Badania laboratoryjne w diagnostyce neuroboreliozy

Badania laboratoryjne w diagnostyce neuroboreliozy

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2012 • Volume 48 • Number 2 • 205-211
Praca poglądowa • Review Article
Badania laboratoryjne w diagnostyce neuroboreliozy
Laboratory diagnostics of neuroborreliosis
Olga Martyna Koper, Joanna Kamińska, Halina Kemona
Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku
Streszczenie
Borelioza (choroba z Lyme) jest przewlekłą chorobą bakteryjną, której czynnikiem etiologicznym są krętki Borrelia burgdorferi
sensu lato. Jest zoonozą wywołującą zespoły kliniczne o bogatej i wielonarządowej symptomatologii. W Polsce terenem endemicznym występowania krętka jest obszar województwa podlaskiego i warmińsko - mazurskiego. U około 40% chorych na
boreliozę rozwijają się neurologiczne postacie choroby z Lyme. W przebiegu neuroboreliozy u około 15% chorych występuje
limfocytarne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych (meningitis). Współistnienie objawów meningitis, bolesnego zespołu korzeniowego oraz porażenia nerwów czaszkowych nosi nazwę zespołu Bannwarth’a. Znacznie rzadziej (u ok. 0, 1% chorych)
rozwija się zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego. Według zaleceń Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych Laboratoryjna diagnostyka neuroboreliozy powinna składać się z dwuetapowego protokołu diagnostycznego.
W pierwszym etapie należy stwierdzić obecność swoistych przeciwciał w klasie IgM lub IgG przeciw Borrelia burgdorferi
metodą immunoenzymatyczną. W drugim etapie badań u chorych z dodatnim lub wątpliwym wynikiem badań serologicznych
należy wykonać oznaczenie przeciwciał techniką Western- blot. Obserwowane wyniki fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie
mogą wynikać z: pobrania próbki zanim pojawią się przeciwciała lub będą one w ilości niewykrywanej przez test, powstawania
kompleksów immunologicznych, które nie mogą być wykryte metodą immunoenzymatyczną i reakcji krzyżowych w wyniku
koinfekcji. Uzupełnieniem serologicznej diagnostyki neuroboreliozy może być badanie ogólne oraz cytodiagnostyka płynu
mózgowo- rdzeniowego. Metodą, która pozwala stosunkowo wcześnie wykryć zakażenie Borrelia burgdorferi jest łańcuchowa reakcja polimerazowa (polymerase chain reaction- PCR). W ostatnich latach zwraca się również uwagę na rolę cytokin
w zakażeniu Borrelia burgdorferi oraz wykorzystanie ich w celu monitorowania przebiegu choroby.
Summary
Borreliosis (Lyme disease) is a chronic disease, caused by etiologic factors which are spirochaetes Borrelia burgdorferi sensu
lato. In Poland the endemic area of the occurrence of Borrelia lies in the Podlaskie and Warminsko- Mazurskie Provinces. Neurological forms of Lyme disease develop in about 40% of the patients suffering from Borrelia. Approximately 15% of patients
suffering from neuroborreliosis are affected with lymphocytic cerebrospinal meningitis (meningitis). Coexistence of meningitis
symptoms, painful radicular syndrome and cranial nerves paralysis is called Bannwarth syndrome. Myeloencephalitis develops much more rarely (in about 0, 1% of the patients). According to the recommendations of the Polish Society of Epidemiologists and Doctors of Infectious Diseases, laboratory diagnosis of neuroborreliosis should consist of a two-stage diagnostic
protocol. In the first stage there should be evaluated specific IgM and IgG antibodies against Borrelia burgdorferi with the use
of immunoenzimatic method. In the second stage, patients with positive or doubtful result of the previous examination should
be tested by a Western- blot method. Laboratory investigations of the sample taken before the occurrence of antibodies or
when their concentration is undetectable as well as the presence of immunologic complexes might lead to false- negative or
false- positive results. A general examination and the cytodiagnosis of cerebrospinal fluid might be used to complete serologic
diagnostics of neuroborreliosis. Polymerase chain reaction (PCR) is a method which can be used in an early detection of Borrelia burgdorferi infection. Recently attention has been paid to the role of cytokines in the disease monitoring.
Słowa kluczowe:laboratoryjna diagnostyka neuroboreliozy, neuroborelioza, płyn mózgowo-rdzeniowy
Key words:laboratory diagnosis of neuroborreliosis, neuroborreliosis, cerebrospinal fluid
Borelioza (krętkowica kleszczowa), zwana także chorobą
z Lyme (ang. Lyme disease, Lyme borreliosis) jest przewlekłą chorobą bakteryjną, której czynnikiem etiologicznym są
krętki Borrelia burgdorferi sensu lato, należące do rodziny
Spirochaetaceae [1, 2, 3]. Jest zoonozą wywołującą zespoły kliniczne o bogatej i wielonarządowej symptomatologii.
205
Badania laboratoryjne w diagnostyce neuroboreliozy
Głównym wektorem choroby są kleszcze Ixodes, przebywające w środowisku leśnym lub innych skupiskach drzew
i krzewów (Tabela I) [2, 4, 5]. W Europie dominującą postacią zakażenia tą bakterią jest neuroborelioza ośrodkowego
i obwodowego układu nerwowego [6, 7].
