Wrażliwość radiacyjna mikroorganizmów

&ARM0RZEGL.AUK†
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
7RA˜LIWOu¿RADIACYJNAMIKROORGANIZMÌW
2ADIOSENSITIVITYOFMICROORGANISMS
3ŒAWOMIR7ILCZYÊSKI
+ATEDRAI:AKŒAD"IOFIZYKI7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ35-W+ATOWICACH
+IEROWNIK+ATEDRYDRHABNFIZ"ARBARA0ILAWA
Streszczenie
Wyjaławianie ma na celu zabicie lub usunięcie ze środowiska lub materiału wszystkich drobnoustrojów w ich
formach wegetatywnych i przetrwalnikowych. Problem
jałowości szczególnego znaczenia nabiera w kontekście
sterylności leków. Wybór metody wyjaławiana substancji
leczniczych zależy od rodzaju, właściwości oraz sposobu
ich produkcji.
Zastosowanie promieniowania gamma do sterylizacji leków,
także produktów spożywczych, materiałów do transplantacji, gleby i wielu innych, wynika z faktu, że wszystkie mikroorganizmy są w większym lub mniejszym stopniu wrażliwe na to promieniowanie [1]. Podstawowym parametrem,
który wpływa na efektywność inaktywacji drobnoustrojów,
a więc pośrednio na skuteczność sterylizacji, jest dawka
zastosowanego promieniowania gamma [2,3-8]. Niemniej
jednak promieniowanie gamma należy traktować jako
uniwersalny, nieselektywny czynnik biobójczy działający
w każdej dawce [3].
Na skuteczność procesu sterylizacji radiacyjnej wpływają trzy podstawowe parametry: poziom wstępnego zanieczyszczenia mikrobiologicznego, poziom SAL (Sterility
Assurance Level), który chcemy osiągnąć i wrażliwość
radiacyjna mikroorganizmów [9].
Jako czynniki potencjalnie patogenne, zanieczyszczające sterylizowane obiekty mogą być traktowane bakterie,
grzyby, glony i wirusy.
Abstract
Sterilization is process leading to elimination from environment or material microbes both vegetative and spore
forms. Microbial purity of drugs plays essential role in
treatment. Depending on type, characteristics and way of
production of pharmaceutics different methods of sterilizations are apply. It is possible to sterilize drugs, foodstuffs, transplantation materials, soil and many others with
gamma radiation because all microorganisms are less or
more radiosensitive [1]. The most important parameter
which impacts on radiosterilization efficiency is dose of
ionizating radiation [2, 3-8]. Nevertheless, ionizating radiation can be treat as non selective, universal lethal factor
which acts irrespective of radiation dose [3]. The efficiency of ionizing radiation depend on free basic parameters:
level of initial microbial contamination, sterility assurance
level and microorganisms sensitivity [9]. Among potentially pathogenic factors bacteria, fungi and algae can be
mentioned.
Key words: ionizing radiation, microorganisms, dose of
radiation
Słowa kluczowe: promieniowanie jonizujące, mikroorganizmy, dawka promieniowania
'–-¸qlª|²ÉŸ–-Jl-A¬oy-Ÿ7-p R–ll
Bakterie są najmniej wrażliwymi na promieniowanie
gamma organizmami. Szczególnie oporne są bakterie wytwarzające przetrwalniki [2,9,10]. Generalnie można przyjąć, że im bardziej złożony organizm tym jest bardziej wrażliwy na promieniowanie gamma [2,11].
Wrażliwość bakterii na promieniowanie gamma zależy
od typu, gatunku i szczepu bakterii [4], dawki promieniowania [2,3-9], w niewielkim stopniu od mocy dawki [2],
temperatury napromieniowania, obecności tlenu, obecności
wody, obecności sensybilizatorów lub protektorów (substancji uczulających bądź chroniących przed promieniowaniem
gamma) [4-6,12].
Poszczególne gatunki bakterii bardzo różnią się między sobą pod względem wrażliwości radiacyjnej [2,3-8].
Generalnie można przyjąć, że bakterie Gram-dodatnie
są zazwyczaj bardziej oporne niż baterie Gram-ujemne, co
może wynikać z różnic w budowie ściany komórkowej [2].
