Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2012 • Volume 48 • Number 2 • 187-197
Praca poglądowa • Review Article
Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek
mikrobiologicznych w laboratorium medycznym
Quality assurance and quality control of microbiology culture
media in medical laboratory
Marzena Strzyż, Urszula Wendt
Laboratoria Medyczne BRUSS Grupa ALAB Sp. z o.o.
Streszczenie
Medyczne laboratorium mikrobiologiczne wdrażające system zarządzania jakością zobligowane jest do kontrolowania jakości
stosowanego wyposażenia, w tym także, pożywek mikrobiologicznych. Pożywki mikrobiologiczne odgrywają kluczową rolę
w badaniach mikrobiologicznych. Jakość pożywek determinuje możliwość wzrostu, prawidłową identyfikację i poprawną ocenę lekowrażliwości drobnoustrojów. W laboratoriach mikrobiologicznych kontrola pożywek służy sprawdzeniu ich jakości i potwierdzeniu ich przydatności do stosowania w badaniach mikrobiologicznych. Kontrola ta obejmuje ogólną ocenę właściwości
fizycznych i chemicznych oraz ocenę właściwości mikrobiologicznych takich jak jałowość, żyzność, selektywność, specyficzność oraz zdolność do oceny lekowrażliwości.
Summary
Medical microbiology laboratory which implement quality management system is obligated to control/ evaluation of quality of
equipment, including, microbiology culture media. Microbiology culture media play a key role in microbiology examinations.
Quality of culture media determinate possibility of growth, correct identification and accurate antimicrobial susceptibility testing. In medical laboratories control of culture media are used for control of their quality and for performance testing of culture
media. Quality control include general estimation of physical and chemical characteristics and estimation of microbiological
charakteristics like sterility, productivity, selectivity, specificity and ability for antimicrobial susceptibility testing.
Słowa kluczowe:kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych, pożywki mikrobiologiczne, właściwości mikrobiologiczne pożywek
Key words:quality control of microbiology culture media, microbiology culture media, microbiology characteristics of culture
media
Wstęp
Wdrożenie systemu zarządzania jakością w medycznym
laboratorium mikrobiologicznym wymaga uruchomienia
i utrzymywania mechanizmów zapewniających wiarygodność uzyskiwanych wyników badań. Zgodnie z ISO/IEC
17025 oraz ISO 15189 [1, 2], jednym z czynników istotnie
wpływających na jakość wyników badań jest wyposażenie
laboratorium, którym są nie tylko urządzenia badawczopomiarowe, ale także odczynniki, wzorce odniesienia, itp.
W przypadku badań mikrobiologicznych, dodatkowym elementem wyposażenia o szczególnym znaczeniu dla powtarzalności i wiarygodności wyników badań są pożywki mikrobiologiczne. Jakość pożywek determinuje bowiem, zarówno
możliwość wykrycia drobnoustrojów w badanej próbce, jak
też ich poprawnej identyfikacji i prawidłowej oceny lekowrażliwości. W procesie badawczym, nawet najlepiej dobrane
do określonego kierunku badania pożywki, ale niewłaściwej
jakości, mogą spowodować uzyskanie niewiarygodnego
wyniku. Jest to powód, dla którego pożywki mikrobiologiczne muszą odpowiadać określonym kryteriom jakościowym,
a laboratorium powinno zapewniać odpowiednią jakość pożywek oraz sprawdzać i potwierdzać spełnienie kryteriów
jakości pożywek.
W zależności od możliwości organizacyjnych, medyczne laboratoria mikrobiologiczne wykorzystują podłoża komercyjne lub przygotowują pożywki we własnym zakresie. Pożywki
komercyjne są dostarczane do laboratorium w postaci gotowej do użycia lub jako częściowo przygotowane pożywki
w postaci odwodnionych granulatów ewentualnie proszków,
z których należy przygotować pożywkę. Każda seria pożywki
dostarczana jest do laboratorium wraz z certyfikatem jakości,
w którym wytwórca potwierdza jej jakość. Certyfikat jakości
187
Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym
pożywki potwierdza wykonanie przez wytwórcę badań kontrolnych danej serii pożywki i przedstawia ich wyniki. W przypadku pożywek odwodnionych, certyfikat odnosi się do tej
postaci, w jakiej pożywkę dostarczono do laboratorium, gdyż
właściwości pożywki w jej ostatecznej postaci będą zależeć
od sposobu przygotowania pożywki do użycia przez laboratorium. W przypadku, gdy laboratorium samodzielnie przygotowuje pożywki, cała odpowiedzialność za zapewnienie
właściwości pożywek, tj. ich odpowiedniej jakości, spoczywa
na laboratorium. W tej sytuacji, laboratorium jest zobligowane do zapewnienia jakości pożywek poprzez standaryzację
procesu wytwarzania oraz samodzielnego kontrolowania ich
jakości poprzez sprawdzanie właściwości pożywek.
W celu określenia zakresu i częstotliwości kontroli pożywek
mikrobiologicznych należy posłużyć się dokumentami normatywnymi opisującymi wymagania odnośnie zapewniania
jakości pożywek w procesie wytwarzania oraz ich sprawdzania, tj. kontroli jakości. Dokumentami takimi są: norma
EN 12322 określająca kryteria oceny jakości pożywek do
diagnostyki in vitro [3] oraz specyfikacja techniczna ISO/TS
11133 [4, 5]. Specyfikacja ta składa się z dwóch części:
–– ISO/TS 11133-1 - dokument przedstawiający wytyczne
dotyczące kontrolowania jakości pożywek mikrobiologicznych przygotowywanych w laboratorium [4]
–– ISO/TS 11133-2 - dokument zawierający wytyczne przygotowywania i wytwarzania pożywek w laboratorium [5].
Zgodnie z wymaganiami ISO/IEC 17025 (pkt. 4.6.2) oraz
ISO 15189 (pkt. 4.6.2.), laboratorium powinno poddawać
sprawdzeniom wyposażenie i materiały, które w istotny sposób wpływają na wiarygodność wyników badań, przy czym
sprawdzeń tych, należy dokonywać przed użyciem danego wyposażenia w procesie badawczym [1, 2]. Oznacza
to, że ze względu na kluczową rolę pożywek w badaniach
mikrobiologicznych, należy sprawdzać także pożywki. O ile
kontrolowanie jakości pożywek wykonywanych w laboratorium wydaje się oczywiste, to jednak pojawia się pytanie
o konieczność sprawdzania pożywek komercyjnych. Odpowiedź na to pytanie można znaleźć w dokumencie EA-04/10
„Akredytacja laboratoriów mikrobiologicznych” [6], w którym
w pkt. 7 zapisano wymaganie, iż przed pierwszym użyciem,
sprawdzać należy zarówno pożywki przygotowywane w laboratoriach, jak i pożywki gotowe do użycia. Wyjątkiem są
gotowe do użycia lub częściowo przygotowane pożywki (pożywki suche), których wytwórca posiada potwierdzony odpowiednim certyfikatem system jakości jakim jest, np. system
zarządzania zgodny z wymaganiami normy ISO 9001 lub
ISO 13485 (system zarządzania obowiązujący wytwórców
wyposażenia do diagnostyki in vitro - przyp. autorów) [7, 8].
W takim przypadku, wykorzystywana jest bowiem zasada
„oczekiwania stałej jakości” dostaw, i laboratorium może
zakres sprawdzania jakości pożywek istotnie ograniczyć.
Zasada ta nie obowiązuje w przypadku wytwórców, którzy
nie posiadają potwierdzonego systemu zarządzania, czego
konsekwencją jest konieczność sprawdzania przez laboratorium jakości pożywek, mimo dostarczenia przez wytwórcę
188
certyfikatu jakości danej serii pożywki.
