REGULACJA METABOLIZMU

REGULACJA METABOLIZMU
Zbiór ćwiczeń dla studentów III roku kierunku Biologia
oraz studentów I roku MU na kierunku Biologia (spec. BKiO)
i na kierunku Biotechnologia (spec. Biol.Mol., Biotech. lub Biot.Med.)
Zakład Regulacji Metabolizmu
Instytut Biochemii UW
Spis treści
I.
Aktywność glikolityczna w homogenacie mózgu
str. 3
II.
Transport anionów przez błonę mitochondrialną
str. 7
III.
Metabolizm glikogenu w homogenacie wątroby
str.10
IV.
Metabolizm argininy w mitochondriach
str.13
V.
Karboksylacja pirogronianu w mitochondriach wątroby
str.16
VI.
Wpływ różnych efektorów na aktywność dehydrogenazy
glutaminianowej w mitochondriach wątroby lub nerki
str.20
Oznaczanie fosforu metodą Fiske-Subbarowa
str.23
Oznaczanie białka metodą biuretową
str.24
2
1. AKTYWNOŚĆ GLIKOLITYCZNA W HOMOGENACIE MÓZGU
Glikoliza w tkankach zwierzęcych polega na przekształceniu glukozy w mleczan w
procesie obejmującym szereg reakcji enzymatycznych, czemu towarzyszy wytworzenie 2
moli ATP na jeden mol zużytej glukozy. Aktywność glikolityczna jest uwarunkowana
obecnością ATP i NAD+. ATP jest niezbędny do fosforylacji glukozy i fruktozo-6-fosforanu
w reakcjach katalizowanych przez heksokinazę i fosfofruktokinazę. NAD + jest koenzymem
dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego.
Oznaczenie aktywności glikolitycznej polega na pomiarze ubytku glukozy i fosforanu
z mieszaniny reakcyjnej, oraz na oznaczeniu wytworzonego mleczanu. Stężenie glukozy
oznacza się kolorymetrycznie mierząc produkt jej reakcji z kwasem dinitrosalicylowym.
Fosforan oznacza się metodą Fiske-Subbarowa (patrz. odp. rozdział), a obecność mleczanu w
mieszaninie reakcyjnej wykrywa się spektrofotometrycznie na podstawie redukcji NAD + w
reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę mleczanową.
Materiały i odczynniki
1. Homogenat mózgu: mózg szczura lub królika homogenizować przez 20 s w czterokrotnej
objętości zimnego, 1 mM buforu osforanowego o pH 7,4. Homogenat przygotować
bezpośrednio przed rozpoczęciem inkubacji i przechowywać w łaźni lodowej.
2. 50 mM glukoza
3. 0,2 M bufor fosforanowy (zrobiony, 4 0C)
4. 0,1 M amid kwasu nikotynowego
5. Mieszanina podstawowa o składzie: 25 mM glukozy, 15 mM bufor fosforanowy, 25 mM
amid kwasu nikotynowego. Do kolbki miarowej odmierzyć odpowiednie ilości odczynników:
2, 3 ,4 i uzupełnić wodą do 25 ml.
6. 80 mM M MgCl2 (zrobiony, 4 0C )
7. 5 mM NAD+
8. 7 mM zobojętniony ATP (zrobiony, -20 0C )
9. 0,25 M KHCO3 (zrobiony, RT)
10. 35 % kwas nadchlorowy (PCA) (zrobiony, RT)
11. 3 M K2CO3 (zrobiony, RT)
12. 5 M KOH (zrobiony, pod wyciągiem)
13. Odczynniki do oznaczania fosforu (patrz rozdział „Oznaczanie fosforu”)
3
14. Standardowy roztwór glukozy (2 mg/ml)
15. 1 % roztwór dinitrosalicylowego w 0,4 M NaOH. (zrobiony, RT)
16. Bufor do oznaczania mleczanu o składzie: 0,4 M wodzian lub siarczan hydrazyny, 1 M
glicyna, 5 mM EDTA; pH 9.5 (pH doprowadzić za pomocą 5 M KOH - zużywa się go ok. 10
ml !). Należy przygotować 50 ml buforu (w dniu oznaczania mleczanu !)
17.
Roztwór NAD (60 mg/ ml)
18.
Roztwór dehydrogenazy mleczanowej (wydaje prowadzący)
Wykonanie
a. Czynności przygotowawcze
0
Nastawić temperaturę łażni wodnej na 37
C. Przygotować 4 serie ponumerowanych
probówek;
- 3 probówki ok. 10 ml do przeprowadzenia inkubacji
- 9 ponumerowanych od 1 do 9 probówek typu Eppendorf zawierających 0,1 ml 35 % PCA 9 probówek ok. 10 ml do zobojętniania prób
- 9 probówek typu Eppendorf do przechowywania prób.
b. Przeprowadzenie inkubacji
Do 3 ponumerowanych probówek odmierzyć poszczególnie składniki mieszaniny reakcyjnej
wg. Tabeli (objętości podano w ml)
Składniki
Numer probówki
1
2
3
1,6
1,6
1,6
Woda
-
0,4
0,4
MgCl2
0,4
0,4
0,4
NAD
0,4
-
0,4
ATP
0,4
0,4
-
KHCO3
0,4
0,4
0,4
Mieszanina podstawowa
Uwaga, do pipetowania homogenatu używać końcówek do pipet skróconych skalpelem o ok. 2
mm. Przed rozpoczęciem reakcji mieszaniny reakcyjne inkubować w 37 0C co najmniej 3 min.
