Charakterystyka potencjału inwazyjnego enteroagregacyjnych

Charakterystyka potencjału inwazyjnego enteroagregacyjnych

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2012 • Volume 48 • Number 4 • 393-398
Praca oryginalna • Original Article
Charakterystyka potencjału inwazyjnego
enteroagregacyjnych szczepów Escherichia coli
izolowanych od osób z zespołem jelita nadwrażliwego
Characteristics of invasive potential of enteroaggregative
Escherichia coli strains isolated from individuals with irritable
bowel syndrome
Anna Krystyna Duda, Beata Sobieszczańska
Katedra i Zakład Mikrobiologii Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu
Streszczenie
Zespół jelita nadwrażliwego (IBS, ang. irritable bowel syndrome) jest przewlekłym, czynnościowym zaburzeniem funkcji jelit.
Chociaż wśród czynników predysponujących do rozwoju IBS wymienia się m.in. przebyte, bakteryjne zakażenia przewodu
pokarmowego, dokładna rola bakterii w patomechanizmie tej jednostki chorobowej jest nieznana. Opisana zdolność inwazji
enteroagregacyjnych szczepów E. coli (EAEC) do komórek nabłonka jelita oraz częsta izolacja tych bakterii od osób z IBS
dały podstawę niniejszym badaniom, których celem była ocena zdolności inwazyjnych EAEC izolowanych od osób z IBS oraz
genów kodujących inwazyny u tych szczepów. Ponadto w pracy oceniano aktywność mucynolityczną badanych szczepów
EAEC. Zdolności inwazyjne EAEC oceniono w teście inwazji in vitro do komórek nabłonka jelita cienkiego linii Int407, natomiast obecność genów kodujących inwazyny oznaczano w reakcji PCR. Większość badanych szczepów EAEC była internalizowana in vitro przez komórki nabłonka jelita oraz posiadała geny inwazji. Jedna trzecia badanych szczepów EAEC wykazała
aktywność mucynolityczną. Zdolność inwazji do komórek nabłonka szczepów EAEC może odpowiadać za przewlekły charakter zakażeń wywoływanych przez te patogeny.
Summary
Irritable bowel syndrome is a chronic, functional intestinal disorder. Despite the fact that among the factors predisposing to the
development of IBS a history of bacterial gastrointestinal infections is mentioned, the exact role of bacteria in the pathogenesis
of this disease is unknown.
Invasive abilities of enteroaggregative E. coli (EAEC) to the intestinal epithelial cells and frequent isolation of these strains
from individuals with IBS was the basis of this research. The purpose of the study was to assess the invasion ability and the
presence of invasion genes among EAEC isolated from individuals with IBS. Moreover, in the study the mucinase activity was
examined. The invasive capability of EAEC was evaluated by an in vitro invasion assay into the intestinal epithelial cells Int407
whereas the genes involved in the invasiveness were determined by PCR. Most of EAEC strains showed invasion capability
and invasion genes determined. About one third of these strains showed mucinolytic activity. Invasion capability of EAEC strains examined may account for the chronic nature of infections caused by these pathogens.
Słowa kluczowe:enteroagregacyjne E. coli, inwazja, mucynaza, zespół jelita nadwrażliwego
Key words:enteroaggregative E. coli, invasion, mucinase, irritable bowel syndrome
Wstęp
Enteroagregacyjne szczepy Escherichia coli (E. coli; EAEC)
są grupą patogennych szczepów E. coli odpowiedzialnych
za ostre i przewlekłe zakażenia jelit u dzieci i osób dorosłych na całym świecie. Charakterystyczny sposób adhezji
do komórek nabłonka jelit, w postaci agregatów przypominających stosy cegieł, jest cechą swoistą EAEC, różniącą je od
innych patogennych szczepów E. coli. EAEC są niezwykle
zróżnicowane pod względem prezentowanych czynników
wirulencji, które z łatwością nabywają na drodze horyzontalnego transferu genów od innych patogenów przewodu
pokarmowego. Kilkuetapowy patomechanizm zakażenia
wywoływanego przez EAEC obejmuje: a) adhezję do komórek nabłonka jelita za pośrednictwem swoistych dla tej grupy
393
Charakterystyka potencjału inwazyjnego enteroagregacyjnych szczepów Escherichia coli izolowanych od osób ...