Od jakich czynników zależy jakość pożywek, na jakie etapy
i czynności procesu wytwarzania pożywek należy zwrócić
szczególną uwagę w celu zapewnienia ich jakości, jaki powinien być zakres i szczegółowość kontroli, jak przeprowadzić kontrolę pożywek mikrobiologicznych w laboratorium?
Niniejsze opracowanie ma na celu udzielenie odpowiedzi na
te pytania, szczególnie w odniesieniu do pożywek komercyjnych gotowych do użycia.
1. Parametry jakości pożywek mikrobiologicznych
W zależności od kryterium [9], pożywki mikrobiologiczne
można klasyfikować ze względu na:
–– skład: podłoża syntetyczne o ściśle określonym składzie
chemicznym i podłoża o nie w pełni zdefiniowanym składzie chemicznym ze względu na obecność składników pochodzenia naturalnego,
–– konsystencję: pożywki stałe, półpłynne i płynne,
–– zastosowanie: podłoża namnażające, różnicujące, wybiórcze, wybiórczo-różnicujące, transportowe, itd.
–– postać pożywki: pożywki gotowe do użycia, pożywki suche i niekompletne.
(Pochodzące z dokumentów normatywnych podstawowe
definicje dotyczące pożywek przedstawia Tabela I).
Jednak bez względu na postać, skład, stan czy przeznaczenie, pożywki mikrobiologiczne powinny posiadać odpowiednią jakość [3, 10, 11, 12]. Podstawowymi parametrami jakości pożywek są odpowiednie właściwości fizyczne
i chemiczne, a także właściwości mikrobiologiczne takie jak
jałowość oraz, zależne od składu chemicznego - żyzność,
selektywność, specyficzność i zdolność do badania wrażliwości drobnoustrojów na leki [3].
Wśród właściwości fizycznych jakimi powinna charakteryzować się pożywka o odpowiedniej jakości, można wymienić takie jak np. właściwa grubość warstwy i jednorodność
podłoża, prawidłowa wartość pH, itd. Każda z tych cech jest
na tyle istotna, że może warunkować użycie pożywki w procesie wykonania badania. Inną, ważną właściwością jest
jałowość pożywki, która zapewnia ograniczenie możliwości
uzyskania wyniku fałszywie dodatniego hodowli drobnoustrojów, będącego wynikiem zanieczyszczenia mikrobiologicznego pożywki przed jej użyciem do badań. Żyzność to
taka cecha, która świadczy o właściwościach odżywczych
pożywki wpływających na możliwość wzrostu drobnoustrojów. Pożywka charakteryzująca się odpowiednią żyznością
to pożywka umożliwiająca szybki i intensywny wzrost drobnoustrojów. Żyzność wskazuje czy pożywka posiada prawidłowy skład, tj. zawiera wszystkie niezbędne do wzrostu
drobnoustrojów składniki oraz czy stężenie tych składników
jest prawidłowe. Inną cechą użytkową pożywki jest selektywność (wybiórczość), świadcząca o zdolności pożywki do
wybiórczego hamowania wzrostu określonych grup drobnoustrojów. Cecha ta związana jest z obecnością w pożywce
takich składników (suplementów), które wybiórczo hamują
wzrost jednych drobnoustrojów, ale nie wpływają na możli-
Tabela I
Wybrane definicje dotyczące pożywek mikrobiologicznych, szczepów referencyjnych oraz kontroli właściwości pożywek.
Pożywka mikrobiologiczna to zestaw substancji w płynnej, półpłynnej lub stałej postaci, zawierający naturalne i/lub syntetyczne
składniki służące do namnożenia lub utrzymania przy życiu drobnoustrojów [PN-EN 1659:2004]
Partia pożywki mikrobiologicznej (seria pożywki) to w pełni możliwa do zidentyfikowania jednostka pochodząca z określonej masy
półproduktu lub gotowego produktu, jednolitego typu i jakości, która spełnia wymagania produkcyjne (kontrola w trakcie produkcji) i kryteria
zapewnienia jakości, wytworzona w tym samym zdefiniowanym okresie produkcyjnym i oznakowana tym samym numerem serii [PN-EN
12322:2005]
Pożywka gotowa do użycia to pożywka mikrobiologiczna, która jest dostarczona w pojemnikach, w formie gotowej do użycia (np.
w płytkach Petriego, w probówkach lub innych pojemnikach) [PN-EN 1659:2004]
Pożywka niekompletna to pożywka mikrobiologiczna, która wymaga co najmniej jeszcze jednego dodatkowego etapu pracy przed jej
zamierzonym użyciem (np. rozpuszczenia, wylania do płytek, rozporcjowania, dodania suplementu/suplementów) [PN-EN 1659:2004]
Pożywka sucha to pożywka mikrobiologiczna w postaci suchej, która nie jest gotowa do bezpośredniego użycia (np. proszki, granulaty, produkty liofilizowane) [PN-EN 1659:2004]
Szczep referencyjny to drobnoustrój oznaczony przynajmniej do poziomu rodzaju i gatunku, skatalogowany i opisany zgodnie z jego
właściwościami [PN-EN 12322:2005]
Szczep macierzysty to partia fiolek/pojemników z hodowlą uzyskaną w laboratorium z pojedynczego przesiewu szczepu referencyjnego lub wiele fiolek/pojemników z tej samej serii szczepu referencyjnego od dostawcy[PN-EN 12322:2005]
Szczep kontrolny to drobnoustrój używany do mikrobiologicznej oceny działania pożywek mikrobiologicznych [PN-EN 12322:2005]
wość jednoczesnego wzrostu innych drobnoustrojów. Dzięki tej właściwości pożywki, możemy hodować określone,
wybrane grupy drobnoustrojów. Specyficzność pożywki to
cecha zapewniająca właściwe różnicowanie drobnoustrojów wyhodowanych na danym podłożu. Rozróżnienie drobnoustrojów poprzez makroskopową ocenę stopnia nasilenia
reakcji biochemicznych i/lub fizjologicznych (np. wielkość
i kolor kolonii, obecność hemolizy, itp.) możliwe jest dzięki
obecności w pożywce odpowiednich składników różnicujących. Kolejną właściwością pożywek jest zdolność do oceny
wrażliwości drobnoustrojów na leki. Badanie lekowrażliwości wykonywane jest przy użyciu specjalnych pożywek, które mają umożliwić nie tylko wzrost drobnoustroju, ale także
właściwą dyfuzję leku w pożywce, dzięki czemu warunkują
prawidłowy wynik badania.
2. Czynniki wpływające na jakość pożywek mikrobiologicznych
W procesie wytwarzania pożywek, co dotyczy zarówno laboratorium jak i wytwórców pożywek komercyjnych, należy
zapewnić nadzorowanie wszystkich tych czynników i etapów
postępowania, które mogą mieć wpływ na jakość pożywek
mikrobiologicznych, tj. na ich właściwości fizyczne, chemiczne oraz właściwości mikrobiologiczne. Wśród czynników
o największym znaczeniu dla jakości pożywek można wymienić [3, 4, 5]:
–– jakość poszczególnych składników, w tym wody i suplementów, z których sporządzane są pożywki,
–– skład ilościowy pożywek warunkujący właściwości odżywcze,
–– sposób przeprowadzenia procedury przygotowania pożywek,
–– proces sterylizacji warunkujący jałowość pożywek,
–– sposób pakowania zabezpieczający przed wtórnym za-
nieczyszczeniem mikrobiologicznym, odwodnieniem, destrukcyjnym działaniem światła,
–– sposób i warunki przechowywania pożywek warunkujące
stabilność właściwości pożywek,
–– warunki transportu mające wpływ na stabilność pożywek.