4
Homogenat mózgu zamieszać. Reakcje rozpocząć dodaniem dokładnie 0,8 ml homogenatu do
probówki nr 1. Właczyć stoper, zamieszać zawartość probówki i szybko pobrać 1 ml
mieszaniny, przenieść ją do probówki Eppendorfa nr 1 zawierającej PCA. Probówkę nr 1 z
mieszaniną reakcyjną ponownie umieścić w łażni. Po 1 min dodać 0,8 ml homogenatu do
probówki nr 2 i jak poprzednio, po wymieszaniu, pobrać 1 ml do odpowiedniej probówki
Eppendorfa. Po upływie kolejnej minuty rozpocząć reakcję w probówce nr 3, pobierając
również i z niej próbę odpowiadającą czasowi „0 min”.
Po inkubacji z probówek 1, 2 ,3 pobrać w odstępach 1 min po 1 ml i przenieść do probówek
Eppendorfa (4, 5, 6) zawierających PCA. Czas „30 min” pobrać odpowiednio do probówek
Eppendorfa nr (7, 8, 9). W ten sposób otrzymuje się próby do oznaczania fosforu, glukozy, i
mleczanu odpowiadające 0, 15, 30 min inkubacji.
c. Przygotowanie prób do oznaczania
Próby zawierające wytrącone białko należy odwirować w mikrowirówce przez 2 min.
Supernatanty przenieść do odpowiednich probówek, a następnie zawartość każdej z nich
zobojętnić za pomocą 3 M węglanu potasowego. Wartość pH należy kontrolować za pomocą
papierka lakmusowego. Zanotować objętość roztworu węglanu zużytą do zobojętniania
każdej próby (do zobojętniania 1 ml supernatantu zużywa się około 91 µl węglanu). Po
zobojętnieniu próby należy przenieść do próbówek typu Eppendorf i wstawić na 12-15 min
do zamrażalnika, a następnie osad nadchloranu zwirować. Suprnatant przenieść do
odpowiednich probówek Eppendorfa. Próby przechowujemy zamrożone.
d. Oznaczanie glukozy
Jednocześnie z oznaczaniem glukozy w badanych próbach należy wykonać krzywą
wzorcową. Do probówek na typu Eppendorf należy odmierzyć w dwóch powtórzeniach
odpowiednie objętości roztworu wzorcowego tak, by zawierały 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6 lub 0,8 mg
glukozy. Objętość roztworu w każdej probówce należy dopełnić wodą destylowaną do 1 ml, a
następnie dodać 0,175 ml 1% roztworu kwasu dinitrosalicylowego w 0,4 M NAOH.
Z badanych prób pobrać po 0,15 ml roztworu i przenieść do ponumerowanych próbówek. Do
każdej próbówki dodać 0,85 ml wody destylowanej , a następnie 0,175 ml roztworu kwasu
dinitrosalicylowego. Zawartość wszytykich probówek wymieszać i wstawić je do termobloku
na 100 0C na 10 min. Po wyjęciu probówki ostudzić i zmierzyć absorpcję prób przy 550 nm
wobec próby odczynnikowej (bez glukozy).
5
e. Oznaczanie fosforu
Do 9 probówek (na 10 ml) odmierzyć po 0,05 ml prób badanych, dopełnić wodą do 2,5 ml, a
do probówki 10 odmierzyć 2,5 ml wody destylowanej . Następnie do każdej probów ki
odmierzyć w kolejności odczynniki do oznaczania fosforu wg przepisu w rozdziale
„Oznaczanie fosforu...”. Zawartość fosforu odczytać ze sporządzonej jednocześnie z próbami
badanymi krzywej wzorcowej.
f. Oznaczanie mleczanu
Do kuwet spektrofotometrycznych odmierzyć po 14 20 µl buforu do oznaczania mleczanu, 40
µl roztworu NAD (60 mg/ml) oraz 10 µl roztworu dehydrogenazy mleczanowej. Zawartość
kuwet wymieszać za pomocą plastikowej szpatułki i zmierzyć początkową wartość absorpcji
przy 340 nm wobec próby zawierającej bufor ( odczyt zanotować dopiero po ustabilizowaniu
się wskazań przyrządu, czyli po ok. 10 minutach. Następnie dodać 30 µl próby badanej,
roztwór dokładnie wymieszać i po 15 minutach odczytać zmianę absorbcji. Obliczyć stężenie
mleczanu w badanych próbach wiedząc, że milimolowy współczynnik absorbancji dla NADH
przy fali o długości 340 nm wynosi 6,22.
Opracowanie wyników
Obliczyć ile µmoli glukozy, fosforanu i mleczanu znajdowało się w mieszaninie reakcyjnej w
poszczególnych próbach (µmol/g mózgu). Na podstawie różnic w oznaczeniach glukozy,
fosforanu i mleczanu obliczyć:
1. Ile µmoli glukozy i fosforanu ubyło z mieszaniny reakcyjnej oraz ile mleczanu powstało w
wyniku glikolizy.
2. Jaki jest stosunek zużycia fosforanu do ilości wykorzystanej glukozy.
3. Jaki jest stosunek ilości wytworzonego mleczanu do ilości zużytej glukozy.
Wyniki zestawić w tabeli.
