ĆWICZENIE VI

ĆWICZENIE VI
Temat: Mikroflora środowisk naturalnych
1. Określanie ogólnej liczby drobnoustrojów w powietrzu
Powietrze jest środowiskiem niesprzyjającym rozwojowi drobnoustrojów co nie oznacza, że mikroorganizmy
tam nie występują.
Skład jakościowy i ilościowy mikroflory powietrza zależy od takich czynników, jak:
•
•
•
•
•
•
•
obecność i liczebność organizmów żywych,
stanu ich zdrowotności,
temperatury,
wilgotności,
naświetlenia,
ruchów powietrza,
stopnia uprzemysłowienia terenu itp.
Drobnoustroje dostają się do powietrza z gleby, wody, powierzchni roślin, wydalin ludzi i zwierząt. W
powietrzu spotyka się przedstawicieli wszystkich grup drobnoustrojów. Brak przyswajalnych składników
pokarmowych w powietrzu ogranicza rozwój drobnoustrojów. Są przypadki, w których drobnoustroje mogą się
odżywiać substancjami organicznymi rozpuszczonymi w kropelkach mgły zawieszonej w powietrzu i
rozmnażać się. Niektóre komórki giną w wyniku wysuszenia lub działania promieni ultrafioletowych, inne są
przenoszone z prądami powietrza. Liczba drobnoustrojów w powietrzu jest jednym z ważnych mierników
zanieczyszczenia atmosfery w przestrzeni otwartej i w pomieszczeniach zamkniętych. Liczba drobnoustrojów
w pomieszczeniach, szczególnie o dużym zagęszczeniu ludzi i sprzętów, jest wielokrotnie większa niż w
powietrzu w miejscach odkrytych. W pomieszczeniach znajduje się szczególnie dużo drobnoustrojów
chorobotwórczych wydzielanych ze śliną, przy kichaniu i kaszlu. Wyniku badań nad zawartością
drobnoustrojów w powietrzu służba zdrowia uzyskuje ocenę stanu sanitarnego atmosfery.
Zastosowana na ćwiczeniu metoda oznaczania liczby drobnoustrojów w określonej objętości powietrza
ma charakter jedynie orientacyjny - nie jest metodą ilościową w ścisłym znaczeniu tego słowa. Jednak ze
względu na prostotę wykonania bywa często stosowana w praktyce. W metodzie tej, zwanej sedymentacyjną
Kocha, wykorzystuje się zjawisko opadania drobnoustrojów będących w powietrzu i osadzania się ich na
przygotowanym podłożu hodowlanym. Żywe komórki drobnoustrojów, znajdują w podłożu warunki do życia,
rozmnażają się i tworzą kolonie dostrzegalne przy użyciu niewielkich powiększeń, a nawet gołym okiem.
Przy określaniu liczby drobnoustrojów w powietrzu zakłada się, że każda kolonia pochodzi od
komórki bakteryjnej, fragmentu strzępki czy zarodnika grzyba lub promieniowca. Oznaczenie
drobnoustrojów w określonej objętości powietrza opiera się na obserwacjach z których wynika, że
kolonii, które wyrosły na 100 cm2 podłoża po 5-minutowym kontakcie podłoża z powietrzem równa
przybliżeniu liczbie drobnoustrojów zawartych w 10 dm3 powietrza.
jednej
liczby
liczba
jest w
Część praktyczna
a). W celu określenia liczby drobnoustrojów w powietrzu uczestnicy ćwiczeń otrzymują płytki Petriego z
jałowym agarem odżywczym.
Płytkę otwieramy, dbając o uniknięcie kontaktu podłoża z ręką eksperymentatora, a także wystrzegając się
zanieczyszczenia podłoża (nie pochylać się nad otwartą płytką, nie dmuchać na nią). Wieczko płytki odkładamy
ostrożnie na bok dnem do góry. Po upływie 5 minut zamykamy płytkę, na wieczku piszemy datę doświadczenia
oraz inicjały eksperymentatora. Zakażone płytki wstawiamy do cieplarki o temp. 28°C. Jako kontrolę
wstawiamy do cieplarki płytki identycznie przygotowane, które nie były jednak otwierane. Płytki ustawiamy w
cieplarce zawsze dnem do góry, aby zbierająca się woda kondensacyjna nie zalewała powierzchni pożywki.