Nadzorowanie wymienionych czynników poprzez standaryzację procesu wytwarzania i przechowywania pożywek
oraz wdrożenie odpowiednich mechanizmów kontrolnych
obejmujących, zarówno poszczególne etapy wytwarzania
pożywek, jak i sprawdzanie właściwości pożywki w jej końcowej postaci, są działaniami zapewniającymi, że do badań
mikrobiologicznych zostaną użyte pożywki o właściwej jakości.
2.1. Pożywki wykonywane w laboratorium
W przypadku laboratoriów samodzielnie wykonujących pożywki, istotne jest ustalenie zasad i mechanizmów nadzorowania wszystkich, oprócz transportu, etapów wytwarzania
pożywek wpływających na ich jakość [4, 5, 10, 12, 13].
Jakość podłoża bezpośrednio zależy od jakości surowców
stosowanych do jej wytworzenia, dlatego też zaleca się, aby
laboratorium dokonywało zakupu komponentów i suplementów pożywek u renomowanych dostawców. W przypadku
składników do sporządzania pożywek, ale także dla pożywek
częściowo przygotowanych dostarczanych do laboratorium
w postaci granulatu lub odwodnionego proszku, niezwykle
istotne jest kierowanie się zasadą first in - first out (pierwsze
przyszło – pierwsze wyszło) [4, 13]. Wykorzystywanie tego
typu składników i pożywek wiąże się z koniecznością sprawdzania szczelności opakowania, notowaniem daty pierwszego otwarcia oraz każdorazowym dokonywaniem oceny
wizualnej zawartości otwieranego pojemnika. W przypadku
stwierdzenia zmiany sypkości, zbrylenia, zmiany zabarwienia lub innych zmian fizyko-chemicznych, dane opakowanie
189
Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym
składnika lub pożywki należy odrzucić, a do przygotowania
pożywki użyć innego opakowania.
Jednym z głównych składników pożywek jest woda. W przypadku tego komponentu, parametry, które należy kontrolować to pH i przewodnictwo [13]. Prawidłowo, wartość pH
wody powinna mieścić się w zakresie od 5,5 do 7,5 [4, 13].
Wskaźnikiem stopnia czystości wody jest przewodność właściwa, która zależy od zawartości jonów soli organicznych
i nieorganicznych, w tym także jonów miedzi, których obecność w pożywce wpływa hamująco na wzrost drobnoustrojów. Prawidłowo, przewodność właściwa wody mierzona
w temperaturze 250C nie powinna przekraczać 25 µS cm-1 [4,
13]. Wyższa przewodność świadczy o zwiększonej zawartości jonów, a więc niskiej czystości wody. Jeśli pomiar jest
przeprowadzany w innej temperaturze, to w celu uzyskania
prawidłowego wyniku przewodności, należy zastosować odpowiedni współczynnik przeliczeniowy dla rzeczywistej temperatury, w której dokonano pomiaru.
W laboratorium, które samodzielnie przygotowuje pożywki, cały tok postępowania podczas przygotowywania i wytwarzania pożywek powinien być przeprowadzany zgodnie
z recepturą danej pożywki, ustaloną procedurą i szczegółowo dokumentowany. Dokumentacja ta powinna umożliwić
odtworzenie przebiegu całego procesu wytwarzania każdej
partii pożywek w celu oceny poprawności przygotowania pożywki do użycia.
Jałowość pożywki uzależniona jest od właściwego przeprowadzenia procesu sterylizacji. Sterylizację najczęściej wykonuje się za pomocą przegrzanej pary wodnej lub metodą
filtracji [14]. Sterylizację za pomocą pary wodnej przeprowadza się w autoklawie, a liczba pożywek jakie jednorazowo
można poddać procesowi sterylizacji i czas trwania powinny
być ściśle określone, bowiem podczas obróbki cieplej może
dojść do niepożądanych reakcji między poszczególnymi
składnikami pożywki lub do ich zniszczenia. Z tego powodu, cały proces sterylizacji powinien być stale monitorowany
poprzez sprawdzanie temperatury i ciśnienia. Dodatkowym
mechanizmem pozwalającym na ocenę poprawności procesu sterylizacji jest także monitorowanie skuteczności procesu sterylizacji za pomocą wskaźników fizycznych, chemicznych i biologicznych.
Jakość pożywki w dużej mierze zależy także od warunków
jej przechowywania [3, 4]. Pożywkom wytworzonym w laboratorium należy zapewnić takie warunki, aby uchronić je
przed zmianą składu i wtórnym zanieczyszczeniem mikrobiologicznym. Zgodnie ze specyfikacja techniczną ISO/TS
11133-1 zaleca się, aby pożywki chronić przed dostępem
światła, odwodnieniem i przechowywać je w temperaturze
5±30C [4]. W przypadku dłuższej ekspozycji na światło słoneczne lub sztuczne może dojść do zmian składu chemicznego pożywki, zaś odwodnienie może skutkować zmianą
stężenia poszczególnych jej składników. W konsekwencji,
w każdym z tych przypadków, dochodzi do zmian właściwości pożywki, a więc obniżenia jej jakości.
Specyfikacja ISO/TS 11133-1 zaleca także, aby pożywek
190
rozlanych na płytki nie przechowywać dłużej niż 2-4 tygodni,
zaś pożywek rozlanych do butelek i probówek – nie dłużej
niż 3-6 miesięcy [4]. Okres przechowywania danego typu
podłoża można modyfikować na podstawie wyników badań
wykonywanych podczas walidacji trwałości podłoża. Okres
przydatności pożywek można wydłużać jeśli będą one
przechowywane w szczelnych plastikowych opakowaniach
zbiorczych. W celu wyeliminowania nadmiernego skraplania
wody podczas przechowywania, płytki przed zamknięciem
należy schodzić.
Dla zapewnienia pełnej identyfikowalności stosowanych
podłoży, każda płytka powinna być dokładnie opisana, poprzez umieszczenie na spodzie lub z boku płytki, daty przygotowania i/lub daty ważności, a także kodu wskazującego
na rodzaj podłoża. Wszystkie te oznakowania umożliwiają
pełną identyfikację serii danej pożywki.
2.2. Pożywki gotowe do użycia
W przypadku podłóż gotowych do użycia odpowiednia jakość komponentów, prawidłowy skład pożywki, sposób
wytwarzania i sterylizacji, jej właściwości fizyko-chemiczne
i mikrobiologiczne gwarantowane są przez wytwórcę [7, 15].
Potwierdzeniem jakości danej serii pożywki jest stosowny
certyfikat jakości, który wytwórca zobowiązany jest dostarczyć do laboratorium. W przypadku pożywek gotowych do
użycia, jakość pożywki dostarczanej do laboratorium, zależy
głównie od warunków transportu do laboratorium i sposobu
przechowywania w laboratorium.
Podczas transportu do laboratorium, najczęściej zapewnianego i organizowanego przez wytwórcę lub dystrybutora,
pożywki powinny być zapakowane w sposób zabezpieczający je przed ewentualnymi uszkodzeniami mechanicznymi,
a warunki w jakich są transportowane powinny chronić je
przed przegrzaniem lub zamrożeniem oraz odwodnieniem.
Transportowanie i przechowywanie pożywek w temperaturze znacznie wyższej od zalecanej przez wytwórcę, może
doprowadzić do zmiany składu chemicznego pożywki (degradacja, niepożądane reakcje pomiędzy komponentami)
oraz zmiany stężenia składników pożywki, co w konsekwencji może spowodować pogorszenie właściwości pożywki
takich jak żyzność, selektywność i specyficzność. Następujące po sobie skrajne zmiany temperatury mogą natomiast
doprowadzić do pojawienia się na wieczku płytki z pożywką
wilgoci, spowodowanej nadmierną kondensacją wody [4].
