Ćwiczenie 1 AMINOKWASY – BUDOWA I WŁAŚCIWOŚCI BIAŁKA

Ćwiczenie 1 AMINOKWASY – BUDOWA I WŁAŚCIWOŚCI BIAŁKA

Ćwiczenie 1
AMINOKWASY – BUDOWA I WŁAŚCIWOŚCI
BIAŁKA – BUDOWA I FUNKCJE
Część doświadczalna obejmuje:
− rozdział aminokwasów metodą chromatografii podziałowej (technika chromatografii bibułowej wstępującej)
− wykonanie reakcji charakterystycznych dla wybranych aminokwasów
− ilościowe oznaczanie białek metodą biuretową
WPROWADZENIE
AMINOKWASY
Budowa i właściwości ogólne aminokwasów
Aminokwasy są kwasami organicznymi zawierającymi wolną grupą karboksylową
oraz wolną grupą aminową, położoną przy α-atomie węgla. Poza tymi dwoma grupami,
każdy aminokwas ma charakterystyczny dla siebie łańcuch boczny R (Ryc. 1 i 2).
Ryc. 1. Schemat budowy i zróżnicowanie funkcjonalne aminokwasów (Koolman i Röhm
2005)
1
Ryc. 2. Łańcuchy boczne aminokwasów proteinogennych (Koolman i Röhm 2005)
Na Ryc. 2 przedstawiono łańcuchy boczne dwudziestu aminokwasów budujących białka
(aminokwasy proteinogenne), które ze względu na budowę chemiczną oraz polarność łańcuchów bocznych podzielono na siedem klas. Wartości podane na dole po lewej przedstawiają stopień polarności danego łańcucha bocznego (najmniejszy dla Phe, Cys, Met, Ala, a największy dla Arg, Lys). Przy łańcuchach bocznych zdolnych do jonizacji podane są także wartości pK (czerwone liczby). Szczególną pozycję wśród aminokwasów zajmuje prolina (Pro).
Jej łańcuch boczny wraz z węglem α i grupą aminową przy tym węglu tworzą 5-członowy
2
pierścień. Atom azotu w pierścieniu jest słabo zasadowy i w warunkach fizjologicznych nie
jest uprotonowany. Aminokwasy, które nie mogą być syntetyzowane w organizmach ludzkich
(aminokwasy egzogenne) oznaczone są czerwoną gwiazdką.
Aminokwasy są składnikami budulcowymi peptydów i białek (aminokwasy proteinogenne). Niektóre aminokwasy wchodzą w skład lipidów, np. seryna występuje w fosfolipidach, a glicyna w solach żółciowych. Glutaminian, asparaginian oraz glicyna odgrywają rolę
neuroprzekaźników. Wszystkie aminokwasy, za wyjątkiem lizyny i leucyny, mogą być metabolitami pośrednimi szlaku glukoneogenezy (aminokwasy glukogenne), tzn. mogą posłużyć
do biosyntezy glukozy. Niektóre aminokwasy są wykorzystywane do syntezy zasad purynowych i pirymidynowych (asparaginian, glutaminian), hemu (glicyna), amin biogennych
(np. seryna, glutaminian) (Ryc. 3). Aminokwasy są też donorami grup aminowych przenoszonych na ketokwasy lub funkcjonują w cyklu mocznikowym (ornityna, cytrulina) (Ryc. 4).
Ryc. 3. Aminy biogenne wywodzące się z aminokwasów (Koolman i Röhm 2005)
Ryc. 4. Aminokwasy rzadkie (Koolman i Röhm 2005)
Właściwości amfoteryczne aminokwasów
Obecność w aminokwasach grupy karboksylowej i grupy aminowej powoduje, że są
one związkami amfoterycznymi. W roztworach wodnych występują głównie w formie jo-
3
nów. W zależności od pH środowiska jony te mogą mieć charakter kwasowy bądź zasadowy,
zgodnie z poniższymi równaniami reakcji:
Zmiany stanu jonizacji aminokwasów w zależności od pH
W środowisku kwasowym aminokwas przyłącza proton, staje się kationem i zachowuje jak
kwas, gdyż występujące w cząsteczce grupa karboksylowa –COOH i grupa amoniowa –NH3+
mogą być donorami protonów. W środowisku zasadowym aminokwas oddając proton staje
się anionem i zachowuje się jak zasada, ponieważ zdysocjowana grupa karboksylowa COOi grupa aminowa NH2 mogą przyłączać protony. Jest taka wartość pH roztworu, przy której
cząsteczki aminokwasów występują w formie jonu obojnaczego, w którym liczba ładunków
ujemnych jest równa liczbie ładunków dodatnich, czyli sumarycznie ładunek równy jest zeru.