Płytki wyjmuje się z cieplarki po 72 godzinach i przechowujemy do następnego ćwiczenia w chłodziarce o temp.
4°C lub w temperaturze pokojowej.
2. Określanie ogólnej liczby drobnoustrojów w glebie
Określanie liczby drobnoustrojów w glebie należy do zabiegów często podejmowanych przez badaczy
zajmujących się mikrobiologią gleby. Znajomość liczby drobnoustrojów w glebie ułatwia, w powiązaniu ze
znajomością innych danych, poznanie kierunku procesów zachodzących w glebie i aktualnego stanu gleby.
Liczba drobnoustrojów glebowych i ich skład jakościowy (występujące gatunki lub grupy fizjologiczne)
określają poziom tzw. aktywności biologicznej gleby, jednego z czynników kształtujących w dużym stopniu
żyzność gleby.
Praktyka mikrobiologiczna zna kilka metod oznaczania liczby drobnoustrojów w glebie. Wszystkie one
dalekie są od doskonałości i umożliwiają uzyskanie wyników jedynie orientacyjnych. Na ćwiczeniach stosuje
się tzw. metodę płytkową, często wykorzystywaną przez mikrobiologów glebowych. Jest to metoda pośrednia,
oparta na liczeniu kolonii wyrosłych na podłożu hodowlanym, zaszczepionych znaną masą gleby. Metody
bezpośrednie polegają na liczeniu drobnoustrojów bezpośrednio w próbkach gleby przy użyciu mikroskopu.
Metodą płytkową uzyskujemy wskaźnik, określany często jako ogólna liczba drobnoustrojów. Określenie
to nie jest jednak ścisłe. Metodą płytkową określamy nie ogólną liczbę drobnoustrojów występujących w danej
glebie w ogóle, ale jedynie przybliżoną liczbę drobnoustrojów zdolnych do rozwoju i rozmnażania się na
zastosowanej w doświadczeniu pożywce. Posiewając próbkę tej samej gleby na różne podłoża (np. zawierające
różne źródła węgla, różne źródła azotu, zróżnicowane pod względem odczynu), otrzymamy przy zastosowaniu
metody płytkowej różniące się nieraz znacznie wyniki, stwierdzimy przy tym również wyraźne różnice
jakościowe w składzie mikroflory. Niemniej w praktyce mikrobiologicznej metoda płytkowa, wykonana
starannie i w dostatecznej liczbie powtórzeń, oddaje duże usługi. Należy jednak zawsze pamiętać o podaniu w
opisie, jakie zastosowano podłoże oraz w jakich warunkach i jak długo prowadzono hodowlę.
W celu uzyskania wiarygodnych wyników konieczne jest określone postępowanie przy pobieraniu próbek
gleby, a także przeprowadzenie kilku równoległych powtórzeń dla każdej próby.
W celu otrzymania próbki reprezentacyjnej pobiera się z badanego terenu kilka równoległych próbek
gleby laską Egnera, najczęściej z głębokości 2-20 cm. Pobraną glebę umieszcza się w woreczkach z folii lub
słoikach z odpowiednim zamknięciem. Przewiezienie próbek do laboratorium i nastawienie doświadczenia
powinno nastąpić w zasadzie w dniu pobrania próby. Jednocześnie z nastawieniem doświadczenia określa się
suchą masę gleby. Znajomość zawartości wody jest konieczna do późniejszych przeliczeń.
W laboratorium miesza się pobrane próbki i przesiewa przez sito o oczkach o średnicy 1 mm. Z przesianej
gleby odważa się 2 próbki po 10 g każda i wsypuje do kolbek zawierających po 100 cm3 jałowej wody.
