stałe nowe obs

Badanie kinetyki wiązania tetracykliny (Tc) do represora tetracykliny
(TetR) w obecności i pod nieobecność efektora
Badanie kinetyki oddziaływania białko-ligand
Celem analizy kinetyki stanów przejściowych jest ustalenie ścieżki reakcji i pomiar
wartości wszystkich stałych kinetycznych. Stała szybkości asocjacji jest ograniczona przez
dyfuzję i ułożenie przestrzenne miejsca wiązania (tzw. kontrola dyfuzyjna). Reakcja może
być jednak spowolniona przez następcze procesy chemiczne, czyli tylko częściowo podlega
kontroli dyfuzyjnej. Typowe stałe asocjacji są rzędu 105-106 M-1s-1, natomiast stałe szybkości
przekraczające 109 M-1s-1 dotyczą procesów, w których szybkość ma funkcjonalne znaczenie.
W tych przypadkach stała asocjacji jest wzmacniana przez silne, faworyzowane siły
elektrostatyczne. Metoda zatrzymanego przepływu jest powszechnie używanym narzędziem
w badaniach mechanizmu procesów kinetyki molekularnej w zakresie czasowym od
milisekund to tysięcy sekund. Typowy pomiar polega na szybkim zmieszaniu dwóch
reagentów i obserwacji zmian sygnału optycznego (np. fluorescencji) w funkcji czasu do
momentu osiągnięcia przez układ stanu stacjonarnego (np. w przypadku enzymu i substratu)
lub stanu równowagi (np. w przypadku enzymu i inhibitora). W warunkach reakcji
pseudopierwszego rzędu polegających na zastosowaniu molowego nadmiaru jednego ze
substratów, zakłada się, że jego stężenie w czasie reakcji nie ulega zmianie. Trzeba jednak
pamiętać, że duży nadmiar jednego z reagentów może uczynić proces asocjacji zbyt szybkim
dla tej techniki. Metoda zatrzymanego przepływu pozwala śledzić procesy, dla których
obserwowana stała szybkości asocjacji, k obs , nie przekracza 1000-500 s-1. W warunkach
reakcji pseudopierwszego rzędu rozwiązaniem równania różniczkowego jest prosta funkcja
eksponencjalna (lub też suma eksponentów). Zasadniczo każdy z eksponencjanych członów
opisuje istotny etap reakcji asocjacji. W najprostszym przypadku reakcja asocjacji białkoligand jest procesem jednoetapowym:
k1
B + L ↔ BL ,
k −1
chociaż, jeśli białko wiąże pojedynczą cząsteczkę liganda, rozsądną wydaje się hipoteza
następczych zmian konformacyjnych występujących po początkowym zderzenia. To
prowadzi do dwuetapowej kinetyki wiązania:
1
k1
k2
k −1
k− 2
B + L ↔ BL ↔ BL∗ ,
gdzie k i są stałymi kinetycznymi , B oznacza białko, L ligand, BL przejściowy kompleks
białko-ligand, oraz BL∗ oznacza końcowy kompleks białko-ligand. Oczywiście teoretycznie
można wziąć pod uwagę więcej następczych, polegających na rearanżacji białka etapów, ale
praktycznie trudno jest zaobserwować więcej niż dwa etapy reakcji wiązania białko-ligand
Analiza krzywych kinetycznych
Do otrzymanych w warunkach reakcji pseudopierwszego rzędu przebiegów kinetycznych
należy dopasować funkcje będące sumą członów eksponencjalnych:
A(t ) = ∑ [A0 exp(− kt ) + A∞ ] ,
gdzie k oznacza kinetyczną stałą szybkości, t czas, A0 i A∞ amplitudy sygnału w czasie zero i
w nieskończoności.
Pełny
dwuetapowy
mechanizm
wiązania
liganda
obejmuje
sekwencję
dwóch
odwracalnych reakcji:
[L ]k a
kc
kd
k−c
B + L ↔ (B − L) )↔ (B − L ) .