Ponadto bardziej wrażliwe są bakterie tlenowe niż beztlenowe [2]. Wyniki otrzymane przez Farkas, Gazsó i Diósi
[4] w badaniach mikroflory gleby wskazują, że dawka D10
[kGy] powodująca dziesięciokrotne zmniejszenie populacji
dla badanych przez nich bakterii aerobowych waha się pomiędzy 0.8 a 2.44 kGy natomiast dla bakterii anaerobowych
oscyluje w granicach 1.86-4.93 kGy.
Dawki D10 dla różnych gatunków bakterii mogą się
różnić o kilka rzędów wielkości. Dawki D10 dla bakterii za-
&ARM0RZEGL.AUK
siedlających produkty spożywcze (mięso wołowe) Bacillus cereus, Staphylococcus aureus czy Escherichia coli
wynoszą odpowiednio 0.663, 0.594 i 0.538 kGy [5]. Natomiast Gram-dodatnie bakterie z rodzaju Brevibacterium,
naturalnie występujące w glebie, przeżywały napromieniowanie nawet dawką 40 kGy [11]. Do najbardziej opornych
na promieniowanie gamma bakterii należy mutant popromienny Micrococcus radiodurans [2]. Parker i Vincent
[13] wyizolowali z torfu bakterię podobną do Micrococcus
radiodurans, która przetrwała napromieniowanie dawką
25 – 35 kGy.
Nie tylko sam gatunek bakterii determinuje jej radiowrażliwość. Także poszczególne szczepy bakterii tego samego gatunku mogą bardzo znacznie różnić się wrażliwością
radiacyjną [2,4]. Dla Escherichia coli różnica pomiędzy najbardziej a najmniej wrażliwym szczepem (Texas) w średniej
dawce letalnej jest prawie trzykrotna [2]. Może to wynikać
z faktu, że u różnych szczepów mogą występować różne
mechanizmy naprawcze [14].
Kolejnym parametrem mogącym nieznacznie wpływać
na skuteczność sterylizacji (wynikającej z wrażliwości bakterii) jest moc dawki [2]. Dawki podawane impulsowo lub
w stosunkowo dużym przedziale czasowym mogą dać szansę na włączenie przez komórkę mechanizmów naprawczych,
a więc zwiększyć przeżywalność bakterii. Z praktycznego
punktu widzenia nie ma to jednak większego znaczenia,
ponieważ wytwórcy starają się zdeponować jak największą
dawkę w jak najkrótszym czasie, aby ze względów ekonomicznych jak najbardziej przyspieszyć ten etap technologiczny. Ponadto różnice we wrażliwości radiacyjnej nawet
skrajnie różnych mocy dawki nie są duże [2].
Ogromne znaczenie w przebiegu procesu sterylizacji
ma obecność lub brak wody w sterylizowanym obiekcie
[2,4,5,12]. Wynika to faktu, iż promieniowanie gamma prowadzi do radiolizy wody, której produkty mogą działać letalnie na bakterie [5,8,9,11,12,15]. Pośród produktów radiolizy
wody: eaq-, H3O+, ·OH, H, H2 i H2O2, największe zniszczenia u bakterii powoduje rodnik ·OH [12]. Powstające wolne
rodniki (powstające zewnątrz- i wewnątrzkomórkowo [11])
zakłócają organizację biochemiczną organizmu, co prowadzi do śmierci komórki [9]. Między innymi niska zawartość
wody może powodować małą wrażliwość na promieniowanie gamma przetrwalników bakterii [2]. Natomiast z drugiej
strony, jeśli przetrwalniki (w obecności tlenu) znajdują się
blisko stanu maksymalnego wysuszenia są bardzo wrażliwe na promieniowanie gamma [2]. McNamara, Black,
Beresford i Parekh [11] zauważyli, że sterylizacja mokrej
gleby jest efektywniejsza niż suchej ponieważ bakterie
w mokrej glebie są bardziej wrażliwe na promieniowanie niż
w suchej.