6
II. TRANSPORT ANIONÓW PRZEZ BŁONĘ MITOCHONDRIALNĄ
Istnienie
wewnątrzkomórkowych
struktur
i
przestrzeni
ograniczonych
błonami
o
wyspecjalizowanych funkcjach biochemicznych jest ważnym czynnikiem regulacyjnym w
metabolizmie komórki. Decydującą rolę odgrywa tu wybiórcza półprzepuszczalność tych
błon oraz związane z tym procesy ułatwionego i aktywnego transportu metabolitów.
Właściwie tylko woda i rozpuszczone w niej gazy; CO2, O2, NH3, przenikają swobodnie przez
błonę mitochondrialną na zasadzie dyfuzji. Kwasy di-, trikarboksylowe, pośredniki cyklu
kwasów trikarboksylowych, mogą być transportowane do mitochondriów w wyniku istnienia
swoistych
przenośników.
Wielu
danych
o
transporcie
metabolitów
przez
błonę
mitochondrialną dostarczyły badania szybkości pęcznienia mitochondriów zawieszonych w
izoosmotycznych roztworach soli amonowych. Pomiar pęcznienia przeprowadza się
spektrofotometrycznie przy długości fali 520 nm.
Materiały i odczynniki
1. Mitochondria z wątroby lub nerki szczura lub królika (wydaje prowadzący)
2 . 20 mM buforu TRIS- HCl pH 7,4
3. 1 mM roztwór rotenonu w etanolu (wydaje prowadzący)
4. 0,2 M roztwór kwasu glutaminowego zobojętniony 3 M roztworem NH3, pH 7,4
5 0,2 M roztwór kwasu glutaminowego zobojętniony 2 M roztworem KOH, pH 7,4
6. 0, 15 M roztwór kwasu cytrynowego zobojętniony 3 M roztworem NH3, pH 7,4
7. 60 mM roztwór jabłczanu zobojętniony (na papierek lakmusowy) 2 M roztworem Tris
8 0,2 M roztwór jabłczanu zobojętniony 3 M roztworem NH3, pH 7,4
9 0,3 M roztwór octanu amonowego
10 0,3 M roztwór chlorku potasowego
11 0,6 M roztwór fosforanu potasowego
12 0,6 M roztwór sacharozy
Wykonanie
a. Czynności przygotowawcze:
Na 10 min przed pomiarem włączyć spektrofotometr i ustawić długość fali na 520nm.
Przygotować 2 kuwety. Do jednej z nich (A) odmierzyć 1,5 ml wody destylowanej (próba
odniesienia), do drugiej (B) 700µl buforu Tris-HCl o pH 7,4; 700 µl sacharozy i 5µl rotenonu.
Kuwety umieścić w spektrofotometrze. Do kuwety B dodać 10 µl zawiesiny mitochondriów i
7
natychmiast zmierzyć absorbcję proby. Na podstawie uzyskanych wyników rozcieńczyć
zawiesine mitochondriów tak, aby po dodaniu jej w ilości 10 do kuwety zawierającej roztwór
sacharozy z rotenonem wartość absorpcji próby mierzona przy 520 nm wynosiła około 0,8000,990. (Uwaga - mitochondria należy rozcieńczyć 0,3 M mannitolem). Tak rozcieńczone
mitochondria stosować do dalszych badań.
b. Oznaczanie pęcznienia mitochondriów
Do suchych szklanych kuwet spektrofotometrycznych odmierzyć poszczególne składniki
mieszaniny w ilościach podanych w Tabeli w µl. Poszczególne kuwety umieszczać kolejno w
spektrofotometrze, stosując jako próbę odniesienia wodę destylowaną. Szybkość pęcznienia
mitochondriów w kuwecie badać dodając do niej 10µl upszednio przygotowanej zawiesiny
mitochondriów i mierząc wartość absorbcji przy 520 nm po 15 sekundach od dodania
mitochondriów. Kolejne trzy pomiary absorpcji wykonywać co 15 sekund od momentu
dodania mitochondriów, a następnie w odstępach 30 sekund notując zmiany absorpcji przez 6
minut. Analogiczne pomiary wykonać dla pozostałych prób.
Składniki
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Bufor Tris-HCl
700
700
700
700
700
700
700
700
700
700
Sacharoza
700
700
700
700
50
50
mieszaniny
reakcyjnej
KCl
700
Glutaminian
700
potasowy
Glutaminian
700
amonowy
Cytrynian
amonowy
Fosforan potasowy
Jabłczan-Tris
50
50
Jabłaczan
700
700
amonowy
Octan amonowy
Rotenon
700
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
8
Opracowanie wyników
Wyniki uzyskane dla poszczególnych prób przedstawić w postaci wykresu, odkładając na osi
odciętych czas pomiaru pęcznienia mitochondriów, a na osi rzędnych wartość absorpcji przy
520 nm. Wyjaśnić różnicę szybkości pęcznienia mitochondriów w obecności różnych
substratów.
9
III. METABOLIZM GLIKOGENU W HOMOGENACIE WĄTROBY
Proces degradacji glikogenu przebiega w wątrobie i w mięśniach, które cechuje duża
zawartość tego wielocukru. Rozkład glikogenu jest katalizowany przez fosforylazę glikogenu:
glikogen (n reszt glukozy) + fosforan  glikogen (n - 1 reszt glukozy) + glukozo-1-fosforan
In vivo równowaga tej reakcji jest znacznie przesunięta w kierunku degradacji glikogenu.
