TOMASZ ZĄBEK Amplifikacja i analiza sekwencji DNA gatunku

ROCZNIKI NAUKOWE ZOOTECHNIKI
Monografie i Rozprawy
TOMASZ ZĄBEK
Amplifikacja i analiza sekwencji DNA
gatunku Equus caballus,
homologicznych u innych gatunków
ssaków
Amplification and analysis of Equus caballus
DNA sequences, the homologues of other
mammalian species
INSTYTUT ZOOTECHNIKI PAŃSTWOWY INSTYTUT BADAWCZY
KRAKÓW 2010
SPIS TREŚCI
...................................................................................................
1. WPROWADZENIE
1.1. Wykorzystanie konserwatyzmu sekwencji DNA w identyfikacji genów
u różnych gatunków ssaków
...........................................................................
1.2. Bazy danych sekwencji genomów ssaków
.......................................................
1.3. Analiza homologii i metody identyfikacji regionów kodujących
w sekwencjach DNA .............................................................................................
1.4. Identyfikacja konserwatywnych regionów DNA różnych gatunków
z wykorzystaniem molekularnych metod mapowania porównawczego ..........
1.5. Porównawcze mapy genomu Equus caballus
................................................
........................................
1.6. Badania nad poznaniem sekwencji genomu konia
1.7. Identyfikacja regionów kodujących w genomie E. caballus z wykorzystaniem
sekwencji RNA .....................................................................................................
5
11
2. CEL I TEMATYKA ROZPRAWY HABILITACYJNEJ
...................................
12
3. MATERIAŁ I METODY ..........................................................................................
3.1. Objaśnienia skrótów enzymów i związków chemicznych ..............................
3.2. Materiał badawczy i izolacja genomowego DNA ..........................................
3.3. Wybór genów i sekwencji kodujących ............................................................
3.3.1. Charakterystyka genów kodujących białka czynników transkrypcyjnych
3.3.2. Charakterystyka genów białek sygnalnych ............................................
3.3.3. Geny białek receptorowych .....................................................................
3.3.4. Geny białek wchodzących w skład większych kompleksów białkowych ....
3.3.5. Geny białek strukturalnych ........................................................................
3.3.6. Geny białek enzymatycznych ...................................................................
3.3.7. Geny sprzężone z ludzkim chromosomem Y ...........................................
3.4. Projektowanie starterów do międzygatunkowej amplifikacji PCR .....................
3.5. Warunki reakcji PCR i sekwencjonowania produktów amplifikacji ...................
3.6. Analiza bioinformatyczna ..................................................................................
13
13
13
14
16
17
18
18
19
19
19
20
21
23
4. WYNIKI ......................................................................................................................
4.1. Amplifikacja genomowego DNA konia z użyciem starterów projektowanych
w oparciu o homologiczne sekwencje innych gatunków ssaków .........................
4.2. Analiza regionów kodujących w sekwencji DNA E. caballus ........................
4.2.1. Homologia sekwencji DNA E. caballus, zidentyfikowanych w badaniach
własnych, z sekwencjami DNA innych gatunków ssaków .........................
4.2.2. Wyniki identyfikacji regionów kodujących i charakterystyka sekwencji
białkowych
...............................................................................................
4.2.3. Wyniki analizy BLASTp i PSI-BLAST ..................................................
26
5
6
7
8
9
10
26
64
64
76
83
4.3. Porównawcza analiza wyników badań własnych z danymi z projektu
sekwencjonowania genomu konia ........................................................................
4.3.1. Wyniki analizy homologii sekwencji kodujących E. caballus,
zidentyfikowanych w badaniach własnych, w porównaniu do sekwencji
referencyjnej genomu E. caballus ..............................................................
4.3.2. Wyniki porównania końskich sekwencji DNA, zidentyfikowanych w badaniach własnych, z sekwencją kontigów genomu konia (WGS) i sekwencją genów E. caballus, opracowywanych w bazie ENSEMBL ....................
5. OMÓWIENIE WYNIKÓW ..........................................................................................
5.1. Amplifikacja sekwencji DNA E. caballus z zastosowaniem starterów
specyficznych dla sekwencji DNA innych gatunków ssaków ............................
5.1.1. Efektywność amplifikacji DNA a konserwatyzm regionów hybrydyzacji
starterów .....................................................................................................
5.1.2. Modyfikacje warunków międzygatunkowej reakcji PCR
5.1.3. Amplifikacja sekwencji pseudogenów .......................................................
5.2. Analiza wyników sekwencjonowania produktów amplifikacji końskiego DNA
5.2.1. Homologia sekwencji produktów amplifikacji DNA E. caballus do
sekwencji nukleotydowych (nucleotide BLAST) i sekwencji białkowych
(BLASTx) w NCBI ......................................................................................
5.2.2. Analiza regionów translacji w oparciu o homologię sekwencji DNA
E. caballus do znanych białek (BLASTx) .................................................
5.2.3. Porównanie wyników badań własnych z danymi z projektu
sekwencjonowania genomu konia .............................................................
5.2.3.1. Homologia końskich sekwencji DNA zidentyfikowanych w badaniach własnych do referencyjnej sekwencji genomu E. caballus
5.2.3.2. Homologia sekwencji DNA E. caballus, zidentyfikowanych
w badaniach własnych, z sekwencją kontigów genomu konia
i przewidywanie ich lokalizacji w genomie ..................................
5.2.3.3. Porównanie sekwencji PAX1, TERT i TWIST1 do genomowej
sekwencji E. caballus w bazie ENSEMBL ..................................
6. WNIOSKI
84
84
90
97
97
97
99
99
100
101
102
103
103
104
106
..................................................................................................................
108
7. LITERATURA .............................................................................................................
109
8. STRESZCZENIE ...........................................................................................................
116
9. SUMMARY......................................................................................................................
117