Pobierz wersję PDF

Transkrypt

Pobierz wersję PDF

ISSN 1895 - 4421
EPISTEME
CZASOPISMO NAUKOWO-KULTURALNE
KRAKÓW
Nr 14/2012
EPISTEME
CZASOPISMO NAUKOWO-KULTURALNE
Redakcja:
Zdzisław Szczepanik (red. naczelny)
Katarzyna Daraż-Duda (sekretarz redakcji)
Piotr Walecki
Grzegorz Chajko
Krzysztof Duda
Rada Naukowa:
Prof. dr hab. Dariusz Rott
Prof. dr hab. Włodzimierz Sady
Prof. dr hab. Michał Śliwa
Prof. dr hab. inż. Ryszard Tadeusiewicz
Prof. dr hab. Bogdan Zemanek
Ks. Prof. UPJP II, dr hab. Władysław Zuziak
Prof. nadzw. dr hab. Wiesław Alejziak
Prof. Ignatianum i UJ, dr hab. Józef Bremer SJ
Prof. dr przew. kwal. II Paweł Taranczewski
Prof. dr Olga E. Kosheleva
Prof. dr Aleksandr Lokshin
Prof. dr Hans Jørgen Jensen
Prof. dr Oleksandr Chyrkov
Prof. dr Iryna Diachuk
Prof. dr Luiza Arutinov
Prof. dr hab. Michaił Odesskij
Prof. dr hab., dr. phil. Andrzej Wiercinski
Prof. dr eng. Elena Horska
projekt okładki i skład: Roman Turowski
Wydawca:
Stowarzyszenie Twórców Nauki i Kultury „Episteme”
ul. Okólna 28/87
30-669 Kraków
© Stowarzyszenie Twórców Nauki i Kultury „Episteme” i Autorzy
Szanowni Państwo !
Niezmiernie nam miło przekazać Państwu nowy numer naszego
czasopisma, którego zawartość zapełniają teksty młodych naukowców
z zakresu nauk przyrodniczych. Teksty te mają charakter nowatorski i wnoszą
nową jakość do nauki. Artykuły te przeszły gruntowną recenzję specjalistów
z zakresów do których się odnoszą i uzyskały ich akceptację, co ostatecznie
zadecydowało o ich publikacji.
Gratulując autorom tekstów opublikowanych jednocześnie życzymy
czytelnikom inspiracji z nich wynikających.
Redakcja
SPIS TREŚCI
I. OCHRONA I INŻYNIERIA ŚRODOWISKA
Łukasz Borek, Krzysztof Ostrowski, Tomasz Stachura
SEZONOWA ZMIENNOŚĆ WŁAŚCIWOŚCI FIZYKO-CHEMICZNYCH
WÓD OPADOWYCH I ODPŁYWAJĄCYCH ZE ZLEWNI
PLANOWANEGO ZBIORNIKA MAŁEJ RETENCJI „BISTUSZOWA” . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Marta Czekaj
OPINIE WYBRANYCH PRODUCENTÓW ROLNYCH
DOT. STOSOWANIA NAWOZÓW NIEKONWENCJONALNYCH
(ZE SZCZEGÓLNYM UWZGLĘDNIENIEM POPIOŁU PALENISKOWEGO) . . . . . . . . 25
Leszek Gersztyn, Anna Karczewska
SPECJACJA MIEDZI W OSADACH POFLOTACYJNYCH GÓRNICTWA
MIEDZI WZBOGACONYCH W RÓŻNE DODATKI ORGANICZNE . . . . . . . . . . . . . . 33
Katarzyna Kołodziejczyk, Roman Pieprzka
KSZTAŁTOWANIE SIĘ ZAWARTOŚCI METALI CIĘŻKICH W GLEBACH
WYBRANYCH DWÓCH OBSZARÓW CHRONIONYCH DOLNEGO ŚLĄSKA . . . . . . . . . 41
Małgorzata Koncewicz-Baran, Krzysztof Gondek, Agnieszka Ozimek
ZAWARTOŚĆ NIKLU W ROŚLINACH
PO ZASTOSOWANIU OSADÓW ŚCIEKOWYCH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
Jakub Kośmider, Magdalena Greczuk
POZIOM EDUKACJI PRZYRODNICZO-LEŚNEJ
DOTYCZĄCEJ GROMADY REPTILIA W WOJEWÓDZTWIE MAZOWIECKIM . . . . . . . . 59
Edyta Kruk, Kamila Dedio, Marek Ryczek
OCENA ZAGROŻENIA EROZJĄ WODNĄ ZLEWNI POTOKU SMUGAWKA
W BESKIDZIE MAKOWSKIM Z WYKORZYSTANIEM TECHNIK GIS . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Anna Lehmann, Marta Jabłońska, Magdalena Giemza-Mikoda
WALORY PRZYRODNICZE PARKU PRZYPAŁACOWEGO W WOLSZTYNIE . . . . . . . . . . 77
Małgorzata Leja, Agnieszka Hawryło
WALORYZACJA HYDROMORFOLOGICZNA NA
PRZYKŁADZIE ODCINKA RZEKI WISŁOKI OD MOKRZCA DO PUSTKOWA . . . . . . . . 85
Agnieszka Listosz
BIOMASA NADZIEMNA TRZCINNIKA PIASKOWEGO NA GRUNTACH ZDEGRADOWANYCH PRZY ZAKŁADACH AZOTOWYCH „PUŁAWY”
S.A W KONTEKSCIE WYKORZYSTANIA NA CELE ENERGETYCZNE . . . . . . . . . . . . . . . 93
spis treści
Mateusz Malinowski
UWARUNKOWANIA WYTWARZANIA PALIW
ALTERNATYWNYCH ZE ZMIESZANYCH ODPADÓW KOMUNALNYCH . . . . . . . . . . . 101
Weronika Maślanko, Joanna Sender
STAN EKOLOGICZNY JEZIORA KRASNE W OPARCIU O WSKAŹNIKI
MAKROFITOWE ORAZ ANALIZA STRUKTURY UŻYTKOWANIA JEGO ZLEWNI . . . . 109
Agnieszka Ozimek, Małgorzata Koncewicz-Baran
WPŁYW NAWOŻENIA KOMPOSTAMI Z DODATKIEM ODPADÓW BIODEGRADOWALNYCH NA ZAWARTOŚĆ MANGANU W GLEBIE I ROŚLINACH . . . . . . . . 121
Krzysztof Stasiak, Karolina Piekarska, Ignacy Kitowski
THE BREEDING POPULATION OF MAGPIE PICA PICA IN CHEŁM
(EASTERN POLAND) – A COMPARISON OF SURVEYS OF 1991 AND 2011 . . . . . . . . . . . . 129
Ewelina Szwaj
BIORÓŻNORODNOŚĆ RYJKOWCÓW (CURCULIONOIDEA) KSEROTERMICZNYCH OBSZARÓW LUBELSZCZYZNY . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
Krzysztof Wąs
ANALIZA WARUNKÓW CIEPLNO-WILGOTNOŚCIOWYCH W OKRESIE
LATA W PASYWNYM PREFABRYKOWANYM BUDYNKU SZKIELETOWYM . . . . . . . . 147
II. TECHNOLOGIA ŻYWNOŚCI
Mariusz Adamski, Katarzyna Pisarska
WYSTĘPOWANIE ENDOSYMBIOTYCZNYCH BAKTERII
W KOMÓRKACH BOCZNIAKA (PLEUROTUS (FR.) P. KUMM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155
Iwona Cieślik, Barbara Mickowska, Katarzyna Kluz, Władysław Migdał
PRÓBA ZASTOSOWANIA CHROMATOGRAFII
JONOWYMIENNEJ DO ANALIZY AMIN BIOGENNYCH W MIĘSIE RYB . . . . . . . . . . 161
Anna Dudzińska, Magda Filipczak-Fiutak, Jacek Domagała
WPŁYW PRESURYZACJI NA PRZEŻYWALNOŚĆ MIKROFLORY JOGURTOWEJ . . . . 169
Agnieszka Dylewska
WPŁYW CZASU OGRZEWANIA ROZTWORÓW KONCENTRATU
BIAŁEK SERWATKOWYCH NA NAPIĘCIE POWIERZCHNIOWE I LEPKOŚĆ . . . . . . . 177
6
spis treści
Agnieszka Gębusia, Ewa Cieślik, Anna Kościej, Agnieszka Siembida
OCENA WIEDZY ORAZ POBRANIA KWASU FOLIOWEGO
PRZEZ MIESZKANCÓW WOJEWÓDZTWA MAŁOPOLSKIEGO . . . . . . . . . . . . . . . . . .185
Justyna Górecka
WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNE MODELOWYCH
PRODUKTÓW MIĘSNYCH, WYPRODUKOWANYCH Z WSTĘPNIE
UTRWALONEGO MIĘŚNIA NAJDŁUŻSZEGO GRZBIETU DZIKA . . . . . . . . . . . . . . . . 193
Dorota Kowalewska
WPŁYW KULTURY STARTOWEJ NA PROCESY
LIPOLIZY W SERACH MIĘKKICH Z MLEKA KROWIEGO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
Karolina Królikowska, Sławomir Pietrzyk, Teresa Fortuna
WPŁYW WYBRANYCH SKŁADNIKÓW MINERALNYCH NA WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNE UTLENIONEJ SKROBI KUKURYDZIANEJ . . . . . . . . . 215
Krzysztof Kucharczyk, Monika Cioch
WPŁYW TEMPERATURY FERMENTACJI BRZECZKI
PIWNEJ NA PROFIL WYBRANYCH ZWIĄZKÓW LOTNYCH PIWA . . . . . . . . . . . . . . . 223
Gabriela Kulig, Monika Halik, Anna Ptaszek
WŁAŚCIWOŚCI OSMOTYCZNE WODNYCH
UKŁADÓW PVP- ŻELATYNA RYB MORSKICH-WODA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231
Karolina Malecka, Ryszard Macura, Grzegorz Fiutak, Marek Szeląg
WYKORZYSTANIE KRIOKONCENTRACJI DO
PRODUKCJI PREPARATÓW BARWIĄCYCH Z SOKU BURAKA ĆWIKŁOWEGO PODDANEGO FERMENTACJI MLEKOWEJ I AKOHOLOWEJ . . . . . . . . . . . . . 239
Agnieszka Siembida, Anna Kościej, Lidia Duda, Ewa Cieślik
OSZACOWANIE SPOŻYCIA PRODUKTÓW ZAWIERAJĄCYCH FRUKTANY . . . . . . . 247
Dagmara Stangierska, Monika Świątkowska
WYBRANE DETERMINANTY DECYZJI
PODEJMOWANYCH PRZEZ KONSUMENTÓW NA RYNKU
USŁUG GASTRONOMICZNYCH NA PRZYKŁADZIE McDONALD’S . . . . . . . . . . . . . .255
Agnieszka Staszowska, Anna Litwińczuk, Monika Kędzierska, Piotr Skałecki
ZAWARTOŚĆ MIKRO- I MAKROELEMENTÓW W TKANCE
MIĘŚNIOWEJ WYBRANYCH GATUNKÓW RYB Z MORZA BAŁTYCKIEGO . . . . . . . . 263
Marek Szeląg, Karolina Malecka
WPŁYW PARAMETRÓW TECHNICZNYCH UKŁADU ROBOCZEGO KUTRA
NA OGRANICZENIE PRZYROSTU TEMPERATURY I MIGRACJI ZUŻYTYCH
CZĄSTEK DO ROZDRABNIANEGO SUROWCA PODCZAS KUTROWANIA . . . . . . . 269
7
spis treści
III. BIOLOGIA I BIOTECHNOLOGIA
Łukasz Dyba
ANALIZA SEKWENCJI INTRONÓW GENÓW IPI I CRTISO MARCHWI
CHARAKTERYZUJĄCYCH SIĘ OBECNOŚCIĄ TRANSPOZONÓW TYPU MITE . . . . . 279
Agnieszka Fornal, Anna Radko
OCENA POLIMORFIZMU MARKERÓW
MIKROSATELITARNYCH DNA U KONIKÓW POLSKICH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287
Marta Głogowska, Grzegorz Formicki, Bogdan Kosowski, Robert Stawarz
KUMULACJA RTĘCI W LUDZKICH TKANKACH NOWOTWOROWYCH
ŻOŁĄDKA I JELITA GRUBEGO W ZALEŻNOŚCI OD WIEKU I PŁCI . . . . . . . . . . . . . 293
Beata Horecka
STRUKTURA GENETYCZNA POPULACJI DZIKO
ŻYJĄCEJ LISA POSPOLITEGO (VULPES VULPES) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301
Andrzej Jurkowski, Andrzej Latusek
ANALIZA OBECNOŚCI MARKERA XCFD81-5D U ŻYTA OZIMEGO . . . . . . . . . . . . . . 309
Agata Kapturowska, Wanda Zamojska, Izabela Stolarzewicz, Ewa Białecka-Florjańczyk
SUBSTRATY HYDROFOBOWE W PODŁOŻACH STYMULUJĄCYCH
AKTYWNOŚĆ LIPOLITYCZNĄ DROŻDŻY YARROWIA LIPOLYTICA . . . . . . . . . . . . . 317
Bartosz Kozak
WYBÓR STARTERÓW Z NUKLEOTYDAMI SELEKCYJNYMI DO
ANALIZ AFLP U ŁUBINU WĄSKOLISTNEGO (LUPINUS ANGUSTIFOLIUS L.) . . . . . 325
Iwona Kozikowska, M. Chrobaczyńska-Dyląg, K. Suprewicz, M.Czajkowska
WPŁYW ILOŚCI PORODÓW NA KUMULACJĘ KADMU, MIEDZI I CYNKU
W ŁOŻYSKACH KOBIET ORAZ KRWI PĘPOWINOWEJ NOWORODKÓW. . . . . . . . . 333
Anna Latacz, Paulina Szczurek, Marta Strzetelska, Krystyna Pierzchała-Koziec
UDZIAŁ OPIOIDÓW W MODULOWANIU WPŁYWU RAPAMYCYNY
NA STĘŻENIE BIAŁKA S6K1 SZLAKU MTORC1 W PODWZGÓRZU . . . . . . . . . . . . . . 341
Małgorzata Łukasz, Aleksandra Cetera, Barbara Rusztowicz, Jerzy Świtalski
ODDZIAŁYWANIE WODY ANIONOWEJ
NA TEMPO WZROSTU DROBNOUSTROJÓW .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 349
8
spis treści
Katarzyna Małek, Ilona Czyczyło-Mysza, Izabela Marcińska, Michał Dziurka
MAPOWANIE QTL PLONU
I ZAWARTOŚCI SACHAROZY W STRESIE SUSZY U PSZENICY . . . . . . . . . . . . . . . . . . 357
Rafał Ogórek, Katarzyna Kalinowska, Bartosz Kozak
ZRÓŻNICOWANIE GENETYCZNE IZOLATÓW
CANDIDA ALBICANS ZA POMOCĄ MARKERÓW ITS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .365
Hubert Okła, Jan Słodki, Krzysztof P. Jasik
ZAKAŻENIE KLESZCZY IXODES RICINUS TYPOWYMI PATOGENAMI
NA TERENIE WYBRANYCH SIEDLISK WOJEWÓDZTWA ŚLĄSKIEGO . . . . . . . . . . . . 373
Katarzyna Pisarska, Mariusz Adamski
OCENA WPŁYWU ENDOFITYCZNEGO METHYLOBACTERIUM
EXTORQUENS NA WYBRANE CECHY KUKURYDZY (ZEA MAYS L.) . . . . . . . . . . . . . 381
Jan Słodki, Hubert Okła, Krzysztof P. Jasik
TRANSMISJA WERTYKALNA PIERWOTNIAKA
BABESIA MICROTI U SZCZURÓW . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 389
Katarzyna Stalmach, Małgorzata Borek, Katarzyna Śniegowska
FIZJOLOGICZNE ASPEKTY ODPOWIEDZI ROŚLIN
JĘCZMIENIA JAREGO (HORDEUM VULGARE L.) NA STRES SUSZY . . . . . . . . . . . . . . . 395
Marta Strzetelska, Anna Latacz, Ewa Stypka, Krystyna Pierzchała-Koziec
PROTEKCYJNA ROLA MET-ENKEFALINY W CENTRALNYM
UKŁADZIE NERWOWYM W WARUNKACH HIPOGLIKEMII . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .409
Katarzyna Śniegowska, Katarzyna Stalmach
THE COMPARISON OF HVA1 AND SRG6 GENES EXPRESSION PROFILES
IN SEEDLING AND FLOWERING STAGE IN A SPRING BARLEY (HORDEUM VULGARE L.) CULTIVARS DURING DROUGHT TREATMENT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 417
Katarzyna Wolny-Koładka, Anna Lenart
AEROZOL MIKROBIOLOGICZNY W WYBRANYCH
POMIESZCZENIACH UNIWERSYTETU ROLNICZEGO W KRAKOWIE .. . . . . . . . . . . . 423
Isaura Zaleska, Marta Wawrzyszyn
DYNAMIKA EKSPRESJI GENÓW FOXP3, JAK1,
STAT1 W TRAKCIE ROZWOJU CIA U SZCZURÓW . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 431
9
I. OCHRONA I INŻYNIERIA ŚRODOWISKA
Łukasz Borek
Krzysztof Ostrowski
Tomasz Stachura
EPISTEME
14/2012
s.13-23
ISSN 1895-4421
SEZONOWA ZMIENNOŚĆ WŁAŚCIWOŚCI FIZYKO-CHEMICZNYCH
WÓD OPADOWYCH I ODPŁYWAJĄCYCH ZE ZLEWNI
PLANOWANEGO ZBIORNIKA MAŁEJ RETENCJI „BISTUSZOWA”
SEASONAL CHANGEABILITY OF THE PHYSICO-CHEMICAL
PROPERTIES OF RAINWATER AND RUNOFF FROM THE
CATCHMENT OF THE PLANNED OF SMALL RETENTION
RESERVOIR „BISTUSZOWA”
Abstrakt. Celem analizy było określenie istotności różnic sezonowych stężeń wybranych wskaźników zanieczyszczeń wód opadowych i odpływających ze zlewni potoku
Rygliczanka, na terenie której planowana jest budowa zbiornika małej retencji. Badania wód opadowych przeprowadzono w okresie od V 2007 do XII 2010 r., a wód powierzchniowych od XI 2006 do XII 2010 r. Próbki wody opadowej i powierzchniowej
pobierano systematycznie raz w miesiącu. Badane wskaźniki poddano analizie statystycznej. Istotną różnicę między wartościami stężeń zanieczyszczeń pomiędzy półroczem letnim i zimowym stwierdzono w przypadku kilku na kilkanaście oznaczanych
wskaźników w wodzie opadowej i powierzchniowej. W pozostałych przypadkach
różnice te były statystycznie nieistotne, przy założonym poziomie istotności 0,05.