Jednakże w określonych warunkach in vitro szybkość reakcji w kierunku przeciwnym jest 3krotnie wyższa niż w kierunku fizjologicznym. Fosforylaza glikogenu występuje w dwóch
formach aktywnej (fosforylaza a) oraz znacznie mniej aktywnej (fosforylaza b) , której
inhibitorem jest kofeina. W obecności kinazy fosforylazy i ATP forma b może zostać
przekształcona w formę a. Forma a przechodzi w formę b przy udziale fosfatazy fosforylazy.
W ćwiczeniu aktywność fosforylazy jest mierzona szybkością uwalniania fosforanu z glukozo
-1-fosforanu.
Odczynniki
1. 0,9 % NaCl
2. 0,5 M glukozo- 1- fosforan (zrobiony, -20 0C )
3. 10 % roztwór glikogenu
4. 1 M NaF
5 Roztwór kofeiny [10 mg/ml]
6. Odczynniki do oznaczania fosforu metodą Fiske-Subbarowa (Patrz: rozdz. ”Oznaczanie
fosforu”)
7. 0,2 M AMP (zrobiony, -20 0C )
8. 35 % kwas nadchlorowy (PCA) (zrobiony, RT)
Przygotowanie homogenatu wątroby
Pobraną ze zwierzęcia wątrobę umieścić w zlewce z oziębionym 0,9% NaCl. Zważyć 5g
wątroby, rozdrobnić ją skalpelem, a następnie zhomogenizować w 20 ml oziębionego
roztworu NaCl. Homogenat przesączyć przez 2 warstwy gazy opatrunkowej.
10
Przeprowadzenie inkubacji
Do 12 ponumerowanych probówek Eppendorfa dodać po 20 µl PCA. Do 4 probówek (A, B,
C, D) odmierzyć składniki mieszaniny reakcyjnej wg Tabeli (wartości podano w µl).
Substrat
A
B
C
D
Glukozo-1-P
60
60
60
60
Glikogen
200
200
200
200
NaF
-
200
200
200
kofeina
-
-
10
-
AMP
-
-
-
40
Woda
240
40
30
-
Zawartość probówek wymieszać i preinkubować przez 5 min w łaźni wodnej o temperaturze
370 C. Reakcje enzymatyczną rozpocząć dodaniem do probówki A 0,5 ml ogrzanego w łaźni
homogenatu wątroby (do pipetowania użyć ściętej końcówki). Włączyć stoper i zamieszać
zawartość probówki. Szybko pobrać 200 µl mieszaniny i przenieść do probówki Eppendorfa
nr 1 zawierającej PCA. Po upływie 1 min dodać 0,5 ml homogenatu do probówki B,
pobierając po 200 µl próby do probówki Eppendorfa nr 2. Po upływie kolejnej minuty
rozpocząć reakcję w probówce C, a następnie w D, pobierając po 200 µl próby do probówek
Eppendorfa odpowiednio nr 3 i 4. Kolejne próby pobierać w 10 i 20 min z probówki A, w 11 i
21 min z probówki B, w 12 i 22 min z C, a w 13 i 23 min z D.
Przygotowanie prób do oznaczeń
Próby zawierające wytrącone białko wirować przez 1 min w mikrowirówce. Supernatanty
przenieść do probówek Eppendorfa i użyć bezpośrednio do oznaczeń lub przechowywać
zamrożone.
Oznaczanie fosforu w badanych próbach i opracowanie wyników
Do probówek dodać 75 µl badanych prób i dopełnić wodą do 2,5 ml. Jednocześnie
przygotować krzywą wzorcową do oznaczeń fosforu wg przepisu zawartego w rozdziale
„Oznaczanie fosforanu metodą Fiske –Subbarowa”, dodając kwas trójchlorooctowy, kwaśny
roztwór molibdenianu amonowego i odczynnik redukujący również do prób badanych. Dalej
postępować zgodnie z przepisem. Wykreślić krzywe obrazujące przebieg reakcji w
11
poszczególnych próbach odkładając na osi Y ilość µmoli P/ml mieszaniny reakcyjnej, a na osi
X - czas w minutach.
12
IV. METABOLIZM ARGININY W MITOCHONDRIACH
Amoniak powstając w wyniku przemian związków azotowych jest usuwany z organizmów
ssaków w postaci mocznika dzięki działania enzymów cyklu mocznikowego. Arginaza,
katalizująca ostatnią reakcję cyklu, powoduje rozkład argininy z wytworzeniem mocznika i
ornityny. Enzym ten występuje we frakcji cytolosowej wątroby oraz w mitochondriach
wątroby, nerki i innych tkanek.
W mitochondriach, w obecności 2-oksoglutaranu, ornityna podlega następnie reakcji
transaminacji katalizowanej przez aminotransferazę ornitynową z utworzeniem glutaminianu.
Aktywność arginazy oznacza się na podstawie pomiaru ilości ornityny uwolnionej w trakcie
inkubacji, aminotransferazy zaś na podstawie ilości wyprodukowanego glutaminianu.
Aminokwasy w próbach oznacza się za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii
cieczowej w układzie z odwróconymi fazami (RP-HPLC). Przed przeprowadzeniem
chromatografii aminokwasy przeprowadza się w pochodne DABSYLowe, co umożliwia
pomiar stężenia w zakresie światła widzialnego (maksimum absorpcji 436 nm)
Aminokwas (NH2) + DABS (SO2Cl)  Aminokwas (NHSO2) DABS
Rozdziału aminokwasów dokonuje się na kolumnie Spherogel® C18. Fazą ruchomą są: bufor
octanowy pH 3,5 oraz acetonitryl. Chromatografię rozwija się w gradiencie liniowym
zaczynając od 20% acetonitrylu i zwiększając jego stężenie do 70% w ciągu 25 min.