Tabela I
Gatunki kleszczy przenoszące krętki B. burgdorferi w regionach
świata.
jelit kleszczy. Borrelia burgdorferi, która swoją nazwę otrzymała od nazwiska odkrywcy, została uznana jako czynnik
patogenny odpowiedzialny za chorobę z Lyme występującą
w Stanach Zjednoczonych. Następnie bakterię tą wyizolowano również w Europie u chorych z podobną symptomatologią [5].
Rozpoznanie neuroboreliozy powinno opierać się o diagnozę kliniczną wynikającą z objawów wskazujących na zajęcie
ośrodkowego układu nerwowego oraz testy laboratoryjne
mające na celu wykrycie przeciwciał przeciw B. burgdorferi
w surowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym (PMR) [4, 8, 9].
Dodatkowym badaniem przydatnym w prawidłowym rozpoznaniu neuroboreliozy może być badanie płynu mózgowordzeniowego obejmujące ocenę parametrów fizycznych,
biochemicznych oraz pleocytozę wraz z cytodiagnostyką [9,
10]. Potrzebę poszerzania diagnostyki o dodatkowe badania tłumaczy fakt, iż wykonywane rutynowo w laboratoriach
testy serologiczne w kierunku (neuro) boreliozy często sprawiają trudności interpretacyjne, ponieważ odpowiedź immunologiczna w wyniku zakażenia jest zależna m.in. od fazy
choroby, lokalnej produkcji przeciwciał (np. tylko w płynie
mózgowo-rdzeniowym) a także niedoskonałości metod diagnostycznych [4, 7, 10]. Dokładny wywiad dotyczący pobytu
chorego na obszarze endemicznym z możliwością ekspozycji na ukłucie przez kleszcza również może być pomocny
w rozpoznaniu (neuro) boreliozy [11].
Epidemiologia neuroboreliozy
Dotychczas choroba z Lyme została opisana w ponad 50
krajach, głównie strefy klimatu umiarkowanego. Najwięcej
zachorowań diagnozuje się w Europie Wschodniej i Centralnej, Stanach Zjednoczonych, Azji Środkowej a także Japonii
[1, 5]. W Polsce terenem endemicznym występowania krętka jest obszar województwa podlaskiego oraz warmińsko
-mazurskiego [3, 13].
W USA najczęściej izolowanymi gatunkami u chorych są
B. burgdorferi sensu stricto. W Europie (w tym w Polsce)
u chorych z neuroboreliozą z płynu mózgowo- rdzeniowego (PMR) najczęściej izolowane są gatunki Borrelia garinii
(do 72%), Borrelia afzelii (do 28%) oraz Borrelia burgdorferi
sensu stricto (do 11%) [7]. Najsilniejsze właściwości neurotropowe wykazuje B. garinii [9].
Jak już wspomniano na wstępie, zmiany dotyczące układu
nerwowego w wyniku zakażenia B. burgdorferi częściej występują u chorych w Europie niż w Ameryce Północnej (USA)
[7, 14]. Coyle i wsp. podają, że postać neurologiczna rozwija
się u 15- 40% chorych na chorobę z Lyme [14]. Pancewicz
i wsp. w latach 1993-1995 przeprowadzili badania epidemiologiczne wykazując, że wśród hospitalizowanych w Klinice
Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku z powodu wszystkich postaci choroby
z Lyme 17% stanowili chorzy z neuroboreliozą [7]. Podobny
wynik uzyskali Czupryna i wsp. w badaniach przeprowadzonych 5 lat później (lata 2000- 2005), którzy wykazali zachorowalność na neuroboreliozę na poziomie 13% [15]. Zbliżone wyniki dotyczące zakażeń układu nerwowego przez
B. burgdorferi uzyskano także w innych krajach Europy: 16%
w Szwecji i 15% w Anglii [16, 17]. Z kolei Biletska i wsp.
podają, że na Ukrainie zajęcie układu nerwowego występuje
u 21 % zakażonych krętkiem B. burgdorferi [28].
Historia choroby z Lyme
Pierwsze opisy skórnej postaci tej choroby pojawiły się dopiero na początku XX wieku. Wtedy to Afzelius połączył wystąpienie rumienia wędrującego z ukłuciem przez kleszcza.
W 1941 roku Bannwarth opisał kliniczny zespół limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych z porażeniem
nerwów czaszkowych i również powiązał to z wcześniejszym ukąszeniem przez kleszcza [5]. Kolejne opisy tej choroby znaleźć można w połowie lat 70-tych. Dotyczyły one
grupy dzieci z miejscowości Old Lyme w stanie Connecticut
w Stanach Zjednoczonych (USA) z młodzieńczym zapaleniem stawów [1, 5, 12]. Poszukiwanie czynnika patogennego
doprowadziło do wyizolowania w 1983 roku przez Williego
Burgdorfera Gram ujemnego krętka z preparatów uchyłków
Budowa krętka Borrelia burgdorferi
Krętki Borrelia burgdorferi są to spiralne bakterie Gram
ujemne posiadające peryplazmatyczne wici umożliwiające
im ruch [1]. W swojej wegetatywnej postaci mają długość
8-22 μm i szerokość 0, 25 – 30 μm oraz tworzą około 3-10
zwojów [12]. W organizmie człowieka mogą występować
w formie: krętka o owalnej postaci bez ściany komórkowej
(forma L), w formie cysty oraz jako spory. Wszystkie te formy zachowują możliwość wzajemnej transformacji [19, 20].
