Techniki molekularne do identyfikacji pasożytów u ludzi

Techniki molekularne do
identyfikacji pasożytów u ludzi
Danuta Grygierczyk
W laboratoryjnej diagnostyce parazytologicznej stosuje się
rutynowo badania:
 Mikroskopowe
 Immunologiczne
 Biochemiczne
 Hodowle in vitro/ in vivo
 PCR- badania molekularne ( wybrane laboratoria) –
przydatność w wykrywaniu pasożytów oprócz materiału
klinicznego, w próbach środowiskowych
Zastosowanie PCR i innych technik molekularnych ma
znaczenie:
 przy niskiej intensywności zarażenia
 gdy pasożyty są trudne lub niemożliwe do hodowli
 są trudności w różnicowaniu gatunków morfologicznie
podobnych
 jeśli badania immunologiczne są niewystarczające
Molekularna diagnostyka pierwotniaków
Toxoplasma gondii
Główną rolę w diagnostyce laboratoryjnej odgrywają badania
serologiczne.
Przy rozpoznawaniu toksoplazmozy mózgowej i ocznej a także
we wczesnym rozpoznawaniu zarażeń wrodzonych – hodowla
pasożytów z płynów ustrojowych poprzez dootrzewnową
inokulację myszy ( kilka tygodni)
PCR w toksoplazmozie wykorzystywane do poszukiwania
sekwencji genów: B1, P30 i 18S rDNA pasożyta
Wykrywany materiał genetyczny to zawartość pojedynczych
tachyzoitów






W inwazji prenatalnej diagnozowanie toksoplazmozy płynu
owodniowego techniką PCR uzależnione jest od okresu,
w którym doszło do zarażenia.
Czułość PCR 92,9% - przy inwazji w II trymestrze ciąży
Najwyższe prawdopodobieństwo uzyskania wyników fałszywie
ujemnych- zarażenie przed 17 i po 21 tygodniu ciąży.
Ujemny wynik badania płynu owodniowego metodą PCR nie
może wykluczyć inwazji wrodzonej u płodu.
Otrzymanie pozytywnego wyniku amplifikacji nie jest
możliwe we wszystkich przypadkach toksoplazmowego
zapalenia mózgu.
 Brak DNA pasożyta w płynie mózgowo- rdzeniowym przy
aktywnym procesie inwazji wynika z parenchymalnego
umiejscowienia zmian z dala od opon mózgowych i komór
mózgu.
 Toksoplazmoza oczna- amplifikacja genów: B1, P30 i
18S rDNA pasożyta w płynie z przedniej komory oka i z
wycinków siatkówki i naczyniówki.
Wartość diagnostyczna tego badania jest jednak ograniczona
( mała objętość próbki, brak DNA T. gondii w płynie gdy
inwazja obejmuje regiony odległe od komory przedniej
gałki ocznej)

Antygeny rekombinowane – pozwolą na określenie stadium
choroby
Otrzymano antygeny/ markery toksoplazmozy: mikronem
(MIC), roptrii (ROP), granul (GRA), powierzchniowe (SAG),
cytoplazmatyczny (BAG1) (bradyzoitów)
Genotypowanie T. gondii – znana sekwencja genów – B1,P30,
P23, P22, H4, H11
Polimorficzny gen SAG2 wskazuje na istnienie III odmiennych
szczepów T. gondii; II najczęściej wywołuje toksoplazmozę
wrodzoną bezobjawową przewlekłą. Może prowadzić także do
poronień, powikłań ze strony OUN i narządu wzroku u płodu.
I typ występuje rzadko u człowieka wywołując wrodzoną
toksoplazmozę o ciężkim przebiegu. Typ III typowy u
zwierząt.

Cryptosporidium spp.

W stosunku do tego gatunku metody PCR stały się referencyjne w
diagnostyce parazytologicznej ( czułość i swoistość). W odróżnieniu od
konwencjonalnych metod pozwalają na wyróżnienie gatunków i/lub
genogatunków Cryptosporidium inwazyjnych i patogennych dla człowieka
oraz mają zastosowanie do badania prób środowiskowych
( kał, żywność, woda, gleba).
Wykonujemy: PCR podstawowy, PCR-RFLP, FISH
PCR-fingerprinting i PCR- sekwencjonowanie.
Tradycyjne metody mikroskopowe i immunologiczne nie pozwalają na
wyróżnienie szczepów.
Na podstawie genotypowania różnych gatunków Cryptosporidium zostały
wyodrębnione nowe : C. felis, C. wrairi; izolat C. parvum od psów, świń,
myszy domowej, torbaczy , małp.
W populacji ludzkiej 2 szczepy C.parvum - H( genotyp1)i C( genotyp 2).
Badania polimorfizmu w obrębie C. parvum pozwoliły na
określenie pokrewieństwa pomiędzy gatunkami i szczepami
pasożyta.
 Najbardziej filogenetycznie spokrewnione są szczepy H i C,
izolat od małp i od myszy domowej; oddzielne gałęzie to izolaty
od psów, świń torbaczy i C. felis. Najbardziej odległe
filogenetycznie od specyficznie ludzkiego szczepu H są gatunki:
C. muris, C. andersoni, C. serpentis i C. nasorum.
Szczep H (genotyp1)- odpowiedzialny za epidemie miejskie, z
dobrym układem odpornościowym
Szczep C – wspólny dla ludzi i zwierząt ( epidemie
wodnopochodne na terenach rolniczych) oraz połowę zarażeń
u nosicieli wirusa HIV