Odczynniki
1. Mitochondria izolowane z wątroby lub nerki królika (wydaje prowadzący)
2. Mieszanina podstawowa o składzie: 0,24 M mannitol., 20 mM bufor fosforanowy; pH 7,4
(przygotować w dniu inkubacji)
3. 0,1 M roztwór kwasu aminooksyoctowego (AOA) zobojętniony za pomocą 3M KOH
(zrobiony, -20 0C )
4. 0,1 M zobojętniony roztwór kwasu 2- oksoglutarowego (na papierek lakmusowy)
5. 0,2 M roztwór argininy zobojętniony za pomocą HCl (na papierek lakmusowy)
6. 0,1 M zobojętniony roztwór kwasu jabłkowego (na papierek lakmusowy)
7. Metanolowy roztwór rotenonu (0,2 mg/ml) (wydaje prowadzący)
8. 8 mM roztwór chlorku dabsylu w acetonie (wydaje prowadzący)
13
9. 0.4 M bufor węglanowy pH 9,0 (wydaje prowadzący)
10. 35 % roztwór kwasu nadchlorowego (zrobiony, RT)
11. 3 M roztwór K2CO (zrobiony, RT)
12. Odczynnik biuretowy do oznaczania białka (zrobiony, RT)
13. 10 % roztwór dezoksycholanu sodowego (zrobiony, RT)
14. 70% etanol (wydaje prowadzący)
Wykonanie
Do naczynek inkubacyjnych odmierzyć składniki mieszaniny reakcyjnej w ilościach
podanych w tabeli (µl):
Składniki
1
2
3
4
5
Mieszanina
1000
1000
1000
1000
1000
Arginina
50
50
50
50
50
2-OG
-
40
40
40
40
Jabłczan
-
-
20
-
20
AOA
-
-
-
40
40
Rotenon
20
20
20
20
20
Woda
830
790
770
750
730
podst.
Naczynka preinkubować w temperaturze 300 C przez 5 minut, a następnie rozpocząć reakcje
enzymatyczne poprzez dodanie po 100 µl zawiesiny mitochondriów do każdego naczynka w
odstępach 1-minutowych. Po 40 minutach inkubacje przerwać pobierając 1 ml próby do
probówek Eppendorfa zawierających po 100 µl 35% PCA. Próby wymieszać i schłodzić
przez 10 min w zamrażalniku. Następnie próby zwirować, przenieść supernatanty do
odpowiednio oznaczonych probówek i zobojętnić je za pomocą 3 M węglanu potasowego
(należy użyć około 100 µl węglanu na 1 ml supernatantu). Zobojętnione próby ponownie
schłodzić, a następnie ciecze znad osadów przenieść do probówek Eppendorfa i odwirować
pozostałości osadu.
Nie zapomnieć o oznaczeniu białka mitochondrialnego (wg przepisu w rozdziale
„Oznaczanie białka metodą biuretową”).
14
Przygotowanie prób do chromatografii (dabsylacja)
Wszystkie czynności należy wykonywać pod kierunkiem prowadzących. Do podpisanych
kalibrowanych probówek Eppendorfa dodać po 50 µl buforu węglanowego pH 9,0, a
następnie – 50 µl zobojętnionej próby oraz 200 µl roztworu DABS w acetonie. Zawartość
probówek wymieszać zgodnie ze wskazówkami otrzymanymi od prowadzących. Następnie
probówki umieścić na 10 min w cieplarce rozgrzanej do temperatury 70 0 C. Po upływie tego
czasu probówki wyjąć z cieplarki, delikatnie wymieszać ich zawartość i z powrotem wstawić
do cieplarki na dalszych 10 min. Po zakończeniu dabsylacji próby uzupełnić do 0,5 ml za
pomocą 70 % etanolu i wymieszać za pomocą mieszadła elektrycznego. Tak przygotowane
próby można przechowywać zamrożone. Chromatograficzny rozdział aminokwasów jest
wykonywany przez prowadzących . Studenci interpretują otrzymane chromatogramy.
Opracowanie wyników
Obliczyć ilość ornityny i glutaminianu w próbach. Wyniki wyrazić w nmol/mg białka.
15
V. KARBOKSYLACJA PIROGRONIANU W MITOCHONDRIACH WĄTROBY
Pierwszy
etap
glukoneogenezy
-
karboksylacja
pirogronianu
z
wytworzeniem
szczawiooctanu, katalizowana przez karboksylazę pirogronianową (ligazę pirogronian : CO2;
EC 6.4.1.1), zachodzi w mitochondriach zgodnie z następującym równaniem:
AcetyloCoA, Me+2
Pirogronian + ATP + HCO3- ---------------------- szczawiooctan + ADP + fosforan
Stwierdzono, że szybkość karboksylacji pirogronianu może być regulowana przez kwasy
tłuszczowe. Związki te są wykorzystywane mitochondriach jako substraty oddechowe,
utlenieniu
których
towarzyszy
wytwarzanie
acetylo-CoA, aktywatora
karboksylazy
pirogronianowej. Ponadto długołańcuchowe kwasy tłuszczowe hamują transport nukleotydów
adeninowych przez błonę mitochondrialną, zaś nienasycone kwasy tłuszczowe są znane jako
związki rozprzęgające oksydacyjną fosforylację. Różny wpływ kwasów tłuszczowych na
szybkość procesu karboksylacji pirogronianu jest uwarunkowany między innymi rodzajem
kwasu
tłuszczowego
oraz
stanem
metabolicznym
mitochondriów.