Taka wartość pH nosi nazwę punktu izoelektrycznego (pI).
Charakter amfoteryczny aminokwasów ujmuje graficznie krzywa miareczkowania
roztworów aminokwasów mocnymi kwasami lub zasadami (Ryc. 5). Krzywa przedstawia
zależność wartości pH miareczkowanego roztworu od liczby dodanych moli kwasu lub zasady. Zależność między wartością pH a stanem dysocjacji opisano równaniem HendersonaHasselbalcha, gdzie Ka = stała kwasowa, a pKa = ujemny logarytm stałej kwasowej:
Z powyższego równania wynika, iż w warunkach, gdy formy zdysocjowana i niezdysocjowana są w stężeniach równowagowych, to pKa = pH. Miareczkowanie roztworu aminokwasu
połączone z jednoczesnym pomiarem pH roztworu pozwala na doświadczalne wyznaczenie
krzywej dysocjacji aminokwasu, określenie jego wartości pI oraz wyznaczenie wartości pKa
jego grup funkcyjnych.
4
Ryc. 5. Krzywa miareczkowania histydyny (Karlson 1987)
Rozdział aminokwasów
Jedną z metod rozdziału aminokwasów pozwalającą izolować z mieszaniny pojedyncze aminokwasy jest chromatografia podziałowa. Opiera się ona na prawie podziału solutu
(substancji rozpuszczonej) między dwie fazy ciekłe – ruchomą i stacjonarną. Faza stacjonarna utrzymywana jest przez porowaty nośnik słabo adsorbujący składniki solutu. Porowatym nośnikiem może być bibuła albo żel ułożony w kolumnie chromatograficznej lub wylany
na płytkę. Warunkiem decydującym o rozdziale substancji są różnice w ich rozpuszczalności
w fazie ruchomej i nieruchomej, tj. różnice we współczynnikach podziału między dwie nie
mieszające się ze sobą fazy ciekłe. Chromatografia podziałowa opiera się więc na prawie
Nernsta, które mówi, iż w układzie utworzonym przez dwie nie mieszające się ze sobą fazy
ciekłe i wspólny dla nich solut, stosunek stężenia tego solutu w fazie 1 (c1) do jego stężenia w
fazie 2 (c2) jest w stanie równowagi wielkością stałą zależną od temperatury i właściwości
substancji tworzących roztwory, a niezależną od ilości substancji rozpuszczonej: c1/c2 = k.
Miarą selektywności rozdziału dwóch substancji A i B w danym układzie jest stopień rozdziału, którego wartość określa wzór: β = KA/KB gdzie KA określa stosunek podziału substancji A,
KB – stosunek podziału substancji B między fazę ruchomą i nieruchomą.
Technika chromatografii bibułowej. W chromatografii bibułowej nośnikiem fazy stacjonarnej, najczęściej polarnej, jest odpowiednio spreparowana bibuła filtracyjna. Bibuła jest zbudowana z włókien celulozowych ułożonych w porowatą, żelową strukturę stanowiącą fazę
5
nieruchomą. Cząsteczki wody zaadsorbowane na bibule łączą się z włóknami celulozy wiązaniami wodorowymi. Fazę ruchomą w chromatografii bibułowej stanowią odpowiednie rozpuszczalniki organiczne pojedyncze lub zmieszane. Rozpuszczalniki muszą się częściowo
mieszać z wodą, np. szeroko rozpowszechnionym układem jest mieszanina n-butanolu/kwasu
octowego/wody, w zmiennych proporcjach.