Zamrożenie może spowodować, że pożywki agarowe zupełnie nie będą nadawać się do użycia w procesie diagnostycznym, zaś w pożywkach płynnych może dojść do wytrącenia
niektórych składników pożywki, co także uniemożliwia ich
stosowanie.
W przypadku komercyjnych podłóż gotowych do użycia,
laboratorium bezwzględnie powinno przestrzegać instrukcji
wytwórcy w zakresie warunków przechowywania oraz okresu przydatności pożywek do użycia. Informacje odnośnie
warunków przechowywania danej pożywki zawarte są w firmowej instrukcji technicznej pożywki (opisie pożywki).
3. Kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych
Kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych służy do
sprawdzania i/lub potwierdzania jakości, a tym samym,
przydatności pożywek do wykonywania rutynowych badań
mikrobiologicznych. Jak już wspomniano na wstępie, kontroli należy poddać pożywki wykonywane w laboratorium oraz
pożywki pochodzenia komercyjnego [6]. Kontrolę tę wykonuje się dla każdej serii pożywki stopniowo, etapami o różnym
poziomie szczegółowości [3, 4, 13, 15]. Pierwszym etapem
kontroli jest ocena ogólna, obejmująca określenie właściwości fizyko-chemicznych pożywki. Drugi etap, to ocena
szczegółowa obejmująca mikrobiologiczne kryteria jakości
pożywek charakteryzujące właściwości użytkowe pożywek,
tj. jałowość, żyzność, selektywność i specyficzność. Zgodnie
z EN 12322, daną partię pożywki można zaakceptować jako
przydatną do stosowania w procesie diagnostycznym, tzn.
uznać jej jakość za właściwą, jeśli jednocześnie spełnione
są ogólne i mikrobiologiczne kryteria jakości [3].
O zakresie kontroli jakości pożywek mikrobiologicznych
decyduje laboratorium. Zakres kontroli jest uzależniony od
tego, czy laboratorium wykorzystuje pożywki przygotowywane samodzielnie czy pożywki komercyjne. W przypadku pożywek wytwarzanych w laboratorium, należy przeprowadzać
pełną kontrolę jakości pożywek [6] - ogólną i szczegółową,
zgodnie z zaleceniami obowiązujących norm [3, 4, 5, 10].
W tym miejscu, trzeba zauważyć, że właściwie tylko norma
europejska EN 12322 bardzo ogólnie odnosi się do kontrolowania pożywek mikrobiologicznych wykorzystywanych
do diagnostyki in vitro. Pozostałe dokumenty normatywne,
szczegółowo opisujące metody kontrolowania pożywek mikrobiologicznych, np. specyfikacja techniczna ISO/TS 11133
[4, 5], przeznaczone są do stosowania w laboratoriach mikrobiologii żywności i pasz. Specyfikacja ta podaje ogólne
zasady kontrolowania pożywek mikrobiologicznych (metody
kontroli i kryteria oceny), które ze względu na uniwersalność
są stosowane do kontrolowania pożywek wykorzystywanych w laboratoriach o innych profilach badań mikrobiologicznych, w tym także w mikrobiologicznych laboratoriach
medycznych [10].
W przypadku pożywek komercyjnych wykorzystywanych do
diagnostyki in vitro, zakres kontroli uzależniony jest, jak już
wspomniano, od posiadania przez wytwórcę potwierdzonego
systemu zarządzania jakością [6]. Ze względu na brak szczegółowych wytycznych dotyczących pożywek do diagnostyki
in vitro, w celu ustalenia sposobu wykonania kontroli tych
pożywek, laboratorium może również oprzeć się na firmowej
instrukcji technicznej pożywki. Instrukcja taka, oprócz opisu
pożywki, powinna przedstawiać sposób przeprowadzenia
kontroli danej pożywki, a także kryteria oceny poszczególnych parametrów jakości pożywki wraz z oczekiwanymi wynikami. Zgodnie z dyrektywą IVD [7] oraz obowiązującymi
normami europejskimi [3, 4, 13], wytwórca zobowiązany jest
do przekazania takich informacji do laboratorium.
W przypadku pożywek komercyjnych, dodatkowym, wstępnym etapem kontrolnym, poprzedzającym właściwą kontrolę
jakości pożywek, jest każdorazowe sprawdzenie dokumentacji dostawy oraz ocena opakowania transportowego [4, 13,
15].
3.1. Kontrola wstępna dostawy pożywek komercyjnych
Wstępna kontrola dostawy komercyjnych pożywek mikrobiologicznych obejmuje sprawdzenie dokumentacji potwierdzającej jakość pożywki dostarczanej przez wytwórcę – dokumenty dostawy wskazujące na warunki transportu oraz
certyfikat jakości [4, 13, 15]. Certyfikat ten dla każdej serii
pożywek, powinien zawierać następujące dane:
–– nazwę wytwórcy,
–– nazwę produktu, numer serii i datę ważności,
–– ogólną charakterystykę właściwości fizyko-chemicznych
pożywki: kolor, pH, itp.,
–– charakterystykę mikrobiologiczną tj. wykaz szczepów kontrolnych użytych do przeprowadzenia kontroli danej serii
pożywki wraz z opisem prawidłowej morfologii kolonii wyrosłych na pożywce.
Podczas odbioru każdej dostawy pożywek, laboratorium
zobowiązane jest do odnotowywania daty otrzymania dostawy oraz wizualnej oceny opakowania transportowego,
tj. sprawdzenia jego oznakowania (dane identyfikujące pożywkę), szczelności i integralności [4, 13, 15]. Stwierdzenie
uszkodzenia opakowania transportowego pożywek wskazuje na potencjalne obniżenie jakości pożywek i jest podstawą
do złożenia reklamacji u wytwórcy lub dystrybutora.
3.2. Kontrola ogólna właściwości fizycznych i chemicznych pożywki
Właściwości fizyczne i chemiczne oceniane są głównie poprzez wizualną, makroskopową ocenę wyglądu pożywki.
Kontrola ta jest łatwa do przeprowadzenia i bardzo przydatna, gdyż przed rozpoczęciem szczegółowych badań
kontrolnych, może wskazywać na zmiany jakości pożywki.
Przykładowo, inne niż oczekiwane zabarwienie pożywki
może świadczyć o nieprawidłowym jej składzie chemicznym. Właściwości fizyczne i chemiczne należy kontrolować
dla każdej partii pożywek, zarówno tych przygotowanych
w laboratorium, jak i komercyjnych [3, 4, 13]. Kontrola pożywek do diagnostyki in vitro obejmuje ocenę [3, 15]:
–– ilości produktu w opakowaniu (w przypadku pożywek sypkich),
–– grubości warstwy agaru i formy wypełnienia dla podłoży
stałych oraz objętości pożywki płynnej,
–– wyglądu zewnętrznego, tj. zabarwienia, klarowności,
obecności artefaktów, jednorodności,
–– stabilności i konsystencji żelu,
–– wyglądu zewnętrznego specyficznych pożywek, np. agaru
z krwią,
–– zawartości wilgoci lub homogenność suchych pożywek tj.
czy pożywka nie uległa zbryleniu,
–– wartości pH.
Jedną z ważniejszych cech fizycznych jest pH, które powinno być sprawdzane szczególnie podczas przygotowywania
191
Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym
podłóż w laboratorium, tj. przed i po autoklawowaniu przy
użyciu wzorcowanego pehametru. Zasadniczo, przyjmuje
się, że schłodzona do temperatury 25°C, pożywka powinna
mieć wymaganą wartość pH ± 0,2 jednostki pH [4], np. agar
XLD powinien mieć pH 7,4± 0,2.