Wszystkie opisane tu zabiegi, a także dalsze należy prowadzić w sposób maksymalnie zabezpieczający przed
przypadkowym zakażeniem.
Zawiesinę gleby w wodzie przygotowuje się na wytrząsarce. Z wstępnego rozcieńczenia (10-1), którego
1 cm zawiera 0,1 g gleby przygotowuje się dalsze. Z rozcieńczenia wstępnego pobiera się jałową pipetą 1 cm3
zawiesiny i wprowadza do probówki zawierającej 9 cm3 wyjałowionej wody, uzyskując kolejne rozcieńczanie
(10-2). W ten sposób postępujemy dalej aż do osiągnięcia wymaganego rozcieńczenia. Przygotowując każde
rozcieńczenie, należy używać nowej jałowej pipety. Przed pobraniem zawiesiny do dalszego jej rozcieńczenia
starannie ją mieszamy.
3
Konieczność przygotowania rozcieńczeń przed wysiewem gleby związana jest z bardzo dużą liczebnością
drobnoustrojów w glebie.
Rozcieńczenie 1:10 zapisujemy w skrócie 10-1.
Część praktyczna
Ze względów organizacyjnych pierwsze etapy postępowania pobieranie i odważenie próbki gleby, określenie
zawartości wody w badanej glebie i przygotowanie wstępnych rozcieńczeń dokonywane są przez prowadzących
ćwiczenia. Uczestnicy ćwiczeń dostają więc gotową, określoną zawiesinę gleby w wodzie i z tej zawiesiny
przygotowują dalsze rozcieńczenia.
Studenci otrzymują w probówkach rozcieńczenie gleby 10-3 /1:1000/, probówki zawierające po 9 cm3 wody
jałowej, jałowe płytki Petriego i pipety oraz jałowe rozpuszczone podłoża w kolbach.
Przygotować z rozcieńczenia 10-3 dalsze rozcieńczenia: 10-4 i 10-5.
Z dokładnie wymieszanych rozcieńczeń 10-3 i 10-5 przenosimy jałowymi pipetami po 1 cm3 do pustych jałowych
płytek Petriego. Zawiesinę o rozcieńczeniu 10-3 zalewamy podłożem wg Martina, a zawiesinę o rozcieńczeniu
10-5 podłożem wg Bunta i Roviry. Pożywki przed wylaniem powinny być schłodzone do temp. ok. 50oC.
Poruszając ostrożnie płytką, należy wymieszać zawiesinę z podłożem i zostawić płytkę w spokoju do zestalenia
się podłoża. Następnie płytki wstawiamy do cieplarki o temp. 28oC i inkubujemy.
3. Określanie ogólnej liczby drobnoustrojów i miana coli w wodzie
Woda jako środowisko naturalne wykazuje dużą różnorodność mikroflory uwarunkowaną różnym
pochodzeniem drobnoustrojów.
Drobnoustroje występujące w wodzie można podzielić na 2 grupy.
Drobnoustroje autochtoniczne, czyli tubylcze, dla których woda jest naturalnym środowiskiem
bytowania i rozwoju.
Drobnoustroje allochtoniczne, czyli naniesione. Drobnoustroje dostają się do wody z gleby, powietrza, z
przewodu pokarmowego ludzi, zwierząt oraz w niektórych wypadkach ze ścieków przemysłowych. Określenie
liczby drobnoustrojów w wodzie i ujawnienie poszczególnych grup mikroflory jest jednym z podstawowych
elementów badań przy ocenie przydatności wody do codziennego użytku, a także w różnych dziedzinach
przemysłu, zwłaszcza spożywczego.
Badania sanitarno-epidemiologiczne, jakim poddawana jest woda do picia, obejmują m.in. określenie
ogólnej liczby drobnoustrojów oraz ilościowe oznaczenie występowania bakterii pałeczki okrężnicy
(Escherichia coli). Bakterie z tej grupy znajdują się w przewodzie pokarmowym ludzi oraz zwierząt i są
wydalane z kałem. Obecność ich jest wskaźnikiem bezpośredniego lub pośredniego zakażenia wody
odchodami. Na podstawie znajomości liczby bakterii z grupy pałeczki okrężnicy można wyciągnąć wnioski o
stopniu zanieczyszczenia wody i jej przydatności do spożycia. Liczbę tych bakterii w wodzie określa się przez
oznaczenie tzw. miana coli.
