bakteriobójcze dzia£anie immobilizowanych preparatów srebra i mo

bakteriobójcze dzia£anie immobilizowanych preparatów srebra i mo

Nr 2/2008
ANALIZA STATUSU PRZECIWUTLENIAJ¥CEGO USTROJU ...
BAKTERIOBÓJCZE DZIA£ANIE IMMOBILIZOWANYCH
PREPARATÓW SREBRA I MO¯LIWOŒÆ ICH
PRAKTYCZNEGO ZASTOSOWANIA
BACTERICIDAL ACTIVITY OF IMMOMIBILISED SPECIMENS OF SILVER
AND ITS PRACTICAL APPLICATION
Gabriela Bugla-P³oskoñskaa, Marek Jasiorskib, Anna Leszkiewicza, Beata Borakb, Agnieszka
Baszczukb, Stefan Brzeziñskic, Gra¿yna Malinowskac ,W³odzimierz Doroszkiewicza
a Zak³ad Mikrobiologii, Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wroc³awski, Wroc³aw
b Wydzia³ Mechaniczny, Instytut Materia³oznawstwa i Mechaniki Technicznej, Politechnika Wroc³awska, Wroc³aw
c Instytut In¿ynierii Materia³ów W³ókienniczych, £ódŸ
Kierownik placówki naukowej, z której pochodzi praca:
prof. dr hab. W³odzimierz Doroszkiewicz
Streszczenie
Abstract
W niniejszym artykule zaprezentowano wyniki wrażliwości szczepu Klebsiella pneumoniae ATCC 4352 na
srebro w formie nanocząstek umieszczone na powierzchni submikronowych kul krzemionkowych. Stwierdzono, że minimalne biologicznie aktywne stężenie kompleksu SiO2/Ag w korelacji z materiałem wynosi od 2 do
2,5% SiO2/Ag w 100g polimeru. Submikronowe kule
SiO2 syntezowano techniką zol-żelową. Regularny proszek krzemionkowy stanowił matrycę dla aktywnych
nanowysepek metalicznego srebra. Taki biologicznie
aktywny materiał wprowadzano do past na bazie powłokotwórczych polimerów, którymi powlekano materiały
włókiennicze nadając im oczekiwane właściwości bakteriostatyczne. Badania mikrobiologiczne wykonywano
za pomocą testu dyfuzyjnego wg norm ISO.
Statement written in this article was based on agar
diffusion plate test ISO method. Our experiment show
biological activity of textiles with silver silica spheres
against Klebsiella pneumoniae ATCC 4352. During the
experiment minimal inhibit concentration was
determined. Now we are knowing that minimal bioactive
concentration of silver add to textiles is about 2 - 2,5%.
Silica submicron spheres was obtained by sol-gel
method. The regular spheres made up matrix to
biological active of metallic silver. Such a powder of
silica spheres with silver nanoparticles islands added to
the textile inhibits a growth of reference bacteria. Silver
silica submicron spheres added to thermopolymer
should be added to textile carriers.
Słowa kluczowe: tkaniny impregnowane nanokompozytem srebra, Klebsiella pneumoniae.