E. coli fimbrii agregacyjnych; b) stymulację gruczołów błony śluzowej jelita do sekrecji śluzu, w którym EAEC tworzą
biofilm; c) wydzielanie enterotoksyn i/lub cytotoksyn, które
modulują aktywność sekrecyjną enterocytów lub powodują
ich uszkodzenie [1]. Ważnym czynnikiem wirulencji niektórych szczepów EAEC, a także pałeczek Shigella spp. jest
proteaza serynowa Pic (ang. protease involved in intestinal
colonization) o aktywności mucynazy. Mucynaza Pic indukuje sekrecję śluzu przez komórki kubkowe błony śluzowej
jelita, co odpowiada za śluzowy charakter biegunek oraz
degraduje mucyny zawarte w śluzie, co z kolei ułatwia tym
patogenom osiąganie powierzchni nabłonka i przewlekłą kolonizację jelit [2]. Ponadto, niektóre szczepy EAEC wykazują
zdolność inwazji do komórek nabłonka jelita [1]. Przebieg
zakażenia w dużej mierze zależy więc od czynników wirulencji jakimi dysponują szczepy EAEC.
Zespół jelita nadwrażliwego (IBS) jest czynnościowym zaburzeniem funkcji jelit o nieznanej etiologii, które dotyczy ok.
3-10% populacji. Wśród potencjalnych czynników mogących
indukować rozwój IBS wymieniane są: płeć, długotrwała antybiotykoterapia, stres, zabiegi chirurgiczne w obrębie jamy
brzusznej, nadwrażliwość mięśni jelit, nadużywanie alkoholu, mocnej kawy i herbaty oraz zakażenia bakteryjne. Objawy kliniczne, towarzyszące IBS obejmują kurczowe bóle
brzucha, dyskomfort, uczucie niepełnego wypróżnienia, zaburzenia rytmu wypróżnień [3, 4]. Po-zakaźna postać IBS,
której dominującym objawem klinicznym jest uporczywa biegunka, najczęściej jest skutkiem przebytego zakażenia przewodu pokarmowego, choć dotychczas nie zidentyfikowano
żadnego, konkretnego drobnoustroju, mogącego indukować
rozwój tej postaci IBS. Po-zakaźna postać IBS łączona jest
z przebytym zakażeniem wywołanym przez bakterie (np.:
E. coli., Campylobacter jejuni, Shigella spp.,) lub pasożyty (np.: Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Trichinella
spp.) pomimo, że nie udowodniono roli żadnego z tych patogenów w rozwoju IBS [5]. Z biegunkową postacią IBS łączone są również szczepy EAEC, które izolowano od ponad
80% osób cierpiących na IBS i tylko od ok. 32% dorosłych
osób zdrowych [6].
Celem badań była charakterystyka potencjału inwazyjnego
tj., ocena częstości występowania genów kodujących inwazyny rozpowszechnione wśród patogennych szczepów
E. coli oraz zdolności inwazji do ludzkich komórek nabłonka jelita linii Int407 szczepów EAEC izolowanych od osób
z IBS. Ponadto, w pracy oceniano zdolność badanych szczepów EAEC do degradacji mucyny.
Materiały i metody
Szczepy bakterii. Badania przeprowadzono na 47 archiwalnych szczepach E. coli: 36 szczepów pochodziło z próbek
kału osób dorosłych (średni wiek 43 lata) z biegunkową
postacią IBS (grupa EAEC-IBS), rozpoznaną na podstawie
Kryteriów Rzymskich II w Klinice Gastroenterologii i Hepatologii Akademii Medycznej we Wrocławiu; 11 szczepów
uzyskano od osób zdrowych (ochotników nie zgłaszających
394
żadnych dolegliwości ze strony przewodu pokarmowego
w okresie uzyskania materiału), w tym samym przedziale
wiekowym (grupa EAEC-zdrowi). Badane szczepy E. coli
zakwalifikowano do grupy EAEC na podstawie testu adhezji
in vitro do komórek nabłonka linii HEp-2 (Ryc. 1). Przyna-
Rycina 1.
leżność badanych szczepów do gatunku E. coli potwierdzono komercyjnymi zestawami biochemicznymi (API32GN,
BioMerieux). Jako kontrole dodatnie do oznaczenia genów
inwazji oraz w teście inwazji in vitro wykorzystano następujące szczepy referencyjne: enteroagregacyjny szczep E. coli
17-2 aggB – dodatni; ipaH – dodatni szczep Shigella flexneri
(ATCCTM12022); tia – dodatni enterotoksynogenny szczep
E. coli (ETEC) (ATCCTM35401); afaD – dodatni szczep
E. coli o rozsianym typie adhezji (DAEC) izolowany od dziecka z biegunką. Jako kontrolę ujemną we wszystkich wykonanych oznaczeniach użyto niepatogennego, nieinwazyjnego
szczepu E. coli K12C600. Wszystkie badane szczepy przechowywano w bulionie Luria (LB) z 15% glicerolem w temp.