Przez miano coli rozumiemy najmniejszą ilość wody, w której stwierdza się jeszcze obecność pałeczki
okrężnicy. Jeżeli np. stwierdzimy obecność pałeczek okrężnicy w 100 cm3 wody a nie ujawnimy ich
występowania w 75 cm3, to przyjmujemy miano coli badanej wody za 100.
Przy określaniu miana coli wykorzystuje się zdolność pałeczki okrężnicy do fermentowania laktozy z
wytworzeniem kwasu i gazu. W stacjach sanitarno-epidemiologicznych stosuje się do określenia miana coli
pożywkę Ejkmana zawierającą pepton, 2 % laktozy i purpurę bromokrezolową jako wskaźnik pH. Po
wprowadzeniu określonej objętości wody do pożywki inkubację prowadzi się w temp. 37oC. Wynik odczytuje
się po 24 i 48 godzinach. O obecności pałeczki okrężnicy świadczy zmiana zabarwienia z czerwonego na żółte
wskutek zakwaszenia środowiska i pojawianie się pęcherzyków gazu w rurkach Durhama.
Normy Polskie przewidują, że dla wody z wodociągów obsługujących co najmniej 50 tys. mieszkańców
miano coli powinno mieć wartość powyżej 100, a ogólna liczba drobnoustrojów oznaczonych na agarze
odżywczym nie powinna przekraczać 5. Dla wodociągów obsługujących poniżej 50 tys. mieszkańców oraz dla
wody studziennej miano coli nie powinno być niższe niż 50 a ogólna liczba drobnoustrojów oznaczona na
agarze odżywczym nie większa niż 20. Jeżeli nie zostaną spełnione powyższe warunki, to woda zostaje pod
wzglądem sanitarnym zdyskwalifikowana.
W celu pobrania próby wody z kranu wodociągowego należy końcówkę zmyć tamponem umoczonym w
70 % alkoholu etylowym lub denaturacie i opalić, następnie pozostawić na 10 minut kran odkręcony, aby
spłynęły pierwsze partie wody, a następnie pobrać próby do jałowych naczyń.
Analizę mikrobiologiczną wykonujemy jak najszybciej po pobraniu wody (do 2 godz.).
Część praktyczna
Uczestnicy ćwiczeń otrzymuje do badania wodę w jałowych butelkach. W czasie ćwiczenia określamy:
a) ogólną liczbę drobnoustrojów na agarze odżywczym,
b) orientacyjne miano coli na pożywce płynnej.
a). W celu oznaczenie ogólnej liczby drobnoustrojów pobieramy jałową pipetą 1 cm3 badanej wody i
wprowadzamy na dno płytki Petriego, a następnie zalewamy rozpuszczonym i ochłodzonym do ok. 50 °C
agarem odżywczym, mieszając podobnie jak przy określeniu liczby drobnoustrojów w glebie. Po zastygnięciu
podłoża płytki znaczymy i inkubujemy w cieplarce w temp. 28 °C.
Na następnym ćwiczeniu liczymy kolonie i ustalamy ogólną liczbę drobnoustrojów zawartych w 1 cm3 badanej
wody.
b). W celu określenia miana coli w wodzie wysiewamy po 10 cm3 wody do 10 cm3pożywki diagnostycznej w 5
probówkach oraz 50 cm3 wody do 50 cm3 pożywki diagnostycznej w jednej probówce (patrz wyżej). Jedną
probówkę z pożywką służącą jako kontrola pozostawiamy nie zaszczepioną. Probówki znaczymy i wstawiamy
do cieplarki. Wyniki odczytujemy na następnym ćwiczeniu.