Szybkość wędrowania danego związku w określonych warunkach jest wartością stałą.
Jej miarą jest wartość Rf: Rf = x/y, gdzie x oznacza odległość od linii startowej do środka
plamy aminokwasu, a y – odległość od linii startowej do czoła rozpuszczalnika. W Tabeli 1
podane są wartości Rf dla większości aminokwasów rozdzielanych w warunkach zbliżonych
do tych, w jakich będzie wykonywane ćwiczenie.
Tabela 1. Wartości Rf aminokwasów (faza ruchoma: n-butanol/kwas octowy/woda, 4:1:1)
Lp.
Nazwa aminokwasu
Symbol aminokwasu
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
alanina
arginina
kwas asparaginowy
asparagina
cystyna
cysteina
kwas cysteinowy
fenyloalanina
glicyna
kwas glutaminowy
glutamina
histydyna
leucyna
izoleucyna
lizyna
metionina
sulfonian metioniny
prolina
hydroksyprolina
seryna
treonina
tryptofan
tyrozyna
walina
ornityna
cytrulina
Ala
Arg
Asp
Asn
A
R
D
N
Cys
CysSO3H
Phe
Gly
Glu
Gln
His
Leu
Ile
Lys
Met
MetSO3H
Pro
ProOH
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
Orn
Cytr
C
F
G
E
Q
H
L
I
K
M
P
S
T
W
Y
V
6
Wartości Rf x 100 w układzie
rozpuszczalników:
n-butanol/CH3COOH/H2O
30
15
22
12
5
8
7
60
23
28
17
11
70
67
12
50
22
34
22
22
26
50
45
51
12
18
BIAŁKA
Budowa, podział i funkcje białek
Łączenie się aminokwasów wiązaniami amidowymi prowadzi do utworzenia liniowej
makrocząsteczki – polipeptydu. Łańcuchy polipeptydowe zawierające ponad 100 reszt aminokwasowych przyjęto określać jako białka. Wiązanie amidowe, nazywane również wiązaniem peptydowym, powstaje z grupy α-karboksylowej i grupy α-aminowej. Na Ryc. 6A
przedstawiono dipeptyd (seryloalaninę) utworzony z seryny i alaniny. Wiązanie peptydowe
jest stabilizowane mezomerycznie, gdyż wiązanie C–N ma częściowo charakter wiązania
podwójnego C=N (Ryc.6B). To usztywnienie wiązania peptydowego powoduje, że we
wszystkich ułożeniach przestrzennych białek grupy amidowe pozostają płaskie. Swobodna
rotacja jest możliwa tylko wokół wiązania N−Cα i Cα–C, a obroty są opisywane przez wartości kątów torsyjnych ϕ (fi) i ψ (psi) (Ryc. 6A).
Ryc. 6. Właściwości wiązania amidowego (peptydowego) (Koolman i Röhm 2005)
Konformacja łańcucha peptydowego utworzona przez kilka kolejnych reszt aminokwasowych i stabilizowana wiązaniami wodorowymi pomiędzy atomami tlenu i azotu z
ugrupowań peptydowych definiuje strukturę drugorzędową (Ryc. 7).
7
Ryc. 7. Struktury drugorzędowe białek (α-helisa, helisa kolagenu, pofałdowanej kartki,
β-pętla) (Koolman i Röhm 2005)
8
Białka, ze względu na skład, dzieli się na białka proste i złożone. Białka proste zbudowane są tylko z aminokwasów, natomiast białka złożone zawierają szereg różnych komponentów nieaminokwasowych, których rodzaj jest podstawą podziału białek na:
− glikoproteiny – białka zawierające cukry obojętne (galaktoza, mannoza, fukoza), aminocukry (N-acetyloglukozamina, N-acetylogalaktozamina) lub kwasy pochodne monosacharydów (kwas uronowy, kwas sjalowy)
− lipoproteiny – zawierają fosfolipidy, cholesterol i inne związki lipidowe
− metaloproteiny – zawierają jony metali związane jonowo lub koordynacyjnie
− fosfoproteiny – reszty tyrozyny, treoniny lub seryny są zestryfikowane kwasem fosforowym
− nukleoproteiny – zawierają RNA lub DNA
− chromoproteiny – zawierają grupę prostetyczną, którą stanowią różne związki barwne
Na Ryc. 8 pokazano potencjalne miejsca modyfikacji łańcucha polipeptydowego. Modyfikacjom ulegają zwykle polarne reszty aminokwasów, stanowiąc ważne źródło różnorodności
białek.