W
warunkach
fizjologicznych powstający szczawiooctan ulega redukcji do jabłczanu, pod wpływem
dehydrogenazy jabłczanowej, lub jest przekształcany w cytrynian w reakcji katalizowanej
przez syntazę cytrynianową. Szybkość karboksylacji pirogronianu można zmierzyć
enzymatycznie, oznaczając zawartość jabłczanu i cytrynianu w mitochondriach, bądź też, po
podaniu znakowanego H14CO3-, ilością radioaktywnego dwutlenku węgla włączonego do
produktów karboksylacji.
Materiał i odczynniki
1. Mitochondria wątroby królika (1 ml zawiesiny zawierającej w przybliżeniu 60 mg
białka/ml) (wydaje prowadzący)
2. 1 M roztwór chlorku potasowego (zrobiony, 4 0C)
3. 0,1 M chlorku magnezowego (zrobiony, 4 0C)
4. 0,2 M bufor fosforanowy (K2HPO4 /KH2PO4), pH 7,4 (zrobiony, 4 0C)
5. 0,2 M bufor Tris- HCl, pH 7,4 (zrobiony, 4 0C)
6. 0,1 M roztwór EDTA (zrobiony, 4 0C)
16
7. Mieszanina podstawowa o następującym składzie: 30 mM KCl, 4 mM EDTA, 10 mM
MgCl2, 20 mM bufor fosforanowy pH 7,4, 0,1 M bufor Tris-HCl pH 7,4. Mieszaninę o
ostatecznej objętości 50 ml sporządzić poprzez zmieszanie w kolbie miarowej odpowiednich
ilości odczynników 2,3,4,5 i 6. Uzupełnić objętość wodą. (przygotować w dniu inkubacji)
8. 0,2 M roztwór kwasu pirogronowego zobojętniony NaOH (na papierek lakmusowy)
lub 0,2 M roztwór pirogronianu sodowego
9. 1 M roztwór kwaśnego węglanu potasowego zawierający NaH14CO3 (60 μCi/ml) (wydaje
prowadzący)
10. 50 mM roztwór kwasu palmitynowego w etanolu (wydaje prowadzący)
11. 50 mM roztwór kwasu kaprylowego w etanolu (wydaje prowadzący)
12. 0,2 M zobojętniony roztwór bursztynianu (na papierek lakmusowy) lub 0,2 M roztwór
bursztynianu sodowego
13. 0,1 M roztwór ATP zobojętniony Tris (zrobiony, -20 0C )
14. 1 mM roztwór rotenonu w etanolu (zrobiony, -20 0C )
15. Oligomycyna, roztwór etanolowy (1 mg/ml) (wydaje prowadzący)
16. 10 mM roztwór 2,4-dinitrofenolu (DNP) w etanolu lub 1 mM etanolowy roztwór FCCP
(wydaje prowadzący)
17. Mieszanina scyntylacyjna (wydaje prowadzący)
18. Odczynniki do oznaczania białka metodą biuretową (zrobione, RT)
19. 35% kwas nadchlorowy (zrobiony, RT)
20. 3 M roztwór węglanu potasu (zrobiony, RT)
Wykonanie
a. Czynności przygotowawcze
14
Wszystkie czynności wymagające pracy z izotopem
C przeprowadzać pod kierunkiem
prowadzących i bezwzględnie stosować się do regulaminu.
Włączyć termostat utrzymujący stałą temperaturę (300 C) w naczynkach inkubacyjnych. Do
probówek typu Eppendorf podpisanych A1, A2, B1, B2, C1, C2 lub w innej kombinacji (wg
decyzji prowadzących) odmierzyć po 0,1 ml 35% PCA. Do wskazanych przez prowadzących
naczynek inkubacyjnych (np. A, B, C) odmierzyć poszczególne składniki mieszaniny
reakcyjnej w ilościach podanych w tabeli (μl). Nad naczynkami inkubacyjnymi umieścić
zamocowane w korkach szklane rurki z kapilarami podłączonymi do butli z mieszaniną tlenu
i dwutlenku węgla (karbogenem).
17
Składniki
Mieszanina
A
B
C
D
E
F
G
1500
1500
1500
1500
1500
1500
1500
50
50
50
50
50
50
podstawowa
NaH14CO3 w 50
KHCO3
Pirogronian
50
50
50
50
50
50
50
Kaprylan
-
20
-
-
-
-
-
Palmitynian
-
-
20
-
-
-
-
Bursztynian
-
-
-
-
150
-
-
ATP
-
-
-
-
-
10
10
Oligomycyna -
-
-
-
-
10
10
Rotenon
-
-
-
10
10
10
10
DNP lub
-
-
-
-
-
-
10*
1400
1380
1380
1390
1240
1370
1360
FCCP
Woda
*UWAGA
W przypadku próby G, do naczynka inkubacyjnego dodajemy wszystkie składniki według
tabeli, z wyjątkiem DNP lub FCCP. Następnie dodajemy zawiesinę mitochondriów i po
minucie rozpoczynamy inkubację przez dodanie DNP lub FCCP.