Ogólna ocena jakości wód odpływających, wykonana w oparciu o Rozporządzenie
Ministra Środowiska z 2008 r. wykazała, że stan jednolitych części wód powierzchniowych jest zły.
Słowa kluczowe: zasoby wodne, mała retencja, wskaźniki jakości wody
Summary. The aim was to determine the significance of seasonal differences in concentrations of examined indicators of pollution rainwater and the runoff from the
catchment Rygliczanka stream, where a small retention reservoir is planned to be
built. The examination of the rainwater was conducted from May 2007 to December
2010, and of the surface water from November 2006 to December 2010. The samples
of rainwater and surface water were collected regularly once a month. The tested
indicators were analyzed statistically. A significant difference between the values of
concentrations of pollutants between summer and winter semester was found in the
case of several indicators in some designated rainwater and surface water. In other
cases the differences were not statistically significant, at the assumed level of significance 0,05. Overall assessment of the quality of the runoff water, made on the basis of
the Minister of Environment’s regulation from 2008 revealed, that the level of surface
waters is bad.
Key words: water resources, small retention, water quality indicators
13
WSTĘP
Obszar województwa małopolskiego ze względu na swoją fizjografię charakteryzuje się dość dużymi opadami atmosferycznymi, osiągającymi roczne
sumy 600-700 mm, a w terenach górskich i podgórskich nawet ponad 1200
mm [Mikulski 1998]. Nie zmienia to jednak faktu, że w latach suchych rejon
ten zmaga się z deficytami wody, szczególnie jeśli chodzi o sektor rolniczy
i zaopatrzenie ludności. Natomiast występowanie krótkich, ale obfitych deszczy, połączonych z burzami na terenach zurbanizowanych o rozbudowanej
infrastrukturze technicznej jest przyczyną wezbrań tzw. „flash floods”, podtopień a nawet powodzi, często tragicznych w swych skutkach. Wskazuje
to na potrzebę odpowiedzialnego i odpowiedniego gospodarowania wodą
w skali lokalnej, w tym szczególnie w małych zlewniach podgórskich, gdzie
zaczynają się formować zasoby wodne, a rzeźba terenu wpływa na szybki
odpływ wód opadowych. Bez takiego podejścia w gospodarowaniu wodą
tracona jest bezproduktywnie duża jej część, co w naszych warunkach klimatycznych nie powinno mieć miejsca.
Jednym z działań wychodzącym naprzeciw tym potrzebom jest „Program
Małej Retencji Województwa Małopolskiego” [Program… 2003/2004].
Głównych celem Programu jest przeciwdziałanie negatywnym skutkom powodzi i suszy, poprzez zwiększanie retencyjności zlewni oraz poprawę stanu
technicznego urządzeń ochrony przeciwpowodziowej.
Woda dociera na powierzchnię Ziemi w postaci opadów deszczu, śniegu lub
gradu. To jakimi charakteryzuje się właściwościami zależy od stanu czystości środowiska naturalnego na danym obszarze, w tym również czystości atmosfery. Wody naturalne cechuje dynamika procesów chemicznych, dlatego
tak ważne jest określenie właściwości, na podstawie których możemy ocenić
ich przydatność do różnych celów [Chełmicki 2002].
Celem artykułu jest analiza sezonowej zmienności właściwości fizyko-chemicznych wód opadowych i odpływających ze zlewni potoku Rygliczanka,
i ich wpływu na stan jednolitej części wód powierzchniowych.
MATERIAŁ I METODY
Teren, na którym planowana jest budowa zbiornika wodnego małej retencji
położony jest w województwie małopolskim w powiecie tarnowskim w granicach miejscowości Bistuszowa, administracyjnie należącej do gminy Ryglice. Zakres badań obejmował pomiary terenowe, prowadzone bezpośrednio
w miejscu projektowanej zapory czołowej zbiornika w kilometrze cieku 0+630
oraz oznaczenia laboratoryjne wybranych wskaźników jakości wody. Zlewnia
ma charakter rolniczo-leśny. Oznaczenia w wodzie opadowej przeprowadzono
w okresie od V 2007 r. do XII 2010 r., a w wodzie powierzchniowej od XI 2006
14
Sezonowa zmienność właściwości fizyko-chemicznych wód...
r. do XII 2010 r. Bezpośrednio w terenie w wodzie opadowej i powierzchniowej mierzono: temperaturę, pH, przewodność elektrolityczną właściwą oraz
zawartość tlenu rozpuszczonego. Fitobentos do określenia wskaźnika okrzemkowego pobierano z podłoża trwale zanurzonego w wodzie – głównie z otoczaków, przy pomocy nożyka [Przewodnik Metodyczny 2010]. W pobranych
próbkach wody oznaczono metodami standardowymi stężenia: wapnia (Ca2+),
magnezu (Mg2+), żelaza (Fe2+/3+), manganu (Mn2+), ołowiu (Pb2+), niklu (Ni2+),
kadmu (Cd2+), chromu (Cr3+/6+), cynku (Zn2+), miedzi (Cu2+), azotu amonowego
(N-NH4+), azotanowego (N-NO3-), azotynowego (N-NO2-), fosforu ogólnego
(Pog.), fosforanów (PO43-), chlorków (Cl-), zawiesiny ogólnej (ZO), substancji
rozpuszczonej (SR), siarczanów (SO42-) oraz BZT5 i CHZTMn [Hermanowicz
i in. 1999].
Wyniki pomiarów terenowych i laboratoryjnych poddano opracowaniu statystycznemu w programie Statistica PL wersja 9. Dla badanych wskaźników
określono miary: położenia i rozproszenia [Stanisz 1998]. W celu sprawdzenia istotności różnic między wartościami badanych wskaźników jakości
wody pomiędzy półroczem letnim (V-X) i zimowym (XI-IV) zastosowano
testy parametryczne i nieparametryczne dla poziomu istotności α = 0,05,
służące odpowiednio do weryfikacji hipotez istotności różnic wartości średnich i charakteru rozkładu. Jakość wody odpływającej ze zlewni oceniono
w oparciu o Rozporządzenie Ministra Środowiska (RMŚ) z 20 sierpnia 2008 r.
w sprawie klasyfikacji stanu jednolitych części wód powierzchniowych [Dz.
U. z 2008 r. Nr 162, poz. 1008].
WYNIKI
W analizie statystycznej wody opadowej uwzględniono 15 (Tab. 1), a w wodzie powierzchniowej 19 wskaźników [Tab. 2].
W wodzie opadowej średnie stężenia ZO, pH, Pog., PO43-, N-NO2-, SR, SO42-,
Ca2+ i Mg2+ osiągnęły większe wartości w półroczach letnich (PL), natomiast
w półroczach zimowych (PZ) odnotowano wyższe średnie wartości stężeń:
N-NH4+, N-NO3-, EC, Cl-, Fe2+/3+ i Mn2+. W wodzie powierzchniowej, w półroczach letnich, wyższymi średnimi wartościami odznaczały się: temperatura, ZO, pH, CHZT-Mn, Pog., PO43-, N-NO2-, EC, SR, SO42-, Ca2+, Mg2+, Fe2+/3+
i Mn2+. W półroczach zimowych notowano natomiast wyższe średnie wartości: tlenu rozpuszczonego, BZT5, N-NH4+, N-NO3- oraz Cl-.
Na podstawie wartości testu Shapiro-Wilka, wykazano, że 3 spośród 15 wskaźników określonych w wodzie opadowej oraz 5 spośród 19 wskaźników wody
powierzchniowej, charakteryzowało się przebiegiem zgodnym z krzywą Gaussa
– rozkładu normalnego (p>0,05), a w pozostałych przypadkach stwierdzono asymetryczność i dekoncentrację wartości wokół wartości średniej.
15
Dość dużym zróżnicowaniem (dyspersją) i rozproszeniem wyników wokół
wartości średniej, zmiennych w wodzie opadowej, charakteryzowały się stężenia: ZO, SR, SO42-, Cl-, Ca2+ i EC. W wodzie odpływającej największym
zróżnicowaniem wartości cechowały się: temperatura, ZO, tlen rozpuszczony, EC, SR, SO42-, Cl-, Ca2+ i Mg2+.
Mn2+ [mg∙dm-3]
Fe2+/3+ [mg∙dm-3]
Mg2+ [mg∙dm-3]
Ca2+ [mg∙dm-3]
Cl- [mg∙dm-3]
SO42- [mg∙dm-3]
SR [mg∙dm-3]
EC 20oC [µS∙cm-1]
N-NO3- [mg∙dm-3]
N-NO2- [mg∙dm-3]
N-NH4+ [mg∙dm-3]
PO43- [mg∙dm-3]
Pog. [mg∙dm-3]
Odczyn [pH]
ZO [mg∙dm-3]
Wskaźnik / Statystyka
W celu sprawdzenia równości średnich w dwóch populacjach, mających
rozkład normalny i jednorodne wariancje skorzystano z testu T-Studenta.
Sformułowano następującą hipotezę zerową (Ho) – średnie z półroczy letnich
i zimowych nie różnią się istotnie (m1 = m2), wobec hipotezy alternatywnej
(H1) – średnie z półroczy letnich i zimowych nie są równe (m1 ≠ m2). W przypadkach braku jednorodności wariancji – określonej testem Fishera-Sendecora, do oceny równości średnich wykorzystano parametryczną alternatywę
testu T-Studenta, tj. test Cochrana-Coxa.
