithic columns
by transmission electron microscopy, Anal. Chem. 79 (2007) 335-344.
88 M. Ganter, J. Kressler, W. Heckmann, N. Higashida, T. Inoue TEM study of block copolymers confined in thin films,
Polymer 36 (1995) 4167-4171.
- 32 -
Załącznik 3A
Kolejnym etapem było znalezienie sposobu zwiększania kontrastu89. Początkowo
kolumny przepłukiwałem roztworami substancji zazwyczaj stosowanymi do tego celu, tj.
czterotlenkiem osmu, czerwienią rutenową i kwasem fosforowolframowym. Metody
przepłukiwania były jednak długotrwałe, a uzyskany kontrast był niezadowalający. Stwierdziłem
wtedy, że dobrym wyjściem byłoby dodanie środka kontrastującego bezpośrednio do mieszaniny
polimeryzacyjnej i zaproponowałem dodatek metakrylanu ołowiu. Odczynnik ten nie był
dostępny w handlu, więc bazując na patencie90 przeprowadziłem jego syntezę, która opisana jest
szczegółowo w publikacji H4. Metakrylan ołowiu (Pb(MA)2) jest łatwo mieszalny z wieloma
monomerami, więc użycie go było bardzo wygodne. Jednak jako dodatkowy monomer sieciujący
w układzie, spowodował on zmniejszenie się wielkości uzyskanych porów i globul, co pokazuje
rysunek 17.
Ru red
Pb(MA)
2
100 µm
Rysunek 17. Porównanie kontrastowania czerwienią rutenową i metakrylanem ołowiu. W tym
drugim przypadku widoczne jest znaczne zmniejszenie wielkości globul i porów. Po prawej –
obraz TEM przekroju monolitu o średnicy 100 µm. Widoczna jest przyścienna warstwa
polimeru, o której mowa była w publikacji H2. Obrazy wykonano podczas badań
rozwojowych do publikacji [H4].
Drugim sposobem kontrastowania był dodatek metakrylanu ołowiu do żywicy (w ilości
1.8%). Uzyskany obraz przedstawiał jasne plamy globul monolitu na ciemnym tle. Ta metodyka
została zastosowana w dalszej części badań. Do eksperymentów zsyntetyzowano serię złóż
monolitycznych charakteryzujących się różną porowatością i bazując na opracowanej metodyce
wykonano serię obrazów TEM. Otrzymane obrazy poddano obróbce w programie Corel PhotoPaint, aż uzyskano czarno-białe obrazy, tak, że czarne elementy reprezentowały globule
polimeru. Obrazy te wykorzystano w pomiarach porowatości (tę część wykonał dr Fredrik
Georgsson, Uniwersytet w Umeå, Instytut Informatyki). Pomiary takie polegały na wyznaczeniu,
z losowo wybranych miejsc obrazu (miejsc „pustych”, białych, reprezentujących pory) wektorów,
a dwa wektory o przeciwnych zwrotach osiągające czarne punkty (reprezentujące jednostkę
strukturalną monolitu) stanowiły cięciwę czyli „średnicę poru”. Odrzucane były te cięciwy, które
89
C. Martin, J. Coyne, G. Carta Properties and performance of novel high-resolution/high-permeability ion-exchange media for
protein chromatography, J. Chromatogr. A 1069 (2005) 43-52.
90 S. Besecke, G. Schroder, W. Ude, E. Baumgartner patent DE322427, 1984.
- 33 -
Załącznik 3A
trafiały w brzeg obrazu, jako że nie niosły za sobą żadnej użytecznej informacji. Wstępnie w
danym obrazie zadawano wyprowadzenie 180000 cięciw z 10000 punktów, ale ocena zbieżności
średniej długości cięciw i ich odchylenia standardowego w funkcji ilości cięciw, pozwoliły na
stwierdzenie, że wielkości te nie zmieniają się po zastosowaniu ok. 20000 cięciw, co stanowiło ok.
1200 punktów. Rysunek 18 przedstawia schemat postepowania z obrazem [H4].
Rysunek 18. Schemat postepowania podczas pomiarów porowatości z użyciem TEM, oraz
korelacja między zaproponowaną metodą a porozymetrią rtęciową, według [H4].
Uzyskane zaproponowaną metodą dane bardzo dobrze korelują z danymi uzyskanymi za pomocą
porozymetrii rtęciowej, co pokazuje rysunek 18 z tym, że wyniki uzyskane za pomocą TEM są
dwukrotnie większe. Różnica ta wynikać może z faktu, że w porozymetrii rtęciowej obliczenie
średnicy porów jest obliczane w oparciu o równanie Washburna, które zakłada istnienie idealnie
cylindrycznych porów, co oczywiście nie ma miejsca w złożu monolitycznym i wielu innych
materiałach. W badaniach nad szkłami porowatymi Gille i współ.91 również uzyskali wyniki
porowatości różne dla porozymetrii rtęciowej i małokątowego rozpraszania promieni