– 800C. Przed wykonaniem badań szczepy wysiewano na
podłoże wybiórczo-różnicujące MacConkeya.
Test inwazji. Zdolność ludzkich komórek nabłonka jelita
cienkiego linii Int407(ATCC CCL6) do internalizacji in vitro
badanych szczepów E. coli określano powszechnie stosowanym testem z gentamycyną wg Boudeau i wsp. [7]. Gentamycyna nie penetruje do komórek, więc pałeczki E. coli,
które wnikają do komórek (wewnątrzkomórkowe) przeżywają ekspozycję na wysokie stężenia gentamycyny, w przeciwieństwie do bakterii zlokalizowanych zewnątrzkomórkowo.
Komórki nabłonka linii Int407 hodowano do czasu uzyskania jednowarstwowej hodowli (monolayer) w podłożu MEM
(minimal essential medium; Gibco BRL) wzbogaconym 10%
surowicą płodową bydlęcą (FBS; Gibco BRL) oraz roztworem antybiotyków (penicylina 100U, streptomycyna 100
μg/ml, amfoterycyna B 0,25 μg/ml; Sigma-Aldrich) w 370C,
w wilgotnej atmosferze wzbogaconej 5% CO2. Przed wykonaniem testu inwazji komórki płukano, trypsynizowano
i po odwirowaniu (1000 rpm; 10 min) zawieszano w świeżym
podłożu MEM. Zawiesinę komórek (o gęstości 4x105 komórek/ml) wsiewano (po 0,5 ml) do dołków 24-dołkowej płytki do
hodowli komórek (NUNC) i inkubowano do następnego dnia.
Przed zakażeniem komórki płukano dwukrotnie roztworem
soli fizjologicznej (0,9% roztwór NaCl) w celu odpłukania antybiotyków. Badane szczepy E. coli do zakażenia komórek
przygotowywano w następujący sposób: całonocne hodowle szczepów w LB (Luria broth) odwirowywano (16400 rpm;
5 min), uzyskane osady bakterii zawieszano w podłożu MEM
z 2% FBS bez antybiotyków do uzyskania gęstości optycznej
OD≅ 1,5x108 cfu/ml. Tak przygotowywanymi zawiesinami
szczepów E. coli zakażano komórki nabłonka linii Int407 (0,5
ml zawiesiny E. coli na dołek). Płytki z zakażonymi komórkami wirowano (1200 rpm, 10 min) w celu ułatwienia kontaktu bakterii z powierzchnią komórek i inkubowano 4 godz.
w temp. 370C w atmosferze 5% CO2. Po inkubacji komórki
płukano trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć
niezwiązane z komórkami bakterie i dodawano świeże podłoże MEM z 2% FBS i gentamycyną w stężeniu 100 μg/ml
w celu zabicia zewnątrzkomórkowych bakterii przylegających do komórek. Płytki ponownie inkubowano w temp. 370C
w atmosferze 5% CO2 przez 1 godz. Po inkubacji komórki
płukano trzykrotnie i lizowano, dodając do każdego dołka
0,5 ml wodnego roztworu 1% Triton X-100 w celu uwolnienia wewnątrzkomórkowych bakterii. Po 10 min. Inkubacji
z wytrząsaniem z każdego dołka płytki pobierano 100 µl lizatu komórek, który rozcieńczano solą fizjologiczną w postępie
geometrycznym w szeregu probówek i posiewano na podłoże MacConkeya. Po całonocnej inkubacji liczono wyrosłe
kolonie bakteryjne. Liczbę bakterii w 1 ml lizatu obliczano
ze wzoru:
gdzie:
cfu/ml – liczba bakterii w 1 ml lizatu
n - liczba wyrosłych kolonii
10-x – rozcieńczenie lizatu posiewane na podłoże stałe
0,1 ml – objętość wysiewanego lizatu
Za zdolne do inwazji przyjmowano szczepy, dla których średnia liczba wewnątrzkomórkowych bakterii była większa lub
równa liczbie kolonii referencyjnego, inwazyjnego szczepu
Shigella flexneri (ATCCTM12022) tj. wartości ≥ 104 cfu/ml.