b. przeprowadzenie inkubacji
Poprosić prowadzących o odkręcenie dopływu karbogenu do naczynek inkubacyjnych. Do
naczynka A dodać 0,15 ml zawiesiny mitochondriów i włączyć stoper. Natychmiast pobrać 1
ml mieszaniny i przenieść do probówki Eppendorfa A1 zawierającej 0,1 ml 35% PCA. Po 1
min dodać 0,15 ml zawiesiny mitochondriów do naczynka B i podobnie jak poprzednio
natychmiast pobrać próbę zerową do probówki Eppendorfa B1 zawierającej 0,1 ml 35 %
PCA. Podobnie postępować z kolejnymi próbami, zachowując jednominutowe przerwy. Po
10 minutach od momentu dodania mitochondriów do pierwszego naczynka inkubacyjnego
pobrać po 1 ml mieszaniny inkubacyjnej z kolejnych naczynek i przenieść (z zachowaniem tej
samej kolejności i jednominutowych przerw jak podczas rozpoczynania inkubacji) do
probówek Eppendorfa zawierających 0,1 ml 35 PCA, podpisanych A2, B2, C2 itd.
(Oczywiście naczynka podpisujemy A, B, C, jeżeli to akurat ten zestaw doświadczalny został
wybrany przez prowadzących.)
18
Probówki Eppendorfa zawierające wytrącone białko wstawić do lodówki na 10 min, a
następnie odwirować w mikrowirówce. Supernatanty (dokładnie po 0,8 ml) przenieść do
odpowiednio podpisanych probówek i wstawić na 30 minut do wytrząsarki (po kierunkiem
prowadzących), a następnie zneutralizować 3 M węglanem potasowym. Po odwirowaniu
osadu nadchloranu potasowego przenieść po 0,5 ml każdej próby do naczynek
scyntylacyjnych, dodać po 5 ml mieszaniny scyntylacyjnej i zmierzyć radioaktywność prób
(pod kierunkiem prowadzących). Nie zapomnieć o oznaczeniu białka mitochondrialnego
(wg przepisu w rozdziale „Oznaczanie białka metodą biuretową”).
c. Opracowanie wyników
Otrzymane wyniki wyrazić liczbą impulsów (cpm) radioaktywnego dwutlenku węgla
włączonego w ciągu minuty na miligram białka mitochondrialnego.
19
VI. WPŁYW RÓŻNYCH EFEKTORÓW NA AKTYWNOŚĆ DEHYDROGENAZY
GLUTAMINIANOWEJ W MITOCHONDRIACH WĄTROBY LUB KORY NERKI
Dehydrogenaza L glutaminianowa katalizuje reakcję redukcyjnej aminacji 2-oksoglutaranu
oraz reakcję oksydacyjnej dezaminacji glutaminianu;
2-Oksoglutaran + NH4+ + NAD(P)H + H+
↔ L –glutaminian + NAD(P)+ + H2O
Dehydrogenaza glutaminianowa (GDH) jest ważnym ogniwem wiążącym metabolizm białek
i cukrowców, dostarczając w zależności od stanu fizjologicznego komórki 2-oksoglutaranu
lub glutaminianu.
Utlenienie glutaminianu prowadzi do uwolnienia jonu amonowego oraz wytworzenia 2oksoglutaranu, który może być wykorzystany w reakcjach transaminacji lub włączony w
przemiany cyklu Krebsa. Wytworzony w reakcjach cyklu kwasów trikarboksylowych
szczawiooctan
jest
z kolei
substratem
karboksykinazy
fosfoenolopirogronianowej.,
kluczowego enzymu szlaku glukoneogenezy lub syntezy cytrynianowej, uważanej za
regulatorowy enzym cyklu Krebsa.
W wątrobie amoniak uwolniony w reakcji katalizowanej przez GDH jest zużywany do
syntezy mocznika , a w nerce bierze udział w kontroli równowagi kwasowo-zasadowej. W
warunkach zwiększonej zawartości jonów amonowych w komórce GDH katalizuje reakcję
wytwarzania glutaminianu.
Materiały i odczynniki
1. Mitochondria wątroby (ok. 2 mg białka na ml) lub nerki królika (20 mg białka na ml) lub
szczura (wydaje prowadzący)
2. . 0,2 M Bufor Tris- HCl, pH 7.4
3. 1 M KCl
4. 0,1 M EGTA, pH 7,4 (2 ml)
5. Mieszanina podstawowa; 40 mM Bufor Tris- HCL, 240mM KCL, 6 mM EGTA. Do kolby
miarowej o pojemności 25 ml odmierzyć odpowiednie iliści składników 2,3,4, i objętość
uzupełnić wodą do kreski. (Przygotować w dniu oznaczenia)
6. 1 M NH4Cl
7. 10 % Triton X- 100 (zrobiony, RT)
20
8. 1 mM rotenon w metanolu (wydaje prowadzący)
9. 10 mM NADH (przygotować bezpośrednio przed użyciem)
10. 0,2 M 2-oksoglutaran , pH 7,4 (przygotować bezpośrednio przed użyciem)
11. 0,1 M ADP, pH 7.4 (wydaje prowadzący)
12. 0,1 M Leucyna (wydaje prowadzący)
14. 0,2 M gentamycyna
15. 2 mM chlorochina
Wykonanie
A. Czynności przygotowawcze
Nastawić termometr kontaktowy termostatu 30 0C podłączyć termostatyzowaną przystawkę
do spekola i włączyć ogrzewanie. Do termostatu wstawić w kolbach stożkowych mieszaninę
podstawową i wodę. Włączyć spekol. Ustawić długość fali na 340nm.. Przygotować probę
odniesienia zawierającą 1 ml mieszaniny podstawowej i 1 ml wody .