W przypadku gotowych do użycia pożywek komercyjnych,
najczęściej spotykane nieprawidłowości dotyczące właściwości fizycznych i chemicznych obejmują [13]:
–– niewystarczającą ilość agaru w płytce tj. < 3 mm lub pożywki w butelce/probówce,
–– pęknięcie lub uszkodzenie płytki,
–– oderwanie agaru od płytki,
–– zamrożenie lub roztopienie agaru,
–– hemolizę krwi w pożywce,
–– chropowatość powierzchni agaru,
–– nadmiar pęcherzyków na powierzchni agaru,
–– nadmiar wilgoci lub odwodnienie,
–– nietypowe zabarwienie pożywki,
–– obecność zanieczyszczeń mikrobiologicznych widocznych
gołym okiem.
Stwierdzenie jakiejkolwiek z wymienionych nieprawidłowości
w makroskopowej ocenie właściwości pożywki, upoważnia
do reklamacji danej partii pożywki u wytwórcy/ dostawcy.
3.3. Kontrola szczegółowa właściwości mikrobiologicznych pożywek
Metody kontroli poszczególnych parametrów wskazujących
na właściwości mikrobiologiczne pożywek oraz kryteria ich
oceny zostały opisane w ISO/TR 11133-2 [4, 5, 10]. Wyjątkiem jest badanie przydatności pożywek do oceny lekowrażliwości, które, jak podano w EN 12322, należy wykonywać
zgodnie z odpowiednimi metodami referencyjnymi [3].
Kontrola właściwości mikrobiologicznych pożywek ma na
celu sprawdzenie obecności zanieczyszczeń mikrobiologicznych w pożywce, intensywności wzrostu drobnoustrojów
na danej pożywce, zahamowania wzrostu mikroflory towarzyszącej, potwierdzenie, że wyhodowane drobnoustroje
(szczep kontrolny) wykazują charakterystyczne dla swojego
gatunku cechy biochemiczne i fizjologiczne oraz sprawdzenie przydatności do badania lekowrażliwości. Dlatego też,
kontrola ta obejmuje tzw. mikrobiologiczne kryteria jakości
[3]:
• zanieczyszczenia mikrobiologiczne - badany parametr to
jałowość,
• cechy pożywki wpływające na wzrost drobnoustrojów:
–– właściwości odżywcze - badany parametr to żyzność,
–– właściwości selektywne - badany parametr to selektywność,
• cechy pożywki wpływające na ocenę właściwości biochemicznych i fizjologicznych drobnoustrojów - badany parametr to specyficzność,
• przydatność do badania wrażliwości drobnoustrojów na
leki.
Kontrolę właściwości mikrobiologicznych, określanych też
jako właściwości użytkowe pożywek [13], należy wykonywać
192
zawsze wtedy, gdy laboratorium rozpoczyna pracę z nową
serią składników pożywek, dla nowej partii pożywek sporządzonych w laboratorium, przy zmianie dostawcy pożywek,
a także w przypadku zaistnienia wątpliwości dotyczących
jakości danej serii pożywek, o czym można wnioskować na
podstawie wyników ogólnej kontroli pożywek mikrobiologicznych [5].
Do oceny właściwości mikrobiologicznych pożywek wpływających na wzrost, tj. żyzności i selektywności drobnoustrojów, należy wykorzystywać metody ilościowe i półilościowe
[3], zaś do oceny specyficzności - metody jakościowe. Niezbędnym warunkiem przeprowadzenia tej kontroli jest zastosowanie odpowiednich szczepów kontrolnych.
3.3.1. Kontrola jałowości pożywek
Zgodnie z normą EN 12322, pożywki mikrobiologiczne można podzielić na te, które są sterylizowane w końcowym opakowaniu oraz na pożywki gotowe do użycia wyprodukowane
w sposób eliminujący lub ograniczający zanieczyszczenia do
akceptowalnego minimum [3]. Norma EN 12322 zaleca, aby
odpowiednia liczba pożywek z każdej partii była badana pod
kątem zanieczyszczeń mikrobiologicznych [3]. Ocenę jałowości przeprowadza się inkubując pożywki w temperaturze
odpowiedniej dla stosowanej metody badania przez co najmniej 3 dni (≥72 godziny) [3]. Norma EN 12322 nie precyzuje
jednak ile pożywek należy poddać kontroli jałowości i w jakiej
dokładnie temperaturze je inkubować. Dlatego też, w celu
prawidłowego przeprowadzenia badania jałowości możemy
oprzeć się na postanowieniach innego dokumentu dotyczącego wytwarzania i kontroli jakości pożywek tj. ISO/TS 11133-2
lub skorzystać z wytycznych wytwórców pożywek. W specyfikacji tej podano, iż pod względem jałowości należy badać, np.
jedną płytkę/butelkę lub 1% płytek/butelek z początku i końca
partii produkcyjnej, inkubując pożywki co najmniej 18 godzin
w temperaturze 37°C lub temperaturze w jakiej pożywka jest
stosowana w procedurze badawczej [13].
W przypadku pożywek sterylizowanych w końcowym opakowaniu, jałowość powinna być zagwarantowana poprzez
zastosowanie przez wytwórcę zwalidowanego procesu
sterylizacji całkowicie eliminującego zanieczyszczenia mikrobiologiczne [3, 7], co oznacza, że w żadnym z końcowych opakowań, pożywki nie powinny wykazywać wzrostu
drobnoustrojów. W przypadku pożywek przygotowywanych
w warunkach aseptycznych, dopuszcza się zanieczyszczenie mikrobiologiczne w mniej niż 5% całej partii pożywek [3].
Jeżeli poziom zanieczyszczeń mikrobiologicznych przekracza 5% danej partii pożywki, to powinna ona być odrzucona
[3].
Kontrolę jałowości należy przeprowadzać zarówno dla pożywek przygotowywanych w laboratorium, jak i dla pożywek
komercyjnych.
3.3.2. Zasady doboru szczepów kontrolnych
Prawidłowe przeprowadzenie kontroli żyzności, selektywności i specyficzności, wymaga aby dla każdej kontrolowanej
pożywki skomponować odpowiednio dobrany zestaw szczepów kontrolnych przygotowanych na bazie szczepów referencyjnych [3]. W tym celu, laboratorium powinno dysponować odpowiednimi szczepami referencyjnymi pochodzącymi
z uznanych kolekcji stowarzyszonych w European Culture
Collection’s Organization (ECCO) lub World Federation for
Culture Collection (WFCC) [3]. Przykładem takiej kolekcji
jest ATCC (American Type Culture Collection). Prawidłowo
skomponowany zestaw szczepów kontrolnych, określanych
też jako organizmy testowe [4], powinien zawierać [3]:
–– szczep stanowiący kontrolę dodatnią (tzw. szczep docelowy, target) – posiadający typowe cechy, silnie rosnący na
danej pożywce, wykazujący dodatni wynik testu,
–– szczep stanowiący kontrolę słabo dodatnią – słabo rosnący na badanej pożywce, wykazujący z opóźnieniem wynik
testu,
–– szczep stanowiący kontrolę ujemną (non-target) - wykazujący częściowe lub całkowite zahamowanie wzrostu na
badanej pożywce, wykazujący ujemny wynik testu.
Do oceny selektywności koniecznym wydaje się także zastosowanie szczepu dającego inne od szczepu docelowego
reakcje biochemiczne.
Zestawy szczepów kontrolnych dla poszczególnych rodzajów pożywek, laboratorium ustala samodzielnie kierując się
przedstawionymi powyżej zasadami. Przykładowe zestawy
szczepów kontrolnych, jakie można zastosować do kontroli
pożywek wykorzystywanych do diagnostyki in vitro przedstawia Tabela II.