Ryc. 8. Potranslacyjne modyfikacje łańcucha polipeptydowego (Koolman i Röhm 2005)
9
Białka ze względu na pełnione funkcje można podzielić na:
− enzymatyczne – najliczniejsza grupa białek (ponad 2000) o zróżnicowanej masie cząsteczkowej
− strukturalne – są odpowiedzialne za mechaniczną stabilność narządów i tkanek (kolagen,
elastyna, tubulina, aktyna, α-keratyna); do białek strukturalnych zalicza się także histony
pełniące kluczową rolę w upakowaniu DNA w chromatynie
− transportujące – np. hemoglobina uczestniczy w transporcie tlenu i CO2, niektóre białka
osocza (prealbumina) transportujące hormony, transferyna przenosząca żelazo, niektóre
białka błonowe np. kanały jonowe pośredniczące w transporcie jonów, nośniki w transporcie metabolitów i jonów, pompy funkcjonujące w transporcie aktywnym jonów i metabolitów
− regulacyjne – np. niektóre hormony (somatotropina, insulina), a także receptory uczestniczące w percepcji różnych cząsteczek sygnałowych; białkami regulatorowymi są także
czynniki transkrypcyjne, regulujące ekspresję genów
− odpornościowe – białka układu immunologicznego (np. immunoglobuliny) chronią organizm przed czynnikami chorobotwórczymi i ksenobiotykami (substancjami obcymi dla
organizmu)
− motoryczne – uczestniczą w procesach związanych z ruchem (aktyna, miozyna); kinezyna
funkcjonuje w przemieszczaniu organelli w komórce
− zapasowe – np. owoalbumina w białku jaja stanowi źródło aminokwasów dla rozwijającego się zarodka, ferrytyna wiąże żelazo w wątrobie, kazeina jest białkiem zapasowym mleka, niektóre białka budujące mięśnie mogą być wykorzystywane jako materiał energetyczny; także wiele białek roślinnych pełni funkcję zapasową
Ze względu na rozpuszczalność i kształt, białka dzielą się na globularne (kuliste) i fibrylarne (włókienkowate, skleroproteiny). Do białek fibrylarnych należą: α-keratyny włosów, wełny, piór, paznokci, kolageny zawarte głównie w tkance łącznej, elastyny, fibroina
jedwabiu. Białka globularne obejmują: białka obojętne (albuminy, globuliny), białka kwaśne
(prolaminy, gluteiny) oraz białka zasadowe (histony, protaminy).
Na Ryc. 9 przedstawiono schematycznie, w około 1,5-milionowym powiększeniu, struktury kilku wewnątrz- i pozakomórkowych białek.
10
Ryc. 9. Strukturalne i funkcjonalne zróżnicowanie białek (schematyczne struktury w około
1,5 mln powiększeniu; długość kolagenu w tym powiększeniu wynosi około 30 cm) (Koolman i Röhm 2005)
11
WYKONANIE
Chromatografia bibułowa aminokwasów (wstępująca)
Na arkusz bibuły o wymiarach 15 x 20 cm z zaznaczoną linią startową, nanieść w 2
cm odstępach po kilka µl roztworu wzorcowych aminokwasów (glicyna, alanina, tyrozyna,
leucyna) oraz taką samą objętość roztworu zawierającego mieszaninę aminokwasów (próba
badana). Każdy aminokwas wzorcowy oraz próbę badaną nanieść na bibułę dwukrotnie w
celu wyeliminowania ewentualnych artefaktów. W czasie nanoszenia próbek miejsce nanoszenia należy suszyć suszarką do włosów, tak by wielkość plamek była możliwie jak najmniejsza. Arkusz bibuły z naniesionymi próbkami zwinąć w cylinder, spiąć zszywkami i
umieścić do rozwinięcia w komorze chromatograficznej. Rozdział przerwać, gdy rozpuszczalnik dotrze na wysokość około 1,5 cm od górnego brzegu bibuły. Po wyjęciu bibuły z komory, zaznaczyć ołówkiem czoło rozpuszczalnika, bibułę wysuszyć w strumieniu ciepłego
powietrza (ok. 500C), spryskać roztworem ninhydryny, a następnie wysuszyć w suszarce w
temperaturze 800C w celu zlokalizowania miejsca położenia rozdzielonych aminokwasów.