Key words
words: textiles impregnated silver silica
spheres, Klebsiella pneumoniae
WSTÊP:
Liczne badania potwierdzają biologiczną aktywność srebra wobec bakterii Gram-dodatnich oraz
Gram-ujemnych, w tym bakterii tlenowych i beztlenowych, a także grzybów, pierwotniaków i wirusów
(1, 2, 3). W obliczu lawinowo narastającej oporności
na antybiotyki poszukiwane są nieustannie alternatywne drogi zwalczania patogenów. Od dawna znana
była biologiczna aktywność metali, wykorzystywana
już w czasach starożytnych. Nowe, interesujące rozwiązania podsunęła szybko rozwijająca się wiedza techniczna związana z preparatyką obiektów w skali nanowymiarowej – nanotechnologia. Niestety, nanocopyright © 2008 P.G.K. Media Polska,
ISSN 1425-5073
cząstki metaliczne wykazują naturalną tendencję do
agregacji obniżając tym samym poziom aktywności
biologicznej oraz wpływają na niejednorodność występowania aktywnych centrów na poziomie skali
mikroskopowej. Efekt tworzenia klasterów może być
zniwelowany poprzez wprowadzenie odpowiednich
dyspergatorów – w tym przypadku kulistych, submikronowych proszków krzemionkowych (B = 500 nm)
wytwarzanych techniką zol-żel. Na tak wytworzonych
matrycach osadzono powierzchniowo aktywne centra
metalicznego srebra w postaci nanowysepek (4). Interdyscyplinarny i aplikacyjny charakter badań osiągnięto poprzez domieszkowanie aktywnych proszków
Farmaceutyczny
Przegl¹d Naukowy
!
BAKTERIOBÓJCZE DZIA£ANIE IMMOBILIZOWANYCH PREPARATÓW SREBRA
do past na bazie powłokotwórczych polimerów, które
nanoszono techniką bezpośredniego lub odwracalnego powlekania cienkowarstwowego (wielokrotnego) na
odpowiednio dobrane nośniki włókiennicze. Jako
materiały porównawcze zastosowano komercyjnie
dostępne formy drobnocząstkowego srebra w postaci
„srebra koloidalnego” i „nanosrebra”. W niniejszym
artykule przedstawiono wyniki biologicznej aktywności
różnych rodzajów tkanin z naniesionymi powłokami
polimerowymi, zawierającymi różne wielkości dodatku równomiernie jednocząstkowo rozproszonego kompozytu SiO2/Ag wobec szczepu K. pneumoniae ATCC
4352, ze względu na kluczową rolę K. pneumoniae
w zakażeniach szpitalnych. K. pneumoniae jest szczepem oportunistycznym odpowiedzialnym za częste infekcje dróg moczowych u osób cewnikowanych, zapalenie płuc, sepsę oraz zakażenia tkanek miękkich. Pałeczki K. pneumoniae długo przeżywają w środowisku
szpitalnym, bywają zwykle wielolekooporne i łatwo
podlegają antybiotykowej selekcji (5, 6).
MATERIA£Y I METODY:
Szczep bakteryjny: Klebsiella pneumoniae ATCC
4352 (American Type Culture Collection). Tkaniny:
Testowane tkaniny przygotowywano w Instytucie Inżynierii Materiałów Włókienniczych w Łodzi. Testowano: (a) tkaninę, z naniesioną powłoką polimerową
zawierającą odpowiednie ilości SiO2/Ag oraz (b) tkaninę z naniesioną powłoką polimerową, jednak bez
dodatku SiO2/Ag (oznaczona jako „odpowiednik”),
oraz tkaniny zawierające: srebro koloidalne lub „nanosrebro”.
Badania mikrobiologiczne: Badanie mikrobiologiczne przeprowadzano zgodnie z procedurą ISO/DIS
20645:2002 (7).
Synteza kul krzemionkowych: Submikronowe kule
syntezowano techniką zol-żelową poprzez zasadową
hydrolizę krzemoorganicznego prekursora (TEOS –
tetraetoksykrzem). Syntezę prowadzono w środowisku ciekłym w temperaturze pokojowej. Regularny
proszek stanowił matryce dla aktywnych centrów
metalicznego srebra znajdującego się na powierzchni
ziaren SiO2 w postaci nanowysepek (8, 9). Taki biologicznie aktywny materiał wprowadzono do past polimerowych, którymi powlekano materiały włókiennicze nadając im oczekiwane zespoły właściwości użytkowych, w tym bakteriostatyczność. Po obróbce termicznej (160-1700C) otrzymano tkaniny z naniesioną zwartą lub mikroporowatą powłoką polimerową,
"
Farmaceutyczny
Przegl¹d Naukowy
Nr 2/2008
w której znajdowały się aktywne cząstki SiO2/Ag. Zasadnicze znaczenie dla uzyskiwanego efektu bakteriostatyczności ma zapewnienie równomiernego monocząstkowego rozproszenia wprowadzanych cząstek
SiO2/Ag w tworzywie matrycy - powłoki polimerowej.