rentgenowskich (SAS) i różnica ta także stanowiła dwukrotność, podobnie jak w naszym
przypadku. Inni autorzy, np. Guan-Sajonz i współ.85 zauważyli znaczące rozbieżności między
rozkładem wielkości porów uzyskanym za pomocą MIP (próbka makroskopowa) i ISEC (pomiar
chromatograficzny). Można również przypuszczać, że podczas porozymetrii rtęciowej następuje
kruszenie słabszych struktur polimerowych, jak np. materiały typu polyHIPE92. Wyjaśnienie tych
różnic wykracza jednak znacząco poza tematykę rozważań nad polimerowymi materiałami
do chromatografii, co jest tematem przewodnim niniejszego osiągnięcia naukowego.
W 2010 roku przyznano mi grant badawczy MNiSW na badania związane z izolowaniem i
oznaczaniem mykotoksyn za pomocą miniaturowych technik separacyjnych. Podczas realizacji
grantu zaprojektowałem i zbudowałem od podstaw, wykorzystując dostępne części
optomechaniczne, detektor LIF (laser induced fluorescence) przeznaczony do wykrywania aflatoksyn
91
W. Gille, D. Enke, F. Janowski Pore Size Distribution and Chord Length Distribution of Porous VYCOR Glass (PVG), J.
Porous Mater. 9 (2002) 221-230.
92 P. Krajnc, N. Leber, D. Štefanec, S. Kontrec, A. Podgornik Preparation and characterisation of poly(high internal phase
emulsion) methacrylate monoliths and their application as separation media, J. Chromatogr. A 1065 (2005) 69-73.
- 34 -
Załącznik 3A
w kapilarnej komórce pomiarowej. Detektor ten stał się częścią układu mikro-SPE/nanoLC/LIF umożliwiającego izolowanie i rozdzielanie aflatoksyn. W układzie tym zastosowałem
kapilarne kolumienki ekstrakcyjne (mikro-SPE) w połączeniu on-line z kapilarną chromatografią
cieczową. Dzięki zastosowaniu zaworu dziesięciodrożnego możliwe było takie poprowadzenie
strumieni cieczy, że detektor LIF rejestrował najpierw eluat z kolumny mikro-SPE podczas
procesu izolowania (obserwacja ewentualnego przebicia kolumienki) a następnie, po zmianie
pozycji zaworu, rozdzielanie analitów na kolumnie nanoLC. Detektor ten skonstruowany został
jako układ współliniowy z kwarcową soczewką kulistą skupiającą wiązkę lasera wzbudzającego w
kapilarze kwarcowej, stanowiącej komórkę pomiarową. Udoskonalanie różnych elementów tego
układu detekcyjnego było niezwykle czasochłonne (w zasadzie układ ten jeszcze w chwili obecnej
nie spełnia wszystkich moich oczekiwań), ale w końcowym efekcie udało się zredukować
znacząco poziom tła tego detektora oraz wielkość szumów. Jednym z udoskonaleń było
opracowanie komórki pomiarowej w postaci kapilary kwarcowej pokrytej częściowo z zewnątrz
warstwą lustra srebrnego (reakcja Tollensa) jako „reflektora” promieniowania. Zamierzeniem
było zwiększenie ilości promieniowania wzbudzającego (poprzez wielokrotne odbicie wiązki
wzbudzającej) oraz skierowanie fluorescencji w kierunku detektora. Układ ten jest przedmiotem
zgłoszenia patentowego, a pozwolił na zwiększenie stosunku sygnału do szumu około 3x dla
aflatoksyny B1. Przy optymalnych ustawieniach skonstruowany detektor wykrył ilość 41 fg tego
analitu (przy dozowaniu 50 nL próbki). Podczas realizacji zadań grantu podjęliśmy się również
próby zsyntetyzowania polimerowych monolitycznych kolumienek kapilarnych z odciskiem
cząsteczkowym. W badaniach wykorzystywałem wspomniany wcześniej układ do
fotopolimeryzacji w kontrolowanych warunkach termicznych. Dużym problemem podczas
realizacji badań z układem nanoLC była słaba powtarzalność wyników, związana niestety z
brakiem stabilności temperatury w laboratorium. Dużą część badań należało powtórzyć w
klimatyzowanych laboratoriach grupy BioSEP w Interdyscyplinarnego Centrum Nowoczesnych
Technologii przy UMK. Publikacja z tego zakresu jest w końcowej fazie przygotowania.
Próbowałem również swoich sił w syntezie polimerowych złóż monolitycznych w
kapilarach kwarcowych z wykorzystaniem dwutlenku węgla w stanie nadkrytycznym jako
substancji porotwórczej. Podejście takie nie było przedmiotem wcześniejszych badań i mogłem
opierać się jedynie na skąpych danych literaturowych dotyczących syntezy dużych monolitów,
jednak nie nadających się do zastosowań praktycznych. Przeprowadzone przeze mnie badania