Pomierzyć odległości od linii startu do środka wybarwionych plamek oraz odległość do czoła
rozpuszczalnika, a następnie obliczyć wartości współczynnika Rf. Porównując wartości Rf
aminokwasów wzorcowych i aminokwasów zawartych w próbce zidentyfikować aminokwasy występujące w otrzymanej do analizy mieszaninie. Należy również porównać wyliczone
wartości Rf z wartościami zamieszczonymi w Tabeli 1.
Reakcje charakterystyczne aminokwasów
A. Reakcje ogólne:
Reakcja z ninhydryną
Do 0,1 ml 1% roztworu aminokwasu dodać 1 kroplę 0,1% roztworu ninhydryny i
ogrzać do wrzenia. Pojawia się fioletowo-niebieskie zabarwienie. Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu do iminokwasów (reakcja poniżej). Kolejne etapy przemian to deaminacja i dekarboksylacja oraz wytworzenie aldehydu skróconego o 1 atom węgla. W wyniku kondensacji utlenionej i zredukowanej w powyższym procesie cząsteczki ninhydryny oraz amoniaku powstaje kompleks o fioletowo-niebieskiej barwie (maksimum absorpcji przy λ = 570 nm), którego natężenie jest proporcjonalne do zawartości azotu aminowego aminokwasu. Reakcja z ninhydryną może służyć do ilościowego oznaczania aminokwasów metodą spektrofotometryczną. Dodatni odczyn ninhydrynowy dają obok aminokwasów,
peptydów i białek także sole amonowe, aminocukry i amoniak.
12
Reakcja aminokwasów z ninhydryną
B. Reakcje charakterystyczne dla wybranych aminokwasów
Reakcja ksantoproteinowa
Do 0,5 ml 1% roztworu aminokwasu dodać 0,25 ml stężonego HNO3 i kroplę stężonego H2SO4. Roztwór barwi się na żółto. Po zalkalizowaniu 30% roztworem NaOH, zabarwienie przechodzi w pomarańczowe. Reakcja ta jest charakterystyczna dla aminokwasów aromatycznych i fenoli. W wyniku działania stężonego HNO3 pierścień benzenowy ulega nitrowaniu, a powstałe żółte pochodne wielonitrowe dają w roztworze zasadowym pomarańczowe aniony nitrofenolanowe.
Reakcja cystynowa
Do 0,5 ml 1% roztworu aminokwasu dodać 0,5 ml 10% roztworu NaOH i kilka kropel
nasyconego roztworu octanu ołowiu. Podczas ogrzewania ze stężonym NaOH, z cystyny i
cysteiny wydziela się siarkowodór, który w reakcji z Pb2+ daje siarczek ołowiu. Po dłuższym
gotowaniu roztwór staje się brunatny, a następnie wytrąca się osad PbS.
Pb(OOC-CH3)2
NaOH
NaOH
Pb(OH)2
13
Pb(OH)3-
H2S
PbS ↓
Kolorymetryczne oznaczanie białek metodą biuretową
Zasada metody:
Metoda polega na oznaczaniu natężenia barwy powstałej w wyniku wytworzenia
związków kompleksowych białek z jonami miedzi (II) w środowisku zasadowym, z maksimum absorbancji przy λ = 540 nm. Intensywność barwy w reakcji biuretowej jest proporcjonalna do liczby wiązań peptydowych. Zależność ta jest wykorzystywana do ilościowego
oznaczania białek. Czułość metody – 0,1 mg/ml.