16
0,03
0,04
0,02
0,02
0,00
0,03
0,09
0,01
0,07
0,28
0,06
0,20
0,00
0,07
0,29
0,09
0,21
0,14
0,14
0,10
0,07
0,27
0,16
0,02
1,08
0,66
0,57
0,52
2,65
1,63
0,56
0,31
0,81
0,89
0,41
0,85
2,92
1,71
0,43
0,18
3,71
2,93
2,57
2,47
15,58
3,95
1,93
3,72
25,58
158,17 14,00 22,00 15,85
12,58
6,28
39,40
17,54
19,00 16,00 20,53
36,52
6,04
8,31
69,04
0,42
0,62
0,40
0,60
0,03
0,18
0,24
0,06
0,02
0,01
0,01
0,01
0,00
0,02
0,01
0,00
0,74
0,89
0,75
0,74
0,17
0,42
0,59
0,35
0,32
0,04
0,10
0,03
0,37
0,61
0,04
0,00
0,11
0,01
0,03
0,01
0,04
0,20
0,01
0,00
5,51
4,75
6,20
5,38
0,46
0,68
1,10
1,20
3,60
2,60
2,00
1,55
14,01
3,74
3,41
11,63
PL
PZ
PL
PZ
PL
PZ
PL
PZ
Odch.std
Wariancja
Mediana
Średnia
Podstawowe statystyki opisowe:
0,003
0,180
-
-
-
-
-
-
-
0,002
-
-
-
-
-
-
0,002
0,002
0,458
0,185
-
-
-
0,750
0,003
0,688
0,539
0,002
0,697
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0,040
-
-
T-Studenta
0,219
U
Manna CochranaCoxa
Whitnea
-
-
-
-
-
-
0,003*
0,150
0,195
-
-
-
-
-
-
FisheraSendecora
24
24
24
24
24
24
24
24
24
24
24
24
20
20
20
20
19
20
20
20
20
20
20
20
<0,05
<0,05
<0,05
<0,05
<0,05
<0,05
>0,05
>0,05
>0,05
<0,05
<0,05
<0,05
<0,05
24
24
20
20
PL
PZ
Liczebność
24
Normalność rozkładów – prawdopodobieństwo (p) testu:
19
<0,05
<0,05
ShapiroWilka
PL
0,61
0,07
1,72
2,41
0,79
2,62
0,40
1,00
0,48
1,86
1,89
6,80
0,15
0,23
1,02
7,79
8,65
18,95
26,00 40,00
35,00 23,00
0,86
0,04
2,67
0,19
0,06
3,69
16,10 14,40
PZ
Zakres
PL
PZ
0,73
0,07
1,72
2,41
0,79
7,02
0,27
0,00
0,37
0,00
0,00
4,00
0,40
1,00
0,48
1,86
1,95
7,21
0,15
0,23
1,02
7,79
8,65
0,00
0,00
0,00
0,00
0,06
18,95 0,41
30,00 48,00 4,00
43,00 32,00 8,00
1,13
0,04
3,04
0,19
0,06
7,69
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
8,00
9,00
0,12
0,00
0,00
0,00
0,00
4,40
0,60
PL
Minimum
16,30 15,00 0,20
PZ
Maksimum
Jednorodność wariancji – prawdopodobieństwo (p) testu:
Określenie istotności różnic między wartościami wybranych wskaźników jakości wody z
badanych półroczy testem:
Tab. 1. Analiza statystyczna wody opadowej w zlewni potoku Rygliczanka. * wartości
podkreślone oznaczają, że różnice są statystycznie istotne (p < 0,05) na założonym
poziomie istotności α = 0,05
17
18
2,26
9,32
2,60
0,51
0,10
6,58
0,17
2,00
0,65
1,27
0,03
0,01
10,43
0,65
0,28
45,74
37,84
9,82
1,89
9,03
2,34
0,19
0,06
1,00
7,88
6,71
0,40
3,70
0,00
0,00
0,00
0,00
0,11
361,00
260,00
11,12
6,30
43,41
14,80
0,21
0,00
0,60
7,75
8,52
0,20
0,00
0,01
0,00
0,00
0,00
0,15
374,00
208,00
14,94
7,23
48,96
10,20
0,00
0,00
14,08
40,98
45,67
0,19
0,02
0,005
0,02
0,07
1,88
0,53
1,12
0,14
7,41
3,42
2,90
6,40
0,00
PL
PZ
PL
Odch.std
PZ
Minimum
0,00
0,04
5,47
81,45
3,57
96,53
1431,61
2091,72
0,08
0,42
108,79
0,00
0,00
1,61
0,42
4,02
0,03
43,32
8,39
PZ
0,01
0,26
6,76
86,89
5,11
198,25
1679,24
2085,90
0,04
0,00
0,00
0,00
0,00
3,53
0,28
1,26
0,02
54,88
11,68
PL
Wariancja
0,10
0,45
17,51
63,14
9,17
40,58
315,00
446,50
0,44
0,007
0,00
0,02
0,05
3,60
0,90
11,98
8,13
2,85
4,25
PZ
0,09
0,52
19,32
68,50
9,01
43,05
341,00
477,50
0,34
0,01
0,00
0,03
0,09
4,55
0,80
8,59
8,15
3,20
14,10
PL
Mediana
0,09
0,45
17,33
64,01
9,70
39,85
310,62
446,96
0,51
0,13
2,24
0,02
0,05
3,28
1,00
12,00
8,08
5,57
4,27
PZ
0,11
0,68
19,15
66,16
9,38
42,11
339,25
460,63
0,39
0,02
0,002
0,03
0,11
5,38
0,90
8,81
8,12
7,03
13,91
PL
Średnia
Mn2+ [mg∙dm-3]
Fe2+/3+ [mg∙dm-3]
Mg2+ [mg∙dm-3]
Ca2+ [mg∙dm-3]
Cl- [mg∙dm-3]
SO42- [mg∙dm-3]
SR [mg∙dm-3]
EC 20oC [µS∙cm-1]
N-NO3- [mg∙dm-3]
N-NO2- [mg∙dm-3]
N-NH4+ [mg∙dm-3]
PO43- [mg∙dm-3]
Pog. [mg∙dm-3]
ChZT-Mn [mg∙dm-3]
BZT5 [mg∙dm-3]
Tlen rozpuszczony [mgO2∙dm-3]
Odczyn [pH]
ZO [mg∙dm-3]
Temp. wody [oC]
Wskaźnik \ Statystyka Łukasz Borek, Krzysztof Ostrowski, Tomasz Stachura
Na podstawie przeprowadzonych analiz można stwierdzić, że istotne różnice
(p<0,05) pomiędzy półroczem letnim a zimowym w wodzie opadowej występują w przypadku: N-NO3- i SR, natomiast w wodzie powierzchniowej dla:
temperatury, SR i Mg2+. Modelem statystyki, będącym nieparametrycznym odpowiednikiem testu T-Studenta jest test U Mnna Whitneya. Na jego podstawie
stwierdzono, że różnice stężeń pomiędzy rozpatrywanymi okresami w wodzie
opadowej były statystycznie istotne w przypadku: pH, Pog., PO43-, Cl- i Fe2+/3+,
natomiast w wodzie powierzchniowej w odniesieniu do: tlenu rozpuszczonego,
CHZTMn, Pog., PO43- i N-NO2-. Dla pozostałych wskaźników wynik prawdopodobieństwa (p) nie pozwolił odrzucić hipotezy zerowej zarówno w odniesieniu
do wody opadowej jak i powierzchniowej.
Podstawowe statystyki opisowe:
0,49
0,23
0,48
24
24
26
26
0,23
2,52
24,90
20,68
0,82
2,31
10,10
24
26
0,82
24
26
10,48
77,91
85,97
34,50
24
26
37,01
17,24
83,02
71,69
14,71
10,94
71,90
24
26
7,48
24
26
56,75
432,00
372,00
172,00
24
26
164,00
0,81
533,00
535,00
172,00
0,08
24
26
161,00
1,33
0,70
0,02
24
1,18
3,30
0,08
0,09
26
3,30
53,17
0,02
24
26
53,17
0,29
0,18
0,06
0,09
0,29
24
26
0,05
24
26
0,16
10,12
2,60
3,00
5,00
6,42
2,20
24
26
5,00
24
26
2,80
11,66
15,70
4,95
7,18
24
24
26
8,45
24,50
28,80
8,40
0,57
23,50
24
26
0,65
PL
26
28,20
9,00
PZ
PL
13,90
24
26
PZ
PL
PZ
9,00
Maksimum
Zakres
Liczebność
20,30
<0,05
<0,05
>0,05
<0,05
<0,05
<0,05
>0,05
>0,05
<0,05
<0,05
<0,05
<0,05
<0,05
<0,05
<0,05
<0,05
>0,05
<0,05
>0,05
Wilka
Shapiro-
Normalność rozkładów – prawdopodobieństwo (p) testu:
-
-
0,603
-
-
-
0,695
0,999
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0,178
0,421
Sendecora
Fishera-
Jednorodność wariancji – prawdopodobieństwo (p) testu:
-
-
0,137
0,662
-
0,603
-
0,125
0,012
0,425
-
0,431
-
-
-
-
0,013
0,065
0,296
0,000
-
0,072
-
0,000
-
0,000
-
0,000
-
0,579
-
0,000
-
-
-
0,547
-
-
0,385
Coxa
0,000*
CochranaU Manna
Whitneya
T-Studenta
Określenie istotności różnic między wartościami wybranych wskaźników jakości wody z badanych półroczy testem:
Tab. 2. Analiza statystyczna wody powierzchniowej w zlewni potoku Rygliczanka.
*
- Wartości podkreślone oznaczają, że różnice są statystycznie istotne (p < 0,05)
przy założonym poziomie istotności α = 0,05
Do oceny stanu jednolitej części wód powierzchniowych w zlewni omawianego potoku, wykorzystano 22 wskaźniki charakteryzujące stan: ekologiczny, fizyczny i chemiczny wody powierzchniowej (Tab. 3]. Stwierdzono, że
stan ekologiczny wód, określony na podstawie elementu biologicznego kwalifikuje się jako umiarkowany (III klasa). Wartości wskaźników dotyczące
grupy substancji szczególnie szkodliwych dla środowiska wodnego spełniają
wymagania stanu dobrego i wyższego niż dobry. Reasumując – ocena stanu
jednolitej części wód powierzchniowych na podstawie elementu ekologicznego i chemicznego wskazuje na zły stan wód.
19
II.
Półrocza
zimowego
Półrocza
letniego
Wielolecie
Klasa III*
0,30
Wskaźnik
okrzemkowy
>0,70
1
Wyniki badań – percentyl 501,902
lub 1003
Element biologiczny
0,50
I.
Klasa II
Nazwa wskaźnika
jakości wód
Wartości graniczne
wg Rozporządzenia
2008
Klasa I
Lp.
Jednostka
0,36 (III)
Elementy fizykochemiczne wspierające element biologiczny
4
Tlen rozpuszczony
5
BZT5
6
CHZT-Mn
7
Przewodność w 20˚C
8
Substancje
rozpuszczone
8
Substancje
rozpuszczone
≤500
9
Siarczany
10
Chlorki
11
16,32 (I)
17,12(I)
7,82(I)
≤25
≤50
16,12(I)
19,52(I)
14,42(I)
≥7
≥5
8,12(I)
9,52(I)
14,42(I)
≤3
≤6
1,62(I)
1,42(I)
1,72(I)
≤6
≤12
6,42(II)
8,62(II)
4,52(I)
≤1000 ≤1500
512,22(I)
508,12(I)
506,52(I)
≤800
372,42(I)
380,02(I)
361,02(I)
≤800
372,42(I)
380,02(I)
361,02(I)
≤150
≤250
48,82(I)
54,82(I)
47,72(I)
≤200
≤300
12,12(I)
11,12(I)
12,32(I)
Wapń
≤100
≤200
76,92(I)
76,32(I)
76,12(I)
12
Magnez
≤50
≤100
20,82(I)
22,22(I)
20,22(I)
13
Odczyn
6-8,5
6-9
8,32(I)
8,32(I)
8,32(I)
14
Azot amonowy
≤0,78
≤1,56
0,0362(I)
0,0092(I)
0,0432(I)
15
Azot azotanowy
≤2,2
≤5
0,7612(I)
0,7062(I)
0,9142(I)
16
Fosfor ogólny
≤0,2
≤0,4
0,0432(I)
0,0672(I)
0,0252(I)
20
mg·dm-3
pH
mg·dm-3
mgO2·dm-3
o
C
Zawiesina ogólna
≤24
mg·dm-3
3
≤22
µS·cm-1
Temperatura
≤500
2
Substancje szczególnie szkodliwe dla środowiska wodnego
17
Chrom
18
Cynk
19
Miedź
≤0,05
0,0103(+) 0,0093(+)
0,0103(+)
≤1
0,0573(+) 0,0573(+)
0,0163(+)
≤0,05
0,0043(+) 0,0043(+)
0,0033(+)
0,0031(+) 0,0013(+)
0,0011(+) 0,0003(+)
0,0011(+)
Ołów
0,0011(+)
22
0,0001(+) 0,0013(+)
Nikiel
0,0001(+)
21
≤0,02
Kadm
≤0,0072
20
≤0,0015
Chemiczne wskaźniki jakości wody
mg·dm-3
IV.
mg·dm-3
III.
Przyjmuje się następujące oznaczenia w celu lepszego zobrazowania jakości wody:
(I)
(+) -
(-)
Klasa jakości wody,
-
-
Wartość wskaźnika jakości z grupy substancji szczególnie szkodliwych dla środowiska
wodnego spełnia wymagania dla stanu dobrego i stanu wyższego niż dobry, a z grupy
wskaźników chemicznych jakości wody spełnia stan dobry,
Wartość wskaźnika jakości z grupy substancji szczególnie szkodliwych dla środowiska
wodnego nie spełnia wymagania dla stanu dobrego i stanu wyższego niż dobry, a z grupy
wskaźników chemicznych jakości wody oznacza stan poniżej dobrego.
Tab. 3. Ocena stanu jednolitej części wód powierzchniowych potoku Rygliczanka
w oparciu o Rozporządzenie Ministra Środowiska z roku 2008.
* - Wartości granicznej dla klas III - V nie ustala się
DYSKUSJA I WNIOSKI
Według Chełmickiego [2002] relacje między właściwościami fizyko-chemicznymi i biologicznymi, a środowiskiem naturalnym są bardzo złożone.
W przyrodzie bowiem nie występuje woda chemicznie czysta, gdyż zawiera
ona różnego rodzaju domieszki substancji mineralnych i organicznych tworząc zawiesiny i roztwory. Właściwości wody są więc uzależnione od uwarunkowań naturalnych i antropogenicznych. Na terenie zlewni można wyróżnić zanieczyszczenia punktowe, pochodzące z niekontrolowanych zrzutów
21
ścieków bytowych i niedostatecznie rozwiniętej infrastruktury wodno-kanalizacyjnej, zanieczyszczenia obszarowe – z terenów użytkowanych rolniczo
(49,1% pow. zlewni) oraz zanieczyszczenia liniowe, których głównym źródłem jest szeroko rozumiany transport. Zanieczyszczenia transgeniczne również wpływają na jakość wód opadowych, co w pewnym stopniu przekłada
się na właściwości wód powierzchniowych.
Analiza uzyskanych wyników pozwala na sformułowanie następujących wniosków:
• Spośród badanych cech w wodzie opadowej rozkładem normalnym
można opisać 3 wskaźniki, a w wodzie powierzchniowej 5 wskaźników.
• Większość badanych wskaźników zanieczyszczeń, zarówno w półroczu
letnim jak i zimowym, osiągała większe wartości w wodzie odpływającej, jedynie N-NH4+ i N-NO3- w obu półroczach oraz PO43- i N-NO2w półroczu zimowym były większe w wodzie opadowej.
• W wodzie opadowej kilka wskaźników wykazało istotne różnice wartości pomiędzy półroczem letnim a zimowym. Statystycznie istotnie
większymi wartościami w sezonie letnim cechowały się: SR, Pog. i PO43-,
a w sezonie zimowym: N-NO3-, Cl-, i Fe2+/3+.
• W wodzie powierzchniowej istotnie większe wartości średnie w okresie letnim wykazywały: temperatura, CHZT-Mn, Pog., PO43-, N-NO2-, SR
i Mg2+, a w zimowym tylko tlen rozpuszczony.
• Stan ekologiczny wody oceniono jako umiarkowany, a stan chemiczny jako
dobry, co klasyfikuje stan jednolitej części wód powierzchniowych jako zły.
Zachodzi więc potrzeba by równolegle z budową zbiornika podjąć działania
ograniczające zanieczyszczenia wód powierzchniowych w jego zlewni.
LITERATURA
Chełmicki W. 2002. Woda. Zasoby, degradacja, ochrona. PWN. Warszawa.
Hermanowicz W., Dojlido J., Dożańska W., Koziorowski B., Zerbe J. 1999.
Fizyczno–chemiczne badania wody i ścieków. Arkady. Warszawa.
Mikulski Z. 1998. Gospodarka wodna. PWN. Warszawa.
Program małej retencji województwa małopolskiego – Nr 10. Zbiornik Bistuszowa. Hydroprojekt Kraków Sp. z o.o. 2003/2004.
Program małej retencji województwa małopolskiego. 2004. Załącznik nr 1 do
Uchwały nr XXV/344/04 Sejmiku Województwa Małopolskiego z dnia 25
października 2004 r.
22
Przewodnik Metodyczny. Zasady poboru i opracowania prób fitobentosu okrzemkowego z rzek i jezior, wersja 2010.
Rozporządzenia Ministra Środowiska z dnia 20 sierpnia 2008 r. w sprawie klasyfikacji stanu jednolitych części wód powierzchniowych (Dz. U. Nr 162 poz. 1008).
Stanisz A. 1998. Przystępny kurs statyki w oparciu o program Statistica PL na
przykładach z medycyny. StatSoft Polska Sp. z o.o. Kraków.