W budowie B. burgdorferi na uwagę zasługuje trójwarstwowa, blaszkowa błona komórkowa. Ma ona niespotykaną budowę, gdyż łączy cechy bakterii G ujemnych i G dodatnich.
Podobnie, jak u bakterii Gram dodatnich błona komórkowa
jest ściśle powiązana z peptydoglikanową ścianą komórko-
REGION ŚWIATA
GATUNEK KLESZCZA
Europa (w tym Polska)
Ixodes ricinus
Azja
Ixodes persculatus
Ameryka Północna
Ixodes pacificus,
Ixodes scapularis
Bartosik- Psujek H, Belniak E, Mitosek- Szewczyk K. Problemy
neurologiczne w chorobach przenoszonych przez kleszczeaspekty kliniczne i diagnostyczne. Przegl Epidemiol 2002; 56 (1):
30- 37.
206
wą, co zapewnia jej płynność i labilność [3]. Nadaje to bakterii
unikalne cechy związane ze strukturą i funkcjami lipoprotein,
które stanowią znaczny odsetek wszystkich białek Borrelia.
Obecność lipoprotein na powierzchni komórki bakteryjnej
warunkuje charakter interakcji, w jakie wchodzi krętek w organizmie ssaka. Zajkowska i wsp. podają, że odgrywają one
rolę w adhezji, inwazji oraz mogą stać się celem odpowiedzi
odpornościowej gospodarza [3]. W ścianie komórkowej Borrelia burgdorferi jak dotąd badania nie wykazały natomiast
typowych lipopolisacharydów, charakterystycznych dla innych gatunków bakterii [3, 21].
Borrelia burgdorferi posiadają jeden liniowy chromosom
i pozachromosomalne DNA w formie liniowych i kolistych
plazmidów, które są odpowiedzialne za kodowanie białek
[1]. Dotychczas zidentyfikowano: białka powierzchniowe
Osp (ang. Outer surface protein): A, B, C, D, E, F, G; białko
o masie cząsteczkowej 41 kDa- flagellinę; białka o masie 58
i 66 kDa; białka szoku termicznego HSP (ang. heat shock
protein), grupę białek Vsps (ang. Variable small proteins)
oraz Vmps (ang. Variable major proteins) [3, 10]. Dalsze
badania pozwoliły na wyizolowanie białek o masie 22 kDa,
39 kDa, 55 kDa, 66 kDa, 66-73 kDa oraz 93 kDa. Niektóre z tych białek należą także do białek szoku termicznego
[21]. Zajkowska i wsp. zwracają uwagę na fakt, że białka
powierzchniowe B. burgdorferi skojarzone są z genogatunkiem bakterii [3].
W 1997 roku zsekwencjonowano linearny chromosom
szczepu B. burgdorferi. Kilka lat później poznano sekwencję
jego 21 plazmidów i stwierdzono, iż 63% materiału genetycznego zawarte jest w plazmidach. Tak duża ilość plazmidów,
niespotykana u innych bakterii, umożliwia Borrelia burgdorferi dużą zmienność w obrębie gatunku i cyklu życiowego
[12]. Zapewnia również zdolność do adaptacji w warunkach
kleszcz- stałocieplny ssak. Plazmidy nie podlegają selekcji
i pozostają niezmienione, dlatego naukowcy sugerują, że
służą one krętkowi możliwością dopasowania metabolizmu
do aktualnych potrzeb bakterii [3]. Badania nad genomem
Borrelia burgdorferi wykazały, że mają one minimalny metabolizm tłuszczów, białek, węglowodanów, aminokwasów
i żelaza. Dlatego prawie całkowicie są w tej kwestii uzależnione od gospodarza. Zajkowska i wsp. wskazują, że, spośród 1689 ORFs (ang. open reading frames) blisko 2/3 rola
i funkcje są nieznane. Aż 90 % genów w stałych warunkach
hodowli wykazuje niewielką aktywność. Badania wykazały,
że 215 ORFs różni się miedzy sobą w zależności od temperatury a także w zależności od miejsca przebywania krętka
(w kleszczach, skórze czy innych tkankach zakażonych ssaków) [3].
Postacie kliniczne neuroboreliozy
Według zaleceń Polskiego Towarzystwa Epidemiologów
i Lekarzy Chorób Zakaźnych (PTE i LChZ) dotyczących diagnostyki i leczenia Boreliozy z Lyme wyróżnia się następujące postacie kliniczne choroby [22]:
1.Rumień wędrujący (erythema migrans- EM)
2.Borrelial lymphocytoma (BL)
3.Przewlekłe zanikowe zapalenie skóry kończyn (acrodermatitis chronica atrophicans- ACA)
4.Zapalenie stawów (Lyme arthritis- LA)
5.Zapalenie mięśnia sercowego (Lyme carditis- LC)
6.Neuroborelioza
Zadaniem Fallon i wsp. aż u około 40% chorych na boreliozę
rozwijają się neurologiczne postacie choroby z Lyme [23].