Wykrywanie genów inwazji. Geny kodujące inwazyny występujące u chorobotwórczych szczepów E. coli tj.: gen ipaH,
kodujący inwazynę enteroinwazyjnych E. coli (EIEC) i pałeczek Shigella, gen tia, odpowiedzialny za ekspresję inwazyny
enterotoksynogennych E. coli (ETEC), gen afaD, kodujący
inwazynę szczepów DAEC oraz gen aggB, kodujący inwazynę swoistą dla EAEC oznaczano w reakcji PCR. Sekwencje
starterów zastosowanych w reakcji PCR oraz warunki reakcji
podano w Tabeli I. Do oznaczenia genów afaD i aggB zastosowano startery zaprojektowane w naszym laboratorium za pomocą programu Web Primers. Sekwencję starterów dla genu
afaD (Forward: pozycje 7479 do 7498 i Reverse: pozycje
7853 do 7870) opracowano na podstawie sekwencji klastera afa-3 szczepu E. coli A30 izolowanego od chorego
z zapaleniem pęcherza moczowego (Gen-Bank accession
number: X76688). Natomiast sekwencję starterów dla genu
aggB (Forward: pozycje 3460 do 3480 i Reverse: pozycje
3857 do 3880) opracowano na podstawie sekwencji klastera AAF/I referencyjnego enteroagregacyjnego szczepu
E. coli 17-2 (Gen-Bank accession number: U12894). Matrycę DNA do testu PCR stanowił supernatant z lizatów bakterii gotowanych przez 10 minut w łaźni wodnej, a następnie
odwirowanych (1200 rpm, 10 min, 40C). Ujemne lub wątpliwe wyniki testu PCR powtarzano z oczyszczonym DNA
genomowym lub plazmidowym. DNA genomowe izolowano
metodą fenolowo-chloroformową wg Wilson [8] z modyfikacjami. Osad uzyskany z całonocnych hodowli bulionowych (LB) badanych szczepów zawieszano w 1ml buforu S
(1 M Tris-HCl, pH=8; 0,5 M EDTA, pH=8, 5 M NaCl, 10%
CTAB tj. bromek heksadecylotrimetyloamonowy), dodawano
5 µl proteinazy K (10 mg/ml), mieszano i dodawano 100 µl
20% dodecylosiarczanu sodu (SDS). Mieszaninę inkubowano
1 godz. w 650C, a następnie dodawano 500 µl mieszaniny
fenolu i chloroformu (1:1) i po wymieszaniu wirowano (6000
rpm; 10 min). Uzyskany supernatant przenoszono do nowej
probówki Eppendorf, dodawano 0,6 objętości wodnego 99%
roztworu izopropanolu (Isopropanol; Sigma-Aldrich) i wirowano (3600 rpm; 5 min). Do uzyskanego osadu DNA dodawano 1 µl RNA-zy (10 mg/ml) i inkubowano 30 min w 370C.
Po dodaniu 25 µl roztworu fenolu w 10 mMTris-HCl, próbki
mieszano i wirowano (6000 rpm; 10 min). Uzyskany supernatant przenoszono do nowej probówki Eppendorf i dodawano 1/10 objętości 3 M octanu sodu oraz 2 objętości 96%
Tabela I
Sekwencje starterów dla oznaczanych genów inwazji.
Gen
Startery 5’-3’
Produkt (bp)
Warunki reakcji
PCR
Piśmiennictwo
afaD
GTCACCTGCGGGATGTTACT
GCTCCGCCAACCGAAAAC
392
94 C1 min;
720C 45 s
60 C 45 s;
(34 cykle)
[badania własne]
tia
ACCAGCGCTTCCGTCAGG
GCCAGATTCATTCCAGGAGG
382
940C1 min;
720C 1 min
550C 1 min;
(30 cykli)
[19]
ipaH
GCTGGAAAAACTCAGTGCCT
CCAGTCCGTAAATTCATTCT
424
940C 1 min;
560C 2 min;
(29 cykli)
[20]
GCATATTACCGATGTCCTGCG
CCTCTTGATATTAGACATTCA
421
580C 30 s;
(29 cykli)
[badania własne]
aggB
0
72 C 1 min;
0
950C 1 min;
620C 45 s;
0
395
Charakterystyka potencjału inwazyjnego enteroagregacyjnych szczepów Escherichia coli izolowanych od osób ...