Adres do korespondencji:
mgr inż. Łukasz Borek, dr inż. Tomasz Stachura
Katedra Melioracji i Kształtowania Środowiska
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
al. Mickiewicza 24/28, 30-059 Kraków
e-mail: [email protected]
Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Krzysztof Ostrowski
23
Marta Czekaj
EPISTEME
14/2012
s. 25-32
ISSN 1895-4421
OPINIE WYBRANYCH PRODUCENTÓW ROLNYCH DOT.
STOSOWANIA NAWOZÓW NIEKONWENCJONALNYCH
(ZE SZCZEGÓLNYM UWZGLĘDNIENIEM POPIOŁU
PALENISKOWEGO)
FARMERS OPINIONS ABOUT FERTILIZING USING NONCONVENTIONAL FERTILIZERS (PARTICULARLY FLY ASH)
Abstrakt. Artykuł porusza problematykę nawożenia gleby oraz możliwości
zastosowania różnorodnych produktów do tego celu. Szczególną uwagę
skupiono w nim na znajomości wśród rolników niekonwencjonalnych produktów
wykorzystywanych do nawożenia gleby, w tym na popiele paleniskowym.
Z wykorzystaniem kwestionariusza ankiety zbadane zostały opinie rolników o takim
nawozie. Pozyskano również informacje o poziomie wiedzy wśród producentów
rolnych na temat możliwości wykorzystania do celów nawozowych takich produktów
jak np. wermikompost czy wysłodki.
Słowa kluczowe: produkcja rolnicza, nawożenie gleby, popioły paleniskowe jako nawóz
Summary. Fertilizing can be done using non - conventional fertilizers. One of them
is fly ash. The main purpose of the study was to check the farmers opinion about that
solution. The studies were conducted by using an interview questionnaire in 35 farms
located in Małopolska. The collected information concerned the farms situation in
2011. Obtained information about knowledge among farmers about the possibility
of use for fertilizer products such as for example fly ash, vermicompost or beet pulp.
Key words: agricultural production, fertilizing, fly ash as fertilizer
25
Marta Czekaj
WSTĘP
W sytuacji dostępności na rynku różnego rodzaju nawozów mineralnych
producent rolny ma przed sobą trudną decyzję, o wyborze tego, który będzie
najlepiej podnosił jakość gleby i poziom uzyskiwanych plonów. Kryterium
najczęściej wykorzystywanym przez rolnika przy zakupie nawozu jest jego
cena. Wobec rosnących kosztów produkcji rolniczej i znaczącego udziału
kosztów zakupu nawozów mineralnych w ogóle kosztów ponoszonych
przez producentów rolnych coraz częściej mówi się o wykorzystywaniu do
nawożenia gleby niekonwencjonalnych produktów, których koszty zakupu
są niższe niż koszty zakupu nawozów mineralnych. Produktem takim może
być popiół paleniskowy pozyskiwany jako produkt uboczny w procesie
spalania węgla kamiennego. Znalazł on już różnorodne zastosowania m.in.
jako surowiec do produkcja cementu i betonu; jako materiał nasypowy,
przy budowie wałów przeciwpowodziowych; jako surowiec do polepszanie
i stabilizacji gruntów budowlanych; w górnictwie do wypełniania
podziemnych pustek; w ceramice, itd.
Zastosowania popiołów paleniskowych w rolnictwie do celów nawozowych
dotyczy w szczególności tych popiołów, które mają zwiększoną zawartość
wapnia i magnezu, dlatego mogą być one stosowane jako nawozy przeznaczone
do wapnowania gleby. Użycie do nawożenia popiołów pozwala na poprawę
następujących cech fizykochemicznych gleby: odczynu, kwasowości, ilości
glinu pobieranego przez rośliny, pojemności kompleksu sorpcyjnego,
pojemności wodnej, kwasowości hydrolitycznej [Czekaj 2012a].
Stosowanie popiołu paleniskowego do celów nawozowych w rolnictwie stoi
wciąż jeszcze pod znakiem zapytania. Wynika to głównie z nowatorstwa
tego rozwiązania, konieczności jego rozpropagowania wśród rolników oraz
przekonania ich o jego zasadności. Z drugiej strony znane jest powszechnie
zjawisko wypalania traw i ściernisk oraz przekonanie rolników o pozytywnym
jego wpływie na jakość gleb ze względu na pozostające w glebie popioły.
I chociaż jest to zabieg mocno krytykowany przez wiele środowisk i uznawany
za szkodliwy przeżytek, w mentalności ludności wiejskiej pozostaje jako mocno
utrwalone przyzwyczajenie. Sprawą wartą zbadania wydaje się więc określenie
postaw producentów rolnych wobec możliwości wykorzystania nawozu jakim
jest popiół paleniskowy pozyskiwany ze spalania węgla kamiennego.
MATERIAŁ I METODY
Materiał źródłowy do przygotowania opracowania pozyskano z wykorzystaniem kwestionariusza ankiety. Badania przeprowadzone zostały na terenie
województwa małopolskiego, dobór badanych gospodarstw do próby miał
charakter celowy. Dane do badań zbierane były od lutego do kwietnia 2012
roku i dotyczyły roku 2011.W pierwszym etapie badań przeprowadzone
26
Opinie wybranych producentów rolnych...
zostały badania pilotażowe. Ankiety zebrane zostały w 5 gospodarstwach.
Po ich uzyskaniu dokonano wstępnej analizy informacji w nich zawartych.
Kwestionariusz ankiety nie został skorygowany, dlatego przystąpiono do
kolejnego etapu badań – zbierania właściwych danych. Pozyskano w ten
sposób kolejne 30 ankiet, cała próba składała się zatem z 35 ankiet.
Kwestionariusz ankiety zawierał podstawowe pytania charakteryzujące badane
gospodarstwa, w tym m.in. dot. wielkości gospodarstwa, powierzchni przeznaczanej
pod uprawę poszczególnych roślin, wielkości produkcji zwierzęcej. Ponadto
respondentów zapytano o stosowane w gospodarstwie nawozy organiczne
i mineralne. Poproszono o wskazanie rocznych wydatków ponoszonych w związku
z koniecznością zakupu nawozów mineralnych. Ważną częścią ankiety były pytania
pozwalające na ustalenie stopnia wiedzy ankietowanych na temat różnorodnych
produktów wykorzystywanych do nawożenia gleby. Część wykorzystanych
w opracowaniu danych pochodzi z Raportu opracowywanego przez autorkę artykułu
w ramach projektu „Wiedza, praktyka, kadry...” - staże dla pracowników naukowych
w przedsiębiorstwach, prowadzonego przez Małopolską Agencję Rozwoju
Regionalnego w Krakowie. Projekt ten porusza tematykę oceny ekonomicznośrodowiskowych aspektów nawożenia gleby popiołem paleniskowym.
W opracowaniu posłużono się metodą opisową i metodą analizy poziomej, dane
zostały zaprezentowane z wykorzystaniem metody tabelarycznej i graficznej.
WYNIKI
Zboża
Ziemniaki
Przemysłowe
Warzywa
Owoce
Pastewne
Łąki
Pastwiska
Inne
Suma
Jak już wcześniej wspomniano w badanej próbie znalazło się 35 gospodarstw
rolniczych. Ich przeciętna powierzchnia znacząco odbiegała od przeciętnej
powierzchni gospodarstwa w województwie małopolskim (wg danych GUS
jest to około 3,7 ha UR), bowiem wynosiła 8,49 ha UR. Gleby użytkowane
przez ankietowanych rolników były dość dobrej jakości – dominowały
użytki rolne zaliczane do II (ponad 17% ogółu gospodarstw) i III (ponad 51%
ogółu gospodarstw) klasy. Ankietowani rolnicy zajmowali się różnorodną
produkcją rolniczą. Strukturę użytkowania ziemi przedstawiono w tab.1.
Największą powierzchnię w badanych gospodarstwach rolnicy przeznaczali
pod zboża, na drugim miejscu znalazły się warzywa, a na trzecim łąki.
41
6
2
17
9
1
15
5
4
100
Tab. 1. Struktura użytkowania ziemi w badanych gospodarstwach [%]. Źródło:
opracowanie własne na podstawie badań
27
Marta Czekaj
Wśród badanych gospodarstw znalazły się takie, w których utrzymywane
były zwierzęta. Ponad 45% gospodarstw utrzymywało bydło mleczne
– średnio były to 3 sztuki w stadzie. Trzoda chlewna było utrzymywania w 43%
gospodarstw, a średnia liczba tych zwierząt w gospodarstwie to 30 sztuk. Ponadto
wśród respondentów znaleźli się tacy, którzy utrzymywali owce (8%), konie
(14%) oraz drób (49%). Wszystkie gospodarstwa posiadające inwentarz żywy
wykorzystywały wytworzony przez niego nawóz naturalny – tylko 3 rolników
zajmujących się wyłącznie produkcją roślinną nie stosowało takiego nawozu.
Rolnikom zadano pytanie dotyczące stosowania przez nich nawozów
sztucznych. W badanej grupie 66% ankietowanych odpowiedziało, iż stosuje
nawozy sztuczne. Dane gromadzone na potrzeby statystyki masowej przez
GUS w 2011 roku wskazują, że podobnie w zakresie stosowania nawozów
mineralnych wygląda sytuacja dla całego kraju, bowiem 62,9% gospodarstw
rolnych w Polsce, które posiadały użytki rolne w dobrej kulturze stosowało
w roku gospodarczym 2010/2011 nawozy mineralne i wapniowe [GUS 2011].
W grupie badanych gospodarstw respondenci stosujący nawozy mineralne
wskazywali, że stosują następujące nawozy: polifoska (14 gospodarstw),
saletrzak (14 gospodarstw), mocznik (12 gospodarstw), saletra amonowa
(10 gospodarstw). Ponadto część badanych rolników sięgała po takie nawozy
jak: superfosfat, wapno tlenkowe i magnezowe, fosforany czy sól potasowa.
Rolnicy zostali poproszeni o wskazanie jak wysokie wydatki ponoszą
w ciągu roku w związku z zakupem nawozów mineralnych. Wśród
respondentów stosujących nawożenie mineralne średni poziom wydatków na
te nawozy wynosił około 5 920 zł w ciągu roku, przy czym wydatki te były
zróżnicowane, bowiem wybrani producenci rolni nabywali nawozy za kwotę
około 100 zł rocznie, podczas gdy właściciele największych obszarowo
gospodarstw wydatkowali na ten sam cel do 20 000 zł (tak wysokie wydatki
ponosili właściciele sadów). Bardziej miarodajnym miernikiem poziomu
wydatków na nawozy sztuczne jest udział wydatków na te środki w ogólnej
kwocie kosztów ponoszonych w ciągu roku przez rolnika. Respondentów
poproszono o wskazanie takiego udziału. Wyniki zaprezentowane zostały na
ryc. 1. W grupie producentów stosujących nawozy mineralne 26% wskazało,
że udział ten wynosi poniżej 5%. Nieco ponad 1/3 ankietowanych (35%
rolników) wskazała, że koszty związane z zakupem nawozów mineralnych
stanowią ponad 20% ogółu ponoszonych w gospodarstwie kosztów.
W związku z różnorodnością pojawiających się na rynku oraz stosowanych
w praktyce rolniczej nawozów (nie zaliczanych do grupy nawozów
mineralnych) rolnikom zadano pytanie dotyczące stosowania tych
produktów ubocznych bądź odpadowych. Wśród respondentów 29%
odpowiedziało, że stosuje w swoim gospodarstwie tego typu rozwiązania.
Wśród produktów wykorzystywanych do nawożenia rolnicy wskazali:
kompost (8 ankietowanych) oraz trociny (2 odpowiedzi). Zróżnicowanie
28
stosowanych nawozów było więc niewielkie, aczkolwiek pozyskane wyniki
świadczyć mogą, iż rolnicy w przyszłości mogą być zainteresowani dalszym
stosowaniem tego typu środków.
Ryc. 1. Jaką część kosztów ogółem ponoszonych w gospodarstwie stanowią koszty
nawozów? [%]. Źródło: opracowanie własne na podstawie badań
W celu ustalenia poziomu wiedzy ankietowanych na temat różnorodnych
produktów stosowanych do użyźniania gleby przedstawiono im listę takich
środków z prośbą o wskazanie wśród nich tych, z którymi już wcześniej
się zetknęli, bądź o których słyszeli. Rolnikom zaprezentowano do wyboru
zestaw następujących produktów wykorzystywanych do nawożenia gleby:
kora; trawa; liście; rozdrobnione gałęzie drzew i krzewów; roślinne odpady
z targowisk; popielęgnacyjne części roślin z rabat i ogrodów; grzybnia
pochodząca z hodowli pieczarek; wytłoki i inne odpady z przetwórstwa
produktów roślinnych; wysłodki; odpady z przemysłu ziemniaczanego;
wermikompost (odchody dżdżownic); osad biologiczny ze ścieków
garbarskich; szlamy z mycia, czyszczenia, obierania, odwirowywania
i oddzielania surowców; odpady węglanu wapnia i odpady z gaszenia
wapna palonego; osady ściekowe; popioły ze słomy; popioły paleniskowe.
Poproszono ich także o uzupełnienie tej listy o inne produkty, z którym się
zetknęli, a które nie znalazły się w prezentowanym zestawieniu.
Ryc. 2. O jakich produktach (oprócz nawozów mineralnych i naturalnych)
wykorzystywanych do nawożenia gleby Pan(i) słyszał(a)? [%]. Źródło: opracowanie
własne na podstawie badań
29
Marta Czekaj
Respondenci w badanej grupie wykazali dość dużą znajomość w zakresie
stosowania różnorodnych produktów do użyźniania gleby (ryc. 2). Najczęściej
wymieniali oni trawy oraz liście jako produkty, o których słyszeli, a którymi
może być nawożona gleba (odpowiednio po 77% wskazań). Na kolejnych
miejscach znalazły się pozostające po pielęgnacji części roślin (49%), popioły po
spaleniu słomy (49%) oraz rozdrobnione gałęzie drzew i krzewów (46%). Żaden
z ankietowanych nie wskazał osadu biologicznego ze ścieków garbarskich, a tylko
jeden stwierdził, że słyszał o wykorzystywaniu szlamów z mycia, czyszczenia,
obierania, odwirowywania i oddzielania surowców jako produktu do użyźniania
gleby. Ponadto żaden z respondentów nie wskazał innych (oprócz zawartych
w pytaniu) produktów przeznaczonych do użyźniania gleby.
Specyficznym produktem wykorzystywanym do użyźniania gleby jest popiół
paleniskowy. O rosnącym zainteresowaniu wśród producentów rolnych
możliwością wykorzystania go do celów nawozowych świadczyć mogą
informacje zawarte na ryc. 2. Zgodnie z nimi 26% badanych rolników słyszało
o takim kierunku wykorzystania popiołów paleniskowych. Respondentom
zadano także pytanie dotyczące ich skłonności do nabycia takiego nawozu w
przyszłości, gdyby pojawił się on na rynku. Wyniki uzyskanych odpowiedzi
zaprezentowano na ryc. 3. Tylko 17% badanych zdecydowanie odpowiedziało,
że nie nabyłoby nawozu wyprodukowanego z popiołu paleniskowego, a 1/5
ankietowanych pozytywnie odniosła się do takiego pomysłu. Pozostałe osoby
nie były w stanie udzielić jednoznacznej odpowiedzi na zadane pytanie.