Nazwa reakcji pochodzi od biuretu, związku powstającego w wyniku kondensacji dwóch cząsteczek mocznika, zawierającego w swej cząsteczce wiązania amidowe:
Metoda biuretowa nie nadaje się do oznaczania białek w obecności soli amonowych, gdyż jon
amonu daje również barwne kompleksy z jonami miedzi (II). W reakcji przeszkadza także
14
siarczan (VI) magnezu, ponieważ wytrącający się w środowisku nierozpuszczalny wodorotlenek magnezu maskuje właściwy odczyn.
Odczynniki:
1. Standardowy roztwór albuminy – 10 mg/ml w 0,9% NaCl
2. Odczynnik biuretowy – 1,5 g 5hydratu CuSO4 i 6,0 g winianu sodu i potasu rozpuścić w
500 ml wody dest. w kolbie miarowej na 1000 ml. Następnie małymi porcjami stale mieszając dodać 300 ml 10% NaOH i uzupełnić objętość wodą dest. do 1 l. Dodać 2g KJ. Odczynnik jest stabilny.
Wykonanie krzywej standardowej i oznaczenie stężenia białek w surowicy krwi
Do suchych probówek odmierzyć kolejno pipetą podane w tabeli objętości standardowego roztworu albuminy, wody i odczynnika biuretowego. Każdą próbę wykonać w dwóch
powtórzeniach.
Nr próby
1
2
3
4
5
6
Stężenie albuminy (mg/próbę) 1
2
3
4
5
0
Roztwór standardowy (ml)
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0
Woda destylowana (ml)
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0,5
Odczynnik biuretowy (ml)
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
A1
A540nm
A2
Aśr
K=
mg albuminy w próbie
A540 nm
Równocześnie należy oznaczyć zawartość białka w 10-krotnie rozcieńczonej surowicy krwi.
Do oznaczeń pobrać 0,5 ml surowicy (w dwóch powtórzeniach) i dodać 2 ml odczynnika biuretowego. Po upływie 30 minut zmierzyć absorbancję wszystkich prób przy długości fali λ =
540 nm w 1 cm kuwetach. Pomiaru dokonać względem próby zerowej nie zawierającej białka
15
(próba 6). Zapisać wyniki w tabeli i obliczyć współczynnik kierunkowy K. Narysować krzywą wzorcową (zależność wartości absorbancji od stężenia białka w próbie). Przy obliczaniu
ilości białka w próbie stosować obliczony współczynnik K. Z oznaczonej w próbie zawartości
białka obliczyć stężenie białka w surowicy.
Zagadnienia do przygotowania:
− wzory, symbole trzy- i jednoliterowe aminokwasów proteinogennych oraz aminokwasów
cyklu mocznikowego (ornityna, cytrulina)
− klasyfikacja aminokwasów oparta na budowie chemicznej łańcucha bocznego oraz jego
polarności
− podstawowe funkcje aminokwasów (przykłady)
− ogólne zasady chromatografii podziałowej; technika chromatografii bibułowej wstępującej
− reakcje ogólne na aminokwasy (znajomość reakcji z ninhydryną)
− wybrane reakcje charakterystyczne dla aminokwasów
− budowa i właściwości wiązania amidowego (peptydowego)
− struktury drugorzędowe białek (wiązania stabilizujące strukturę)
− wiązania stabilizujące III- i IV- rzędową strukturę białek
− podział białek ze względu na funkcję (przykłady)
− kolorymetria (zasada ilościowego oznaczania białek metodą biuretową)
Literatura:
Biochemia – JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005
Zarys biochemii – P Karlson PWN, Warszawa, 1987
Ćwiczenia z biochemii – pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz PWN, Warszawa, 2005
Biochemia. Ilustrowany przewodnik – J Koolman, K-H Röhm, PZWL, Warszawa 2005
16