pozwalają stwierdzić, ze nadkrytyczny CO2 nie może stać się uniwersalnym roztworem
porotwórczym ze względu na relatywnie dużą rozpuszczalność polimeru (metakrylan butylu z
EDMA), co skutkuje wytworzeniem małych porów w polimerze. Sposób syntezy i aparat do jej
przeprowadzenia są przedmiotem zgłoszeń patentowych, a publikacja na ten temat jest w
recenzji. Powyższe zgłoszenia nie mogą być jeszcze uznane za opublikowane przed przyznaniem
ochrony patentowej.
W latach 2011-2013 zaangażowany byłem również we współredakcję dwóch pozycji
książkowych: Techniki elektromigracyjne – teoria i praktyka (Wydawnictwo Malamut) oraz jej wersji
angielskiej: Electromigration techniques – theory and practice (Wydawnictwo Springer). W książkach tych
byłem autorem oraz współautorem znaczących objętościowo rozdziałów dotyczących aparatury,
elektrochromatografii kapilarnej a także rozdziałów dotyczących separacji w układach
niewodnych i analizy jakościowej i ilościowej.
- 35 -
Załącznik 3A
Przeprowadzone badania oraz rezultaty uzyskane w prezentowanym cyklu publikacji
pozwalają na następujące podsumowanie mojego osiągnięcia:
• w dziedzinie preparatyki i zastosowań polimerowych materiałów do chromatografii:
o dokonałem przeglądu literaturowego dotyczącego preparatyki i zastosowań
monolitycznych faz stacjonarnych (H5, H6)
o zbadałem i porównałem powszechnie stosowane metodyki modyfikacji
wewnętrznych ścianek kapilar kwarcowych stosując proste (pomiar kąta zwilżania)
i zaawansowane techniki badawcze. Opracowałem praktyczny sposób oceny siły
wiązania polimeru do kapilary - test adhezji. W wyniku realizacji badań
potwierdziłem
wzrost
chropowatości
powierzchni
kapilary
przy
wysokotemperaturowym trawieniu wstępnym. Opracowane optymalne metodyki
silanizacji stosuję do dnia dzisiejszego oraz stosowali z powodzeniem studenci i
doktoranci z Katedry Chemii Środowiska i Bioanalityki (np. podczas modyfikacji
kapilar do elektroforezy kapilarnej) oraz z ośrodków zagranicznych (H1, H2).
o zbadałem wpływ temperatury na jakość kapilarnych kolumn monolitycznych
syntetyzowanych metodą fotopolimeryzacji. Samodzielnie zaprojektowałem i
częściowo zbudowałem zestaw do tego celu. Uzyskane wyniki sugerują, że
parametru tego nie można zaniedbać podczas syntezy i można go wykorzystać (w
pewnym stopniu) do kontrolowania własności monolitycznych faz
stacjonarnych(H10).
o w celu poprawy własności separacyjnych opracowałem sposób modyfikacji
powierzchni monolitycznych polistyrenowych faz stacjonarnych łańcuchami
oktadecylowymi przez szczepienie (stosując metakrylan oktadecylu) i porównałem
z modyfikacją metodą Friedla-Craftsa. Tak spreparowane złoża posłużyły do
rozdzielenia kwasów fenolowych oraz dwóch flawonów w warunkach
mikrochromatografii cieczowej i/lub elektrochromatografii (H7, H9).
o zsyntetyzowałem kapilarną kolumnę monolityczną z odciskiem cząsteczkowym
17-β-estradiolu. Przy okazji wykonywania badań sformułowałem ogólny schemat
wyboru roztworu porotwórczego (H1).
o opracowałem skuteczny sposób przeprowadzenia polimeryzacji ATRP na
powierzchni krzemionki. Przy okazji badań opracowałem sposób przygotowania
próbek kapilar kwarcowych do badań XPS (H3).
• w dziedzinie charakterystyki monolitycznych polimerowych faz stacjonarnych:
o przeprowadziłem badania przepływu elektroosmotycznego na kapilarnych
kolumnach polistyrenowych i zaproponowałem mechanizm zmiany prędkości
i kierunku przepływu przy niskich pH. Zaproponowałem badanie EOF, jako
dodatkowego parametru charakteryzującego polimerowe złoże monolityczne
zawierające lub nie grupy funkcyjne obdarzone ładunkiem (H9).
o przedstawiłem koncepcję badań porowatości metodą transmisyjnej mikroskopii
elektronowej oraz zaproponowałem i opracowałem od podstaw metodykę
przygotowania kolumn monolitycznych do tych pomiarów z wykorzystaniem
metakrylanu ołowiu, jako odczynnika kontrastującego (H4).
Toruń, 14 stycznia 2014 r.
- 36 -

Autoreferat - Wydział Chemii UMK

Transkrypt

Podobne dokumenty

wersja 03 – test – odpowiedzi

recenzjaisophon cassiano kolumny podłogowe

QBA AmpliQ2 A.O..indd