Wyniki
Test inwazji. Wśród przebadanych 36 szczepów EAEC-IBS,
23 (63,8%) szczepy wnikały do komórek linii Int407 na poziomie równym lub większym niż referencyjny szczep Shigella flexneri, tj. ≥104cfu/ml. W grupie 11 szczepów EAEC
etanolu. Po odwirowaniu (4600 rpm; 5 min) osad zawierający DNA zawieszano w 20 µl H2O (miliQ). DNA plazmidowe
izolowano metodą lizy alkalicznej wg Birnboim [9] z modyfikacjami. Osady z całonocnych hodowli badanych szczepów
EAEC zawieszano w 100 µl roztworu GTE (50 mM glukoza,
25 mM Tris-HCl; pH=8, 10 mM EDTA) z dodatkiem 10 µl lizozymu (10 mg/ml). Mieszaniny inkubowano w temperaturze
pokojowej przez 15 minut, a następnie dodawano 200 µl roztworu NaOH/SDS (0,2 M NaOH, 1% SDS) i inkubowano na
lodzie przez 5 min. Po inkubacji próbki mieszano ze 150 µl
3 M roztworu octanu potasu i wirowano (16400 rpm; 5 min).
Uzyskany supernatant przenoszono do nowej probówki Eppendorf, dodawano 0,8 ml 96% zimnego etanolu i wirowano
(16400 rpm; 2 min). Uzyskany osad DNA płukano w 0,5 ml
70% etanolu i zawieszano w 30 µl H20 (miliQ). Amplifikację
DNA przeprowadzono w termocyklerze MJ Research, PTC200 (Peltier Thermal Cycler).
Oznaczanie aktywności mucynolitycznej. Aktywność mucynolityczną badanych szczepów E. coli, świadczącą o ich
zdolności wytwarzania mucynazy Pic, oznaczano na podłożu Luria agar z 0,28% mucyną (LA/M) (Bovine Mucin; Sigma-Aldrich) wg Gessner [10] z modyfikacjami. Całonocne
hodowle badanych szczepów EAEC wkłuwano punktowo
w agar LA/M i inkubowano w temp. 370C przez 48 godz. Wyrosłe punktowo hodowle EAEC na podłożu LA/M zalewano
2 ml 1% roztworu CaCl2.
Statystyczna analiza wyników. Do statystycznej analizy
wyników zastosowano test χ2 Pearsona. Wartości p≤0,05
przyjmowano za statystycznie znamienne.
od osób zdrowych, 10 (90,9%) szczepów wykazało zdolność
inwazji na poziomie porównywalnym do szczepu referencyjnego. Nie wykazano różnic statystycznych w zdolności inwazji szczepów EAEC izolowanych od osób z IBS i zdrowych
(p=0,08). Jednakże istotne statystyczne różnice dotyczyły
ilości szczepów obu grup, które wnikały do komórek nabłonka w ilości ≥104 cfu/ml. W grupie szczepów EAEC-IBS było
to 16 (44,4%) izolatów, natomiast w grupie EAEC-zdrowi
2 (18,2%) szczepów (p=0,006). Podobnie, W grupie EAECzdrowi znacznie więcej szczepów było internalizowanych
w liczbie ≥105 cfu/ml niż w grupie EAEC-IBS (p=0,005) (Tabela II).
Geny inwazji. Wyniki oznaczeń genów inwazji przedstawiono w Tabeli III. Analiza statystyczna nie wykazała różnic
w częstości występowania oznaczanych genów inwazji
wśród badanych szczepów obu grup tj. EAEC-IBS i EAECzdrowi (p>0,05). Nie wykazano również korelacji pomiędzy
poziomem inwazji badanych EAEC a obecnością oznaczanych genów inwazyn. Cztery (8,5%) spośród 47 badanych
szczepów EAEC (2 szczepy od osób z IBS i 2 szczepy od
osób zdrowych), które nie posiadały żadnego z oznaczanych genów inwazji również wnikały do komórek nabłonka
na poziomie ≥104-105 cfu/ml. W grupie EAEC-IBS 8 (22,2%)
szczepów, natomiast w grupie EAEC-zdrowi 5 (45,4%)
Tabela II
Porównanie liczby szczepów EAEC-IBS i EAEC-zdrowi internalizowanych przez komórki nabłonka Int407.