Dodatkowym warunkiem uzyskiwania wiarygodnych wyników badań kontrolnych jest właściwe postępowanie ze
szczepami referencyjnymi. Bardzo dobrym źródłem informacji i wytycznych dotyczących prawidłowego postępowania ze szczepami referencyjnymi jest raport techniczny ISO
11133 [4].
3.3.3. Ilościowa i półilościowa kontrola żyzności pożywek
Ocenę żyzności pożywek stałych należy wykonywać metodą
ilościową [3], która opiera się na określeniu tzw. współczynnika żyzności (Productivity Ratio, PR), wyrażającego stosunek całkowitej liczby kolonii wyrosłych na kontrolowanej
pożywce do całkowitej liczby kolonii wyrosłych na pożywce
referencyjnej [5, 10, 13]. Sposób obliczania tego współczynnika przedstawia następujący wzór:
PR = Ns / No
gdzie
PR – współczynnik żyzności (Productivity Ratio)
Ns – całkowita liczba kolonii na pożywce badanej
No – całkowita liczba kolonii na pożywce referencyjnej
Tak więc, dla poprawnego wykonania tego badania kontrolnego należy zastosować tzw. pożywkę referencyjną, pełnią-
Tabela II
Przykładowe zestawy szczepów kontrolnych do oceny żyzności, selektywności oraz specyficzności pożywek (opracowanie własne na podstawie certyfikatów kontroli jakości wytwórców, ISO/TS 11133-2, M22-A3).
Nazwa
pożywki
Cecha
żyzność
XLD
selektywność
specyficzność
żyzność
MCK
selektywność
specyficzność
HEKT
Szczepy testowe
Salmonella enterica
ATCC 13076
Enterococcus faecalis
ATCC 29212
Escherichia coli
ATCC 8739
E. coli
ATCC 25922
Enterococcus faecalis
ATCC 29212
Proteus vulgaris
ATCC 6380
Kryterium oceny- intensywność wzrostu
Dobry wzrost
Całkowite zahamowanie wzrostu
Częściowe
lub całkowite zahamowanie wzrostu
Dobry wzrost
Całkowite zahamowanie wzrostu
Dobry wzrost
żyzność
Salmonella enterica
ATCC 13076
Dobry wzrost
selektywność
Enterococcus faecalis
ATCC 29212
Zahamowanie wzrostu
specyficzność
E. coli
ATCC 25922
Częściowe lub całkowite zahamowanie wzrostu
Kryterium oceny-reakcje
charakterystyczne
Czerwone kolonie
z czarnym środkiem
-
Żółte kolonie
Kolonie laktozo dodatnie
-
Kolonie laktozo ujemne
Zielone kolonie
z czarnym środkiem
-
Łososiowo -żółte kolonie
193
Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym
cą rolę pożywki odniesienia, do której porównujemy pożywkę badaną. Najczęściej, pożywką referencyjną jest pożywka
nieselektywna, zapewniająca optymalny wzrost wszystkich
szczepów kontrolnych, dodatnich i ujemnych. Jako pożywkę referencyjną można także stosować ten sam rodzaj pożywki innej partii, która została już skontrolowana [5, 13].
W metodzie tej, na pożywkę badaną oraz referencyjną należy posiać po 0,1 ml zawiesiny szczepu kontrolnego o tak dobranym stężeniu drobnoustrojów, aby po inkubacji uzyskać
policzalną liczbę kolonii. Zawiesinę bakteryjną dokładnie
rozprowadzić na pożywkach za pomocą głaszczki. Po zakończeniu inkubacji, policzyć kolonie wyrosłe na pożywkach
i obliczyć współczynnik żyzności (PR). Dodatkowo, ocenić
wygląd i wielkość wyrosłych kolonii. Prawidłowo, żyzność
pożywki jest właściwa jeśli dla pożywek selektywnych wartość współczynnika żyzności wynosi co najmniej 0,1, zaś
dla pożywek nieselektywnych co najmniej 0,7 [5, 10, 13].
W przypadku niektórych pożywek dopuszcza się jednak
bardziej liberalne kryteria [13]. Przyjmuje się, że w metodzie
tej wzrost szczepu dodatniego na kontrolowanej pożywce
powinien wynosić co najmniej 70% wzrostu uzyskanego na
pożywce referencyjnej [16].
Inną metodą oceny żyzności pożywek stałych jest półilościowa ekonometryczna metoda posiewu rysowego [5, 13].
W metodzie tej, oceny żyzności dokonuje się poprzez wyznaczenie indeksu wzrostu (Growth Index, GI). Ezą o pojemności 1 µl nachyloną pod kątem 20o-30o w stosunku do
podłoża, należy wykonać posiew rysowy dokładnie według
poniższego schematu (Ryc.1)
Rycina 1
Schemat posiewu rysowego w metodzie ekonometrycznej wg ISO
11133-2.
Odstępy między kolejnymi liniami posiewu powinny wynosić dokładnie 0,5 cm. Do badania należy użyć zawiesiny
dodatniego szczepu kontrolnego (target), zawierającej 103
do 104 jednostek tworzących kolonie (jtk) w 1µl oraz ujemnego szczepu kontrolnego o stężeniu zawiesiny 104 do 106
jtk w 1µl. Indeks wzrostu wylicza się poprzez zsumowanie
punktów przyznawanych każdej posianej linii według następującej skali:
–– 1 punkt - uzyskuje linia, na której stwierdzamy wzrost na
194
całej długości
–– 0,5 punktu - uzyskuje linia, na której stwierdzamy wzrost
na połowie długości
–– 0 punktów – uzyskuje linia, na której nie stwierdzono wzrostu lub wzrost jest mniejszy niż połowa długości posianej
linii.
Prawidłowo, indeks wzrostu dla szczepu dodatniego powinien
wynosić co najmniej 6 punktów [5, 10, 13], zaś wzrost szczepu ujemnego powinien być całkowicie lub częściowo zahamowany. Wykonanie badania kontrolnego tą metodą wymaga
sporego doświadczenia w jej stosowaniu (Rycina 2).
Rycina 2
Ocena żyzności pożywek agarowych półilościową metodą ekonometryczną. Przykład wzrostu Salmonella enterica ATCC 13076 na
pożywce XLD.
3.3.4. Ilościowa kontrola selektywności pożywek
Kontrola wybiórczości pożywek selektywnych ma na celu wykazanie prawidłowego działania składników warunkujących
selektywność danej pożywki. Kontrolę selektywności pożywki można przeprowadzić metodą ilościową poprzez obliczenie tzw. współczynnika selektywności (Selectivity Factor,
SF), który jest różnicą najwyższego rozcieńczenia dającego wzrost co najmniej 10 kolonii na pożywce referencyjnej,
a najwyższym rozcieńczeniem dającym porównywalny
wzrost na pożywce kontrolowanej [5, 10, 13]. Współczynnik
selektywności obliczamy według następującego wzoru:
SF = Do – Ds
gdzie:
SF – współczynnik selektywności (Selectivity Factor) wyrażony w log10
Do – najwyższe rozcieńczenie dające wzrost co najmniej 10
kolonii na pożywce referencyjnej
Ds – najwyższe rozcieńczenie dające porównywalny wzrost
na pożywce badanej
W celu wykonania badania należy przygotować szereg rozcieńczeń szczepu kontrolnego będącego kontrolą ujemną
(non-target). Następnie, na pożywkę badaną i referencyjną
wysiać po 0,1 ml każdego przygotowanego rozcieńczenia,
rozprowadzić jałową głaszczką na powierzchni agaru i inkubować w cieplarce przez 48 godzin w temperaturze i atmos-
ferze w jakiej wykorzystywana jest pożywka w procedurze
badawczej. Po inkubacji ocenić wygląd i wielkość kolonii,
a do obliczenia współczynnika selektywności (SF) wybrać
taką pożywkę kontrolowaną i taką pożywkę referencyjną, na
których uzyskano porównywalny wzrost. Wartość współczynnika selektywności wyrażana jest jako logarytm dziesiętny,
i prawidłowo dla pożywek selektywnych powinna wynosić co
najmniej 2.