B. Przeprowadzenie reakcji enzymatycznej
Do kuwety odmierzyć składniki mieszaniny reakcyjnej
A
B
1000
1000
Mieszanina podstawowa
C
D
E
F
G
1000
1000
1000
1000
1000
Woda
875
835
835
825
825
775
775
NH4Cl
50
50
50
50
50
50
50
Rotenon
5
5
5
5
5
5
5
Triton X-100
10
10
10
10
10
10
10
ADP
-
40
-
-
-
-
-
Leucyna
-
-
40
-
-
40
40
Gentamycyna
-
-
-
50
-
50
-
Chlorochina
-
-
-
-
50
-
50
Po zamieszaniu zawartości kuwety zmierzyć wartość absorpcji mieszaniny, Dodać taką ilość
koenzymu by wartość absorpcji zawierała się w granicach 0,7 -0,9 (ok. 30 µl) Następnie dodać
10µl mitochondriów , zamieszać i włączyć stoper. Po minucie rozpocząć pomiary zmian
absorpcji wywołane utlenieniem NADH. Notować zmiany absorpcji co 15 sekund przez 2
21
minuty. Następnie dodać 20 µl roztworu 2–oksoglutaranu w celu rozpoczęcia reakcji.
Zawartość kuwety zmieszać i notować zmiany absorpcji co 15 sekund przez 3 minuty. Jeżeli
zmiany absorbcji w czasie przekraczają 0,12 /min do pomiaru dodawać mniejsze ilości
mitochondriów. Po zakończeniu pomiaru zawartość kuwety wylać, a kuwetę dokładnie
wypłukać. Białko mitochondrialne oznaczyć metodą biuretową.
C. Opracowanie wyników
Obliczyć aktywność enzymu w każdej próbie, obliczając zmiany absorbcji w czasie. Do
obliczen uwzględnić szybkość początkową reakcji a także szybkość utleniania NADH pod
nieobecność substratu (2-oksoglutaranu). Wyniki podać w nmolach x min-1 x mg-1 białka
mitochondrialnego na minutę. Milimolowy współczynnik absorbcji NADH wynosi 6,22.
22
OZNACZANIE FOSFORU METODĄ FISKE -SUBBAROWA
Podstawą metody jest reakcja jonów ortofosforanowych z molibdenianem amonowym w
środowisku kwaśnym. Powstającą sól amonową o żółtym zabarwieniu poddaje się reakcji z
odczynnikiem redukującym (Eiokonogen), w ktrórej wyniku molibd en związany w soli
kompleksowej ulega redukcji do niższych tlenków molibdenu dając tzw błekit molibdenowy.
Odczynniki
1. Roztwór fosforanu zawierający 1 mg fosforu/ml
2. Roztwór wzorcowy fosforanu o stężeniu 10 µg fosforu/ml. (Przygotować odpowiednio
rozcieńczając roztwór 1)
3. 10 % kwas trójchlorooctowy (TCA) (zrobiony, pod wyciągiem)
4. 25 % molibdenian amonu w 2,5 M kwasie siarkowym (zrobiony, pod wyciągiem)
5. Odczynnik redukujący (Eikonogen) ) (zrobiony, RT)
(przygotowanie krzywej wzorcowej)
Wykonanie
Do próbówek na 10 ml odmierzyć wg schematu (w ml):
Nr probówki
Roztwór
Woda
wzorcowy
Fosfor w próbie
(µg)
fosforanu
1
-
2,5
0
2,3
0,5
2,0
5
4,5
1,0
1,5
10
6,7
1,5
1,0
15
8,9
2,0
0,5
20
Do każdej probówki odmierzyć wg kolejności; 1,5 ml roztworu TCA, 0,5 ml roztworu
molibdenianu i 0,2 ml roztw. Eikonogenu. Próby wymieszać i po 10 min zmierzyć absorbcję
prób przy 660 nm wobec próby odniesienia.
23
OZNACZANIE BIAŁKA METODĄ BIURETOWĄ
Metoda polega na pomiarze stężenia barwnego kompleksu powstałego między wiązaniami
peptydowymi i jonami miedziowymi w środowisku alkalicznym.
Odczynniki
1. Odczynnik biuretowy (gotowy)
2. 10 % roztwór dezoksycholanu sodowego (gotowy)
Wykonanie
Przygotować 3 czyste probówki. Do probówki nr 1 odpipetować 0,9 ml wody i 0,1 ml
dezoksycholanu; do probówek 2 i 3; 50 zawiesiny mitochondriów, 0,1 ml dezoksycholanu i 0,
85 ml wody destylowanej. Następnie do wszystkich probówek dodać 4 ml odczynnika
biuretowego , zawartość wymieszać i po 30 min zmierzyć absorbancję prób przy 540 nm
wobec próby odniesienia (nr 1). Zawartość białka obliczyć posługując się podanym przez
prowadzącego ćwiczenia współczynnikiem [F], wyznaczonym wcześniej dla odczynnika
biuretowego. F x Absorb. = [ mg białka w próbie kolorymetrycznej].
24