Diagnostyka molekularna Dr n.biol. Anna Wawrocka Strategia

Diagnostyka molekularna
Dr n.biol. Anna Wawrocka
Strategia diagnostyki genetycznej:
Aberracje chromosomowe:
Metody:Analiza kariotypu, FISH, aCGH, MLPA, QF-PCR
Gen(y) znany
Metody: PCR, MLPA, Sekwencjonowanie, PCR-RLFP, PCR-Multiplex, PCR-ASO
Gen(y) nieznany
Metody: Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), Analiza sprzężeń, Klonowanie
pozycyjne, Klonowanie funkcjonalne
Źródła DNA/RNA:
• Krew obwodowa
•
Fibroblasty
•
Płyn owodniowy
•
Kosmówka
•
Szpik kostny
•
Plemniki
•
Włosy
• Fragmenty tkanek
Metody izolacji RNA:
•
Izolacja specyficznego RNA poprzez frakcjonowanie całkowitego RNA komórki
•
Bezpośrednia izolacja specyficznego RNA, ograniczona do komórek syntetyzujących
określony RNA w zwiększonej ilości
•
Izolacja poli(A)RNA
•
Izolacja RNA z polirybosomów
•
Izolacja całkowitego RNA komórki a następnie uzyskanie określonego RNA (cDNA)
metodą PCR.
PCR-Łańcuchowa reakcja polimerazy:
1. Matryca DNA
2. Primery (primer forward, primer revers)
3. Polimeraza DNA
4. dNTP’s
5. Buffor
Real Time PCR-PCR w czasie rzeczywistym
•
•
Jest to metoda ilościowego oznaczania DNA.
Pozwala na monitorowanie zmian stężenia produktu PCR poprzez pomiar
fluorescencji proporcjonalnej do jego ilości w czasie trwania reakcji
Zastosowania aplikacji real-time PCR:
•
Ilościowe określanie ekspresji genów
•
Testowanie stabilności genetycznej
•
Wydajność terapii lekowych/monitorowanie leków
•
Ilościowe określanie DNA wirusowego
•
Detekcja patogenów
•
Uszkodzenia DNA (niestabilność mikrosatelitarna)
•
Określanie czasu ekspozycji na promieniowanie
•
Obrazowanie in vivo procesów komórkowych
•
Studia nad DNA mitochondrialnym
•
Detekcja metylacji
•
Detekcja inaktywacji chromosomu X
•
Genotypowanie, analiza krzywej topnienia kwasów nukleinowych
•
Wykrywanie trisomii, poszczególnych kopii jednogenowych
•
Wykrywanie mikrodelecji
Droplet Digital PCR
PCR w wodno-emulsyjnej kropli. Analiza 8 pacjentów jednocześnie, dla każdej rekcji 20.000
kropli o objętości 1 nanolitra.
Zastosowanie:
- Wykrywanie biomarkerów nowotworowych
- Wykrywanie patogenów
- Analiza CNV (copy numer variation)
- Analiza ekspresji
MLPA - Zależna od ligacji multipleksowa amplifikacja sond
•
Detekcja zmian liczby kopii 45 genomowych sekwencji DNA w jednej, prostej do
przeprowadzenia reakcji PCR.
•
Minimum 20 ng ludzkiego DNA lub 10-120 ng RNA
•
Analiza częściowo zdegradowanego DNA
– DNA ze skrawków parafinowych
– Tkanek w formalinie
– Płodowy DNA uzyskany z plazmy krwi matczynej.
•
Rozróżnienie sekwencji które różnią się pojedynczym nukleotydem, detekcja znanych
mutacji oraz SNP
•
45 różnych mRNA
•
Identyfikacja statusu metylacji promotorów
•
wszystkie fragmenty są amplifikowane z wykorzystaniem pojedynczej pary starterów
w reakcji PCR
•
Wyjątkowość tej techniki polega na tym, że w reakcji nie jest amplifikowany DNA
badanej próby, ale sondy, które są dodawane do próbki
Sondy SALSA MLPA
Pojedyńcza sonda MLPA zawiera dwa różne oligonukleotydy, każdy z nich zawiera
sekwencje startera oraz sekwencje komplementarną do sekwencji docelowej.