Na wrażliwość radiacyjną bakterii ma również duży
wpływ temperatura napromieniowania, a w przypadku produktów spożywczych także temperatura przechowywania
produktów po napromieniowaniu [14,16]. Zmniejszanie
temperatury powoduje unieruchomienie wolnych rodników, co prowadzi do zmniejszenia skuteczności pośredniego działania promieniowania gamma [14]. Dawka D10 dla
Listeria monocytogenes napromieniowanej w -72°C była
wyższa niż dla próbki napromieniowanej w 0°C – immobilizacja wolnych rodników zadziałała jako czynnik radiopro-
tekcyjny [14]. Dla Yersinia enterocolitica i Escherichia coli
nie zaobserwowano takiego efektu [14].
Zwiększanie temperatury podczas napromieniowywania
może zwiększać skuteczność sterylizacji poprzez synergistyczne działanie tych dwóch czynników wyjaławiających.
Jednak metoda ta nie znajduje praktycznego zastosowania
ze względu na duże koszty [2].
Zaobserwowano również wpływ środowiska (gazu w jakim prowadzi się napromieniowanie) na wrażliwość bakterii
na promieniowanie gamma [6,12].
W literaturze szeroko prowadzi się dyskusję nad wpływem tlenu na wrażliwość radiacyjną mikroorganizmów
– zjawisko to nazywane jest efektem tlenowym [6,12].
Porównując wrażliwość przetrwalników Clostridium botulinum typu E zaobserwowano, że najkorzystniejszym środowiskiem do ich niszczenia było powietrze [13]. Mniejszą
skuteczność promieniowania gamma dla zarodników Clostridium botulinum zaobserwowano odpowiednio dla atmosfery N2O i N2 [13]. Wrażliwość przetrwalników Clostridium
w powietrzu mogła wynikać z tworzenia się rodników peroksylowych i działania tlenu zawartego w powietrzu jako
utleniacza [12]. Innym czynnikiem mogącym mieć wpływ
na uwrażliwianie bakterii w środowisku tlenowym (powietrzu) jest aktywność ligazy DNA, która naprawia uszkodzony przez promieniowanie kwas deoksyrybonukleinowy. Enzym ten w środowisku tlenowym nie był w stanie
połączyć rozerwanych łańcuchów DNA [12]. Efekt wpływu
atmosfery napromieniowania na wrażliwość bakterii zaobserwowali również Borsa, Lacroix, Ouattara i Chiasson [6].
Wykazali oni, że zastosowanie środowiska składającego się
z 60% tlenu, 30% dwutlenku węgla i 10% azotu (mieszanina
MAP) powoduje zmniejszenie dawki D10 z 0.126 kGy (kontrola-powietrze) do 0.086 kGy (MAP) dla Escherichia coli oraz
z 0.526 kGy (kontrola-powietrze) do 0.221 (MAP) dla Salmonella typhi [6].
Oprócz wyżej wspomnianych czynników ważnym elementem wpływającym na skuteczność przebiegu procesu
wyjaławiania jest obecność różnych substancji chemicznych modyfikujących odpowiedź bakterii na promieniowanie gamma. Substancje te można podzielić na dwie grupy:
substancje powodujące uwrażliwienie na promieniowanie gamma oraz substancje działające radioprotekcyjnie
[6,12,17]. Do substancji mogących działać radioprotekcyjnie należą niektóre poliaminy. Poliaminy dzięki ładunkowi
jaki posiadają, mogą łączyć się z kwasem deoksyrybonukleinowym. Takie połączenie zmienia konformację DNA i
wpływa na mechanizmy naprawcze [17]. Do innych radioprotektorów można zaliczyć chlorek sodu czy tioglikolan
sodu, które zwiększają przeżywalność gamma napromieniowanych przetrwalników Clostridium botulinum [12].
Jednym z mechanizmów działania radioprotekcyjnego niektórych substancji może być zmiatanie wolnych rodników
i stabilizowanie helisy DNA [12].
Do substancji mogących zwiększać wrażliwość radiacyjną bakterii Borsa, Lacroix, Ouattara i Chiasson [6] zaliczyli tymol, karwakrol oraz aldehyd trans-cynamonowy.
Już 0.1% (m/m) tymolu znacząco zwiększa wrażliwość Salmonella typhi zakażających mieloną wołowinę [6] Podobne,
ale już nie takie spektakularne efekty zaobserwowano dla
karwakrolu i aldehydu trans-cynamonowego [6].
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Na wrażliwość bakterii na promieniowanie gamma
wpływa również aktywność metaboliczna i faza cyklu życiowego mikroorganizmu [11].