Ryc. 3. Skłonność rolników do nabycia nawozu produkowanego na bazie popiołu
paleniskowego [%]. Źródło: opracowanie własne na podstawie badań
W ostatnim pytaniu, które zostało skierowane do rolników poproszono ich o podanie
kwoty, jaką skłonni byliby wydać, aby zakupić za nawozy produkowane z popiołu
paleniskowego, a przeznaczone do wapnowania 1 ha gleby. Ponadto w pytaniu tym
zawarta była informacja, że dla dostarczenia niezbędnej dawki CaO na powierzchnię
1 ha gleb ciężkich rolnik potrzebuje około 4,5 t nawozu wapniowego (46% CaO),
a koszty zakupu takiej ilości nawozu to kwota około 1 530 zł [Czekaj 2012b].
W badanej zbiorowości na pytanie to 8 respondentów odpowiedziało „trudno
powiedzieć”, nie podając konkretnej kwoty, natomiast odpowiedzi pozostałych
respondentów pozwoliły na określenie średniej kwoty na poziomie 830 zł/ha.
30
WNIOSKI
• Badana grupa rolników dobrana została w sposób celowy, dlatego nie
można uogólniać pozyskanych w ramach badań wyników na ogół
producentów rolnych działających w województwie małopolskim, można
jednakże na podstawie przeprowadzonych badań poczynić spostrzeżenia
o zainteresowaniu rolników z badanej zbiorowości koncepcją rolniczego
wykorzystania popiołów paleniskowych.
• Nawozy mineralne stosowane były przez 2/3 badanych rolników.
W grupie tej najwięcej respondentów (35%) wskazało, że wydatki
na zakup nawozów mineralnych stanowią ponad 20% ogółu kosztów
ponoszonych w gospodarstwie w ciągu roku, 26% ankietowanych na ten
cel przeznaczało do 5% rocznego budżetu, 22% od 5do 10%, a pozostałe
osoby od 10 do 20%. Średni poziom wydatków na nawozy mineralne został
w badanej grupie (stosującej nawozy mineralne) ustalony na poziomie 5 920 zł.
• Ankietowani rolnicy byli dobrze zorientowani w zakresie stosowania
różnorodnych produktów do użyźniania gleby, wybrane osoby spotkały
się bądź też słyszały o takich produktach do nawożenia gleby jak: szlamy
z mycia, czyszczenia, obierania, odwirowywania i oddzielania surowców,
wysłodki buraczane, wermikompost, odpady z przemysłu ziemniaczanego
oraz popiół paleniskowy.
• Pomimo szerokiej wiedzy w zakresie stosowania różnorodnych produktów
do nawożenia gleby, rolnicy wykazują stosunkowo małe zainteresowanie
w tym temacie, bowiem w badanej grupie tylko nieliczni wskazali na
stosowanie innych niż nawozy mineralne środków do podnoszenia
żyzności gleby (były to kompost oraz trociny).
• Wśród badanych producentów rolnych tylko 17% zdecydowanie
stwierdziło, że nie kupiłoby nawozów produkowanych na bazie popiołów
paleniskowych. Wśród pozostałych 63% nie było w stanie udzielić
jednoznacznej odpowiedzi, natomiast 1/5 była zdecydowana nabyć takie
nawozy w sytuacji, gdy pojawiłyby się one rynku.
• Kwota, jaką respondenci byli skłonni wydatkować za nawozy wapniowe
produkowane na bazie popiołów paleniskowych przeznaczone do
wapnowania 1 ha UR była dwukrotnie niższa niż cena dostępnych na
rynku konwencjonalnych nawozów wapniowych przeznaczonych
do nawożenia takiej samej powierzchni (przy założeniu, że w obu
przypadkach ilość wprowadzanego do 1 ha UR czystego składnika CaO
będzie identyczna).
31
Marta Czekaj
LITERATURA
Czekaj M. 2012a. Ekonomiczno-środowiskowe aspekty nawożenia gleby
– innowacyjne rozwiązania stosowane w tym zakresie. Artykuł w recenzji.
Czekaj M. 2012b. Raport kwiecień. Analiza i ocena ekonomicznych aspektów
rolniczego wykorzystania popiołu paleniskowego. Materiały niepublikowane: 1-12.
GUS 2011 http://www.stat.gov.pl
Marta Chekaj
Katedra Zarządzania i Marketingu w Agrobiznesie
Wydział Rolniczo-Ekonomiczny
al. Mickiewicza 21, 31-120 Kraków
32
Leszek Gersztyn
Anna Karczewska
EPISTEME
14/2012
s. 33-39
ISSN 1895-4421
SPECJACJA MIEDZI W OSADACH POFLOTACYJNYCH
GÓRNICTWA MIEDZI WZBOGACONYCH W RÓŻNE DODATKI
ORGANICZNE
COPPER SPECIATION IN MINE TAILINGS ENRICHED WITH
DIFFERENT ORGANIC MATTER ADDITIVES
Abstrakt. W osadach poflotacyjnych górnictwa miedzi badano ogólną zawartość
Cu oraz jej rozmieszczenie we frakcjach wydzielonych zgodnie z metodyką
zaproponowaną przez Community Bureau of Reference (BCR). Badaniom poddane
zostały osady poflotacyjne testowane w doświadczeniu wazonowym. Osady te,
pochodzące z 2 różnych składowisk, zostały wzbogacone w materię organiczną
w postaci osadów ściekowych o różnym stopniu humifikacji. Dodatek materii
organicznej spowodował zmiany w rozmieszczeniu miedzi w poszczególnych
frakcjach. Zmiany te zależały od właściwości osadów poflotacyjnych oraz rodzaju
wprowadzonej materii organicznej.
Słowa kluczowe: osady poflotacyjne, miedz, materia organiczna, specjacja, BCR
Summary. Copper mine tailings obtained from two different impoundments were
enriched in various kinds of organic matter and used in a pot experiment. Copper
distribution in operationally defined fractions, separated according to the Community
Bureau of Reference methodology (BCR), was examined thereafter. Copper speciation
depended strongly on tailings origin and properties. The addition of organic matter led
to changes in the distribution of copper in various fractions. Those changes depended
on the characteristics of copper tailings and the properties of organic matter.
Key words: mine tailings, copper, organic matter, speciation, BCR
33
WSTĘP
Składowiska osadów poflotacyjnych górnictwa miedzi stanowią olbrzymie
zagrożenie dla środowiska m.in. ze względu na wywiewanie drobnych
cząstek deponowanego materiału do otoczenia, co powoduje lokalne
wzbogacenie gleb w metale ciężkie [Kabała i in. 2008]. W celu ograniczenia
erozji wietrznej, po zakończeniu eksploatacji składowisk na ich powierzchnię
powinna zostać wprowadzona roślinność okrywająca, której celem jest
zmniejszenie niekorzystnego oddziaływania składowisk na środowisko.
Jednakże rekultywacja tych obiektów jest utrudniona ze względu na
niekorzystne właściwości fizyko-chemiczne osadów, a zwłaszcza toksyczne
zawartości metali ciężkich oraz niską zasobność w składniki pokarmowe
[Bogda i in. 2003; Karczewska 2008; Spiak, Gediga 2009]. Wprowadzenie
na teren składowiska materii organicznej nie tylko poprawi niekorzystne
właściwości rekultywowanych osadów, ale także wpłynie korzystnie na
intensywność procesów biochemicznych. Źródłem substancji organicznej
w rekultywacji gruntów bezglebowych, w tym osadników poflotacyjnych,
są często osady ściekowe [Siuta 2005; Karczewska 2008], które stanowią
źródło substancji organicznej oraz pierwiastków biogennych [Baran, Turski
1999; Siuta 2005; Rosik-Dulewska 2010]. W związku z tym użycie osadów
ściekowych do procesu rekultywacji jest jednym z najbardziej uzasadnionych
sposobów ich utylizacji [Kaniuczak i in. 2009]. Jednak wprowadzenie materii
organicznej w postaci osadów ściekowych może spowodować zmiany
w rozmieszczeniu metali ciężkich w glebach [Patorczyk-Pytlik, Gediga
2008]. Analiza specjacyjna pozwoli na określenie rozmieszczenia miedzi w
poszczególnych frakcjach osadów poflotacyjnych jak i określenie toksyczności
i biodostępności analizowanych metali [Quevauvuller i in. 1994].
Celem pracy jest określenie wpływu dodatku materii organicznej na specjację
miedzi w osadach poflotacyjnych.
MATERIAŁY I METODY
Do doświadczenia wytypowano 2 osady pochodzące ze składowisk osadów
poflotacyjnych Żelazny Most (ZM) oraz Iwiny III (Iw). Osady te zostały
wykorzystane w doświadczeniu wazonowym, które zostało założone wiosną
2011 roku. Do wazonów o pojemności 1 kg wprowadzono osad poflotacyjny
wymieszany z osadami ściekowymi, zastosowanymi w dawce 20 g s.m.
Doświadczenia prowadzano w trzech powtórzeniach.
Osady ściekowe pozyskane zostały z wrocławskiej oczyszczalni ścieków
Janówek. Do doświadczania użyto osadów surowych (W1) oraz osadów
po fermentacji metanowej (W2). Cechowały się one zróżnicowanymi
właściwościami fizyko-chemicznymi.
34
Specjacja miedzi w osadach poflotacyjnych górnictwa miedzi...
Po zakończeniu doświadczenia wazonowego z każdego wazonu pobrane
zostały 3 próbki średnie, które zostały wymieszane. Uzyskana próbka
zbiorcza poddana została analizie sekwencyjnego frakcjonowania miedzi
zmodyfikowaną metodą BCR [Rauret i in. 1999, Sahuquillo i in. 1999].
Nr frakcji
Nazwa frakcji
Odczynnik ekstrahujący
F1
rozpuszczalna w
kwasach
0,11 mol×dm-3 CH3COOH
F2
redukowalna
0,5 mol×dm-3 NH2OH-HCl
F3
utlenialna
8,8 mol×dm-3 H2O2 + 1 mol×dm-3 CH3COOHN4
F4
rezydualna
mineralizacja stężonym kwasem nadchlorowym
Tab. 1. Frakcje i odczynniki ekstrahujące użyte w metodzie BCR
Metoda BCR umożliwia wydzielenie pierwiastka we frakcjach (Tab. 1):
rozpuszczalnej i wymiennej w środowisku kwaśnym (F1), ekstrahowanej za
pomocą 0,11 mol×dm-3 kwasu octowego, redukowalnej (F2) która obejmuje
połączenia miedzi z uwodnionymi tlenkami żelaza i manganu otrzymywanej
za pomocą 0,5 mol×dm-3 NH2OH-HCl przy pH=1,5, oraz frakcji utlenialnej
(F3), związanej z substancją organiczną i siarczkami, wydzielanej za pomocą
8,8 mol×dm-3 H2O2 i 1 mol×dm-3 CH3COONH4. Frakcję rezydualną (F4)
uzyskano poprzez mineralizację próbki w stężonym kwasie nadchlorowym.
Stężenia miedzi w pozyskanych ekstraktach określone zostały za pomocą
metody atomowej spektroskopii absorpcyjnej.
WYNIKI
Rozmieszczenie miedzi w poszczególnych frakcjach różniło się w zależności
od pochodzenia osadu poflotacyjnego, a także – choć w mniejszym stopniu od rodzaju wprowadzonej materii organicznej oraz (Tab. 2).
Dodatek
(Addition)
F1
F2
Kontrola
W1
W2
690a
592a
674a
100a
184b
122c
Kontrola
W1
W2
388a
340b
352b
1455a
1289a
1309a
F3
F4
F1+F2+F3+F4
435a
507a
493a
173a
180a
189a
1398a
1463a
1479a
266 a
281 a
251 a
132a
187b
151a
2201a
2097a
2063a
ZM
Iw
Tab. 2. Zawartość miedzi w poszczególnych frakcjach osadów poflotacyjnych.
Objaśnienie: a,b,c – grupy jednorodne wyznaczone testem Duncana α<0,05
35
Jak wynika z danych przedstawionych w tabeli 2, całkowita zawartość miedzi
w osadach poflotacyjnych nie zmieniała się w wyniku aplikacji materii
organicznej, podwyższone wartości miedzi odnotowane w wariantach z
dodatkiem osadów ściekowych W1 i W2 nie różniły się istotnie od wariantu
kontrolnego. Wyższą zawartość miedzi odnotowano w osadach Iw (20632201 mg×kg-1), natomiast niższe stężenia Cu stwierdzono w osadach
poflotacyjnych ZM ze składowiska Żelazny Most (1398-1479 mg×kg-1).
Zawartość miedzi w poszczególnych frakcjach osadu ZM jest różna
(ryc 1). Dominującą frakcją jest frakcja rozpuszczalna w kwasach (F1), a
mniejsze udziały stanowią kolejno frakcja utlenialna (F3), rezydualna (F4) i
redukowalna (F2). Dodatek osadów ściekowych W1 i W2 spowodował istotne
zmiany w udziale frakcji redukowalnej, czyli związanej z tlenkami żelaza
i manganu. Efekt ten może być spowodowany wzrostem rozpuszczalności
miedzi bezpośrednio po aplikacji materii organicznej, a następnie wiązaniem
jej w nierozpuszczalne połączenia żelazisto-manganowe. W pozostałych
frakcjach nie odnotowano istotnych zmian w zawartości Cu.
Ryc. 1. Rozmieszczenie frakcji miedzi w osadzie poflotacyjnym Żelazny Most
Osad poflotacyjny Iw (ryc. 2) cechował się największą zawartością miedzi we
frakcji redukowalnej (F2), następnie we frakcji rozpuszczalnej i wymiennej
(F1), rezydualnej (F4) i frakcji utlenialnej (F3). Istotne statystycznie zmiany
w zawartości miedzi w poszczególnych frakcjach zaobserwowano po
aplikacji osadu W1 - we frakcji F1 oraz we frakcji F4, a w przypadku osadu
ściekowego W2 - we frakcji F1. W pozostałych frakcjach nie odnotowano
istotnych zmian zawartości miedzi.
36
Ryc. 2. Rozmieszczenie frakcji miedzi w osadzie poflotacyjnym Iwiny III.
Wyniki sekwencyjnej ekstrakcji miedzi nie wykazały zmian w zawartości
miedzi we frakcji utlenialnej (F3), która odpowiada za połączenia Cu
z materią organiczną i siarczkami.
WNIOSKI
• Całkowite zawartości oraz formy miedz w osadach poflotacyjnych różnią się
od siebie, w zależności od pochodzenia i właściwości osadu poflotacyjnego.
• Główną frakcją, w której miedź występuje w osadzie poflotacyjnym ZM, jest
frakcja F1 (potencjalnie rozpuszczalna), natomiast w osadzie poflotacyjnym
Iw dominuje Cu we frakcji F2 (związana z tlenkami żelaza i manganu).
• Wprowadzenie osadów ściekowych nie spowodowało istotnego wzrostu
całkowitej zawartości miedzi w osadach poflotacyjnych.
• Dodatek materii organicznej wpłynął na zmiany w rozmieszczeniu miedzi
w poszczególnych frakcjach osadów poflotacyjnych. W przypadku osadów
ZM po zastosowaniu osadów ściekowych W1 i W2 stwierdzono istotny wzrost
zawartości Cu we frakcji F2.W osadach poflotacyjnych Iw, zastosowanie osadu
ściekowego W1 spowodowało zmiany udziału Cu we frakcjach F1 i F4
• Zmiany we frakcji F2 osadu poflotacyjnego ZM po zastosowaniu osadów
ściekowych, mogą być spowodowane wtórną sorpcją, początkowo
mobilnych, związków miedzi ze związkami żelaza i manganu.