Na pożywce selektywnej wzrost szczepów badanych powinien być częściowo lub całkowicie zahamowany. Stopień
zahamowania wzrostu zależy od rodzaju szczepu kontrolnego i użytej pożywki, zwykle jednak przyjmuje się, że wzrost
ulega zredukowaniu o współczynnik wynoszący 103 do 104
lub więcej, w porównaniu ze wzrostem na nieselektywnej
pożywce referencyjnej [16].
3.3.5. Jakościowa kontrola właściwości mikrobiologicznych pożywek stałych
Innym sposobem oceny właściwości użytkowych pożywek
jest jakościowa metoda posiewu rysowego [5,13]. W metodzie tej ezą o pojemności oczka 1µl dokonuje się posiewu
rysowego jednego lub kilku szczepów kontrolnych na pożywkę. W przypadku posiewu kilku szczepów, linie posiewu
poszczególnych szczepów nie powinny się krzyżować (Rycina 3). Zestaw szczepów kontrolnych można dobrać w taki
sposób, aby jednocześnie ocenić żyzności, selektywności
i specyficzności pożywki Do oceny żyzności, inokulum
szczepu kontrolnego powinno zawierać 103 do 104 jtk w 1µl,
do oceny selektywności inokulum szczepu kontrolnego powinno zawierać powyżej 104 jtk w 1 µl [5, 13]. W celu porównywalności wyników kontroli, zaleca się, aby oceny selektywności i specyficzności nie dokonywać wcześniej niż po
48 godzinach inkubacji pożywki. Po zakończeniu inkubacji,
każdej posianej linii przyznawana jest odpowiednia liczba
punktów w skali od 0 do 2. Liczba przyznawanych punktów
odpowiada intensywności wzrostu szczepu kontrolnego na
pożywce według następujących zasad:
–– 0 punktów – brak wzrostu na całej długości linii
–– 1 punkt – słaby wzrost na danej linii
–– 2 punkty – dobry wzrost na danej linii
Dobry wzrost na całej długości linii posianego szczepu dodatniego (docelowego) pozwala na uzyskanie 2 punktów
i oznacza, że kontrolowana pożywka posiada odpowiednią
żyzność. Brak wzrostu szczepu docelowego może sugerować nieodpowiednią jakość pożywki, tj. nieprawidłowość
składu pożywki. W przypadku pożywek selektywnych, brak
wzrostu kontrolnego szczepu ujemnego (non-target) umożliwia ocenę właściwości selektywnych pożywki. Jednoczesna, makroskopowa ocena cech biochemicznych i fizjologicznych wyrosłych drobnoustrojów (morfologia kolonii,
hemoliza, itp.), umożliwia dodatkową ocenę specyficzności
kontrolowanej pożywki. Przykłady jakościowej oceny właściwości pożywek przy użyciu metody posiewu rysowego
przedstawia Rycina 4.
Wyniki uzyskane podczas kontroli metodą posiewu rysowego, należy porównywać z wynikami badań kontrolnych tych
samych szczepów kontrolnych przedstawionymi przez wytwórcę w certyfikacie kontroli jakości danej serii pożywki (np.
opisem wzrostu).
Łatwość stosowania metody jakościowej do kontrolowania pożywek wynika z prostoty wykonania oraz możliwości
jednoczesnej oceny żyzności, selektywności i specyficzności, i jest szczególnie polecana do kontrolowania pożywek gotowych do użycia. Doświadczenia własne pozwoliły
wnioskować, że jakościowa metoda posiewu rysowego jest
optymalną metodą do oceny pożywek chromogennych.
W przypadku tych pożywek, oceniana jest żyzność, a reakcje barwne, dzięki obecności substratów chromogennych
w podłożu umożliwiają ocenę specyficzności. W Tabeli II
przedstawiono przykłady gotowych do użycia pożywek komercyjnych wraz z zestawem szczepów kontrolnych oraz
kryteriami oceny wyników kontroli.
3.3.6. Badanie wrażliwości na antybiotyki
Jedną z informacji o zasadniczym znaczeniu dla podjęcia
właściwej antybiotykoterapii, jest informacja o wrażliwości
wyhodowanego drobnoustroju na leki. Dlatego też, bardzo
ważne jest zapewnienie wiarygodności wyników oceny lekowrażliwości drobnoustrojów, które najczęściej wykony-
Rycina 3
Technika posiewu rysowego w jakościowej metodzie oceny właściwości użytkowych pożywek. a) Schemat posiewu rysowego jednego szczepu kontrolnego b) Schemat posiewu rysowego trzech różnych szczepów kontrolnych.
195
Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym
Rycina 4
Jakościowa ocena właściwości mikrobiologicznych (żyzność, selektywność, specyficzność) pożywek agarowych techniką posiewu rysowego,
na przykładzie pożywek
a) MCK - E. coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Proteus vulgaris ATCC 6380; b) HEKT – Salmonella enterica ATCC
13076, Enterococcus faecalis ATCC 29212, E. coli ATCC 25922.
wane jest metodą dyfuzyjno-krążkową. Na uwagę zasługuje fakt, że wynik tego badania zależy nie tylko od jakości
stosowanych pożywek, ale także od jakości krążków z antybiotykami oraz techniki wykonania badania. Dlatego też,
kontrola jakości metody dyfuzyjno-krążkowej ma charakter
kompleksowy i pełni funkcję kontrolną nie tylko dla sprawdzania jakości stosowanych pożywek, ale także jakości
krążków antybiotykowych oraz poprawności techniki wykonania badania. W celu prawidłowego przeprowadzania kontroli jakości pożywek do określania lekowrażliwości, norma
EN 12322 zaleca stosowanie referencyjnych metod kontroli
[3]. Metody takie zostały opracowane przez organizacje fachowe jakimi są np. CLSI i EUCAST (tłumaczenie). Organizacje te opracowały i opublikowały zasady i procedury wykonywania kontroli jakości metody dyfuzyjno-krążkowej przy
użyciu szczepów referencyjnych oraz sposób interpretowania i kryteria oceny wyników badań kontrolnych [17, 18, 19,
20]. Wykonanie kontroli jakości metody dyfuzyjno-krążkowej
nie powinno przedstawiać większych trudności, gdyż dzięki
KORLD, niezbędne procedury i dokumenty są powszechnie
dostępne w języku polskim.
