62798_Platelia Candida Ag - Bio-Rad

PLATELIA™ TOXO IgG TMB
96 TESTÓW
72741
TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA I ILOŚCIOWEGO
OZNACZANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgG PRZECIWKO TOXOPLASMA GONDII
W LUDZKIEJ SUROWICY LUB OSOCZU
Do diagnostyki in vitro
Wszystkie produkowane i wprowadzane do sprzedaży odczynniki są
przygotowywane zgodnie z systemem jakości, poczynając od materiałów
wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego.
Odczynniki każdej serii podlegają oznaczeniu kontrolnemu, i są dopuszczane do
użytkowania, jeśli spełniają wymagane kryteria.
Odpowiednie protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii są przechowywane w
firmie
1
SPIS TREŚCI
1 - ZASTOSOWANIE ............................................................................................................. 3
2 - ZNACZENIE KLINICZNE................................................................................................. 3
3 - ZASADA TESTU ............................................................................................................... 3
4 - SKŁAD ZESTAWU ........................................................................................................... 4
5 - ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA............................................................................... 5
6 - INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY I SPRZĘT................................................................. 7
7 - PRZYGOTOWANIE I PRZECHOWYWANIE ODCZYNNIKÓW................................ 7
8 – POBIERANIE, OPRACOWYWANIE I PRZECHOWYWANIE MATERIAŁU DO
BADAŃ ..................................................................................................................................... 8
9 - PROCEDURA .................................................................................................................... 8
10 - OBLICZENIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW ....................................................... 10
11 - CHARAKTERYSTYKA I OGRANICZENIA TESTU................................................ 12
12 – LITERATURA ............................................................................................................... 15
2
1 - ZASTOSOWANIE
Test Platelia™ Toxo IgG TMB służy do wykrywania i ilościowego oznaczania przeciwciał
IgG przeciwko Toxoplasma gondii in vitro w ludzkiej surowicy lub osoczu.
2 - ZNACZENIE KLINICZNE
T. gondii jest pierwotniakiem wywołującym zakażenia u licznych gatunków ssaków i
ptaków. Toksoplazmoza występująca u ludzi i zwierząt przeważnie przebiega
bezobjawowo. Częstość występowania zakażeń w danej populacji, wykrywanych metodami
serologicznymi, waha się w różnych krajach i zależy od wieku badanych.
Toksoplazmoza ciężarnych może powodować poważne zaburzenia rozwoju płodu
(zwłaszcza uszkodzenie funkcji mózgu), a czasami prowadzić do obumarcia płodu.
Wykrycie przeciwciał IgG przeciw T. gondii u kobiet przed zapłodnieniem pozwala uzyskać
pewność ochrony płodu przed zakażeniem wrodzonym, w przypadku wystąpienia
toksoplazmozy w czasie ciąży.
Skłonność do występowania toksoplazmozy o ostrym przebiegu występuje u chorych z
nabytym zespołem niedoboru odporności (AIDS) oraz u innych osób z immunosupresją.
Zakażenia te są najczęściej spowodowane reaktywacją cyst pierwotniaka, obecnych w
organizmie chorego przed zakażeniem wirusem HIV. Diagnostyka zakażenia T. gondii
może być skomplikowana, a izolacja pasożyta jest rzadka. Serologiczne potwierdzenie
występowania przeciwciał przeciwko T. gondii świadczy o kontakcie z pasożytem i jest
powszechnie akceptowane w celu określenia statusu immunologicznego pacjenta i
podatności na zakażenie. Wykrywanie poszczególnych izotypów pomaga określić czas
zakażenia T. gondii i zastosowanie odpowiedniego leczenia w przypadku niedawnej infekcji
lub propozycję profilaktyki, obejmującej zalecenia higieniczno-dietetyczne dla kobiet w
ciąży lub chemioprofilaktykę pacjentów z upośledzoną odpornością.
3 - ZASADA TESTU
PLATELIA™ Toxo IgG TMB jest pośrednim testem immunoenzymatycznym, w którym z
fazą stałą związany jest antygen T.gondii, uzyskany z ultrasonatu trofozoitów, wzbogacony
białkami błonowymi. Koniugat stanowią monoklonalne przeciwciała przeciwko ludzkim
łańcuchom gamma, znakowane peroksydazą.
Etap pierwszy
Rozcieńczenie próbek i inkubacja z antygenem T.gondii, związanym z fazą stałą. Podczas
inkubacji przez 1 godzinę w temp. 37°C, obecne w próbce przeciwciała przeciwko T.gondii
wiążą się z antygenem. Po inkubacji, nie swoiste immunoglobuliny i inne białka surowicy
zostają usunięte podczas płukania.
Etap drugi
Naniesienie do studzienek koniugatu: monoklonalnych przeciwciał przeciwko ludzkim
łańcuchom gamma, znakowanych peroksydazą. Podczas inkubacji przez 1 godzinę w
temp. 37°C, znakowane przeciwciała zwiążą się kompleksem przeciwciało IgG antyT.gondii – antygen T.gondii, związanym z fazą stałą. Po inkubacji, nie związane
znakowane przeciwciała są usuwane podczas płukania.