∗
Rozwiązaniem równań różniczkowych dla tego modelu jest suma dwóch członów
eksponencjalnych. Obserwowane stałe kinetyczne ( k1obs i k sobs ) i amplitudy są w tym
przypadku zależne od wszystkich czterech stałych kinetycznych. Forma zależności k1obs
i k sobs od stężenia jest bardzo skomplikowana, ale wprowadzenie pewnych uproszczeń
pozwala przewidzieć przebieg zależności obserwowanych stałych kinetycznych od stężenia
liganda:
k1obs ≈ k a [L ] + k d + k c + k −c ,
(1)
k a [L ](k − c + k c ) + k d k −c
.
k a [L ] + k d + k c + k −c
(2)
k 2 obs ≈
Zależność k1obs od stężenia liganda jest linią prostą, której nachylenie wyznacza wartość
stałej kinetycznej asocjacji k a , zaś przecięcie z osią y jest równe sumie pozostałych trzech
stałych kinetycznych. Wolna faza reakcji definiuje szybkość przekształcenia kompleksu
(
(
)
)
przejściowego B − L w ostateczny produkt reakcji B − L . Zależność od stężenia [L]
∗
obserwowanej stałej szybkości, k2 obs , dla tego etapu ma postać hiperboli i definiuje pozorną
2
stałą
dysocjacji:
K dpoz =
k d k −c
K d kc
=
k1 (k c + k − c ) k c + k −c
oraz
maksymalną
stałą
szybkości:
k max = k c + k −c .
Dwuetapowy mechanizm wiązania liganda obejmuje szereg sytuacji wynikających
z wzajemnego
stosunku
wartości
poszczególnych
stałych
kinetycznych.
Często
dwucząsteczkowa reakcja jest znacznie szybsza niż zmiany konformacyjne. W praktyce taka
sytuacja ma miejsce przy zastosowaniu wystarczająco wysokich stężeń białka i/lub liganda.
Wówczas zachodzi nierówność k a [L ] + k d >> (k c + k − c ) , w wyniku której Równania 1 i 2
przyjmują prostszą postać. Kinetyczna stała obserwowana dla etapu wiązania dana jest
równaniem:
k1obs = k d + k a [L ].
(3)
Wartość k a [L ] odnosi do stałej szybkości pseudopierwszego rzędu i stąd zależy od stężenia
liganda [L] . Obserwowana stała szybkości dla wolnego procesu dana jest przez sumę obu
stałych kinetycznych tego etapu:
k 2 obs = k −c +
gdzie
k c [L ]
,
[L] + K dys
(4)
kd
.
ka
(5)
K dys =
Wszystkie stałe szybkości tego typu dwuetapowej reakcji mogą być wyznaczone z wykresów
zależności k1obs i k 2 obs od stężenia liganda
[L] .
Model dwóch odwracalnych reakcji
następczych, w którym jeden z procesów jest szybszy od drugiego, może być rozwiązany
w oparciu o dwie zasady: 1) istnieją dwa zestawy kinetycznych stałych obserwowanych,
ponieważ obecne są dwa procesy składowe; 2) reakcje składowe są rozpatrywane oddzielnie,
gdyż zachodzą w odrębnych skalach czasowych [Cantor i Schimmel, 1980; Johnson, 1986;
Fersht, 1999].
Ostatecznym potwierdzeniem słuszności zastosowanego modelu kinetycznego jest
zgodność uzyskanych wartości stałych kinetycznych z wynikami globalnej analizy krzywych
kinetycznych dla oddziaływania białko ligand otrzymanych w warunkach reakcji drugiego
rzędu np. w programie komputerowym DynaFit [Kuzmič, 1996]. Zbiór krzywych
kinetycznych
analizuje
się
jednocześnie
według
wybranego
mechanizmu
reakcji
reprezentowanego symbolicznie przez zestaw równań chemicznych. Na tej podstawie
program komputerowy określa układ równań różniczkowych, a następnie stosując iteracyjną
3
metodę nieliniowej regresji wyznacza parametry najlepszego dopasowania. Szacowanymi
parametrami są: stałe szybkości, molowe odpowiedzi fluorescencji każdego ze związków
chemicznych uczestniczących w reakcji, stężenie białka oraz przesunięcie linii podstawowej
przebiegów kinetycznych.
