INDYWIDUALNY HARMONOGRAM ZAJĘĆ

Zajęcia fakultatywne „DIAGNOSTYKA BIOCHEMICZNA”
8.05.2015 – instrukcja do ćwiczeń: „Własności fizykochemiczne aminokwasów i białek”
1. Własności fizykochemiczne aminokwasów i białek
Reakcja biuretowa – wykrywanie wiązania peptydowego
Po dodaniu do roztworu białka lub peptydu niewielkiej ilości rozcieńczonego roztworu siarczanu miedzi(II) i
zalkalizowaniu pojawia się fiołkowe zabarwienie. Reakcja zachodzi tylko wtedy, gdy w peptydzie są co
najmniej dwa wiązania peptydowe (3 aminokwasy). Wolne aminokwasy i dipeptydy dają wynik negatywny.
W oznaczeniu przeszkadzają diamidy kwasów szczawiowego, malonowego i bursztynowego, które także
dają pozytywny wynik próby. Podobnie zachowuje się biuret, od którego pochodzi nazwa metody.
W wyniku reakcji biuretowej powstają związki kompleksowe, w których atom miedzi łączy się z
atomami azotu łańcucha peptydowego wiązaniami koordynacyjnymi.
Reakcja biuretowa znalazła zastosowanie do ilościowego oznaczania stężenia białka w surowicy i
innych płynach biologicznych. Ma ona jednak zastosowanie tylko do oznaczania dość wysokich stężeń
białek (1 – 10 mg/cm3). Niższe stężenia białek wymagają zastosowania bardziej czułych metod
analitycznych (np. metody Lowriego).
Wykonanie ćwiczenia
Do 1 cm3 roztworu białka dodać 1 kroplę roztworu siarczanu miedzi(II), a następnie
zalkalizować, dodając równą objętość 2-molowego NaOH. Zaobserwować zabarwienie roztworu na
kolor fiołkowy.
Reakcja ksantoproteinowa – wykrywanie aminokwasów aromatycznych
Pod wpływem stężonego kwasu azotowego (V) rodnik fenylowy aminokwasów aromatycznych
ulega nitrowaniu, dając nitropochodne o żółtym zabarwieniu. Po zalkalizowaniu zabarwienie pogłębia się do
pomarańczowego. Dodatni wynik tej reakcji otrzymuje się z tyrozyną, tryptofanem i fenyloalaniną (dopiero
po dość silnym ogrzewaniu):
Wykonanie ćwiczenia
Do l cm3 roztworu tyrozyny lub tryptofanu dodać 0,5 cm3 stężonego kwasu azotowego (V).
Roztwór po podgrzaniu zabarwia się na kolor żółty. Po ostudzeniu można dodać l cm 3 30% NaOH kolor zmienia się na pomarańczowy.
Reakcje denaturacji białek:
- Działanie rozpuszczalników organicznych na białka
Rozpuszczalniki organiczne (etanol, aceton) osłabiają wiązania struktury przestrzennej cząsteczki białka i
dezorganizują płaszcz wodny cząsteczki, powodując koagulację białka. Denaturujące działanie etanolu
objawia się dopiero przy wydłużeniu okresu działania rozpuszczalnika i wyższej temperaturze.
Wykonanie ćwiczenia
Do l cm3 roztworu białka dodać l cm3 acetonu. Zaobserwować wytracanie się białka.
- Wytrącanie białka kwasem
Cząsteczki białka o ładunku dodatnim wykazują zdolność nieodwracalnego łączenia się
niektórych kwasów, dając nierozpuszczalne sole. Zjawisko to wykorzystywane jest m.in.
medycznej do usuwania białek z płynów biologicznych (tzw. odbiałczanie). Najczęściej
stosowane są kwasy: trichlorooctowy, chlorowy (VII), sulfosalicylowy, fosforowolframowy,
oraz pikrynowy.
z anionami
w analityce
w tym celu
wolframowy
Wykonanie ćwiczenia
Do probówki zawierającej 1 cm3 białka jaja kurzego wprowadzić kilka kropli 20% roztworu
kwasu sulfosalicylowego. Natychmiast zachodzi proces nieodwracalnej denaturacji białek.
- Wytracanie białek jonami metali ciężkich
Jony niektórych metali ciężkich, takie jak Pb+2, Hg+2, Cu+2 tworzą z białkami trudno rozpuszczalne
sole. Ponadto jony metali ciężkich, nawet w śladowych stężeniach, reagują z wolnymi grupami SH białek,
zmieniając ich aktywność biologiczną (np. blokując centra aktywne białek enzymatycznych).
Wykonanie ćwiczenia
Do 1 cm3 białka jaja kurzego dodać kilka kropli 10% roztworu octanu ołowiu(II). Wytrąca
się biały osad białczanu ołowiu (II).
- Działanie garbników na białka
Garbniki zawarte w niektórych surowcach roślinnych (czarna herbata, kora dębu, dębianki) reagując
z białkami tworzą trudno rozpuszczalne sole (białczany). Zjawisko to wykorzystywane bywa w medycynie,
gdzie przetwory z surowców bogatych w garbniki stosowane są zewnętrznie jako środki o działaniu
ściągającym (np. do płukania jamy ustnej) lub wewnętrznie – jako środki przeciwbiegunkowe (białczan
taniny).
Wykonanie ćwiczenia
Do 1 cm3 białka jaja kurzego dodać kilka kropli 5% roztworu taniny. Wytraca się kremowy
osad białczanu taniny.