Podsumowanie
Niniejsze opracowanie oparto głównie na dokumentach normatywnych zawierających wymagania akredytacyjne dla laboratoriów mikrobiologicznych – ISO/IEC 17025, ISO 15189
i EA-04/10 [1, 2, 6] oraz normach dotyczących nadzorowania pożywek mikrobiologicznych [3, 4, 5]. Zapewnienie jakości oraz kontrolowanie jakości pożywek mikrobiologicznych
są jednym z zasadniczych elementów systemu zarządzania
jakością w laboratorium mikrobiologicznym. Nadzorowanie
procesu wytwarzania pożywek i kontrolowanie ich jakości
wydają się oczywiste w przypadku pożywek wytwarzanych
przez laboratorium na własne potrzeby, jednak konieczność
kontrolowania pożywek gotowych do użycia jest stale dyskutowana. Uważa się bowiem, że pożywki komercyjne nie
wymagają kontrolowania przez laboratorium, a certyfikat jakości pożywki dostarczony przez wytwórcę, jest wystarczającym dowodem ich właściwej jakości. Faktycznie, w ame196
rykańskich wytycznych dotyczących kontrolowania pożywek
komercyjnych (NCCLS, dokument M22-A3), nie wprowadzono obowiązku kontrolowania wszystkich pożywek komercyjnych [15]. Trzeba jednak zwrócić uwagę, że wytyczne
te, w zależności od przeznaczenia pożywek do określonych
kierunków badań w celu wykrycia określonych grup drobnoustrojów, dzielą pożywki na dwie kategorie: pożywki zwolnione z kontroli (exempt media category), dla których certyfikat
jakości wytwórcy może być wystarczającym potwierdzeniem
jakości oraz pożywki określane jako „nonexempt media category”, których jakość obowiązkowo należy potwierdzać
w laboratorium. Do pierwszej grupy pożywek zaliczono
między innymi agar krwawy, Hektoen (HEK) agar, Columbia (CNA) agar. Do drugiej kategorii zaliczono, np. agar
MacConkey z sorbitolem, agar czekoladowy z bacytracyną,
bulion odżywczy. W przypadku laboratoriów mikrobiologicznych ubiegających się o akredytację Polskiego Centrum
Akredytacji, wymagania dokumentów odniesienia, tj. ISO/
IEC 17025, ISO 15189 oraz EA-04/10 stanowiących kryterium oceny w procesie akredytacji, są jednak jednoznaczne
i wskazują na obligatoryjny charakter kontroli jakości pożywek bez względu na źródło ich pochodzenia.
Wspólnym elementem wymagań, zarówno norm europejskich [3, 4], jak i wytycznych amerykańskich (dokument
M22-A3) [15], jest zobowiązanie laboratoriów medycznych do
kontrolowania dokumentacji oraz cech fizyko-chemicznych
każdej dostawy i/lub serii pożywek komercyjnych dostarczanych do laboratorium. Zgodnie z wymaganiami europejskimi [3], kontrola jakości pożywek powinna także obejmować
właściwości mikrobiologiczne pożywek – jałowość, żyzność,
selektywność, specyficzność oraz zdolność do oceny lekowrażliwości. O ile metody kontroli zdolności pożywek do
oceny wrażliwości na leki zostały dobrze opisane w piśmiennictwie fachowym [17, 18, 19, 20], to prawidłowe przeprowadzenie kontroli pozostałych parametrów jakości pożywek
do diagnostyki in vitro jest dość trudne ze względu niedostateczną ilość odpowiednich dokumentów normatywnych
oraz piśmiennictwa fachowego dotyczącego tego zagadnienia. Dlatego też, wydaje się wskazane korzystanie z innych,
uniwersalnych dokumentów normatywnych przeznaczonych
dla laboratoriów mikrobiologicznych o innym profilu badawczym [10] oraz firmowych instrukcji pożywek komercyjnych,
zawierających informacje o sposobie wykonania kontroli
i kryteriach oceny wyników kontroli, czego przykładem mogą
być pożywki wykorzystywane w automatycznych systemach
hodowli krwi i płynów ustrojowych.
Laboratoria mikrobiologiczne starające się o akredytację,
kontrolę jakości pożywek komercyjnych przeprowadzają nie
tylko dla potwierdzenia ich jakości, ale także w celu kwalifikacji dostawców pożywek, gdyż kwalifikacja dostawców
wyposażenia jest jednym z podstawowych wymagań akredytacyjnych [1, 2].
Niniejsze opracowanie nie wyczerpuje bardzo rozległego tematu jakim jest zapewnienie i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych do diagnostyki in vitro. Jednak, nawet jeśli
laboratorium nie wdraża systemu zarządzania jakością, to
w celu zapewnienia wiarygodności wyników badań mikrobiologicznych, w zakresie swoich możliwości organizacyjnych
i technicznych, powinno opracować i stosować mechanizmy
kontrolowania pożywek mikrobiologicznych i, jeśli samo wytwarza pożywki, zapewniania ich jakości podczas procesu
wytwarzania.
15. NCCLS, Quality Control for Commercially Prepared Microbiological Culture Media; Approved Standard-Third Edition, NCCLS document M22-A3, 2004.
16. Ogólna instrukcja dotycząca stosowania. Pożywki gotowe do
użycia i częściowo przygotowane, instrukcja firmowa Becton
Dickinson, July 2009.
17. Antimicrobial susceptibility testing EUCAST disk diffusion method, EUCAST ver. 1.0, Dec. 2009
18. EUCAST recommended strains for internal quality control, EUCAST ver.1.3, Dec.2010
19. CLSI, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility
Testing; Twentieth International Supplement, CLSI document
M100-S18, 2008
20. Stefaniuk E., Standaryzacja testów lekowrażliwości i kontrola
jakości. Aktualności BioMerieux 2006; 39: 12-16.
Zaakceptowano do publikacji: 07.05.2012
Adres do korespondencji:
Dr n. med. Urszula Wendt
Laboratoria Medyczne BRUSS Grupa ALAB Sp. z o.o.
81-519 Gdynia, ul. Powstania Styczniowego 9B
tel. (58) 699 88 66, fax (58) 699 88 63
e-mail: [email protected]
Piśmiennictwo
1. PN-EN ISO/IEC 17025:2005/Ap1:2007. Ogólne wymagania dotyczące kompetencji laboratoriów badawczych i wzorcujących,
PKN, Warszawa 2005.
2. PN-EN ISO 15189:2008. Laboratoria medyczne. Szczególne
wymagania dotyczące jakości i kompetencji, PKN, Warszawa
2008.
3. PN-EN 12322: 2005. Wyroby medyczne do diagnostyki in vitro.
Pożywki mikrobiologiczne – Kryteria oceny działania pożywek
mikrobiologicznych, PKN, Warszawa 2005.
4. PKN-CEN ISO/TS 11133-1: 2009. Mikrobiologia żywności i pasz.
Wytyczne dotyczące przygotowania i wytwarzania pożywek.
Część 1: Ogólne wytyczne dotyczące kontroli jakości pożywek
przygotowywanych w laboratorium, PKN, Warszawa 2009.
5. Kwiatek K. Kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych według
projektu normy prEN ISO 11133-2:2000. Aktualności bioMerieux
2002; 20:13-18.
6. EA-04/10. Akredytacja laboratoriów mikrobiologicznych, PCA.
Warszawa 2002.
7. Dyrektywa nr 98/79/WE Parlamentu Europejskiego i Rady
z dnia 27 października 1998 r. w sprawie wyrobów medycznych
używanych do diagnozy in vitro.
8. PN-EN ISO 13485:2005. Wyroby medyczne. Systemy zarządzania jakością, wymagania dla celów przepisów prawnych.
PKN, Warszawa 2005.
9. PN-EN 1659: 2004. Systemy diagnostyczne in vitro. Pożywki
mikrobiologiczne. Terminy i definicje. PKN, Warszawa 2004.
10. Stefaniuk E. Laboratoryjna kontrola jakości podłoży mikrobiologicznych. Aktualności bioMerieux 2008; 44: 23-26.
11. Zaręba T. Pożywki mikrobiologiczne. Laboratorium 2007; 6: 1819.
12. Basu S, Pal A, Desai PK. Quality control of culture media in
a microbiology laboratory. Indian J Med Microbiol 2005; 23:15963.
13. Materiały szkoleniowe Gdańskiej Fundacji Wody.
14. PN-EN ISO 7218:2008/Ap1:2010. Mikrobiologia żywności
i pasz. Wymagania ogólne i zasady badań mikrobiologicznych,
PKN, Warszawa 2008.
197