• Należy kontynuować badania, z uwzględnieniem szczegółowej dynamiki
miedzi w osadach poflotacyjnych po aplikacji różnych form materii
organicznej.
37
LITERATURA
Baran S., Turski R. 1999. Wybrane zagadnienia z utylizacji i unieszkodliwiania
odpadów. Wyd. AR w Lublinie, Lublin: s 336.
Bogda A., Szopka K., Karczewska A. 2003. Zawartość i rozpuszczalność wybranych
metali ciężkich w osadach poflotacyjnych górnictwa miedzi. W: Gworek B.,
Misiak J. (red.): Obieg pierwiastków w przyrodzie: bioakumulacja, toksyczność,
przeciwdziałanie. T. II. Wydawn. IOŚ, Warszawa: 238-241.
Kabała C., Medyńska A., Chodak T., Jezierski P., Gałka B. 2008. Zmiany zawartości
miedzi i arsenu w glebach wokół składowiska odpadów po flotacji rud miedzi
w 12-letnim cyklu badań monitoringowych. Roczn. Gleb. 58 (3-4): 81-88.
Kaniuczak J., Hajduk E., Zamorska J., Ilek M. 2009. Charakterystyka osadów
ściekowych pod względem przydatności do przyrodniczego wykorzystania. Zesz.
Nauk. P-W O/PTIE i O/PTG w Rzeszowie, 11, 89-94.
Karczewska A. 2008. Ochrona gleb i rekultywacja terenów zdegradowanych. Wyd.
UP we Wrocławiu: s 414.
Sahuquillo A., López-Sánchez J.F., Rubio R., Rauret G., Thomas R.P., Davidson C.M.,
Ure A.M. 1999: Use of a certified reference material for extractable trace metals
to assess sources of uncertainty in the BCR three-stage sequential extraction
procedure. Analytica Chimica Acta 382: 317-327.
Siuta J. 2005. Rekultywacyjna efektywność osadów ściekowych na składowiskach
odpadów przemysłowych Acta Agrophys., 5(2): 417-425.
Spiak Z., Gediga K. 2009. Usefulness of selected mineral wastes for reclamation of
copper industry dumping site. Environ. Prot. Eng. 35 (1): 79-88.
Rauret G.,. López-Sànchez J.F, Sahuquillo A., Rubio R., Davidson C.M., Ure A.M.,.
Quevauviller Ph, 1999: Improvement of the BCR three step sequential extraction
procedure prior to the certification of new sediment and soil reference materials,
J. Environ. Monit., 1, 57-61.
Rosik-Dulewska Cz. 2010. Podstawy gospodarki odpadami. Wyd. IV. Wyd. Nauk.
PWN, Warszawa: s 377.
Quevauvuller Ph, Rauret G., Muntau H., Ure A.M., Rubio R., Lopez-Sanchez J.F.,
Fiedler H.D., Griepink B. 1994 Evaluation of sequential extraction procedure for
determination of extractable trace metal contents in sediments. Fresen. J. Anal.
Chem. 349, 808-814.
38
mgr inż. Leszek Gersztyn, prof. dr hab. Anna Karczewska
Instytut Nauk o Glebie i Ochrony Środowiska
Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
50-357 Wrocław, ul. Grunwaldzka 53
e-mail: [email protected], [email protected]
39
Katarzyna Kołodziejczyk
Roman Pieprzka
EPISTEME
14/2012
s.41-50
ISSN 1895-4421
KSZTAŁTOWANIE SIĘ ZAWARTOŚCI METALI CIĘŻKICH
W GLEBACH WYBRANYCH DWÓCH OBSZARÓW CHRONIONYCH
DOLNEGO ŚLĄSKA
THE HEAVY METAL CONTENT IN SOILS OF TWO CHOSEN PROTECTED AREAS OF LOWER SILESIA
Abstrakt. Obszary chronione narażone są na negatywne oddziaływanie antropogeniczne, które objawia się m.in. akumulacją metali ciężkich. Zawartość metali ciężkich
na obszarach podlegających ochronie jest uzależniona zarówno od źródła naturalnego
w skałach macierzystych, jak i źródeł pochodzenia zewnętrznego. Badaniami objęto
gleby dwóch obszarów, które w myśl ustawy o ochronie przyrody z 2004 r. są kwalifikowane jako formy ochrony przyrody. Należą do nich Park Krajobrazowy Dolina Jezierzycy oraz Park Narodowy Gór Stołowych. Oba obiekty narażone są na oddziaływanie antropogeniczne. Przez PK Dolina Jezierzycy przebiega szlak komunikacyjny,
a przez PNGS tzw. Szosa Stu Zakrętów. Zawartość metali ciężkich w analizowanych
glebach porównano ze standardami jakości gleby i ziemi przedstawionymi w Rozporządzeniu Ministra Środowiska z 2002 r. dla obszarów chronionych należących do
grupy „A”. Zawartość metali ciężkich w większości analizowanych profili glebowych
kształtuje się na naturalnym poziomie i nie przekracza wartości dopuszczalnych.
Słowa kluczowe: zawartość metali ciężkich, obszary chronione, standardy jakości
gleby i ziemi
Summary. Protected areas are exposed to negative anthropogenic impact, which is
manifested by among others accumulation of heavy metals. The heavy metal content
in the areas under protection is dependent on their natural presence in the soil parent
rocks, as well as external origin. The study involved soils of two areas, which are classified as forms of nature conservation in polish law. These include Park Krajobrazowy
Dolina Jezierzycy and Park Narodowy Gór Stołowych. Both areas are exposed to anthropogenic impacts, connected with roads going through them. The heavy metal content in the analyzed soils were compared with the standards of quality of soils according to Rozporządzenie Ministra Środowiska from 2002 for protected areas belonging
to the group „A”. The heavy metal content in all of the analyzed soil profiles is at
a natural level and does not exceed the limit values.
Key words: heavy metal content, protected areas, the standards of soil quality
41
WSTĘP
Obszary prawnie chronione, pomimo ograniczonej działalności gospodarczej, narażone są na różne zanieczyszczenia, głównie pochodzenia antropogenicznego. Zwykle głównym źródłem zanieczyszczeń jest ruch samochodowy. Obszary badań przecinają dwa ważne szlaki komunikacyjne. W Parku
Narodowym Gór Stołowych jest to droga łącząca Kudowę Zdrój i Radków
(nazywana jest „Szosą 100 Zakrętów”), natomiast w Parku Krajobrazowym
Dolina Jezierzycy - droga wojewódzka łącząca Wołów ze Ścinawą. Obecność tak ważnych szlaków komunikacyjnych na obszarach podlegających
prawnej ochronie może stanowić jedno z głównych źródeł zanieczyszczeń
gleb metalami ciężkimi. Celem pracy było określenie wpływu transportu samochodowego na zawartość metali ciężkich w glebach badanych obszarów
chronionych i ich porównanie z normami określonymi w Rozporządzeniu
Ministra Środowiska [2002].
MATERIAŁ I METODY
Materiał glebowy do prac laboratoryjnych został pobrany z terenu dwóch obszarów chronionych województwa dolnośląskiego: z Parku Krajobrazowego
Dolina Jezierzycy (PKDJ) oraz Parku Narodowego Gór Stołowych (PNGS).
Odkrywki glebowe były zlokalizowane w odległości od 50 do 100 m od szlaków komunikacyjnych. Do badań wytypowano gleby wytworzone z piasków
(PKDJ) oraz piaskowców (PNGS) - skał ubogich w pierwiastki śladowe, co
pozwala wykluczyć skałę macierzystą jako główne źródło metali ciężkich.
Wszystkie analizowane profile glebowe należały do działu gleb autogenicznych i rzędu gleb bielicoziemnych. Na obszarze PKDJ były to gleby rdzawe
(profile: 1 i 3) oraz bielicowe (profile: 2 i 4), a na obszarze PNGS - bielicowe
(profile: 5-8). W pobranym materiale glebowym oznaczono skład granulometryczny metodą Bouyoucosa-Casagrande’a w modyfikacji Prószyńskiego,
pH w H2O i 1 M KCl potencjometrycznie oraz zawartość form ogólnych
wybranych metali ciężkich (Cu, Pb, Zn) - metodą AAS, po mineralizacji
w stężonym kwasie nadchlorowym.
WYNIKI I DYSKUSJA
W analizowanych glebach Parku Krajobrazowego Dolina Jezierzycy i Parku Narodowego Gór Stołowych występuje bardzo niewielkie zróżnicowanie
w obrębie grup granulometrycznych. Całość badanego obszaru pokrywają
utwory piaszczyste. W glebach PKDJ większość poziomów glebowych cechuje się uziarnieniem piasku luźnego, w a glebach PNGS - piasku gliniastego, słabogliniastego lub gliny piaszczystej. Frakcja ilasta wynosi zaledwie od 0%
do 10%, co decyduje m.in. o niekorzystnych właściwościach fizyko-chemicznych
42
Kształtowanie się zawartości metali ciężkich w glebach...
badanych gleb [Kołodziejczyk i Kawałko 2010]. Pod względem kategorii ciężkości badane gleby należy zaklasyfikować do bardzo lekkich.
Poziom
genetyczny
Nr profilu
Gleby obu rozpatrywanych obszarów chronionych cechują się niskimi wartościami pH. W szczególności gleby pochodzące z Parku Narodowego Gór Stołowych charakteryzują się silnie kwaśnym odczynem. Niskie wartości pH są
tu spowodowane wysoką sumą opadów, które przyczyniają się do wymywania
składników o charakterze zasadowym [Kabała 2005]. Natomiast na obszarze
Parku Krajobrazowego Dolina Jezierzycy zakwaszenie gleb jest następstwem
„lekkiego” składu granulometrycznego i obecnością roślinności borowej
w omawianych siedliskach [Kawałko i in. 2007], gdzie kwaśne produkty rozkładu i humifikacji szczątków roślinnych gromadzą się w poziomie A.
Głębokość
poziomu
[cm]
Zawartość poszczególnych frakcji [%]
>2
2,0-0,05 0,05-0,002
<0,002
Grupa
granulometryczna
PTG 2008
Gleby Parku Krajobrazowego Dolina Jezierzycy
1
2
3
4
A
Bv
Bv/C
Cgg
0- 29
29- 40
40- 52
>52
4
5
8
10
92
95
97
96
5
4
3
0
3
1
0
4
ps
pl
pl
pl
A
0- 13
7
94
4
2
pl
Ees
13- 18
8
98
2
0
pl
Bh
18- 28
8
97
2
1
pl
Bfe
28- 36
9
98
2
0
pl
Cgg
>36
8
95
1
4
pl
A
0- 15
5
95
4
1
pl
Bv
Bv/C
Cgg
A/Ees
Ees
Bhfe
Cgg
15- 23
23- 68
>68
0- 20
20- 32
32- 46
>46
3
4
4
1
0
1
2
97
94
95
98
94
95
97
3
3
2
2
2
4
3
0
3
3
0
4
1
0
pl
pl
pl
pl
pl
pl
pl
AEes
Eesg
Bhs1
Bhs2
Bs
C
0-5
5-18
18-30
30-40
40-55
55+
5
7
5
4
2
3
pg
pg
pg
pg
pg
ps
Gleby Parku Narodowego Gór Stołowych
1
0
0
0
7
2
39
78
79
82
84
82
87
17
14
13
12
16
10
43
2
4
5
(A)Ees
0-3
0
77
21
2
pg
Eesg
3-11
0
80
15
5
pg
Bh
11-15
15
82
14
4
pg
Bhs
15-22
5
82
14
4
pg
Bs
22-40
0
88
8
4
ps
2BsC
40-70
0
90
8
2
ps
C
70+
0
90
4
6
ps
A
0-23
0
63
37
0
gp
Ees
23-28
15
66
31
3
gp
Bhfe
28-46
0
69
27
4
gp
C
46+
64
81
15
4
użp
A
0-10
14
76
24
0
pg
A/Ees
10-15
0
73
25
2
pg
Ees
15-25
0
72
24
4
gp
Bhfe
25-45
0
73
20
7
gp
C
45+
23
73
17
10
gp
Tab. 1. Skład granulometryczny badanych gleb
W badanych glebach wartość pH mierzona w 1-molowym KCl mieściła się
w granicach od 2,5 do 4,3 dla gleb PNGS i od 3,5 do 5,7 dla gleb PKDJ. Są
to zatem gleby silnie kwaśne, kwaśne, jak i lekko kwaśne, charakterystyczne
dla terenów leśnych [Kawałko i Kaszubkiewicz 2008].
W przypadku pH oznaczonego w wodzie destylowanej, jego wartości mieszczą się w przedziale od 3,5 do 6,3 w glebach parku krajobrazowego i od
3,2 do 4,7 w glebach parku narodowego. Niskie wartości pH sprzyjają uruchamianiu potencjalnie niebezpiecznych dla wzrostu i rozwoju roślin metali
ciężkich obecnych w glebach. Na ich rozmieszczenie w profilu glebowym
wpływają natomiast w dużym stopniu procesy glebotwórcze i glebowe oraz
zawartość substancji organicznej [Czarnowska 1983, 1996].
Zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Środowiska [2002] obszary badań, ze
względu na pełnioną funkcję zostały zaliczone do grupy „A” czyli obszarów
prawnie chronionych. Normy zawartości metali ciężkich w glebach obszarów
grupy A są wyjątkowo restrykcyjne. Dopuszczalne stężenie miedzi w glebach
tych obszarów ustalono na wysokości 30 mg.kg-1 gleby. W przypadku ołowiu, gleby niezanieczyszczone tym pierwiastkiem zawierają maksymalnie 50
mg.kg-1 gleby, zaś ilości cynku nie mogą przekraczać normy 100 mg.kg-1 gleby.
MIEDŹ (Cu). Całkowita zawartość miedzi (Tab. 2) w poziomach mineralnych badanych gleb mieści się w granicach od 0,10 mg.kg-1 do 8,00 mg.kg-1
w glebach Parku Krajobrazowego „Dolina Jezierzycy” i w przedziale od 2,45
44
mg.kg-1 do 9,65 mg.kg-1 w glebach Parku Narodowego Gór Stołowych. Na
żadnym z badanych obszarów zawartość Cu nie przekroczyła 19 mg.kg-1, co
według Kabaty-Pendias i Pendiasa [1999] świadczy o występowaniu tego
pierwiastka na poziomie naturalnym. Najwięcej Cu zgromadzone jest jednakże w poziomach próchnicy nadkładowej badanych gleb i kształtuje się
od 12,50 mg.kg-1 gleby do 27,60 mg.kg-1 gleby. Wysokie zawartości miedzi
w poziomach wierzchnich informują o źródle jej obecności w glebie [Kabała
i in. 1997]. Występowanie miedzi w tych poziomach jest wynikiem akumulacji biologicznej (liście i igliwie). Można także przypuszczać, że Cu pojawia
się w tych częściach profili glebowych na skutek transportu samochodowego. Porównując uzyskane wyniki z normami zawartymi w Rozporządzeniu
Ministra Środowiska [2002] nie stwierdza się przekroczenia norm zawartości miedzi w glebie, co potwierdzają wcześniejsze badania prowadzone na
opisywanym terenie [Kabała 2005, Kawałko i in. 2007], jak i w innych częściach Sudetów [Kabała 1998, Karczewska i in. 2004].