Entamoeba histolytica i E. dispar
E. histolytica s.s.– patogeniczny, w obrębie tego gatunku są
szczepy patogeniczne i niepatogeniczne (badania
izoenzymatyczne i genetyczne)
Diamond i Clark dokonali w 1993r redeskrypcji gatunku E.
histolytica , przywracając nazwę
E. dispar – niepatogeniczny
Badania obu gatunków metodami izoenzymatycznymi,
wykrywającymi swoiste antygeny i PCR( z cyst w kale i treści
ropnia wątroby).

Plasmodium spp.
Rutynowo cienki rozmaz krwi
– 500-1000pasozytów/ μl krwi
Gruba kropla – 10-20pasożytów/μl krwi
Trudności są przy niskiej parazytemii, mieszanej, po przyjęciu
nieskutecznej dawki leku
PCR- pełna krew na EDTA, startery komplementarne do genów
r RNA małej podjednostki rybosomu, białko powierzchniowe
”circumsporozoite” czy BRK1
PCR standardowy, nested PCR
Molekularna diagnostyka robaków

Trichinella spp.
W rutynowej diagnostyce stosowane są nadal mikroskopowe
wykrywanie larw w bioptatach oraz metody serologiczne,
(test ELISA).
PCR: RAPD-PCR, multiplex PCR, RFLP-PCR
Identyfikacja 7 gatunków przy zastosowaniu 11 enzymów
restrykcyjnych- 3 różne produkty PCR:
2800pz( b. sekrecyjne), 1250pz (startery SB147A), 372pz
(startery SB372A)
Potwierdzono występowanie w obrębie rodzaju Trichinella 2
nowych gatunków: T. murrelli oraz T. papue

Echinococcus multilocularis
Głównie badania immunologiczne, skreeningowe (odczyn
hemaglutynacji pośredniej , ELISA)
potwierdzenie -ELISA z antygenem EM2+, immunoblotting z
antygenem EM18 i EM 16, badania histopatologiczne materiału
z zabiegu lub biopsja cienkoigłowa.
PCR – mitochondrialny 12S rRNA, sekwencjonowanie produktów
PCR
Genetyczne zróżnicowanie pasożytniczych
pierwotniaków
Giardia
Obecnie istnieje 5 odmiennych gatunków (grup) w rodzaju
Giardia:
G. agilis,G. muris i G. intestinalis (G. duodenalis),G. psittaci,
G. ardeae.
Genetyczna analiza 200 aksenicznych izolatów Giardia ujawniła,
że należą do 2 dużych grup- „ polskie” (A)(1i 2) i „ belgijskie”
(B)(3 i 4).
W obrębie 1 – izolaty od ludzi i zwierząt, 2- tylko od ludzi, 3 i 4 –
bardziej zróżnicowane.
Dodatkowe grupy C i D ( od psów)
Różnią się kariotypami, sekwencją nukleotydów małej
podjednostki rRNA i obrazem długości fragmentów
restrykcyjnych rDNA.
Zastosowanie technik molekularnych umożliwia identyfikacje
gatunków Giardia w próbach środowiskowych. Samo wykrycie
cyst w wodzie nie pozwala oszacować ryzyka zarażenia ludzi.
Izolaty B odpowiedzialne są za łagodny lub bezobjawowy
przebieg choroby.

Cryptosporidium
Obecnie wyróżnia się 8 gatunków,
obserwuje się różnorodność objawów klinicznych
kryptosporydiozy oraz zmienną inwazyjność i wirulencję
populacji tego pasożyta.
Wynik RAPD PCR wykazał istnienie 4 genetycznie odmiennych
grup wśród kilkudziesięciu izolatów
Cryptosporidium uzyskanych od ssaków i węży (C. serpentis).
Od ludzi są mało zróżnicowane ale różnią się swoją potencją
zoonotyczną.
Molekularna analiza genetycznych różnic w locus genu białka
TRAP-C2 od ludzi z różnych regionów geograficznych wykazała
istnienie 2 genotypów( od ludzi i zwierząt).
Analiza filogenetyczna opiera się na sekwencji 18rDNA i genu
syntetazy acetylo-koenzymu A.

