przepis do ćwiczenia 5

Ćwiczenie 5
Wpływ czynników stresowych na fizjologiczny stan błon komórkowych: oznaczanie
przepuszczalności błon komórkowych i stopnia peroksydacji lipidów komórkowych.
Oznaczanie przepuszczalności błon komórkowych (metoda konduktometryczna)
Odczynniki:
• woda destylowana
na 1 gr (5 zespołów) potrzeba:
• wierzba stresowa 2,5g
• wierzba kontrolna 2,5g
Sprzęt:
• konduktometr
• łaźnia wodna
• Probówki PP zakręcane (bo do wrzącej łaźni wodnej) (30ml)
• pipety szklane i automatyczne
Materiał roślinny:
• wierzba poddana stresowi
• wierzba – osobniki kontrolne.
Procedura:
• Odważyć po około 0,5 g materiału roślinnego (krążki liści, pąki drzew, 1-2 cm odcinki
pędów)
• Materiał roślinny umieścić w zakręcanych, 30 ml probówkach
• Materiał roślinny zalać 10 ml wody destylowanej, zamieszać i natychmiast zmierzyć
początkowe przewodnictwo tzw. tło (L0) za pomocą konduktometru
• Inkubować w temperaturze 25°C przez 30 minut
• Zamieszać i zmierzyć przewodnictwo za pomocą konduktometru (LT)
• Próbki gotować przez 15 minut w łaźni wodnej w celu zabicia materiału roślinnego
• Ochłodzić do temperatury 25°C i inkubować w tej temperaturze przez 30 minut
• Zamieszać
• Zmierzyć przewodnictwo roztworu za pomocą konduktometru (LK)
• Obliczyć stosunek: LT-L0/LK-L0 i wyrazić w %%
Oznaczanie zawartości aldehydu dimalonowego (MDA)
Odczynniki:
• TCA – kwas trichlorooctowy (trichloroacetic acid) 5%. Przygotowanie (na 100 mL
roztworu): odważyć 5 g TCA i rozpuścić go w ok. 70ml wody. Dopełnić wodą do 100 mL.
• TBA reagent (mieszanina 20% TCA i 0,5% tiobarbituric acid). Przygotowanie (na 100 mL):
odważyć 20g TCA, rozpuścić w ok. 70ml wody, odważyć 0,5g TBA i wsypać do
przygotowanego wcześniej roztworu. Wytrząsać overnight a następnie dopełnić do 100 mL
wodą.
16
na 1 gr (5 zespołów) potrzeba:
• zhomogenizowany i zliofilizowany proszek z liści roślin poddanych stresowi i kontrolnych:
2x 300mg
• TCA 35ml
• TBA 70 ml
Sprzęt:
• Spektrofotometr
• wirówka
• wytrząsarka
• łaźnia wodna
• łaźnia lodowa
• probówki eppendorfa 1,5ml
• Probówki PP zakręcane (bo do wrzącej łaźni wodnej) (co najmniej 7-15ml)
• Kuwety szklane
• pipety szklane i automatyczne
Materiał roślinny:
• wierzba poddana stresowi
• wierzba – osobniki kontrolne.
Procedura:
• do 6 probówek PP 10 ml odważyć po ok. 20mg zhomogenizowanego wcześniej proszku
pochodzącego z roślin poddanych stresowi (3 probówki) i roślin kontrolnych (3 probówki),
• zanotować dokładną wagę naważki w mg
• do każdej probówki dodać 1 mL 5% TCA i wytrząsać przez 30 min na lodzie.
• włączyć łaźnię wodną na 93 st C.
• w międzyczasie wstawić do stojaka 7 probówek typu falcon na 15 mL (zakręcane) i dodać
do nich pod digestorium 2 mL przygotowanego roztworu TBA. Falcony trzymać w
pudełkach z wodą i lodem.
• odwirować probówki z proszkiem przez 10 min (5000 rpm)
• z każdej próbki pobrać 0,5ml ekstraktu i dodać do 2 mL przygotowanego wcześniej TBA w
falconie.
• Zakręcić i zamieszać. Do jednego falcona zamiast ekstraktu dodać 0,5 mL czystego 5%
TCA (kontrola-referencja).
• wstawić do łaźni wodnej na 30 min w temp 93stC.
• po wyjęciu z łaźni wodnej falcony szybko ochłodzić (wstawić stojaki do pudełek z wodą i
lodem)
• nalać do kuwety pomiarowej 2 ml roztworu i oznaczać w spektrofotometrze. Pierwsza
kuweta z kontrolą (referencja=tło). Kuwety 2-4 próbki z roślin poddanych stresowi, kuwety
5-7 próbki z roślin kontrolnych. Absorbancję odczytywać dla 532 i 600nm.
• Wyniki przenieść do arkusza kalkulacyjnego i obliczyć stężenie z wzoru:
(((A532 - A600 ) / 155) * 2 * 5) / naważka w gramach) * 1000 [nM/g d.w.]
17