Etap trzeci
Wykrycie kompleksu (T.gondii Ag, przeciwciało IgG anty T.gondii, koniugat anty-T.gondii
IgG) następuje po dodaniu roztworu zawierającego substrat dla peroksydazy i chromogen
wywołujący reakcję barwną.
3
Etap czwarty
Po półgodzinnej inkubacji w temp. pokojowej (18-30°C) i dodaniu 1 N kwasu siarkowego
następuje zatrzymanie reakcji enzymatycznej. Uzyskana przy długości fali 450/620 nm
wartość OD, jest proporcjonalna do ilości przeciwciał IgA przeciwko T.gondii w badanej
próbce
Wynik konwertowany jest na IU/ml wykreślając krzywą wzorcową. Surowice kalibracyjne
(R4a, R4b, R4c) zostały wykalibrowane wg surowicy standardowej WHO (TOXM 185).
4 - SKŁAD ZESTAWU
Wszystkie odczynniki są przeznaczone wyłącznie do diagnostyki in vitro.
Oznaczenie
R1
Mikropłytka
R2
Stężony bufor
do płukania
Charakterystyka odczynnika
Opakowanie
Mikropłytka: 12 pasków po 8 studzienek
opłaszczonych antygenami T.gondii (szczep RH).
1 płytka
Bufor do płukania (10 x):
1 fiolka
Bufor TRIS-NaCl (pH 7.4), 1% Tween® 20
100 ml
Konserwant: 0.01% thimerosal
R3
Kalibrator 0
Kalibrator 0: Ludzka surowica, ujemna pod względem
przeciwciał anty-T.gondii, oraz ujemna pod względem
antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBsAg) i przeciwciał anty-HIV1, anty-HIV2 i anty-HCV.
1 fiolka
1 ml
Konserwant: < 0.01% thimerosal
R4a
Kalibrator 6
Kalibrator 6 IU/ml: Bufor TRIS-NaCl (pH 8 ± 0.2),
ludzka surowica, dodatnia pod względem przeciwciał
IgG anty-T.gondii, oraz ujemna pod względem
antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBsAg) i przeciwciał anty-HIV1, anty-HIV2 i anty-HCV,
albumina bydlęca, glicerol, E102 i E122
1 fiolka
1 ml
Konserwant: < 0.01% thimerosal i < 0.5% Proclin® 300
R4b
Kalibrator 60
Kalibrator 60 IU/ml: Bufor TRIS-NaCl (pH 8 ± 0.2),
ludzka surowica, dodatnia pod względem przeciwciał
IgG anty-T.gondii oraz ujemna pod względem antygenu
powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs-Ag) i
przeciwciał anty-HIV1, anty-HIV2 i anty-HCV, albumina
bydlęca, glicerol, E102 i E122
1 fiolka
1 ml
Konserwant: < 0.01% thimerosal i < 0.5% Proclin® 300
R4c
Kalibrator 240
Kalibrator 240 IU/ml: Bufor TRIS-NaCl (pH 8 ± 0.2),
ludzka surowica, dodatnia pod względem przeciwciał
IgG anty-T.gondii, oraz ujemna pod względem
antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBsAg) i przeciwciał anty-HIV1, anty-HIV2 i anty-HCV,
albumina bydlęca, glicerol, E102 i E122
1 fiolka
1 ml
Konserwant: < 0.01% thimerosal i < 0.5% Proclin® 300
R6
Koniugat (50x)
Koniugat: Mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko
ludzkim IgG, znakowane peroksydazą chrzanu (50x).
1 fiolka
0. 6 ml
4
R7
Rozcieńczalnik Rozcieńczalnik próbek i koniugatu: Bufor TRIS-NaCl
(pH 7.7 ± 0.15), albumina bydlęca, 0.1% Tween® 20,
czerwień fenolowa
2 fiolki
80 ml
Konserwant: < 0.01% thimerosal.
R8
Bufor do substratu: Roztwór kwasu cytrynowego i
Bufor do
substratu TMB octanu sodu (pH 4.0), zawierający 0.015% H2O2 i 4%
DMSO
R9
R10
Chromogen:
Chromogen:
Roztwór TMB
Roztwór zawierający czterometylobenzydynę (TMB)
Roztwór
zatrzymujący
Roztwór zatrzymujący: 1 N kwas siarkowy
1 fiolka
60 ml
1 fiolka
5 ml
1 fiolka
28 ml
Folia adhezyjna
4 szt.
5 - ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA
Środki ostrożności
Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki
Laboratoryjnej:
•
Nie używać odczynników po upływie terminu przydatności.
•
Podczas jednego oznaczenia używać wyłącznie odczynników o tym samym numerze
serii.
Uwaga: Podczas danego oznaczenia można wymiennie używać następujących
odczynników, lecz w jednym teście powinny być one z tej samej serii: roztwór płuczący (R2,
oznaczony 10x na niebiesko), bufor do substratu (R8, oznaczony TMB buf. na niebiesko),
chromogen (R9, oznaczony TMB sol. na zielono) oraz roztwór zatrzymujący (R10,
oznaczony 1N na czerwono). Odczynników tych można używać również w innych testach
Bio-Rad; informacji udzieli serwis techniczny.
•
Przed użyciem przenieść odczynniki w celu stabilizacji na 30 minut do temp.
pokojowej.