4 etapy MLPA:
1. Hybrydyzacja
Mieszanina sond MLPA jest dodawana do zdenaturowanego genomowego DNA
Dwie części każdej sondy hybrydyzują do sekwencji docelowych
(komplementarnych)
2. Ligacja
Połączone w ten sposób sondy ulegaja ligacji (sondy, które nie uległy ligacji nie musza byc
usuwane), wykorzystując termostabilną ligazę, a nastepnie amplifikację PCR.
Liczba otrzymanych w ten sposób produktów wydłużonych sond zależy od liczby
odpowiadajacych sobie docelowych sekwencji w próbce
3. Amplifikacja
Do amplifikacji wszystkich sond została użyta uniwersalna para starterów. Produkt
amplifikacji każdej sondy posiada unikalną wielkość (130-480 pz).
4. Separacja i ocena ilościowa za pomocą elektroforezy kapilarnej
Każdy pik jest produktem amplifikacji poszczególnych sond. Próby porównuje się do prób
kontrolnych. Różnice w relatywnej wielkości piku (wysokość lub powierzchnia) wskazują
zmianę liczby kopii badanej sekwencji.
Sekwencjonowanie
1. Sekwencjonowanie metodą Sangera
2. Sekwencjonowanie nowej generacji:
Next generation sequencing (NGS)/Whole exome sequencing (WES)
-
Zastosowanie NGS:
Wykrywanie mutacji
Analiza transkryptomu – RNA seq
Badanie interakcji białko-DNA/RNA
Sprawdzanie stopnia metylacji
Sekwencjonowanie genomu
•
•
•
Zalety NGS:
Masowe równoległe sekwencjonowanie wielu próbek jednocześnie
Niższy koszt analizy w stosunku do sekwencjonowania metodą Sangera
Krótki czas uzyskania wyników











QF-PCR - Quantitative fluorescence polymerase chain reaction
Amplifikacja specyficznych regionów mikrosatelitarnych (wysoce polimorficznych
krótkich powtórzeń tandemowych typu STR) z zastosowaniem fluorescencyjnych
starterów w reakcji PCR
Ilościowa ocena produktów po amplifikacji
Szybka diagnostyka najczęstszych aneuploidii,
np. 13, 18, 21
aCGH - Technologia mikromacierzy arrayCGH
Stanowi przełom w diagnostyce genetycznej
Umożliwia w jednym badaniu wykrycie wszystkich niezrównoważonych aberracji
chromosomowych
oraz submikroskopowych mikrodelecji i mikroduplikacji
Nie wymaga hodowli komórek
Krótki czas oczekiwania na wynik
Hybrydyzacja wyznakowanego fluorescencyjnie DNA pacjenta do płytki
mikromacierzy z naniesionymi sekwencjami DNA w postaci klonów BAC lub
fragmentów oligonukleotydowych
Rozdzielczość – od 1Mpz do <100 kpz (?)
Nie identyfikuje zmian zrównoważonych oraz poliploidii
Czasami trudna interpretacja uzyskanych wyników
Przykazania dobrej diagnostyki w genetyce klinicznej
1. U kobiety >35 roku życia nie wykonujemy kariotypu z racji wieku
2. U mężczyzny z pary po poronieniach nie wykonujemy rutynowo analizy CFTR ani
AZF, badania te wykonujemy tylko w przypadkach oligozoospermii/azoospermii
3. U pary spokrewnionej nie wykonujemy kariotypów z racji spokrewnienia
4. Jeśli chcemy wykonać diagnostykę prenatalną w kierunku choroby jednogenowej
musimy znać chorobę, gen i konkretną mutację
5. W przypadku aberracji liczby chromosomów u dziecka nie wykonujemy badań
kariotypów u rodziców
6. W przypadku aberracji struktury u dziecka zawsze wykonujemy badania
u rodziców (kariotyp lub FISH do chromosomów metafazowych)
7. FISH nie wykrywa zmian w genach
8. Mikromacierze nie wykrywają translokacji zrównoważonych. Nie stosujemy ich u
zdrowych osób z niepowodzeniami rozrodu
9. Z martwej tkanki (martwo urodzonego płodu, kosmówki poronionego zarodka) nie
robimy kariotypu (tylko mikromacierze, QF-PCR, MLPA)