Zmiany w układzie nerwowym mogą wystąpić tuż po zakażeniu, po kilku miesiącach lub nawet po kilku- kilkunastu
latach [24]. Ostre objawy neuroboreliozy ustępują zazwyczaj w ciągu kilku tygodni lub miesięcy. Dzieje się tak nawet
w przypadku pacjentów nieleczonych. Natomiast objawy
neurologiczne w sferze psychicznej mogą pojawiać się
w znacznym odstępie czasu po ukłuciu przez kleszcza i nie
zawsze są poprzedzone innymi postaciami boreliozy [9,
24].
Objawy neurologiczne w neuroboreliozie są nieswoiste, dlatego jedynie sposób lub chronologia ich rozwoju mogą nasuwać podejrzenie choroby z Lyme. Mogą się pojawić już
podczas lokalnej zmiany skórnej (rumienia wędrującego) [9].
W zależności od przyjętych kryteriów czasowych, zajętych
struktur czy prezentowanych objawów wyróżnia się kilka podziałów klinicznych neuroboreliozy [14].
U około 15% chorych na neuroboreliozę występuje limfocytarne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych (meningitis),
przebiegające początkowo jako zapalenie opon mózgowordzeniowych podstawy mózgu [9]. Współistnienie objawów
meningitis, bolesnego zespołu korzeniowego oraz porażenie
nerwów czaszkowych nosi nazwę zespołu Bannwarth’a [25].
Najczęściej zajętym nerwem czaszkowym jest nerw twarzowy (nerw VII), częste są również porażenia nerwu V, VI i VIII.
W zespole Bannwarth’a objawy oponowe (gorączka, wymioty) zazwyczaj są słabo wyrażone lub nieobecne, co sprawia,
że chorzy zazwyczaj leczeni są ambulatoryjnie, objawowo
bez zdiagnozowania czynnika etiologicznego [9, 18].
Kolejną a zarazem najcięższą postacią neuroboreliozy, rozwijającą się u około 0, 1% zakażonych krętkiem, jest zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego. Może pojawić się w każdym
okresie zapalenia opon mózgowo- rdzeniowych. W zależności od zajętych struktur OUN przebiega z zaburzeniami
świadomości, wodogłowiem, zaburzeniami oddechowymi,
objawami ogniskowymi, niedowładem spastycznym lub
wiotkim oraz zaburzeniami w oddawaniu moczu [9, 18]. Inny
podział kliniczny neuroboreliozy, zależny od kryterium czasowego przedstawiają Coyle i wsp. (Tabela II) [14].
Neuroborelioza- patomechanizm
Po wniknięciu B. burgdorferi przez skórę po pokłuciu przez
kleszcza infekcja przez krótki czas utrzymuje się lokalnie,
a następnie ulega rozproszeniu do wielu organów, w tym
także do układu nerwowego. Krętki przenikają tam najczęściej drogą naczyń krwionośnych, rzadziej drogą neurogenną i limfatyczną [26].
Spiralna budowa Borrelia burgdorferi umożliwia łatwiejsze
207
Badania laboratoryjne w diagnostyce neuroboreliozy
Tabela II
Postacie kliniczne neuroboreliozy w zależności od kryterium czasowego.
Zespół pre meningitis, objawiający się bólami głowy, bez zmian w płynie
mózgowo-rdzeniowym
Wczesna postać choroby z Lyme
Aseptyczne (limfocytarne) zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych
Neuropatie czaszkowe
Ostre, bolesne neuropatie korzeniowe
Późna postać choroby z Lyme
(objawy występujące > 6 miesięcy od zachorowania)
Encefalopatie
Przewlekłe poliradikulopatie
Zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego
Coyle PK, Schutzer SE. Neurologic aspects of Lyme disease. Med Clin North Am 2002; 86 (2): 261-284.
poruszanie się tym bakteriom w środowisku tkanek stawiających opór. Molekularny mechanizm inwazji tkanek przez
krętka nie jest jak dotąd dokładnie zbadany. Sugeruje się, że
ma on związek ze zdolnością odnajdywania niezbędnej dla
B. burgdorferi N- acetyl glukozoaminy, która buduje tkankę
łączną. Dodatkowo zdolność aktywowania przez krętka enzymów proteolitycznych gospodarza, min. metaloproteinaz
ułatwia penetrację tkanek bogatych w kolagen i tłumaczy
łatwość do pokonywania powięzi, opon mózgowych oraz
wnikania do stawów [14, 26].
Według Zajkowska i wsp. zmiany w ośrodkowym układzie
nerwowym (OUN) wywołane przez Borrelia burgdorferi wynikają prawdopodobnie z neurotropizmu danego szczepu jak
i z immunologicznie specyficznego charakteru OUN, zwanego „immunitetem” (przywilejem immunologicznym mózgu),
który zapewnia bariera krew-mózg [26]. W wyniku inwazji
OUN przez krętki zajęte zostać mogą różne struktury układu nerwowego: wyściółka opony, parenchyma mózgowa czy
nerwy obwodowe [26, 27].
Zalecenia w diagnostyce neuroboreliozy
Według zaleceń PTE i LChZ diagnostyka laboratoryjna każdej z postaci klinicznych boreliozy z Lyme (za wyjątkiem
EM) powinna opierać się na dwuetapowym protokole diagnostycznym [22].