Leishmania spp.
Wyróżnia się kilkanaście gatunków Leishmania inwazyjnych
dla człowieka.
Do celów taksonomicznych przydatna jest metoda
fingerprintów DNA.
Do różnicowania izolatów L. donovani wykorzystuje się 2
sondy molekularne odpowiadające sekwencjom genów
białka szoku termicznego (hsp70)

Trypanosoma
Populacja T.cruzi wykazuje dużą heterogeniczność
podobną do Giardia.
Wykazano korelacje miedzy filogenetyczną różnorodnością i
biomedycznymi właściwościami, T.cruzi jest przykładem
klonalnej ewolucji co wykazała analiza różnych markerów
molekularnych- wyróżniono 2 filogenetyczne linie rozwojowe.
Rozróżniono podgatunki w obrębie T. brucei dzięki zastosowaniu
RFLP PCR, hybrydyzacji z sondami DNA, analizie izoenzymów
oraz oceny wrażliwości metacyklicznych trypomastigota na
lityczne działanie ludzkiej surowicy odpornościowej.
Izolaty T.b.gambiense, T.b.rhodesiense różnią się od T.b. brucei

Toxoplasma
Genetyczny polimorfizm T. gondii warunkuje niezwykłą
zdolność adaptacyjną do licznych gatunków żywicieli
pośrednich.
Do oceny stopnia heterogeniczności genomu zastosowano:
RFLP (starter dla genu P30), RAPD i sekwencjonowanie.
Wykazano zmienność wewnątrzgatunkową i
wewnątrzszczepową tego pasożyta.
3 linie klonalne wyróżniono; genotyp 2 związany z ciężkim
przebiegiem toksoplazmozy u ludzi.
Lekooporność pasożytów
Lekooporność wynika z:
 Długotrwałego i powszechnego stosowania tego samego
leku
 Przerwania terapii (uboczne działanie leków)
 Nie przestrzegania przyjmowania odpowiednich dawek leku
Niepodatność na leczenie może być wynikiem genetycznych,
immmunologicznych lub fizjologicznych czynników
zarażonego żywiciela


Lekooporność jest genetycznie przekazywaną utratą
wrażliwości populacji pasożyta na lek, który wcześniej był
skuteczny.
Tolerancja lub naturalna oporność to niepodatność
populacji, która wcześniej nie była wystawiona na działanie
danego leku.
W obu przypadkach dotyczy to pojedynczej lub licznych
mutacji różnicujących populacje pod względem wrażliwości
na działanie leku.
W lekooporności mutacja jest indukowana selekcyjnym
działaniem leku ( lek mutagenem).
Tolerancja ujawnia się w rozprzestrzenieniu różnych
populacji, poddanych naturalnej selekcji.



Oporność na leki wynikać może z nabycia nowej aktywności
przez pasożyty( degradowanie lub inaktywowanie leku)
bądź z utraty wcześniej istniejącej aktywności.
Stwierdza się heterogeniczność różnych gatunków
pasożytów pod względem wrażliwości na działanie leków.
U różnych pasożytów istnieją odmienne molekularna
mechanizmy lekooporności

Schistosoma mansoni
Stwierdzono zmienność międzypopulacyjną
S. mansoni we wrażliwości na hykanton i
oksamnikwin(afrykańskie są bardziej oporne niż
południowoamerykańskie) (genetycznie przekazywana cechaautosomalnie, recesywnie; utrata pojedynczej aktywności
przywr- pojedyncza mutacja punktowa).
Aktywacja leku polega na enzymatycznej estryfikacji,
spontanicznej dysocjacji powstałego estru. Utworzone aktywne
reszty są zdolne do alkilacji DNA lub innych cząsteczek przywr.
Przywry z opornym fenotypem wykazują mniejszą żywotność.
O wysokiej skuteczności nadal jest lek prazykwantel.

Leishmania
Amplifikacja niektórych genów i ich nadekspresja wiąże się z
brakiem wrażliwości na działanie leków
pierwotniakobójczych.
Tlenki związków stosowane jako leki są induktorami
amplifikacji danego genu u Leishmania. Gatunki te często
amplifikują swoistą część genomu po selekcyjnym działaniu
leku. Genomowy region zawierający locus H jest
amplifikowany jako pozachromosomowy, kolisty DNA
2 klasy genów pgp (P- glikoproteina) oporne na leki hydrofilne
(1) i hydrofobowe (2)
Uzyskano szczep L. tropika z fenotypem MDR (multidrug
resistant), u którego stwierdzono nadekspresje genu ltpgpE

Plasmodium spp.
Izolaty Plasmodium spp. uzyskane z przypadków klinicznych
jak i drogą selekcji w warunkach laboratoryjnych wykazują
oporność na liczne leki w szczególności na chlorochinę.
Lekooporność wynika ze zmniejszonej akumulacji leku w
wodniczkach pokarmowych pasożyta.
Przywrócenie wrażliwości na leki jest możliwe po podaniu
inhibitorów kanału wapniowego.
PCR i hybrydyzacja z sondami molekularnymi – geny pfmdr1 i
pfmdr2; amplifikacja i nadekspresja genu 1 występowała u P.
falciparum opornych na chininę, meflochinę i halofantrin przy
braku amplifikacji genu 2

Entamoeba histolytica
W genomie zidentyfikowano geny pgp (4g+2pg)
Wykazano oporność na emetynę, podanie inhibitorów
kanału wapniowego- przywrócenie wrażliwości na leki.
Trichomonas vaginalis
Oporność na metronidazol, wrażliwe na tinidazol.
Oporność jest związana ze spadkiem reduktazy flawiny i
tioredoksyny ( zaburzenia przemiany tlenu) oraz
dehydrogenazy alkoholowej1 (ADH1)