WYNIKI.
Wśród testowanych tkanin można wyróżnić 3 grupy materiałów: tkaniny z naniesionymi powłokami
zawierającymi nanokompozyt SiO2/Ag (w stężeniu od
1% do 2,5% , tabela I), tkaniny z naniesionymi powłokami zawierającymi srebro koloidalne (w ilości
0,3% Ag, tabela II) oraz tkaniny z naniesionymi powłokami napełnianymi „nanosrebrem” (w ilości 0,3%
Ag, tabela III). Biologicznej analizie poddano także
tekstylia stanowiące kontrolę wobec powłoki polimerowej naniesionej na nośnik włókienniczy (tabela I).
Badania wykazały brak właściwości bakteriostatycznych powłoki polimerowej nie zawierającej dodatku
submikrocząstek funkcjonalnych SiO2/Ag. W celu
ustalenia odpowiedniej ilości dodatku kompozytu
SiO2/Ag zapewniających oczekiwane właściwości antybakteryjne/bakteriostatyczne materiałom powłokowym, wykonano ich próby z różnym napełnieniem
SiO2/Ag. Testowano wielkości dodatku od 1% do 2,5%
SiO2/Ag w stosunku do suchej masy polimeru błonotwórczego. Zaprezentowane w tabeli I wyniki pozwalają przyjąć założenie, że graniczne stężenie bakteriobójcze submikrokul krzemionkowych z naniesionymi na powierzchnię nanowysepkami srebra, utrzymuje się w granicach od 2% do 2,5%. Różnicę w aktywności tkanin wobec szczepu K. pneumoniae ATCC
4352 można m.in. uzasadnić różnicami w technice
nanoszenia i wytwarzania powłok polimerowych na
nośnikach włókienniczych (legenda do tabel I, II, III).
Poza srebrem immobilizowanym na krzemionce testom poddano także materiały zawierające komercyjnie dostępne formy srebra w postaci „srebra koloidalnego” (tabela II) i „nanosrebra” (tabela III). W porównaniu do srebra zlokalizowanego na powierzchni
SiO2 zarówno „srebro koloidalne”, jak i „nanosrebro”
nie wykazywały tak dobrych właściwości antybakteryjnych. W ocenie działania antybakteryjnego tkanin
brano pod uwagę bioaktywność wyrobów przed, jak
i po wielokrotnym praniu (10-krotne), co jest wymogiem aplikacyjnym. Zaobserwowano, że efekt hamowania wzrostu wobec komórek bakterii K. pneumoniae ATCC 4352 wzmaga się po wielokrotnym praniu (tabela II i III).
copyright © 2008 P.G.K. Media Polska,
ISSN 1425-5073
Nr 2/2008
aktywna
brak
aktywna
brak
aktywna
brak
aktywna
słaby
aktywna
silny
aktywna
silny
aktywna
silny
aktywna
silny
APTEC
TE
0.2/0.1
2,5% (10x)
0.2/1x i 2x
2,5% (10x)
0.2/0.1
2% (10x)
0.2/1x i 2x
2% (10x)
0.2/0.1
1,5% (10x)
0.2/1x i 2x
1,5% (10x)
Odpowiednik
0.2/0.1 (10x)
Odpowiednik
0.2/1x i 2x (10x)
z AP
Wzrost bakterii
I
Strona tk
aniny
tkaniny
ZK
Oznaczenie tk
aniny
tkaniny
KI do
Tabela I. Aktywność biologiczna tkanin z naniesioną powłoką
polimerową napełnianą nanokompozytem SiO2/Ag wobec K. pneumoniae ATCC 4352.