W pierwszym etapie należy stwierdzić obecność swoistych
przeciwciał w klasie IgM lub IgG przeciw Borrelia burgdorferi
metodą immunoenzymatyczną (ELISA- enzyme- linked immunosorbent assay). W wyniku odpowiedzi immunologicznej gospodarza jako pierwsze pojawiają się przeciwciała (p/
ciała) IgM skierowane przeciwko białku rzęskowemu- flagellinie (o masie 41 kDa) wraz z poliklonalną aktywacją limfocytów B. Jednak mogą one dawać fałszywie ujemne wyniki
w metodzie ELISA, ponieważ charakteryzują się małym powinowactwem do antygenu. Istotne diagnostycznie w klasie
IgM są p/ciała skierowane przeciw białku OspC związanemu
z błoną zewnętrzną bakterii [21, 28]. Odpowiedź w klasie IgG
pojawia się po 3-6 tygodniach od zakażenia i może utrzymywać się nawet przez lata [26]. Dlatego metoda ELISA nie
powinna być stosowana do monitorowania leczenia, a jedynie do badania wstępnego w kierunku (neuro) boreliozy.
208
Zajkowska i wsp. podkreślają również, że testy różnych firm
są nieporównywalne, a ich standaryzacja i powtarzalność
ma miejsce tylko w obrębie jednostki posługującej się produktem jednej firmy [28]. Należy podkreślić, iż oznaczanie
przeciwciał może być trudne również ze względu na różne
stężenie bakterii w przestrzeniach płynowych oraz ich złożoną budowę i zmienność antygenową. Jest to związane
z sekwestracją anatomiczną w miejscach immunologicznie
uprzywilejowanych, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy
[26]. Dlatego aby uzyskać wynik wiarygodny diagnostycznie powinno się wyliczać indeks syntezy przeciwciał klasy
IgM lub IgG przeciw Borrelia burgdorferi w płynie mózgowordzeniowym (oparty o pomiar przeciwciał w surowicy oraz
płynie pacjenta), który uwzględnia różnice stężeń białek
w obu przestrzeniach. Obserwowane często u chorych wyniki fałszywie ujemne mogą wynikać z pobrania próbki zanim
pojawią się przeciwciała lub będą one w ilości niewykrywanej przez test [26]. Z kolei Witecka-Knysz i wsp. zwracają uwagę na fakt, że w przypadku masywnego zakażenia
Borrelia może dojść do powstania kompleksów immunologicznych (wiązanie krążących przeciwciał przez bakteryjne
antygeny), które nie mogą być wykryte metodą ELISA [10].
Andersen wskazuje, że aż u około 4-10% osób zdrowych
testy wychodzą fałszywie dodatnie [4]. Przyczyną tego zjawiska może być produkcja p/ciał niezwiązana z obecnością
patogenu [21]. Problemem diagnostycznym mogą też być
reakcje krzyżowe w wyniku koinfekcji (np. Treponema pallidum, Ehrlichia lub zakażenie wirusem Epstein- Barr) [10].
W drugim etapie badań u chorych z dodatnim lub wątpliwym
wynikiem badań serologicznych należy wykonać oznaczenie
techniką Western- blot. Polega ona na rozdzieleniu antygenów pochodzących z lizatów szczepów metodą elektroforezy. Po wykonaniu testu można rozpoznać p/ciała przeciwko
poszczególnym antygenom [22]. Należy jednak pamiętać, że
aby uniknąć problemu interpretacji wyniku Western- blot powinno się używać testów immunologicznych dla konkretnych
obszarów geograficznych, bazujących na specyficznych antygenach prezentowanych przez gatunki Borrelia burgdorferi
występujące na tych endemicznych obszarach [21].
Według Zaleceń Polskiego Towarzystwa Epidemiologów
i Lekarzy Chorób Zakaźnych obie metody (ELISA i Western-
blot) powinny stanowić nierozłączną całość, ponieważ testy
immunoenzymatyczne cechują się wysoką czułością a stosunkowo niską swoistością. Natomiast metoda Western- blot
charakteryzuje się wysoką swoistością przy niższej czułości
[22]. Jednak tak kompleksowa diagnostyka neuroboreliozy
nadal stanowi trudność, gdyż nieliczne laboratoria diagnostyczne dysponują aparaturą oraz wykwalifikowanym personelem potrafiącym wykonać oba oznaczenia.
Nowe trendy w diagnostyce neuroboreliozy
Aktualnie poszukuje się metod, które pozwoliłyby na jak
najwcześniejsze wykrycie zakażenia B. burgdorferi. Jedną
z nich jest metoda łańcuchowej reakcji polimerazowej (PCRpolymerase chain reaction). Szacuje się, że czułość tej metody dochodzi do 68%, a specyficzność nawet do 100% [21].
Dunaj podaje, że zastosowanie tej metody ma znaczenie
diagnostyczne w krótkim czasie po pokłuciu przez kleszcza
w wycinkach skórnych z granicy erythema migrans. Badanie
PCR można także wykonać we krwi, kiedy jeszcze nie powstały przeciwciała przeciwko B. burgdorferi [18]. Dopiero
w późniejszej fazie choroby badanie może dotyczyć płynu mózgowo-rdzeniowego [18]. Według Zajkowska i wsp.
w płynie mózgowo-rdzeniowym chorych na neuroboreliozę
PCR jest dodatnie u 40-50% [26]. Interesujące wydają się
być badania Pícha i wsp., którzy stwierdzili, że oznaczanie
DNA metodą PCR w moczu i PMR chorych na neuroboreliozę wykazało taką samą czułość diagnostyczną, natomiast
aż dwukrotnie wyższą czułość w porównaniu do osocza [29].