•
Unikać zanieczyszczenia podczas rekonstytucji odczynników.
•
Nie wykonywać testu w obecności kurzu ani reaktywnych par związków zasadowych,
kwasów i aldehydów, które mogą wpływać na aktywność enzymatyczną koniugatu.
•
Używać szkła dokładnie umytego i przepłukanego wodą destylowaną lub, co jest
wskazane, materiałów jednorazowych.
•
Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki pomiędzy etapem płukania a dodawaniem
kolejnego odczynnika.
•
Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na działanie metali i jonów metali.
Należy unikać kontaktu elementów metalowych z roztworami zawierającymi koniugat
lub substrat.
•
Roztwór substratu (bufor do substratu + chromogen) powinien być bezbarwny.
Wystąpienie niebieskiej barwy kilka minut po rekonstytucji świadczy o nie
przydatności roztworu do użycia. Roztwór należy przygotowywać w jednorazowym
plastikowym pojemniku przy pomocy jednorazowych pipet lub końcówek lub używając
5
szkła płukanego 1N kwasem solnym, wodą destylowaną i wysuszonego. Roztwór
należy przechowywać w ciemności.
•
Do każdej badanej próbki zmieniać końcówkę pipety.
•
Płukanie studzienek jest istotnym etapem oznaczenia; należy przestrzegać
przewidzianych cykli płukania oraz zwracać uwagę, czy studzienki są prawidłowo
napełniane i całkowicie opróżniane. Nieprawidłowe płukanie jest przyczyną
fałszywych wyników.
•
Nigdy nie używać tego samego pojemnika na koniugat i roztwór substratu.
•
Sprawdzać, czy pipety i sprzęt są prawidłowo nastawione oraz, czy aparatura
prawidłowo pracuje.
•
Nie zmieniać opisanej procedury.
Higiena i bezpieczeństwo pracy
Wszystkie odczynniki są przeznaczone wyłącznie do diagnostyki in vitro.
•
Podczas pracy z odczynnikami należy używać rękawiczek jednorazowych.
•
Nie pipetować ustami.
•
Ludzkie surowice używane do przygotowania odczynników były ujemne pod
względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs Ag), przeciwciał
przeciwko wirusowi hepatitis C (anty-HCV) oraz przeciwciał anty-HIV 1 i anty-HIV 2.
Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych,
odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego powinny być traktowane jako materiał
potencjalnie zakaźny.
•
Materiały mające kontakt z próbkami lub odczynnikami pochodzenia ludzkiego, w tym
także zużyty roztwór płuczący, należy traktować jako skażone i dekontaminować
przed wyrzuceniem.
•
Unikać rozlania próbek i odczynników je zawierających.
•
Rozlany odczynnik należy zmyć 10% roztworem podchlorynu. W przypadku rozlania
kwasu należy go najpierw zneutralizować dwuwęglanem sodu, potem zmyć
powierzchnię roztworem podchlorynu i wysuszyć bibułą. Materiał używany do
czyszczenia wyrzucić do pojemnika na zanieczyszczone odpady.
•
Próbki, materiały i produkty zanieczyszczone
dekontaminować przed wyrzuceniem.
materiałem
biologicznym
-
przez moczenie w podchlorynie sodu o stężeniu końcowym 5% przez 30
minut,
-
lub autoklawowanie w temp. 121°C przez co najmniej 2 godziny
Autoklawowanie przez co najmniej godzinę w temp. 121°C jest najlepszą metodą
inaktywacji wirusów HIV i wirusów zapalenia wątroby.
UWAGA: NIE AUTOKLAWOWAĆ ROZTWORÓW ZAWIERAJĄCYCH PODCHLORYN
SODU.
•
UWAGA: Niektóre odczynniki zawierają:
*ProClin™ 300 < 0.5%: PRODUKT DRAŻNIĄCY
R43
Substancja drażniąca dla skóry.
S28/37 W przypadku kontaktu ze skórą, szybko przemyć dużą ilością
wody z mydłem. Pracować w odpowiednich rękawiczkach
6
Xi - drażniący
•
Ze związkami chemicznymi należy postępować zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki
Laboratoryjnej.
•
Unikać kontaktu skóry i błon śluzowych z buforem do substratu, chromogenem i
roztworem zatrzymującym, ze względu na możliwość zatrucia, podrażnienia lub
poparzenia.
Karta charakterystyki substancji jest dostępna na życzenie.
6 - INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY I SPRZĘT
•
Worteks
•
Czytnik mikropłytek z filtrami 450 i 620 nm (*)
•
Łaźnia wodna lub inkubator mikropłytek nastawiony na 37° ± 1°C (*)
•
Pojemnik na materiał zakaźny i zanieczyszczone odpady
•
Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu
•
Jałowa woda destylowana lub dejonizowana
•
Cylindry miarowe na 25 ml, 50 ml, 100 ml i 1000 ml
•
Rękawiczki lateksowe jednorazowe
•
Okulary ochronne
•
Bibuła
•
Pipety lub multipipety automatyczne lub półautomatyczne, regulowane lub o stałej
pojemności, pobierające od 10 µl do 1000 µl, oraz 1, 2 i 10 ml.