Nr profilu
OŁÓW (Pb). W poziomach mineralnych badanych gleb całkowita zawartość
Pb (Tab. 2) kształtuje się w granicach od 2,00 mg.kg-1 do 17,70 mg.kg-1 (gleby PKDJ) i od 8,35 mg.kg-1 do 38,20 mg.kg-1 (gleby PNGS). Pod względem
zawartości ołowiu badane gleby należy zakwalifikować do nieznacznie przekraczających tło geochemiczne (kilka poziomów glebowych), gdyż według
Kabaty-Pendias i Pendiasa [1999] dla gleb niezanieczyszczonych Polski zawartości Pb w glebach wynoszą 20 mg.kg-1. Podobne zawartości Pb w PNGS
otrzymali Karczewska i Kabała [2002]. W poziomach organicznych jego ilości są wyższe (13,8-22,8 mg.kg-1 gleby). Zawartość Pb w analizowanych glebach nie przekracza zawartości dopuszczalnej (50 mg.kg-1 gleby) określonej
w Rozporządzeniu Ministra Środowiska [2002].
Poziom
genetyczny
Głębokość
poziomu
[cm]
pH
H2O
Cu
Pb
Zn
[mg.kg-1]
KCl
Gleby Parku Krajobrazowego Dolina Jezierzycy
1
2
O
2-0
4,9
4,3
15
17,7
7
A1
0-29
4,8
4
8
17,7
11,5
A2
0-29
3,7
3,2
1,5
9,1
10
Bv
29-40
5,5
4,7
1,5
8,7
8,5
Bv/C
40-52
5,8
5,2
n.o.
n.o.
n.o.
Cgg
>52
6,3
5,7
n.o.
n.o.
n.o.
A
0-13
4,4
3,8
0,5
11,8
8
Ees
13-18
4,4
3,8
0,1
6,7
6,5
8,5
Bh
18-28
4,7
4,1
1,5
7,5
Bfe
28-36
5,6
4,9
n.o.
5,1
8
Cgg
>36
6
5,5
n.o.
3,5
6,5
45
3
4
O
3-0
4,9
4,1
12,5
16,9
6,5
A
0-15
3,8
3,4
2,5
7,9
9,5
Bv
15-23
4,6
4
0,1
2,4
6,5
Bv/C
23-68
4,9
4,1
n.o.
1,6
4
Cgg
>68
5,6
5
n.o.
n.o.
n.o.
7
O
4-0
4,5
3,8
24,5
21,7
A/Ees
0-20
3,5
3
n.o.
5,5
4
Ees
20-32
4,5
3,7
0,5
3,1
3,5
Bhfe
32-46
5,3
4,6
n.o.
3,5
6
Cgg
>46
5,7
5,1
n.o.
2
5
Oh(Ah)
1-0
3,6
2,7
27,6
22,8
57,35
AEes
0-5
3,6
2,9
5,95
34,6
17,6
Eesg
5-18
4
3,1
3,4
16,8
17
Bhs1
18-30
3,8
3,3
3,6
28,95
18,25
Bhs2
30-40
3,8
3,3
3,8
30,95
14,95
Bs
40-55
4,3
3,8
4,65
34,2
17,35
C
55+
4,5
4,2
4,65
21,6
20,65
(A)Ees
0-3
3,5
2,9
4,1
21,75
14,1
Eesg
3-11
4,1
3,1
3,85
16,5
12,4
Gleby Parku Narodowego Gór Stołowych
5
6
7
8
Bh
11-15
4
3,3
4,4
35,85
16,55
Bhs
15-22
4,4
4
3,9
26,55
15,85
Bs
22-40
4,7
4,3
3,45
17,65
27,05
2BsC
40-70
4,7
4,3
4,05
12,85
23,45
C
70+
4,7
4,1
6,1
17,2
23,7
A
0-23
3,3
3
5,15
38,2
13,75
Ees
23-28
3,7
3,3
2,65
11,15
8,35
Bhfe
28-46
4
3,8
4,35
9,6
20,3
C
46+
4,2
3,8
4,50
8,35
19,9
A
0-10
3,2
2,5
9,65
14,35
14,5
A/Ees
10-15
3,4
2,7
2,65
8,95
7,6
Ees
15-25
3,3
2,8
2,45
9,90
8,95
Bhfe
25-45
3,5
3,3
3,25
9,90
12
C
45+
4
3,7
5,45
11,85
26,1
Tab. 2. Zawartość wybranych metali ciężkich i pH (H2O i KCl) badanych gleb
CYNK (Zn). W poziomach mineralnych badanych gleb całkowita zawartość
cynku (Tab. 2) kształtuje się w granicach od 3,50 do 11,50 mg.kg-1 w glebach
PKDJ i od 7,60 do 27,05 mg.kg-1 w glebach PNGS. Są to niskie zawartości.
W żadnym z poziomów glebowych miedź nie występuje w ilościach wyższych niż typowych dla gleb niezanieczyszczonych Polski (30-125 mg.kg-1
w zależności od kategorii ciężkości gleb) [Kabata-Pendias, Pendias 1999].
46
Zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Środowiska [2002] dopuszczalna zawartość cynku dla obszarów chronionych należących do grupy „A” wynosi 100 mg.kg-1 gleby. Wartość ta nie została, więc przekroczona w żadnym
z poziomów glebowych. Podobne wyniki zawartości Zn uzyskali Karczewska i in. [2004], badając gleby zlokalizowane w sąsiedztwie szosy jakuszyckiej na obrzeżach Karkonoskiego Parku Narodowego.
Stwierdza się wyraźnie wyższe zawartości pierwiastków śladowych w glebach
Parku Narodowego Gór Stołowych niż w glebach Parku Krajobrazowego Doliny Jezierzycy (Rys. 1). Przyczyną takiego stanu rzeczy jest ukształtowanie terenu oraz wpływ chemizmu skały macierzystej na właściwości chemiczne wytworzonych z niej gleb [Kabała 2005, Kawałko 2000]. Można przypuszczać,
że gleby PNGS cechują się wyższymi zawartościami pierwiastków śladowych,
gdyż obszary górskie stanowią barierę orograficzną dla zanieczyszczeń atmosferycznych, często o wyższych koncentracjach metali ciężkich [Karczewska
i Kabała 2002, Kabała i in. 1997, Kabała 1998].
Rys. 1. Zawartość poszczególnych metali ciężkich w glebach PKDJ i PNGS
PODSUMOWANIE
Badania przeprowadzone na glebach dwóch obszarów chronionych Dolnego
Śląska - Parku Narodowego Gór Stołowych i Parku Krajobrazowego Dolina
Jezierzycy - wykazały, iż:
47
• gleby obu parków należą do gleb lekkich, o niewielkiej ilości frakcji ilastej, a w związku z tym posiadają niekorzystne właściwości chemiczne,
fizykochemiczne i biologiczne;
• charakteryzują się one mało zróżnicowanym odczynem - są to gleby silnie kwaśne, kwaśne oraz lekko kwaśne charakterystyczne dla terenów leśnych;
• gleby Parku Narodowego Gór Stołowych cechują się wyższymi zawartościami pierwiastków śladowych niż gleby Parku Krajobrazowego Dolina
Jezierzycy, co może być efektem ukształtowania terenu i wpływu skały
macierzystej na właściwości gleb;
• zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Środowiska w sprawie standardów
jakości gleby oraz standardów jakości ziemi z dnia 9 września 2002 r.
analizowane gleby nie wykazują przekroczenia dopuszczalnych zawartości metali ciężkich, tym samym transport samochodowy nie stanowi
dla nich większego zagrożenia;
• zaleca się dalsze prowadzenie badań na obu obszarach chronionych
w celu monitorowania zmian zawartości metali ciężkich w badanych
glebach i ewentualnego szybkiego reagowania w przypadku wystąpienia
realnego zagrożenia zanieczyszczeniem.
48
LITERATURA
Czarnowska K. 1983. Wpływ skały macierzystej na zawartość metali ciężkich
w glebach. Zesz. Prob. Post. Nauk Rol. 242: 51-61.
Czarnowska K. 1996. Ogólna zawartość metali ciężkich w skałach macierzystych
jako tło geochemiczne gleb. Rocz. Glebozn. 47, Supl. 43-50.
Kabała C. 2005. Geneza, właściwości i występowanie gleb bielicowych w zróżnicowanych
warunkach geoekologicznych Dolnego Śląska, Zeszyty Naukowe AR we Wrocławiu.
Nr 519. Rozprawy CCXXXIII, Wyd. AR we Wrocławiu, ss 169.
Kabała C. Karczewska A. Szaflicka B. 1997. Metale ciężkie w glebach Parku Narodowego Gór Stołowych wzdłuż Szosy 100 Zakrętów. Wyd. PNGS Szczeliniec,
Kudowa Zdrój 2: 9-14.
Kabała C. 1998. Pierwiastki śladowe w glebach Gór Izerskich. Zesz. Naukowe AR
we Wrocławiu, Rolnictwo LXXIII, 347: 95-106.
Kabata-Pendias A. Kabata H. 1999. Biogeochemia pierwiastków sladowych. PWN,
Warszawa.
Karczewska A. Kabała C. Lizurek S. Zając S. 2004. Zanieczyszczenie gleb metalami
ciężkimi w sąsiedztwie Szosy Jakuszyckiej na obrzeżach Karkonoskiego Parku
Narodowego. Opera Corcontica, 41, 1: 60-65.
Karczewska A. Kabała C. 2002. Pierwiastki śladowe w glebach PNGS. [w:] Gleby
Parku Narodowego Gór Stołowych, Monografia, Wydawnictwo PNGS, „Szczeliniec” 6: 133-136.
Kawałko D. 2000. Skład i właściwości gleb wytworzonych z różnych skał macierzystych
na terenie Ślężańskiego Parku Krajobrazowego, część I. Właściwości fizyczne, Zesz.
Nauk. AR we Wrocławiu, Rolnictwo LXXVII, 396: 29-47.
Kawałko D. Kaszubkiewicz J. 2008. Właściwości gleb wybranych siedlisk leśnych
na terenie Parku Krajobrazowego Dolina Jezierzycy, Rocz. Glebozn. LIX (3/4):
115-121.
Kawałko D. Kaszubkiewicz J. Woźniczka P. 2007. Zawartość metali ciężkich w glebach wybranych siedlisk leśnych na terenie Parku Krajobrazowego Dolina Jezierzycy. Ochrona
środowiska i zasobów naturalnych, IOŚ, Warszawa, z. 31: 23 - 27.
Kołodziejczyk K. Kawałko D. 2010. Wybrane właściwości gleb pod lasami grądowymi na terenie Parku Krajobrazowego „Dolina Jezierzycy”. Rocz. Glebozn.
t. LXI nr 1: 52-59.
Rozporządzenie Ministra Środowiska w sprawie standardów jakości gleb oraz standardów jakości ziemi z dnia 9 września 2002 r. (Dz. U. 2002 nr 165 poz.1359).
49
Katarzyna Kołodziejczyk
Katedra Botaniki i Ekologii Roślin
ul. Grunwaldzka 53, 50-357 Wrocław
Roman Pieprzka
Instytut Nauk o Glebie i Ochrony Środowiska
ul. Grunwaldzka 53, 50-357 Wrocław
Promotor: dr hab. inż. Klara Tomaszewska, prof. nadzw. UP
50
Małgorzata Koncewicz-Baran
Krzysztof Gondek
Agnieszka Ozimek
EPISTEME
14/2012
s. 51-58
ISSN 1895-4421
ZAWARTOŚĆ NIKLU W ROŚLINACH PO ZASTOSOWANIU
OSADÓW ŚCIEKOWYCH
NICKEL CONTENT IN PLANTS AFTER APPLICATION
OF SEWAGE SLUDGE
Abstrakt. Określenie wpływu osadów ściekowych ustabilizowanych różnymi metodami na plonowanie rzepaku jarego i owsa oraz zawartość niklu w biomasie przeprowadzono w oparciu o eksperyment wazonowy. Największe sumaryczne plony biomasy
zarówno w pierwszym, jak i w drugim roku badań uzyskano w obiekcie, w którym
zastosowano osad ściekowy ustabilizowany tlenowo. Zastosowane do nawożenia osady ściekowe nie spowodowały nadmiernej kumulacji niklu w częściach nadziemnych
roślin. Najwięcej niklu stwierdzono w częściach nadziemnych rzepaku jarego i owsa
w obiekcie, w którym zastosowano sole mineralne. Pierwiastek ten gromadzony był
głównie w korzeniach roślin. Rzepak jary i owies charakteryzowały zbliżone wartości
wskaźnika translokacji, przy czym istotny wpływ na wartość tego parametru wywierało
nawożenie. Największą wartość współczynnika bioakumulacji niklu w rzepaku stwierdzono po zastosowaniu osadu ściekowego ustabilizowanego tlenowo. Zastosowane nawożenie nie różnicowało wartości wskaźnika bioakumulacji niklu w owsie.
Słowa kluczowe: osad ściekowy, nikiel, rzepak jary, owies
Summary. Determination of the effects of sewage sludge stabilized by different
methods on the yields of spring rape and oat and the nickel content in the biomass was
based on the pot experiment. Both first and second year the biggest total biomass
yields were obtained from the object fertilized with aerobically stabilized sewage
sludge. Sewage sludges did not cause excessive accumulation of nickel in plants
aboveground parts. The greatest nickel quantities were assessed in aboveground parts
both spring rape and oat from the object with mineral salts treatment. This element
was mainly accumulated in the root system. Spring rape and oat were characterized by
similar values of translocation index, while the significant impact on the value of this
parameter caused fertilization. The biggest value of nickel bioaccumulation index was
found after application of aerobically stabilized sewage sludge. Applied fertilization
did not differ significantly the value of bioaccumulation index for oat.
Key words: sewage sludge, nickel, spring rape, oat
51
WSTĘP
Zgodnie z wytycznymi zawartymi w Krajowym Planie Gospodarki Odpadami [2014] w systemie gospodarowania tymi substancjami w najbliższych
latach dążyć się będzie do maksymalizacji wykorzystania składników biogennych zawartych w komunalnych osadach ściekowych. Należy pamiętać
jednak o obciążeniu tych odpadów m.in. metalami ciężkimi, co zwiększa ryzyko środowiskowego wykorzystania tych materiałów.
Osady ściekowe charakteryzują się bardzo zróżnicowaną zawartością metali ciężkich, a także różną ich biodostępnością [Gondek 2006]. Jak wskazują badania innych autorów [Jakubus i Czekała 2001] nikiel w osadach
ściekowych występuje głównie we frakcji rezydualnej, w postaci związanej
z materią organiczną oraz z amorficznymi tlenkami żelaza. Wprowadzenie do
gleby osadu ściekowego może modyfikować jej odczyn, pojemność sorpcyjną,
zawartość substancji organicznej, a także aktywność biologiczną, co wpływa
na mobilność niklu w środowisku glebowym [Kabata-Pendias i Pendias 1999].
Różnorodność form niklu wynikająca m.in. z właściwości gleby decyduje
o jego biodostępności. Nie bez znaczenia dla bioakumulacji niklu pozostaje
gatunek rośliny [Kabata-Pendias i Pendias 1999, Iżewska 2009]. Celem podjętych badań było określenie wpływu aplikacji do gleby ustabilizowanych
osadów ściekowych na ilość biomasy roślin oraz zawartość w nich niklu,
a także określenie wskaźników bioakumulacji i translokacji tego pierwiastka
w roślinach.