Z kolei Gooskens i wsp. donoszą, że metoda PCR wykazuje
największą czułość diagnostyczną u pacjentów w ostrej fazie
choroby, czyli w okresie krótszym niż 2 tygodnie od momentu wystąpienia objawów klinicznych [29]. Jednak według Dunaj poważnym zastrzeżeniem metody PCR jest brak jej standaryzacji, gdyż nawet wykorzystywanie rekomendowanych
fragmentów genomu krętków (takich jak: gen fla, OspA, 16S
rDNA, przestrzeń 5S 23S) powodują rozbieżność otrzymywanych wyników w różnych ośrodkach [18]. Autorka zwraca
uwagę również na fakt, że wykrycie DNA krętków Borrelia
nie pozwala także na rozróżnienie aktywnego zakażenia od
zaszłego. Dlatego też do rutynowej diagnostyki neuroboreliozy metodą PCR konieczne są dalsze badania w kierunku
jej standaryzacji [18].
Prowadzone są również badania nad rolą cytokin w zakażeniu Borrelia oraz ich znaczeniu w monitorowaniu przebiegu choroby. Diterich i wsp. wykazali, że B. burgdorferi, aby
przetrwać w zakażonym organizmie moduluje układ immunologiczny gospodarza [31]. Podstawą tej hipotezy stały się
badania wykazujące, że limfocyty osób chorych na neuroboreliozę wytwarzają większą ilość cytokin prozapalnych:
interferonu-γ (IFN–γ) i czynnika martwicy guza (TNF- α)
w odpowiedzi na stymulację w porównaniu do limfocytów
osób zdrowych [7]. Widhe i wsp. uzyskali wyższe stężenia IL-4 i IFN-γ w płynie mózgowo- rdzeniowym chorych
na neuroboreliozę w porównaniu do osób zdrowych [25].
Z kolei Lisinski i wsp. wykazali, że zakażenie krętkiem indu-
kuje wytwarzanie cytokin przeciwzapalnych jak IL-10 [32].
Potwierdzeniem powyższej hipotezy są również badania
Pancewicza i wsp., którzy zbadali stężenie cytokin: IFN–γ,
interleukiny- 6 (IL-6), interleukiny- 12 i 15 (IL-12, IL-15) w surowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym chorych z rozpoznaną
neuroboreliozą w porównaniu do grupy osób zdrowych [7].
Autorzy wykazali znamiennie statystycznie wyższe stężenie
badanych cytokin w porównaniu do osób zdrowych. Interesujący jest również fakt, że stężenie IFN–γ, IL-6 i IL-12 po
4-tygodniowej antybiotykoterapii i ustąpieniu objawów pozostało nadal istotnie statystycznie wyższe w grupie chorych
niż w grupie osób zdrowych [7]. Jako przyczynę Pancewicz
i wsp. sugerują utrzymywanie się bezobjawowego klinicznie
stanu zapalnego w obrębie ośrodkowego układu nerwowego [7].
Badanie ogólne i cytodiagnostyka płynu mózgowordzeniowego w neuroboreliozie
Niezwykle pomocnym badaniem uzupełniającym serologiczną diagnostykę neuroboreliozy jest badanie ogólne oraz cytodiagnostyka płynu mózgowo-rdzeniowego [7, 18].
Penetracja B. burgdorferi do OUN powoduje odwracalne
i zależne od liczby krętków upośledzenie bariery krew-mózg
oraz bariery krew-płyn [7]. Objawia się ono na skutek zwiększenia przepuszczalności tych barier, wzrostem pleocytozy
PMR oraz wewnątrzoponową syntezą IgM, IgG a czasem
nawet IgA [7, 8]. Trzeba jednak wspomnieć, że w przewlekłych zakażeniach zaobserwowano również zaburzenia wewnątrzoponowej produkcji immunoglobulin [9].
Pancewicz i wsp. po przeanalizowaniu wyników grupy 25
chorych na neuroboreliozę hospitalizowanych w Klinice Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji Uniwersytetu Medycznego
w Białymstoku stwierdzili pleocytozę w płynie mózgowordzeniowym mieszczącą się w zakresie od 38 do 80 komórek/µl płynu (średnio 56), zaś stężenie białka wynosiło od 32
do 91 mg/dl ( średnio 63) [7].
Należy zaznaczyć, iż w przebiegu neuroboreliozy w badaniu płynu mózgowo-rdzeniowego w ciągu pierwszych dwóch
tygodni zazwyczaj nie obserwuje się odchyleń od normy.
W tym czasie rzadko też stwierdza się u pacjentów objawy
neurologiczne. Zmiany w płynie mózgowo-rdzeniowym pojawiają się zwykle między 3 tygodniem a 3 miesiącem po
zakażeniu [9, 13].
Charakterystyczne odchylenia w badaniu płynu mózgowo–rdzeniowego dobrze obrazuje opis przypadku chorego,
u którego w badaniu immunoserologicznym PMR wykryto
przeciwciała IgG i IgM przeciwko Borrelia burgdorferi. Badanie wykonano przy użyciu techniki ELFA (metody enzymoimmunofluorescencyjnej) w systemie VIDAS. Wartość testowa
(TV) została obliczona automatycznie i wynosiła 1,03. Natomiast wynik w kierunku boreliozy jest dodatni przy wartości
testowej TV ≥ 1.