Tabela II. Aktywność biologiczna tkanin z naniesioną powłoką
polimerową napełnianą srebrem koloidalnym (bez nośnika krzemionkowego) wobec K. pneumoniae ATCC 4352.
Oznaczenie tk
aniny
tkaniny
Strona tk
aniny
tkaniny
Wzrost bakterii
0.2/0.1
Ag koloidalne 0,3%
aktywna
słaby
0.2/0.1
Ag koloidalne 0,3%, (10x)
aktywna
brak
Tabela III. Aktywność biologiczna tkanin z naniesioną powłoką
polimerową napełnianą „nanosrebrem”(bez nośnika krzemionkowego) wobec K. pneumoniae ATCC 4352.
Oznaczenie tk
aniny
Strona tk
aniny Wzrost bakterii
tkaniny
tkaniny
0.2/0.1
Ag nano 0,3%
0.2/0.1
Ag nano 0,3%, (10x)
0.2/1x i 2x
Ag nano 0,3%
0.2/1x i 2x
Ag nano 0,3%, (10x)
aktywna
silny
aktywna
słaby
aktywna
silny
aktywna
brak
Legenda do tabel I., II i III wg ISO
ISO::
• Ocena wzrostu bakterii: silny (tzw. „murawa bakteryjna”; niezadowalający efekt antybakteryjny tkanin), słaby (tylko pojedyncze kolonie bakteryjne; ograniczony efekt antybakteryjny
tkanin), brak (widoczna strefa inhibicji; dobry efekt antybakteryjny tkanin).
• Symbol „10x” oznacza tkaniny po 10 krotnym znormalizowanym praniu użytkowym w temperaturze 40oC.
• Powłoki polimerowe modyfikowane były przez dodatek napełniacza - submikrokule SiO2 na których osadzono w formie
„nanowysepek” srebro metaliczne Ag, nadając w ten sposób
wytwarzanym powłokom właściwości bioaktywne. Powłoki polimerowe na tkaninach uzyskiwano techniką wielowarstwowego powlekania bezpośredniego lub odwracalnego nożem podpartym (0.2/0.1) i/lub powietrznym (0.2/1x i 2x).
copyright © 2008 P.G.K. Media Polska,
ISSN 1425-5073
Farmaceutyczny
Przegl¹d Naukowy
#
BAKTERIOBÓJCZE DZIA£ANIE IMMOBILIZOWANYCH PREPARATÓW SREBRA
WNIOSKI I DYSKUSJA:
Połączenie nanomateriałów z tekstyliami jest interesującym, interdyscyplinarnym aspektem komercjalizacji badań o charakterze aplikacyjnym. Opracowana technologia umożliwia wytwarzanie cienkich, zwartych lub mikroporowatych powłok polimerowych (2040 μm) na nośnikach tekstylnych, nadając wyrobom
zespół oczekiwanych właściwości użytkowych, jak np.
wodoszczelność czy przepuszczalność pary wodnej.