Fluorescencyjne własności TetR i kompleksu (TetRB-[Tc-Mg]+)2
Reszty tryptofanu są często stosowane jako wewnętrzne sondy fluorescencyjne
w badaniach konformacji i zmian strukturalnych białek. Represor tetracykliny, TetRB, posiada
dwie naturalne reszty Trp w pozycjach 43 i 75. Fakt, że są one zachowane we wszystkich
klasach białek TetR świadczy o ich dużym znaczeniu dla struktury i funkcji białka.
Selektywne wzbudzenie reszt tryptofanowych (λ295) umożliwia rejestrację pasma emisji
fluorescencji z maksimum przy 330 nm, z kolei tetracyklina wzbudzana światłem o długości
fali 380 nm emituje fluorescencję z maksimum przy 510 nm.
Wiązanie Tc ma drastyczny wpływ na widma fluorescencyjne obu składników niezależnie od
tego czy długość fali światła wzbudzającego wynosi 280, czy 295 nm. Następuje przesunięcie
maksimum emisji białka z 330 do 340 nm połączone z obniżeniem maksimum wzbudzenia Tc
z 380 do 370 nm [Takahashi i wsp., 1986], ale przede wszystkim obserwuje się zmiany
w intensywności fluorescencji reagentów. Fluorescencja białka wygaszana jest w 70%, zaś
tetracykliny wzrasta 3-8 krotnie w zależności od pH. Znaczący wzrost wydajności kwantowej
emisji fluorescencji tetracykliny po związaniu TetR (wzbudzenie przy 280 nm, emisja przy
510 nm) potwierdzono także pomiarami spektroskopii fotoakustycznej [Kaszycki i wsp.,
1996]. Powodem wzrostu emisji fluorescencji tetracykliny (510 nm), wzbudzanej światłem
o λ równym 280 nm podczas wiązania z TetR, jest głównie wzrost wydajności kwantowej Tc,
związany ze zmianą jej środowiska, ale także transfer energii. W kompleksie z TetR pojawia
się nowe pasmo wzbudzenia tetracykliny z λmax ok. 280 nm, kształtem przypominające pasmo
wzbudzenia „wolnego” TetR. Pasmo to powstaje głównie w rezultacie zmian w otoczeniu
leku, ale częściowo także w wyniku transferu energii z Trp na Tc [Hansen i wsp., 1987].
Wydajność kwantowa głównego pasma wzbudzenia Tc (370 nm) w kompleksie z białkiem
wzrasta wyłącznie z powodu zmian w otoczeniu leku.
4
Celem ćwiczenia jest określenie kinetycznego mechanizmu dla procesu wiązania induktora
przez białko TetR i zbadanie roli jonów magnezu w procesie indukcji białka TetR przez
tetracyklinę.
Wykonanie ćwiczenia
-
określenie stężenia roztworu tetracykliny
-
planowanie doświadczenia na podstawie znajomości własności fluorescencyjnych
badanego układu (patrz materiały: „Kinetic and equilibrium characterization of the Tet
repressor-tetracycline
complex
by
fluorescence
measurements”
oraz
wstęp
teoretyczny)
-
dobór filtrów
-
obliczenie stężeń reagentów i przygotowanie dwóch serii roztworów pomiarowych
-
przeprowadzenie pomiarów
-
analiza krzywych kinetycznych zmierzonych w warunkach reakcji pseudo pierwszego
rzędu
-
zapoznanie się z programem DynaFit
Zagadnienie
-
kinetyka reakcji chemicznych
-
zjawisko fluorescencji i transferu energii
-
struktura i funkcja białka TetR
-
mechanizm procesu indukcji wywołany wiązaniem liganda
5