Tabela III przedstawia wyniki badania ogólnego płynu mózgowo-rdzeniowego tego pacjenta. Szczególną uwagę należy zwrócić na znacznie podwyższone stężenie białka oraz
209
Badania laboratoryjne w diagnostyce neuroboreliozy
Tabela III
Wynik badania ogólnego płynu mózgowo-rdzeniowego.
BADANY PARAMETR
WYNIK
Barwa
Jasnożółta
Przejrzystość
Klarowny
Białko
> 1000 mg/dl
Glukoza
65 mg/dl
Pleocytoza
21 komórek/µl
Erytrocyty w osadzie świeżym
20-40 w polu widzenia
Odczyn Nonne- Apelta
Silnie dodatni (+++)
mi pobudzenia w limfocytach (limfocyty transformowane
z widocznymi jąderkami, patrz ryciny 1-4). Wzrost pleocytozy w płynie mózgowo-rdzeniowym w neuroboreliozie związany jest zazwyczaj ze zwiększeniem odsetka limfocytów
i monocytów. Dlatego też zapalenie to może być mylnie rozpoznane jako wirusowe lub aseptyczne.
W postaciach neuroboreliozy nieprzebiegających z limfocytarnym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych zmiany
w PMR stwierdzane są rzadko [9].
silnie dodatni odczyn globulinowy Nonne–Apelta. Przyczyną
tych odchyleń od normy może być wewnątrzoponowa synteza immunoglobulin i zwiększona przepuszczalność dla
białka bariery krew- płyn. Stężenie glukozy było w granicach
normy i wynosiło 65 mg/dl, co jest opisywane w przebiegu
neuroboreliozy. Pleocytoza natomiast, podobnie jak w badaniach Pancewicza i wsp., była zwiększona i wynosiła 21
komórek/ µl płynu. W preparacie cytologicznym barwionym
metodą May Grünwalda Giemsy (MGG) stwierdzono: 29%
neutrofili, 35% limfocytów, 35% monocytów, 1% makrofagów. Preparat cytologiczny był ubogokomórkowy z cecha-
Podsumowanie
Pomimo długiego okresu, jaki upłynął od identyfikacji krętka
Borrelia burgdorferi i postępu badań nad jego biologią laboratoryjna diagnostyka neuroboreliozy jest wciąż aktualnym
tematem rozważań zarówno epidemiologów jak i diagnostów laboratoryjnych. Na dzień dzisiejszy nie dysponujemy
jednoznacznymi testami diagnostycznymi, co związane jest
ze złożoną budową i zmiennością antygenową B. burgdorferi. Żadna z dostępnych metod diagnostyki laboratoryjnej
boreliozy nie pozwala także na odróżnienie aktywnego zakażenia od śladu po przebytym zakażeniu. Natomiast, aby
rozpoznanie neuroboreliozy było trafne diagnostyka powinna się opierać o dwuetapowy protokół badań przeprowadzonych w materiale pobranym w odpowiednim czasie. Jeżeli
uzyskane wyniki są niespójne ze stanem klinicznym pacjenta, diagnostykę można rozszerzyć o badanie ogólne i cyto-
Rycina 1.
Limfocyty małe.
Rycina 3.
Monocyt.
Rycina 2.
Limfocyty transformowane (pobudzone).
Rycina 4.
Limfocyt mały i monocyt.
Na podstawie: Materiał własny Zakładu Laboratoryjnej Diagnostyki Klinicznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku.
210
diagnostykę PMR oraz nowoczesne metody diagnostyczne
np. PCR.
Piśmiennictwo
1. Figlerowicz M. Borelioza- pamiątka z wakacji. Przew Lek 2006;
8: 56-59.
2. Stanek G, Fingerle V, Hunfeld KP, et al. Lyme borreliosis: Clinical case definitions for diagnosis and management in Europe.
Clin Microbiol Infect 2011; 17: 69–79.
3. Zajkowska J, Hermanowska-Szpakowicz T, Rubel J. Atypowe
postacie Borrelia burgdorferi- następstwa kliniczne. Pol Merk
Lek 2005; 103: 115-119.
4. Andersen PH. Neuroborreliosis and TBE detected in Denmark.
EPI-NEWS National Surveillance of communicable diseases
2011; No. 14.
5. Bartosik-Psujek H, Belniak E, Mitosek- Szewczyk K. Problemy
neurologiczne w chorobach przenoszonych przez kleszcze aspekty kliniczne i diagnostyczne. Przegl Epidemiol 2002; 56:
30-37.
6. Berglund J, Stjernberg L, Ornstein K, et al. 5-y Follow-up study
of patients with neuroborreliosis. Scand J Infect Dis 2002; 34:
421-425.
7. Pancewicz SA, Kondrasiuk M, Zajkowska J. Zmiany stężenia
wybranych cytokin prozapalnych IFN- γ, IL-6, IL-12 i IL-15 w
surowicy oraz płynie mózgowo-rdzeniowym pod wpływem antybiotykoterapii u chorych na neuroboreliozę. Pol Merk Lek 2007;
130: 275-279.