•
Płuczka mikropłytek: manualna, półautomatyczna lub automatyczna (*)
•
Próbówki jednorazowe
(*) Dział Techniczny firmy udziela informacji na temat zalecanych aparatów
7 - PRZYGOTOWANIE I PRZECHOWYWANIE ODCZYNNIKÓW
Zestaw należy przechowywać w temp. +2-8°C zgodnie z datą ważności, podaną na
opakowaniu.
Uwaga: Odczynniki są gotowe do użycia po osiągnięciu temp. pokojowej (+18-30°C).
1) Odczynniki gotowe do użycia
•
Odczynnik 1 (R1): Mikropłytka
Każda płytka zawierająca 12 pasków jest zapakowana oddzielnie w foliową torebkę.
Należy ją przeciąć na wysokości 0.5 – 1 cm ponad linią i wyjąć potrzebną liczbę
pasków. Pozostałe paski szczelnie zamknąć i przechowywać w temp. +2-8°C. Po
otwarciu oryginalnego opakowania studzienki mikropłytek zachowują zdolność
reakcyjną przez 1 miesiąc w temp. +2-8°C, przechowywane w szczelnie zamkniętej
torebce.
•
Odczynnik 3 (R3), Odczynnik 4a (R4a), Odczynnik 4b (R4b), Odczynnik 4c (R4c),
Odczynnik 10 (R10): Odczynniki przechowywane w temp. +2-8°C są trwałe, również
po otwarciu, zgodnie z datą ważności.
7
2) Odczynniki do rekonstytucji
•
Odczynnik 2 (R2): Roztwór płuczący 10x stężony
Rozcieńczyć wodą destylowaną 1:10, wymieszać. Do manualnego płukania 12
pasków potrzeba 350 ml rozcieńczonego roztworu płuczącego (R2d). Rozcieńczony
roztwór do płukania można przechowywać 2 tygodnie w temp. +2-8°C. Roztwór
stężony można przechowywać w temp. +2-25°C.
•
Roztwór koniugatu: odczynnik 6 (R6) + odczynnik 7 (R7)
Aby otrzymać roboczy roztwór koniugatu (R6d) na jedną mikropłytkę, należy
rozcieńczyć 0.5 ml koniugatu stężonego 50x w 25 ml rozcieńczalnika (R7). Dobrze
wymieszać. Otrzymaną objętość podzielić przez 10, aby otrzymać ilość koniugatu
roboczego (R6d) potrzebną na 1 pasek zawierający 8 studzienek. Rozcieńczony
koniugat należy zużyć w czasie 60 minut od przygotowania.
•
Roztwór substratu: odczynnik 8 (R8) + odczynnik 9 (R9)
Rozcieńczyć chromogen (R9) w stosunku 1:11 w buforze do substratu (R8) (np. 1 ml
R9 + 10 ml R8). Odczynnik jest stabilny przez 6 godzin w temp. pokojowej (+1830°C), w ciemności.
8 – POBIERANIE, OPRACOWYWANIE I PRZECHOWYWANIE MATERIAŁU
DO BADAŃ
1. Zalecanym rodzajem próbek jest surowica lub osocze, pobrane na antykoagulant
(EDTA, cytrynian, heparyna).
2. Postępowanie z próbkami:
•
Próbki krwi należy pobrać zgodnie z rutynową procedurą, z wkłucia dożylnego.
•
Próbki krwi przed odwirowaniem pozostawić do powstania skrzepu.
•
Próbówki z próbkami przez cały czas powinny być zamknięte.
•
Po odwirowaniu oddzielić surowicę lub osocze od skrzepu i przenieść do
szczelnie zamykanej próbówki.
•
Jeśli test będzie wykonany w ciągu 7 dni, próbki można przechować w temp. +28°C.
•
Jeśli test będzie wykonany później lub próbki będą transportowane, należy je
zamrozić w temp. -20°C lub niższej.
•
Unikać częstego rozmrażania i ponownego zamrażania próbek. Próbki można
zamrozić i rozmrozić najwyżej 3 razy.
•
Po rozmrożeniu próbki należy dokładnie wymieszać przed oznaczeniem.
3. Na oznaczenie nie wywiera wpływu obecność w surowicy 90 g/l albuminy, 100 mg/l
bilirubiny, poziom lipemii odpowiadający 36 g/l trójglicerydów, ani hemoliza
wynosząca do 10 g/l hemoglobiny.
4. Nie ogrzewać próbek.
9 - PROCEDURA
Należy postępować dokładnie wg opisanej procedury.
Do każdej serii oznaczeń włączyć surowice kalibracyjne, co zapewni walidację testu.
8
Przestrzegać zasad Dobrej praktyki Laboratoryjnej.
1. Zanotować rozkład nanoszenia próbek i kalibratorów.
2. Przygotować rozcieńczony roztwór płuczący (R2d) (patrz rozdział 7).
3. Wyjąć potrzebną liczbę pasków (R1), pozostałe zamknąć ponownie w oryginalnym
opakowaniu.
4. Przepłukać jeden raz mikropłytkę rozcieńczonym roztworem (R2d). Osuszyć
odwróconą mikropłytkę na bibule.