Liczba szczepów (%)
Brak internalizacji
IBS n=36
Zdrowi n=11
7 (20,4)
1 (9,1)
p=0,4
6 (16,7)
16 (44,4)
7 (20,4)
0
8,2 x 104
0
2 (18,2)
7 (63,6)
1 (9,1)
3,8 x 105
p=0,1
p=0,006
p=0,005
p=0,06
Internalizacja (cfu/ml)
≥ 10
≥ 10
≥ 10
≥ 10
3
4
5
6
Średnia liczba internalizowanych bakterii
IBS, zespół jelita nadwrażliwego; cfu, liczba kolonii bakteryjnych (colony forming units)
Tabela III
Częstość występowania oznaczanych genów inwazji wśród badanych szczepów EAEC.
Liczba szczepów (%)
Grupa
aggB
afaD
ipaH
tia
2 geny
3 geny
IBS
n=36
Zdrowi
n=11
17
(47,3)
3
(27,3)
10
(27,8)
5
(45,4)
7
(19,4)
4
(36,4)
8
(22,2)
3
(27,3)
7
(19,4)
4
(36,4)
1
(2,8)
1
(9,1)
Razem
n=47
20
(42,5)
15
(31,9)
11
(23,4)
11
(23,4)
11
(23,4)
2
(4,2)
IBS, zespół jelita nadwrażliwego
396
szczepów, wykazało dwa lub trzy różne geny inwazji (np.:
aggB+afaD lub ipaH+afaD+aggB). Ilość wykrywanych genów inwazji nie korelowała jednak ze zdolnością i poziomem
inwazji badanych szczepów.
Aktywność mucynolityczna. Zdolność degradacji mucyny
na podłożu LA/M (tj. obecność strefy przejaśnienia wokół
kolonii) wykazało 13 (36,1%) szczepów EAEC-IBS oraz 2
(18,2%) szczepy z grupy EAEC-zdrowi (p=0,2) (Ryc. 2).
Rycina 2.
Dyskusja
Inwazja do komórek nabłonka jelita stanowi podstawę patomechanizmu zakażeń wywoływanych przez inwazyjne
patogeny przewodu pokarmowego m.in. Salmonella spp.,
Shigella spp., Yersinia spp. oraz EIEC. Wewnątrzkomórkowa lokalizacja zapewnia ochronę przed układem immunologicznym gospodarza, a także niesprzyjającymi warunkami
panującymi w świetle jelita (np.: niekorzystnym wpływem
metabolitów flory komensalnej jelit). Poza tym, wewnątrzkomórkowa lokalizacja zapewnia patogenom dostęp do składników odżywczych i możliwość okresowego wysiewania się
do światła jelita lub inwazji do sąsiednich komórek nabłonka
[11]. Pereira i wsp. [12] wykazali in vitro zdolność szczepów
EAEC izolowanych od dzieci z biegunką do inwazji spolaryzowanych oraz niespolaryzowanych komórek nabłonka,
a także namnażanie się tych szczepów wewnątrz komórek
przez wiele godzin. Zlokalizowane w obrębie komórek nabłonka drobnoustroje mogą stanowić niebezpieczne źródło
przewlekłych zakażeń przewodu pokarmowego i utrzymującego się stanu zapalnego błony śluzowej jelit, który ostatecznie może doprowadzić do rozwoju zaburzenia funkcji
jelit m.in. IBS. W wykonanym teście inwazji większość badanych szczepów EAEC (niezależnie od tego czy szczepy
te pochodziły od osób zdrowych, czy osób z IBS) wykazała
zdolność inwazji in vitro do komórek nabłonka jelita. Częściej cecha inwazji związana była ze szczepami EAEC od
osób zdrowych, co wskazuje, że osoby te – nosiciele, mogą
stanowić źródło tych szczepów dla osób wrażliwych. Inwazyjny potencjał patogenów jelitowych u osób z prawidłową
florą jelit jest zwykle hamowany przez metabolity mikroflory m.in. krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe oraz szczepy
probiotyczne, co może tłumaczyć brak objawów klinicznych
zakażenia u osób zdrowych [13].