8. Djukic M, Schmidt-Samoa C, Lange P, et al. Cerebrospinal fluid
findings in adults with acute Lyme neuroborreliosis. J Neurol
2012: 259: 630-636.
9. Zajkowska JM, Hermanowska-Szpakowicz T, Grygorczuk S.
Neuroborelioza. Pol Przegl Neurol 2006; 2: 13-22.
10. Witecka-Knysz E, Klimczak M, Lakwa K i wsp. Borelioza: dlaczego diagnostyka jest tak trudna? Diagnosta Lab 2007; http: //
www.kidl.org.pl
11. Zajkowska JM, Hermanowska- Szpakowicz T. Nowe aspekty
patogenetyczne boreliozy z Lyme. Przegl Epidemiol 2002; 56:
57-69.
12. Aguero-Rosenfeld ME, Wang G, Schwartz I, et al. Diagnosis of
Lyme Borreliosis. Clin Microbiol Rev 2005; 18: 484–509.
13. Biesiada G, Czepiel J, Leśniak M i wsp. The analysis of epidemiology, clinical symptoms, serological tests in the course of
borreliosis. Przegl Lek 2010; 67: 181-183.
14. Coyle PK, Schutzer SE. Neurologic aspects of Lyme disease.
Med Clin North Am 2002; 86: 261-284.
15. Czupryna P. Kuśmierczyk J, Zajkowska JM. Kliniczne postacie
neuroboreliozy u chorych hospitalizowanych w latach 20002005. Pol Merk Lek 2007; 23: 103-106.
16. Berglund J, Eitrem R, Ornstein K, et al. An epidemiologic study
of Lyme disease in southern Sweden. N Engl J Med 1995; 333:
1319-1327.
17. Smith R, O’Conell S, Palmer S. Lyme disease surveillance in
England and Wales, 1986- 1998. Emerg Infect Dis 2000; 6: 404407.
18. Książka streszczeń: VII Ogólnopolska Konferencja Naukowa
„Neuroinfekcje” zorganizowana przez Klinikę Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku;
13- 15 październik 2011 r, Białystok.
19. Brorson O, Brorson SH. An in vitro study of the susceptibility of
mobile and cystic forms of Borrelia burgdorferi to tinidazole. Int
Microbiol 2004; 7: 139-142.
20. Murgia R, Piazzetta C, Cinco M. Cystic forms of Borrelia burgdorferi sensu lato: induction, development, and the role of RpoS.
Wien Klin Wochenschr 2002; 114: 574- 579.
21. Gąsiorowski J, Witecka- Knysz E, Knysz B. Diagnostyka boreliozy. Med Pr 2007; 58: 439–447.
22. Flisiak R, Pancewicz S. Diagnostyka i leczenie Boreliozy
z Lyme- rekomendacje Polskiego Towarzystwa Epidemiologów
i Lekarzy Chorób Zakaźnych. Przegl Epidemiol 2008; 62: 193199.
23. Fallon BA, Kochevar JM, Gaito A. The underdiagnosis of neuropsychiatric Lyme disease in children and adults. Psychiatr Clin
North Am 1998; 21: 693-703.
24. Cerar T, Ogrinc K, Cimperman J. Validation of Cultivation and
PCR Methods for Diagnosis of Lyme Neuroborreliosis. J Clin
Microbiol 2008; 46: 3375-3379.
25. Widhe M, Skogman BH, Jarefors S. Up regulation of Borreliaspecific IL-4 and IFN- gamma- secreting cells in cerobrospinal
fluid from children with Lyme neuroborreliosis. Int Immunol
2005; 17: 1283-1291.
26. Zajkowska JM, Pancewicz SA, Grygorczuk S. Neuroboreliozawybrane aspekty patogenezy, diagnostyki i leczenia. Pol Merk
Lek 2008; 143: 453-457.
27. Aberer E, Koszik F, Silberer M. Why is chronic Lyme borreliosis
chronic? Clin Infect Dis 1997; 25: 64-70.
28. Pachner AR, Steiner I. Lyme neuroborreliosis: infection, immunity, and inflammation. Lancet Neurol 2007; 6: 544-552.
29. Pícha D, Moravcová L, Holečková D, et al. Examination of specific DNA by PCR in patients with different forms of Lyme borreliosis. Int J Dermatol 2008; 47: 1004–1010.
30. Gooskens J, Templeton KE, Claas EC. Evaluation of an internally controlled real-time PCR targeting the ospA gene for detection of Borrelia burgdorferi sensu lato DNA in cerebrospinal
fluid. Clin Microbiol Infect 2006; 12: 894-900.
31. Diterich I, Rauter C, Kirschning CJ, et al. Borrelia burgdorferiinduced tolerance as a model of persistence via immunosuppression. Infect Immun 2003; 71: 3973-3987.
32. Lisinski TJ, Furie MB. Interleukin-10 inhibits proimflamatory
activation of endothelium in response to Borrelia burgdorferi or
lipopolysaccharide but not IL-1beta or tumor necrosis factor alpha. J Leukoc Biol 2002; 72: 503-511.
Zaakceptowano do publikacji: 10.05.2012
Adres do korespondencji:
Mgr Olga Martyna Koper
Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Klinicznej
Uniwersytet Medyczny w Białymstoku
15-269 Białystok, ul. Waszyngtona 15A
tel./fax: 85 7468584
e-mail: [email protected]
211