5. Rozcieńczyć badane próbki oraz kalibratory 0, 6, 60, 240 (R3, R4a, R4b i R4c) w
stosunku 1:101, dodając 10 µl próbki lub kalibratora do 1 ml rozcieńczalnika (R7). Po
rozcieńczeniu wymieszać próbki na worteksie.
6. Podczas manualnego wykonania testu, nanieść do studzienek po 200 µl
rozcieńczonych kalibratorów oraz rozcieńczonych badanych próbek w następujący
sposób:
Studzienka 1A:
Studzienka 1B:
200 µl kalibratora 0 IU/ml (R3) w rozcieńczeniu 1/101
200 µl kalibratora 6 IU/ml (R4a) w rozcieńczeniu 1/101
Studzienka 1C:
200 µl kalibratora 60 IU/ml (R4b) w rozcieńczeniu 1/101
Studzienka 1D:
200 µl kalibratora 240 IU/ml (R4c) w rozcieńczeniu 1/101
Studzienka 1E, 1F, 1G, itd.: 200 µl próbki w rozcieńczeniu 1/101
7. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną. Inkubować w łaźni wodnej z
termostatem lub w inkubatorze mikropłytek przez 1 godzinę ± 5 minut w temp. 37 °C
± 1°C.
8. Przygotować roboczy roztwór koniugatu (R6d) na 15 minut przed końcem pierwszej
inkubacji. Na 1 mikropłytkę należy rozcieńczyć 0.5 ml koniugatu stężonego 50x (R6)
w 25 ml rozcieńczalnika (R7). Dobrze wymieszać. (patrz rozdział 7).
9. Zdjąć folię adhezyjną. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika z
podchlorynem sodu). Wykonać 3 cykle płukania roboczym buforem płuczącym (R2d) i
osuszyć mikropłytkę na bibule.
10. Natychmiast do wszystkich studzienek nanieść po 200 µl roboczego roztworu
koniugatu (R6d). Roztwór wstrząsnąć delikatnie przed użyciem.
11. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną. Inkubować w łaźni wodnej z
termostatem lub w inkubatorze mikropłytek przez 1 godzinę ± 5 minut w temp. 37 °C
± 1°C.
12. Zdjąć folię. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika z podchlorynem sodu).
Wykonać 4 cykle płukania jak powyżej i osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule.
13. Natychmiast i szybko nanieść do wszystkich studzienek po 200 µl wymieszanego
roztworu substratu (R8 + R9). Pozostawić reakcję w ciemności na 30 ± 5 minut w
temp. pokojowej (18-30°C). Nie zakrywać folią adhezyjną.
14. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do każdej studzienki 100 µl roztworu
R10, w tej samej kolejności, w której dodawany był roztwór substratu.
15. Wytrzeć spód mikropłytki i w ciągu 30 minut od zatrzymania reakcji zmierzyć gęstość
optyczną każdej studzienki w czytniku mikropłytek, przy długości fali 450/620 nm.
Przed odczytem chronić płytkę od światła.
16. Przed opisem wyników sprawdzić zgodność kolejności odczytu z ustalonym na
początku
rozkładem
studzienek
oraz
zgodność
pomiędzy
odczytem
spektrofotometrycznym a wizualnym.
9
10 - OBLICZENIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW
1) Kalibracja
Występowanie i poziom przeciwciał IgG przeciwko T.gondii w badanej próbce określa
porównanie gęstości optycznej (OD) próbki z wartością OD standardów. Zawarte w
zestawie surowice kalibracyjne o stężeniach przeciwciał 6, 60, 240 UI/ml, zostały
wykalibrowane wg Standardu WHO (TOX M 185). Obserwowane pewne rozbieżności
wartości uzyskiwanych dla danej surowicy oznaczanej różnymi testami, wynikają z różnych
proporcji rozpuszczalnych antygenów błonowych T.gondii, zastosowanych w
poszczególnych testach.
2) Kontrola jakości
Podczas każdego oznaczenia należy włączyć wszystkie surowice kalibracyjne. Aby wyniki
testu były ważne, muszą być spełnione odpowiednie kryteria:
•
•
Wartości gęstości optycznej:
-
OD R3 ≤ 0.200
-
OD R4c ≥ 1.000
Współczynnik: OD R4a / OD R3 ≥ 2
Jeśli nie spełnione są kryteria kontroli jakości, test należy powtórzyć.
3) Krzywa wzorcowa
a) Wykreślenie krzywej wzorcowej
W metodzie manualnej, na papierze w linie należy zaznaczyć wartości OD uzyskane dla
kalibratorów (R3, R4a, R4b i R4c) na osi pionowej (y). Na osi poziomej (x) odłożyć
odpowiadające tym wartościom stężenia przeciwciał, podane w IU/ml. Przeprowadzić
krzywą przez 4 punkty.
b) Obliczenie stężenia przeciwciał w IU/ml
Jeśli odczytana wartość OD badanej próbki mieści się między wartościami OD R4a i OD
R4c, należy znaleźć odpowiadający jej punkt na osi y, i przeprowadzić od niego poziomą
linię w kierunku krzywej. Od punktu przecięcia z krzywą, wykreślić pionową linię w kierunku
osi x. Na osi x zostanie w ten sposób zaznaczony punkt, odpowiadający stężeniu
przeciwciał w UI/ml w badanej próbce.