Inwazja patogenów przewodu pokarmowego takich jak:
Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp. do komórek
gospodarza kodowana jest przez zespoły genów chromosomalnych i/lub plazmidowych, które mogą rozprzestrzeniać się wśród pałeczek jelitowych na drodze koniugacji
lub transdukcji [14]. Inwazyną swoistą dla EAEC jest białko
AggB, które na podstawie podobieństw strukturalnych do
rodziny inwazyn AfaD, charakterystycznych dla szczepów
DAEC, uważane jest za inwazynę promującą internalizację szczepów EAEC do komórek nabłonka [15, 16]. Gen kodujący inwazynę AggB był najczęściej wykrywanym genem
inwazji wśród badanych szczepów EAEC. Obecność genu
kodującego białko AggB u prawie połowy szczepów EAEC
izolowanych od osób z IBS oraz 27% osób zdrowych, wskazuje na jego szerokie rozpowszechnienie wśród tej grupy
patogennych E. coli. Jednakże brak statystycznie istotnych
różnic w częstości występowania inwazyny AggB oraz brak
korelacji pomiędzy obecnością tego antygenu a zdolnością
i poziomem inwazji badanych szczepów EAEC, wskazują,
że inwazyna ta może odgrywać rolę pomocniczą w procesie
internalizacji AggB-dodatnich EAEC do komórek nabłonka,
natomiast za proces inwazji odpowiedzialna jest inna, nieznana inwazyna. Ponadto, obecność genu, wykryta w reakcji PCR, niekoniecznie oznacza jego ekspresję, co mogłoby
tłumaczyć brak korelacji pomiędzy obecnością tego genu
a poziomem inwazji u badanych szczepów EAEC. Nieustalona ostatecznie funkcja białka AggB w procesie inwazji EAEC
oraz nieznana częstość jego rozpowszechnienia wśród tych
szczepów izolowanych na świecie utrudniła analizę uzyskanych wyników oznaczeń. Dodatkowo, wiele badanych
szczepów EAEC prezentowało obok inwazyny AggB, obecność innych genów inwazji, co mogło wpłynąć na wynik testu
inwazji.
Poza inwazyną AggB, drugim najczęściej występującym genem inwazji wśród badanych szczepów EAEC był gen afaD,
kodujący inwazynę swoistą dla DAEC. Białko AfaD jest
składnikiem osłonki adhezyn afimbrialnych syntetyzowanych
przez uropatogenne szczepy E. coli (UPEC), odpowiedzialne za zakażenia układu moczowego oraz biegunki u małych
dzieci [17]. Według badań Jouve i wsp. [18] geny kodujące
adhezyny Afa posiada 11 – 32% UPEC. W wykonanych badaniach gen afaD częściej występował u szczepów EAEC
od osób zdrowych, niż wśród szczepów od osób z IBS, co
można wytłumaczyć faktem, że UPEC często kolonizują jelita osób zdrowych.
Wykonane badania wykazały po raz pierwszy obecność wśród
EAEC genów kodujących inwazyny swoiste dla ETEC, EIEC
i pałeczek Shigella spp. tj. geny tia i ipaH. Brak danych na
temat występowania tych inwazyn wśród EAEC izolowanych
na świecie uniemożliwił analizę częstości rozprzestrzeniania
tych inwazyn wśród badanych szczepów. Tym niemniej, ich
obecność u części badanych szczepów EAEC potwierdza
fakt łatwego nabywania przez nie różnych genów wirulencji
397
Charakterystyka potencjału inwazyjnego enteroagregacyjnych szczepów Escherichia coli izolowanych od osób ...
od innych patogenów przewodu pokarmowego. Analiza korelacji pomiędzy inwazją a obecnością oznaczonych genów
inwazji nie wykazała jednak żadnego związku z konkretnym,
oznaczanym genem. Co więcej, niektóre badane szczepy
prezentowały więcej niż jeden gen inwazji, co również nie
korelowało ze zdolnością inwazji tych szczepów. Uzyskane
wyniki wskazują na konieczność dalszych badań ekspresji
genów inwazji zlokalizowanych wewnątrzkomórkowo szczepów EAEC, co umożliwi wyjaśnienie roli wykrytych inwazyny
w procesie internalizacji EAEC przez nabłonek jelita.
afa-3 gene cluster are mediated by the AfaE and AfaD proteins,
respectively. Infect Immun 1997; 65: 4082-4085.