'–-¸qlª|²ÉŸ–-Jl-A¬oy-Ÿa–®¬7}ª
Grzyby są bardziej wrażliwe na promieniowanie gamma niż bakterie [2,7,11,15,18]. Podobnie jak w przypadku
bakterii, także u grzybów można zauważyć znaczne różnice
w oporności na promieniowanie gamma w zależności od gatunku [2,7,11,15].
Zarodniki, grzybnie, skleroty czy inne struktury morfologiczne mogą wykazywać różną wrażliwość radiacyjną [2].
Można przyjąć, że zarodniki są bardziej odporne niż formy
wegetatywne, szczególnie zarodniki wielokomórkowe. Inną
przyczyną zmniejszonej wrażliwości niektórych zarodników może być ich wielojądrzastość [2].
Podobnie jak w przypadku bakterii, zwiększanie dawki
promieniowania gamma zwiększa skuteczność sterylizacji (zwiększa ilość inaktywowanych grzybów) [2,7,11,15].
W przypadku sterylizacji gleby dawka 10 kGy eliminuje
większość (>99%) grzybów glebowych [7,11]. Niektóre gatunki grzybów, jak np. Aspergillus spp., zasiedlający
stare książki i dokumenty, jest odporna nawet na dawkę 20
kGy [15]. Równie wysoką odpornością wykazuje się gatunek Cladosporium spp. Ciemny barwnik, melanina, pełni
w wypadku tego gatunku rolę radioprotektora i zwiększa
jego radioodporność [15].
Promieniowanie gamma stosowane jest także do sterylizacji (przede wszystkim odgrzybiania) zbóż [5]. Dawka
4 kGy powoduje całkowite usunięcie grzybów z ziaren
Oryza sativa (ryż siewny) i Cicer arietinum (ciecierzyca
pospolita) oraz eliminuje ryzyko zatrucia niebezpiecznymi
toksynami produkowanymi przez niektóre gatunki grzybów
zasiedlających te zboża [18]. Ponadto, zastosowanie takich
dawek promieniowania gamma nie wpływa znacząco na potencjał kiełkowania tych zbóż [18].
Podobnie, jak w przypadku bakterii, zaobserwowano
wpływ tlenu na skuteczność eliminacji grzybów. Zauważono, że dawka eliminująca 99.9% zarodni Rhizopus stolonifer zmienia się z 3 kGy w środowisku tlenowym do 4 kGy
w środowisku beztlenowym [2].
RAi-yl®u¬ŸJ®l-t-yl-Ÿ
‚–|ulRyl|ª-yl-Ÿa-uu-Ÿy-Ÿulp–||–a-yl®u¬
Śmierć komórki pod wpływem promieniowania gamma nie jest natychmiastowa. Niektóre z funkcji komórki
mogą być zachowane po gamma napromieniowaniu [2].
Związane jest to często z dużą odpornością enzymów, które
mogą pozostać aktywne nawet po zaabsorbowaniu bardzo
wysokich dawek promieniowania [2,11]. Zaobserwowano,
że napromieniowanie gleby dawką 20 kGy, która skutecznie eliminuje zdecydowaną większość grzybów i bakterii,
nie powoduje dezaktywacji enzymów [11]. Nawet po tak
wysokiej dawce promieniowania gamma, fosfatazy, urazy,
sacharozy czy inne enzymy proteolityczne pozostają aktywne jeszcze przez wiele tygodni [11]. Napromieniowanie
gleby dawką 75 kGy zmniejszyło aktywność fosfataz do
około 70% aktywności wyjściowej, dekarboksylaz o 0.5%
w stosunku do aktywności wyjściowej, a aktywność ureaz
nie uległa zmianie [11]. Podobnie jak w przypadku bakterii
czy grzybów obecność wody zwiększa wrażliwość enzymów na promieniowanie gamma [11].
Komórka jest najbardziej wrażliwa na promieniowanie
gamma w fazie S (podziału komórkowego) [2]. Promieniowanie gamma oddziaływując z mikroorganizmem może powodować jego uszkodzenia bezpośrednie (jonizacja powoduje uszkodzenia DNA <mutacje>, które często są letalne),
może również działać pośrednio przez produkty jonizacji
(radiolizy) wody czy innych struktur komórki. Wytworzone
w ten sposób reaktywne formy tlenu (w tym wolne rodniki)
mogą zaburzać działanie podstawowych struktur organizmu
i prowadzić do śmierci komórki [11].