UWAGA: Jeśli wartość OD próbki rozcieńczonej 1:101 jest wyższa niż OD R4c, należy
próbkę oznaczyć ponownie po rozcieńczeniu 1:1010 w R7. Obliczoną wartość poziomu
przeciwciał należy wtedy pomnożyć przez 10 – czynnik rozcieńczenia.
4) Interpretacja wyników
Wykrycie przeciwciał IgG przeciwko T.gondii w teście Platelia™ Toxo IgG TMB pozwala
określić status immunologiczny pacjenta.
•
Miano < 6 IU/ml
Nie znamienny poziom przeciwciał = brak odporności.
•
6 IU/ml ≤ miano ≤ 9 IU/ml
Nie znamienny poziom przeciwciał w tej metodzie = badanie pojedynczej próbki nie
pozwala na określenie statusu immunologicznego. Wg aktualnych zaleceń francuskich,
należy oznaczyć kolejną próbkę dwiema metodami.
10
•
9 IU/ml < miano ≤ 240 IU/ml
Poziom przeciwciał znamienny = długotrwała odporność lub wczesny etap serokonwersji.
•
Miano > 240 IU/ml
Wysoki poziom przeciwciał = niedawna serokonwersja lub przetrwały wysoki poziom
odporności, obserwowany u niektórych osób.
•
Ograniczenia metody
Diagnozę niedawnego zakażenia pierwotniakiem można postawić dopiero po połączeniu
danych klinicznych i wyników testu serologicznego.
Wynik uzyskany dla jednej próbki nie wystarcza do potwierdzenia niedawnego zakażenia.
Dopiero znamienny wzrost poziomu przeciwciał IgG anty-T.gondii w dwóch próbkach
pobranych w odstępie co najmniej trzech tygodni, oznaczanych jednocześnie, pozwala
diagnozować świeże zakażenie, powinien jednak być interpretowany jako świadectwo
niedawno nabytego zakażenia. W przypadku osób podejrzanych o zakażenie T.gondii,
można również oznaczyć przeciwciała w klasie IgM, które pojawiają się wcześniej niż
przeciwciała IgG.
5) Najczęstsze problemy
Wyniki nieważne lub nie interpretowalne najczęściej są spowodowane przez:
•
Nie odpowiednie płukanie mikropłytki.
•
Zanieczyszczenie próbek ujemnych próbką o wysokim poziomie przeciwciał.
•
Zanieczyszczenie roztworu substratu czynnikiem utleniającym (wybielacz, jony
metali).
•
Zanieczyszczenie roztworu zatrzymującego reakcję.
6) Przykład obliczenia
Uwaga: Podane wartości służą jako przykład i nie należy podstawiać ich w miejsce
uzyskanych wyników.
•
Wyniki
Studzienka
R3 (ujemna)
R4a
R4b
R4c
Próbka 1 (rozcieńczenie 1:101)
Próbka 2 (rozcieńczenie 1:101)
Próbka 3 (rozcieńczenie 1:101)
Próbka 4 (rozcieńczenie 1:101)
Próbka 5 (rozcieńczenie 1:101)
OD (450/620 nm)
0.121
0.615
1.466
2.099
0.108
0.675
0.808
2.080
1.283
Poziom przeciwciał (IU/ml)
0
6
60
240
Ujemna
7 IU/ml
12 IU/ml
231 IU/ml
43 IU/ml
*Dla rozcieńczenia 1/1010, końcowe stężenie = IU/ml x 10
•
Walidacja testu
- Wartości gęstości optycznej
- Współczynnik
. OD R3 ≤ 0.200
. OD R4a / OD R3 ≥ 2
. OD R4c ≥ 1.000
11
11 - CHARAKTERYSTYKA I OGRANICZENIA TESTU
Ocenę właściwości testu prowadzono oznaczając próbki pobrane do suchych próbówek,
do próbówek z separatorem surowicy, próbówek zawierających aktywator skrzepu lub
próbówek z różnymi antykoagulantami (EDTA, heparyna, cytrynian).
1. Właściwości testu
Przedstawione poniżej dane uzyskano, badając świeże próbki surowicy, pobrane od kobiet
w ciąży, pacjentów z immunosupresją oraz zdrowych dawców krwi, a także oznaczając
zamrożone próbki surowicy, uprzednio oznaczone jako dodatnie lub ujemne.
•
Badania porównawcze
W teście Platelia™ Toxo IgG TMB i w innym, komercyjnym teście EIA oznaczono
równolegle ogółem 787 próbek, pochodzących od losowo wybranych kobiet w ciąży. Do
wyjaśnienia niezgodności stosowano metodę bezpośredniej aglutynacji. Podczas obliczeń
do określenia względnej swoistości, czułości i zgodności testu pominięto wyniki wątpliwe,
uzyskane dla 23 próbek.
Wynik
Ujemny
Dodatni
Ogółem
Inny test EIA
Platelia™ Toxo IgG TMB
Ujemny
488
5
493
Ogółem
488
276
764
Wyniki badań (ośrodek 1)
488 / 488
100%
(99.0% - 100 %)
271 / 276
98.2%
(95.6% - 99.3%)
759 / 764
99.3%
(98.8% - 99.9%)
Względna swoistość
Względna czułość
Względna zgodność
•
Dodatni
0
271
271
Swoistość
Swoistość testu Platelia™ Toxo IgG TMB badano w 2 niezależnych ośrodkach. Testowano
surowice uprzednio oznaczone komercyjnymi testami w technice EIA. Do wyjaśnienia
niezgodności stosowano metodę bezpośredniej aglutynacji. Podczas obliczeń do
określenia swoistości testu nie uwzględniono wyników wątpliwych.