19. Darfeuille-Michaud A, Boudeau J, Bulois P, et al. High Prevalence of Adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn’s disease. Gastroenterol 2004; 127: 412421.
20. Dutta S, Chatterjee A, Dutta P, et al. Sensitivity and performance
characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison
to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. J Med Microbiol 2001; 50: 667- 674.
Piśmiennictwo:
Finansowanie badań: wykonane badania finansowane były z grantu
uczelnianego Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu nr 1278
1. Nataro JP, Steiner T, Guerrant RL. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis 1998; 4: 251-261.
2. Navarro-Garcia F, Gutierrez-Jimenez J, Garcia-Tovar C. Pic, an
autotransporter protein secreted by different pathogens in the
Enterobacteriaceae family, is a potent mucus secretagogue. Infect Immun 2010; 78: 4101-4109.
3. Olden KW. The challenge of diagnosing irritable bowel syndrome. Rev Gastroenterol Disord 2003; 3: 3-11.
4. Locke GR. Natural history of irritable bowel syndrome and durability of the diagnosis. Rev Gastroenterol Disord 2003; 3: 1217.
5. Morgan DR, Benshoff M, Cáceres M, et al. Irritable bowel
syndrome and gastrointestinal parasite infection in a developing nation environment. Gastroenterol Res Pract 2012, 2012:
343812.
6. Sobieszczańska BM, Osek J, Waśko-Czopnik D, et al. Association of enteroagreggative Escherichia coli with irritable bowel
syndrome. Clin Microbiol Infect 2007; 13: 404-407.
7. Boudeau J, Glasser AL, Masseret E, et al. Invasive ability of an
Escherichia coli strain isolated from the ileal mucosa of a patient
with Crohn’s disease. Infect Immun 1999; 67: 4499- 4509.
8. Wilson K. Preparation of genomic DNA from bacteria. Ausubel
FM & Brent R eds. Current Protocols in Molecular Biology, New
York: Greene Publ. Assoc. and Wiley Interscience, 1990: 241245.
9. Birnboim HC. A rapid alkaline extraction method for the isolation
of plasmid DNA. Methods Enzymol 1983; 100: 243-256.
10. Gessner AR, Mortensen JE. Pathogenic factors of Pseudomonas cepacia isolates from patients with cystic fibrosis. J Med
Microbiol 1990; 33: 115-120.
11. Huang DB, Dupont HL. Enteroaggregative Escherichia coli: an
emerging pathogen in children. Semin Pediatr Infect Dis 2004;
15: 266-271.
12. Pereira AC, Britto-Filho JD, de Carvalho JJ, et al. Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) strains enter and survive within
cultured intestinal epithelial cells. Microb Pathog 2008; 45: 310314.
13. Tuohy KM, Rouzaud GC, Bruck WM, et al. Modulation of the
human gut microflora towards improved health using prebiotics
– assesment of efficacy. Curr Pharm Des 2005; 11: 78-90.
14. Włodarczyk M. Różnorodność cech fenotypowych bakterii kodowanych przez plazmidy. Kosmos 2002; 51: 241-254.
15. Sobieszczańska BM. Agregacyjne E. coli ‑ nowa grupa szczepów E. coli odpowiedzialnych za biegunki. Post Mikrobiol 2003;
42: 139-160.
16. Garcia MI, Jouve M, Nataro JP, et al. Characterization of the
AfaD-like family of invasins encoded by pathogenic Escherichia
coli associated with intestinal and extra-intestinal infections.
FEBS Lett 2000; 479: 111-117.
17. Servin AL. Pathogenesis of Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli. Clin Microbiol Rev 2005; 18: 264-292.
18. Jouve M, Garcia MJ, Courcoux P, et al. Adhesion to and invasion of HeLa cells by pathogenic Escherichia coli carrying the
398
Adres do korespondencji:
mgr Anna Krystyna Duda
Katedra i Zakład Mikrobiologii
Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu
50-368 Wrocław, ul. Chałubińskiego 4
Tel. 71 7841278
e-mail: [email protected]
Zaakceptowano do publikacji: 24.10.2012