Powłoki takie mogą być napełniane submikrocząstkami SiO2/Ag, nadającymi im dodatkowe, specyficzne
właściwości np. bakteriostatyczne. Opracowana technologia wytwarzania polimerowych materiałów powłokowych napełnianych SiO2/Ag stwarza korzystne perspektywy dla zastosowań przemysłowych celem uzyskiwania wyrobów, których główną lub dodatkową
cechą jest bioaktywność. Materiał taki nadaje tekstyliom długotrwałe właściwości biostatyczne, nie powodując zaburzenia jego podstawowych cech użytkowych. Podstawowym warunkiem uzyskiwania oczekiwanych wyników wprowadzania cząstek SiO2/Ag do
matryc polimerowych jest zapewnienie ich monocząstkowego równomiernego rozproszenia w tworzywie
błony czy powłoki polimerowej (10). Wytworzone
w ten sposób materiały powłokowe mogą znaleźć zastosowanie zarówno jako opatrunki, pościel w szpitalach, jak i odzież dla personelu medycznego, zmniejszając w ten sposób częstość zakażeń szpitalnych. Eksperymenty wykazały, że srebro uwalnia się z krzemionkowego nośnika i dyfunduje do podłoża, a szczep wykorzystany w badaniach wykazuje wrażliwość na immobilizowane preparaty srebra znajdujące się w tkaninach. Wzmocnienie aktywności biologicznej tkanin
po 10 krotnym praniu może być powodowane jonizacją cząstek srebra w kąpieli piorącej, a jak wiadomo
tylko srebro w postaci zjonizowanej wykazuje aktywność antybakteryjną. Brak efektu barierowego dla zastosowanych komercyjnych form drobnocząsteczkowego srebra (mimo użycia porównywalnej ilości srebra – 0,3%, co odpowiada zawartości srebra w 2,5%
dodatku submikrokul SiO2/Ag) może świadczyć o różnej aktywności powierzchni srebra ulegającej pasywacji
z wytworzeniem warstwy nieaktywnej biologicznie
blokującej dyfuzję jonów do wnętrza komórki bakterii. Zaprezentowane wyniki potwierdzają także ogromne znaczenie krzemionkowego nośnika zapobiegającego agregacji nanocząstek metalu i utrzymującego
srebro w postaci monocząstkowej dyspersji. Tkaniny
z naniesionymi powłokami polimerowymi napełnianymi biologicznie aktywnymi cząstkami SiO2/Ag
mogą znaleźć zastosowanie w medycynie, farmacji i innych dziedzinach życia, a submikronowy proszek na-
$
Farmaceutyczny
Przegl¹d Naukowy
Nr 2/2008
daje się do bezpośredniego zastosowania jako lek, czy
środek odkażający pomieszczenia szpitalne i rany.
LITERATURA:
1. Samuel U., Guggenbichler J.P.: Prevention of catheter-related infection: the potential of a new
nano-silver impregnated catheter. Int. J. Ant.
Agents (2004) 23S1, 75-78
2. Hamilton-Miller J.M.T., Shah S.: A microbiological
assessment of silver fusidate, a novel topical antimicrobial agent. Int. J. Ant. Agents (1996) 7, 9799
3. Schierholz J.M., Lucas L.J., Rump A., Pulverer G.:
Efficacy of silver-coated medical devices. J. Hosp.
Infect. (1998) 40, 257-262
4. Pike-Biegunski M.J.: Nanotechnologia w medycynie i farmacji. (2005) 15, 207
5. Szewczyk E.M.: Diagnostyka bakteriologiczna,
PWN, (2005), 123-124
6. Souza Lopesa A.C., Rodriguesb J.F., Morais
Ju´niorb M.A.: Molecular typing of Klebsiella pneumoniae isolates from public hospitals in Recife,
Brazil. Microbiol. Res. (2005)160, 37-46 7. European Committee for Standardization: Textile fabrics - Determination of anti - bacterial activity Agar diffusion plate test, Draft International Standard ISO/DIS 20645 (2002)
8. Jasiorski M. i wsp.: Properties and application of
silica submicron powders with surface Ag nanoclusters. Materials Science-Poland (2004), 22, 2
9. Jasiorski M.: Synteza i spektroskopowe właściwości szkieł kwarcowych aktywowanych molekułami
organicznymi i nieorganicznymi, otrzymywanych
metodą zol-żel. Rozprawa doktorska dostępna w bibliotece INTiBS PAN Wrocław (2003)
10. Niepublikowane prace badawcze IIMW z lat 20032005, realizowane w ramach PBZ KBN-095/T08/
2003 oraz IMiMT PWr z lat 2003-2005, realizowane w ramach PBZ KBN-095/T08/200
copyright © 2008 P.G.K. Media Polska,
ISSN 1425-5073