- ośrodek 1: 99.8%
(403 / 404)
- ośrodek 2: 100%
(488 / 488)
ogółem:
•
99.9%
(891 / 892)
Czułość
Czułość testu Platelia™ Toxo IgG TMB badano w 2 niezależnych ośrodkach. Używano
surowice uprzednio oznaczone komercyjnymi testami w technice EIA. Do wyjaśnienia
niezgodności stosowano metodę bezpośredniej aglutynacji. Podczas obliczeń do
określenia czułości testu nie uwzględniono wyników wątpliwych.
12
- ośrodek 1: 100%
(196 / 196)
- ośrodek 2: 98.2%
(271 / 276)
ogółem:
98.9%
W teście Platelia
oraz panele:
™
(467 / 472)
Toxo IgG TMB oznaczano także panele serokonwersji (ośrodek 1 i 2)
•
84 próbki surowicy od 33 kobiet w ciąży (ośrodek 1)
•
48 próbek surowicy od 14 kobiet w ciąży (ośrodek 2)
uprzednio oznaczone w innym komercyjnym teście EIA. Do wyjaśnienia niezgodności
stosowano metodę bezpośredniej aglutynacji.
W ośrodku 1, w teście Platelia™ Toxo IgG TMB dla 5 próbek uzyskano wynik dodatni
wcześniej, niż stosując inny test EIA. W ośrodku 2, w 6 przypadkach uzyskano wcześniej
wyniki dodatnie za pomocą testu EIA, innego niż używany w ośrodku 1, w porównaniu z
testem Platelia™ Toxo IgG TMB.
•
Częstość występowania
Występowanie w populacji przeciwciał IgG przeciwko T.gondii może różnić się
ekstremalnie w zależności od kraju. We Francji, w okolicach Paryża wyniki dodatnie
uzyskano dla 67.6% zdrowych dawców krwi:
2. Precyzja
•
Powtarzalność wewnątrz-testowa
4 próbki (1 ujemna i 3 dodatnie) oznaczano 30 razy w tym samym teście:
13
Próbki
Próbka ujemna Próbka dodatnia Próbka dodatnia Próbka dodatnia
1
2
3
Miano IU/ml
Średnia
0.25
11
38
110
Odchylenie
Standardowe
0.02
0.83
1.35
9.53
Współczynnik
Zmienności
6.29
7.57
3.55
8.64
•
Powtarzalność pomiędzy-testowa
1 ujemną i 3 dodatnie próbki oznaczało dwóch techników w triplikacie przez 5 dni:
Próbki
Próbka ujemna
Próbka dodatnia Próbka dodatnia Próbka dodatnia
1
2
3
Miano IU/ml
Średnia
0.22
11.8
39.2
127.5
Odchylenie
Standardowe
0.08
1.65
5.14
14.13
Współczynnik
Zmienności
34.11
13.90
13.10
11.08
3. Reakcje krzyżowe
Oznaczano 141 próbek, dodatnich po względem markerów mogących dawać potencjalne
reakcje krzyżowe. Swoistość oceniono na 99.2% (140/141).
Dodatni marker dla:
Reaktywność
CMV IgG
5
1
CMV IgM
5
0
VZV IgM
10
0
VZV IgG
9
0
Świnka IgG
7
0
Świnka IgM
3
0
Różyczka IgG
7
0
Różyczka IgM
7
0
EBV IgG
8
0
EBV IgM
9
0
Uwagi
Ujemna
powtórzeniu
po
14
Różyczka IgG
5
0
Różyczka IgM
5
0
HSV IgG
5
0
HSV IgM
5
0
HIV
15
0
Szpiczak
8
0
RF
15
0
ANA
10
0
HAMA
3
0
Ogółem
141
1
12 – LITERATURA
1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. :The diagnosis of toxoplasmosis. Southern
Med. J. 1975; 68, 1433-1443
2. BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the HEMOCO
and SEROCO Study Groups : Incidence and risk factors of toxoplasmosis in a cohort
of Human immunodeficiency virus-infected patients (1988-1995). Clinical Infectious
Diseases 1999; 28, 575-581
3. BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. : Evaluation of some of the parameters of the
enzyme-linked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279-S285
4. DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT C.,
VALENTI D. and COX L. : Prenatal management of 746 pregnancies at risk for
congenital toxoplasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 318, 271-275
5. DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L’AULNOIS D.,
VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C.,
DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of
congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, 310-315
6. DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G.,
ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L., SALAMON R.
and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group Predictive value of Toxoplasma gondii
antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIV-infected
patients.AIDS 1996; 10, 1521-1527
7. DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and COLIN J. :
Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des méthodes simples, pour des questions
précises. Le concours médical 1985; 107-03, 227-234
8. DUBEY J.P. and BEATTIE C.P. : Toxoplasmosis of animal and man. CRC Press
(1988)
9. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A.,
ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in 35 940 pregnant
women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol.