Większa odporność niektórych mikroorganizmów na
promieniowanie gamma wynika z rozwiniętych mechanizmów naprawczych. Zmienione zasady azotowe są enzymatycznie wycinane, a brakujące elementy łańcucha DNA
są odbudowywane na podstawie nici komplementarnej [2].
Niektóre mikroorganizmy, jak np.: jednokomórkowy glon
Euglena gracilis posiada system chroniący DNA aktywowany światłem białym [19].
W przypadku niektórych mikroorganizmów (np.: Cladosporium spp.) funkcje radioprotekcyjne może pełnić produkowana i magazynowana w grzybni melanina [15].
Piśmiennictwo
1. Farkas J. Microbiological of irradiated foods. Int J Microbiol 1989; 9: 1-45.
2. Zagórski ZP. Sterylizacja radiacyjna. Warszawa: PZWL;
1991.
3. Katušin-Ražem B, Novak B, Ražem D. Microbiological
decontamination of botanical raw materials and corresponding pharmaceutical products by irradiation. Rad
Phys Chem 2001; 62: 261-275.
4. Farkas G, Gazsó LG, Diósi G. Radiosensitivity of subterranean bacteria in the Hungarian upper permian siltstone formation. J Env Rad 2002; 61: 233-239.
5. Jo C I wsp. Inactivation of foodborne pathogens in marinated beef rib by ionizing radiation. Food Microbiol
2004; 21: 543-548.
6. Borsa J i wsp. Radiosterilization: enhancing the radiation inactivation of foodborne bacteria. Rad Phys Chem
2004; 71: 135-139.
7. McNamara NP i wsp. The sensitivity of a forest soil
microbial community to acute gamma-irradiation. Appl
Soil Ecol 2007; 37: 1-9.
8. Ishii N i wsp. Takahashi S. Impact of gamma irradiation
on the transformation efficiency for extracellular plasmid DNA. J Env Rad 2007; 97: 159-167.
9. Pourahmad R, Pakravan R. Radiosterilization of disposable medical devices. Radiat Phys Chem 1997; 49: 285286.
10. Ražem D, Katušin-Ražem B. Dose requirements for microbial decontamination of botanical materials by irradiation. Rad Phys Chem 2002; 63: 697-701.
11. McNamara NP i wsp. Effects of acute gamma irradiation
on chemical, physical and biological properties of soils.
Appl Soil Ecol 2003; 24: 117-132.
&ARM0RZEGL.AUK
12. Lim YH, Hamdy MK, Toledo RT. Combined effects of
ionizing-irradiation and different environments on Clostridium botulinum type E spores. Int Food Microbiol
2003; 89: 251-263.
13. Parker FE, Vincent JM. Sterilization of peat by gamma
radiation. Plant Soil 1962; 94: 71-74.
14. Kamat A i wsp. Low-dose irradiation as a measure to
improve microbial quality of ice cream. Int J Food Microbiol 2000; 62: 27-35.
15. Da Silva M i wsp. Inactivation of fungi from deteriorated paper materials by radiation. Int Biodeter Biodegr
2006; 57: 163-167.
16. Adu-Gyamfi A, Nketsia-Tabiri J, Apea Bah F. Radiosensitivities of bacterial isolates on minced chicken and poached
chicken meal and their elimination following irradiation
and chilled storage. Rad Phys Chem 2008; 77: 174-178.
17. Kim IG, Oh TJ. SOS induction of the recA gene by UV-,
γ-irradiation and mitomycin C is mediated by polyamines
in Escherichia coli K-12.Tox Lett 2000; 116: 143-149.
18. Maity JP i wsp. Radiation-induced effects on some common storage edible seeds in India infested with surface
microflora. Rad Phys Chem 2004; 71: 1065-1072.
19. Hayashi H i wsp. Light dependency of resistance to ionizing radiation in Euglena gracilis. J Plant Physiol 2004;
161: 1101-1106.
Adres do korespondencji:
Sławomir Wilczyński
Katedra i Zakład Biofizyki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej SUM w Katowicach
tel. 32-3641162,
kom. 507169625; e-mail: [email protected]