1998; 36, 2900-2906
10. JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins
G, M, and A following Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and
pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2907-2913
15
11. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. : Improved Diagnosis
of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of antiToxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol. 1997 ; 35, 1972-1977
12. LAPPALAINEN M., KOSKELA P., KOSKINIEMI M., AMMALA P., HILESMAA V.,
TERAMO K., RAIVIO K.O., REMINGTON J.S., HEDMAN K.: Toxoplasmosis acquired
during pregnancy: improved serodiagnosis based on avidity of IgG. J. Infect. Dis.
1993; 41, 155-158
13. LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of
toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, 2 155-158
14. LEBECH M., JOYNSON D.H.M., SEITZ H.M. THULLIEZ P., GILBERT R.E., DUTTON
G.N., OVLISEN B. and PETERSEN E., : Classification system and case definition of
Toxoplasma gondii infection in immunocompetent pregnant women and their
congenitally infected offspring. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 799-805
15. LUFT B.J. and REMINGTON J.S. : Toxoplasmic encephalitis. Clinical Infectious
Diseases 1992; 15, 211- 222
16. NAESSENS A., HEUNINCKX W., FOULON W. and LAUWERS S. : Evaluation of
seven commercially available enzyme immunoassays for immunoglobulin G and M
antibody detection of Toxoplasma gondii. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 258-262
17. PETITHORY J.C., REITER-OWONA I., BERTHELOT F., MILGRAM M., DE LOYE J.
and PETERSEN E. : Performance of European laboratories testing serum samples
for Toxoplasma gondii. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 45-49
18. REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the
fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co.,
Philadelphia 1976; 191-332
19. SABIN A.B., and FELDMAN H.A. : Dyes as microchemical indicators of a new
immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma), Science 1948;
108: 660 - 663
20. SANTORO F., AFCHAIN D., PIERCE J.R., CESBRON J.Y., OVLAQUE G. and
CAPRON A. : Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified parasite protein
P30. Clin. Exp. Immunol. 1885; 62, 262-269
21. SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and REMINGTON J.S. :
Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognized by human
IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131: 977-983
22. SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ
B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or
reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by
ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 63-69
23. SULZER A.J. and HALL EC. : Indirect fluorescent antibody tests for parasitic
diseases : IV Statistical study of variation in the indirect fluorescent antibody (IFA) test
for toxoplasmosis. Amer. J. Epidemiol. 1967; 86: 401-407
24. WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and
the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six
commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma
gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, 3112-3115
25. WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7,
299-316
16
STRESZCZENIE PROCEDURY WYKONANIA TESTU
1. Ustaw inkubator na 37 ± 10C.
2. Rozcieńcz chromogen R9 1:11 w buforze do substratu R8 (roztwór do reakcji
enzymatycznej).
3. Rozcieńcz wodą destylowaną 1:10 roztwór płuczący R2 10x (R2d).
4. Przepłucz jeden raz paski rozcieńczonym roztworem płuczącym (R2d).
5. Rozcieńcz badane próbki oraz kontrole w R7 stosunku 1:101.
6. Nanieść 200 µl rozcieńczonych kontroli i badanych próbek w sugerowany sposób:
1
2
A R3
S5
B R4a
S6
C R4a
S7
D R4b
S8
E S1
S9
F S2
S10
G S3
S11
H S4
S12
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
7. Inkubacja przez godzinę w temp. 37 °C ± 1°C.
8. Przygotuj roztwór roboczy koniugatu (R6b + R6a).
9. Zaaspirować zawartość studzienek i przepłukać 3 razy roztworem do płukania
(R2d).
10. Do wszystkich studzienek nanieść po 200 µl roboczego roztworu koniugatu.
11. Inkubacja przez godzinę w temp. 37 °C ± 1°C.
12. Zaaspirować zawartość studzienek i przepłukać 4 razy roztworem do płukania
(R2d).
13. Do wszystkich studzienek nanieść po 200 µl roztworu do reakcji enzymatycznej (R8
+ R9).
14. Inkubacja w ciemności, przez 30 minut, w temperaturze pokojowej (+18 - 30 °C ).
15. Dodać do każdej studzienki po 100 µl roztworu zatrzymującego reakcję (R10).
16. Zmierzyć absorbancję w czytniku mikropłytek, przy długości fali 450/620 nm.
17
• CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)
• Znak CE (Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady nr 98/79/CE o wyrobach diagnozy medycznej in vitro)
•
•
For in vitro diagnostic use
Wyrób do diagnostyki in vitro
•
•
Catalogue number
Numer katalogowy
•
•
Manufacturer
Wytwórca
•
•
Authorised Representative
Autoryzowany przedstawiciel
•
•
Batch code
Kod partii
•
•
Expiry date YYYY/MM/DD
Użyć przed RRRR/MM/DD
•
•
Storage temperature limitation
Przestrzegać zakresu temperatur
•
•
Consult Instruction for use
Sprawdź w instrukcji obsługi
Bio-Rad
3, Bd Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette – France
Tél. : 33 (0) 1 47 95 60 00
Fax.: 33 (0) 1 47 41 91 33
18
0459
05/2006
nr 881002