MATERIAŁ I METODY
Doświadczenie wazonowe przeprowadzono w latach 2010-2011 w hali wegetacyjnej Katedry Chemii Rolnej i Środowiskowej UR w Krakowie. Wazony PCV użyte w doświadczeniu mieściły 9,00 kg powietrznie suchego
materiału glebowego pobranego z warstwy 0-20 cm pola ornego zlokalizowanego w obrębie stacji doświadczalnej UR w Mydlnikach. Doświadczenie
obejmowało 5 obiektów prowadzonych w 4 powtórzeniach wg schematu:
0 – gleba bez nawożenia, M – gleba z dodatkiem soli mineralnych, OB
– gleba z dodatkiem obornika, OŚI – gleba z dodatkiem osadu ściekowego
ustabilizowanego tlenowo, OŚII – gleba z dodatkiem osadu ściekowego ustabilizowanego beztlenowo.
Doświadczenie założono na glebie o składzie granulometrycznym piasku gliniastego mocnego pylastego (klasyfikacja wg BN-78/9180-11) o odczynie lekko
kwaśnym. Wybrane właściwości materiału glebowego oznaczono przed rozpoczęciem badań metodami powszechnie stosowanymi w chemii rolnej [Ostrowska i in.
1991]. Kwasowość hydrolityczna gleby wynosiła 19,4 mmol(+)·kg-1 s.m., zawartość węgla organicznego - 7,90 g C·kg-1 s.m., a azotu ogólnego - 1,16 g·kg-1 s.m.
Ogólna zawartość niklu w glebie wynosiła 6,79 mg·kg-1 s.m.
52
Zawartość niklu w roślinach po zastosowaniu osadów ściekowych...
W badaniach zastosowano osady ściekowe (obiekty OŚ i OŚII) pochodzące
z mechaniczno-biologicznej oczyszczalni ścieków zlokalizowanej w Krakowie-Płaszowie. Osady różniły się sposobem stabilizacji. Osad OŚI stabilizowano w warunkach tlenowych, zaś osad OŚII w warunkach beztlenowych.
Jako odniesienie analizowanych cech w badaniach zastosowano średnio
przefermentowany obornik od trzody chlewnej. W materiałach organicznych
oznaczono podstawowe właściwości chemiczne według metodyki zamieszczonej w opracowaniu Barana i Turskiego [1996]. Wybrane właściwości materiałów organicznych zamieszczono w tabeli 1. Z wprowadzonym do gleby obornikiem (OB), osadem ściekowym ustabilizowanym tlenowo (OŚI) oraz osadem
ściekowym ustabilizowanym beztlenowo (OŚII) wniesiono odpowiednio 0,14
mg Ni, 1,27 mg Ni oraz 1,64 mg Ni·wazon-1.
Oznaczenie
Jednostka
Sucha masa
g · kg-1
159,8
225,7
140,9
Materia organiczna
g · kg-1 s.m.
839,7
504,5
485,0
7,73
6,35
7,81
4,03
3,04
1,65
36,72
46,38
42,17
11,72
32,77
34,00
pH (H2O)
Przewodność elektrolityczna
mS · cm-1
OB
OŚI
OŚII
Formy ogólne
N
P
g ∙ kg-1 s.m.
K
Ni
mg ∙ kg-1 s.m.
18,44
2,18
8,61
5,90
54,65
64,05
Tab. 1. Wybrane właściwości obornika i osadów ściekowych
zastosowanych w badaniach
Dawka azotu, w pierwszym roku badań w obiektach, w których zastosowano
nawożenie wynosiła 1,35 g N∙wazon-1, przy czym w obiektach, w których zastosowano obornik oraz osady ściekowe 80% dawki N wprowadzono z materiałami organicznymi, a 20% w formie wodnego roztworu czystej chemicznie soli
NH4NO3. We wszystkich obiektach (oprócz obiektu bez nawożenia) uzupełniono do jednakowego poziomu wprowadzonego z nawożeniem fosfor (do 1,134g
P∙wazon-1) i potas (do1,62 g K∙wazon-1) przy użyciu wodnych roztworów czystych chemicznie soli Ca(H2PO4)2∙H2O oraz KCl. W obiekcie, w którym zastosowano do nawożenia wyłącznie sole mineralne azot, fosfor i potas zastosowano
odpowiednio w formie: NH4NO3, Ca(H2PO4)2∙H2O, KCl. W drugim roku badań
we wszystkich obiektach, oprócz obiektu kontrolnego, zastosowano nawożenie
mineralne azotem, fosforem i potasem w formie wodnych roztworów związków,
jakie stosowano w roku pierwszym. Wprowadzone ilości składników wynosiły:
1,00 g N, 0,40 g P i 1,80 g K·wazon-1.
53
Rośliną testową w pierwszym roku badań był rzepak jary odmiany „Feliks”,
który zebrano w końcu fazy kwitnienia. W drugim roku badań rośliną testową był owies nagoziarnisty odmiany „Siwek” zebrany w fazie dojrzałości
mlecznej ziarna. Plon roślin rozdzielano na części nadziemne i korzenie, suszono do stałej wagi w temperaturze 70 oC w suszarce z przepływem gorącego powietrza, a następnie określano plon suchej masy. Wysuszony i rozdrobniony materiał roślinny zmineralizowano na sucho w piecu komorowym
(450 oC przez 5 godz.). Popiół roztworzono w rozcieńczonym (1:2) kwasie
azotowym (V). W uzyskanych roztworach oznaczono zawartość niklu metodą ICP-OES na aparacie Perkin Elmer Optima 7300DV, a uzyskane wyniki
przeliczono na absolutnie suchą masę materiału roślinnego.
Na podstawie uzyskanych wyników wyliczono wskaźnik translokacji (WT)
niklu jako iloraz zawartości tego pierwiastka w częściach nadziemnych do
zawartości w korzeniach przyjmując za 100 zawartość w korzeniach [Kopcewicz i Lewak 1998] oraz wartość współczynnika bioakumulacji (WB) jako iloraz zawartości niklu w częściach nadziemnych i korzeniach roślin oraz ogólnej
zawartości tego pierwiastka w glebie [Kabata-Pendias i Pendias 1999].
Uzyskane wyniki poddano ocenie statystycznej z uwzględnieniem analizy
wariancji jednoczynnikowej (czynnik: nawożenie) lub dwuczynnikowej
(czynniki: nawożenie i roślina) w zależności od analizowanego parametru.
Istotność różnic pomiędzy średnimi arytmetycznymi oszacowano za pomocą
testu Duncana przy poziomie istotności α < 0,05.
WYNIKI I DYSKUSJA
W obydwu latach badań w obiektach, w których zastosowano osady ściekowe
i obornik uzyskano więcej biomasy niż po zastosowaniu soli mineralnych (Tab.
2). Spośród materiałów organicznych najkorzystniej na ilość biomasy roślin,
zwłaszcza części nadziemnych, wpływał osad ściekowy ustabilizowany tlenowo (OŚI). Osad ściekowy ustabilizowany beztlenowo (OŚII) działał podobnie
jak obornik na ilość wytworzonej biomasy. Korzystny wpływ osadów ściekowych, zwłaszcza w stosowanych razem z nawożeniem mineralnym, na plonowanie roślin potwierdzają wyniki badań Jakubus [2006] i Iżewskiej [2009].
Zawartość niklu w biomasie zależała od gatunku rośliny, jej części oraz od
zastosowanego nawożenia. Oznaczone zawartości niklu nie budziły zastrzeżeń pod względem wykorzystania paszowego roślin [Gorlach i Gambuś
2000]. Większe zawartości niklu oznaczono w biomasie owsa (Tab. 3), co
potwierdza wyniki badań wskazujące na większą kumulację niklu przez tą
roślinę, zwłaszcza w porównaniu do innych roślin zbożowych (Kabata-Pendias i Pendias 1999). Najwięcej niklu oznaczono w częściach nadziemnych
roślin z obiektu, w którym zastosowano sole mineralne (M). Istotnie więcej
54
niklu zawierały części nadziemne roślin rzepaku jarego nawożonego osadem
ściekowym ustabilizowanym beztlenowo (OŚII) w porównaniu do zawartości, jaką oznaczono w roślinach z obiektów, w których zastosowano obornik
i osad ściekowy ustabilizowany tlenowo. Jakubus [2006] również nie zaobserwowała zróżnicowania zawartości niklu w częściach nadziemnych gorczycy i łubinu nawożonych osadem ściekowym ustabilizowanym tlenowo
w porównaniu do obornika.
Owies
Obiekt*
Rzepak jary
Części nadziemne
0
30,90 a**
4,31 a
35,21a
41,50 a
5,19 a
46,69a
M
52,91 b
7,88 bc
60,79b
79,88 b
8,13 b
88,01b
OB
59,73
7,36
67,09
91,25
10,66
101,91cd
OŚI
63,16 c
8,40 bc
71,56c
98,37 d
9,88 c
108,25d
OŚII
53,09
9,47
62,56
84,63
10,64
95,27bc
Korzenie
Suma
Części nadziemne
Korzenie
Suma
g s.m. ∙ wazon-1
c
b
b
c
bc
bc
c
bc
c
c
Tab. 2. Ilości biomasy rzepaku jarego i owsa. *Obiekty doświadczenia jak w metodyce. ** - Średnie oznaczone tymi samymi literami w kolumnach nie różnią się istotnie
wg testu Duncana przy α < 0,05; czynnik: nawożenie
Korzenie, niezależnie od gatunku rośliny, kumulowały kilkakrotnie więcej niklu niż części nadziemne. Najwięcej tego metalu zawierały korzenie rzepaku
jarego i owsa z obiektu, w którym do gleby wprowadzono osad ustabilizowany
beztlenowo (OŚII). Iżewska [2009] wskazuje na istotne zwiększenie kumulacji niklu w nasionach rzepaku i pszenżyta po zastosowaniu osadu ściekowego
w porównaniu do obornika. Badania te prowadzone były na glebie kwaśnej, co
mogło jednakże wpływać na większą biodostępność tego pierwiastka.
Owies
Obiekt*
Rzepak jary
Części nadziemne
0
1,71 a **
5,37 a
2,72 a
9,55 a
M
2,02
9,17
3,26
b
12,81 a
OB
1,62 a
8,60 b
2,55 a
12,77 a
OŚI
1,70
6,79
2,81
a
11,94 a
OŚII
1,89 b
2,65 a
17,66 b
Korzenie
Części nadziemne
Korzenie
mg Ni ∙ kg s.m.
-1
b
a
b
a
9,63 b
Tab. 3. Zawartość niklu w biomasie rzepaku jarego i owsa. * - Obiekty doświadczenia jak w metodyce. ** - Średnie oznaczone tymi samymi literami w kolumnach nie
różnią się istotnie wg testu Duncana przy α < 0,05; czynnik: nawożenie
55
Nie zaobserwowano istotnego statystycznie zróżnicowania w wartościach
wskaźnika translokacji niklu w roślinach w zależności od zastosowanego
nawożenia (Rys. 1). Wartość wskaźnika translokacji niklu zarówno dla rzepaku jarego, jak i owsa w obiektach, w których zastosowano osady ściekowe
i obornik nie przekraczały wartości 25. Największe wartości wskaźnika translokacji stwierdzono dla obu roślin w obiekcie bez nawożenia (0), co wynikało z małej akumulacji tego pierwiastka w systemie korzeniowym. Istotnie
większą wartość wskaźnika translokacji, niezależnie od rośliny, stwierdzono po zastosowania osadu ściekowego ustabilizowanego tlenowo (OŚI) niż
beztlenowo (OŚII). Według danych literaturowych nikiel jest pierwiastkiem
łatwo przemieszczanym z korzeni do części nadziemnych roślin, zwłaszcza
do ziarna i liści [Kabata-Pendias i Pendias 1999, Gondek 2007,], co również
wykazano w prezentowanych badaniach.
Statystycznie istotnie największe wartości współczynnika bioakumulacji niklu w rzepaku jarym stwierdzono po zastosowaniu osadu ściekowego ustabilizowanego beztlenowo (OŚII) (Tab. 4). W pozostałych wariantach doświadczenia nie stwierdzono istotnego zróżnicowania w wartości tego parametru.
Zastosowane nawożenie nie zróżnicowało istotnie wartości współczynnika
WB dla części nadziemnych i korzeni owsa za wyjątkiem obiektu, w którym
do gleby wprowadzono osad ściekowy ustabilizowany beztlenowo (OŚII),
który wpływał na zwiększenie bioakumulacji niklu w korzeniach. Również
Jakubus [2006] nie stwierdziła większego zróżnicowania wartości współczynnika bioakumulacji niklu w roślinach nawożonych osadami ściekowymi.
35
f*
ef
30
de
de
25
cd
bcd
ab
b
WT
20
bc
a
15
10
Rzepak
Owies
5
0
0
M
OB.
OŚI
OŚII
Obiekty
Rys. 1. Wartości wskaźnika translokacji (WT) niklu dla rzepaku jarego i owsa.
Obiekty doświadczenia jak w metodyce. *- Średnie oznaczone tymi samymi literami
nie różnią się istotnie wg testu Duncana przy α < 0,05; czynnik: nawożenie x roślina
56
Obiekty*
Części nadziemne
Korzenie
Rzepak jary
Owies
Rzepak jary
Owies
0
0,258 a**
0,405 a
0,803 a
1,433 a
M
0,313 bc
0,503 b
1,413 c
1,965 b
OB
0,290 ab
0,453 ab
1,523 c
2,270 b
OŚI
0,287
0,472
1,148
b
2,008 b
OŚII
0,342 c
1,740 d
3,198 c
ab
b
0,480 b
Tab. 4. Wartości współczynnika bioakumulacji (WB) niklu dla rzepaku jarego i owsa.
* - Obiekty doświadczenia jak w metodyce. ** - Średnie oznaczone tymi samymi
literami w kolumnach nie różnią się istotnie wg testu Duncana przy p < 0,05;
czynnik: nawożenie
WNIOSKI
• Istotnie większe plony biomasy roślin w obydwu latach badań uzyskano w obiektach, w których zastosowano osady ściekowe lub obornik
w porównaniu do obiektu, w którym zastosowano nawożenie mineralne.
• Doglebowa aplikacja osadów ściekowych nie spowodowała nadmiernej
akumulacji niklu w częściach nadziemnych roślin. Pierwiastek ten był
gromadzony głównie w korzeniach.
• Wartości wskaźnika translokacji niklu dla rzepaku i owsa były zbliżone
i zależały od zastosowanego nawożenia.
• Największą wartość współczynnika bioakumulacji niklu w rzepaku
stwierdzono po zastosowaniu osadu ściekowego ustabilizowanego tlenowo. Zastosowane nawożenie nie różnicowało wartości wskaźnika bioakumulacji niklu w owsie.
LITERATURA
Baran S., Turski R. 1996. Ćwiczenia specjalistyczne z utylizacji odpadów i ścieków.
Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Lublinie, 136 ss.
BN-78/9180-11: Gleby i utwory mineralne - podział na frakcje i grupy granulometryczne
Gondek K. 2007. Akumulacja metali ciężkich w owsie nawożonym kompostami. Acta
Agrophysica. 10 (1): 89-102
57
Gondek K. 2006. Zawartość różnych form metali ciężkich w osadach ściekowych i
kompostach. Acta Agrophysica, 8(4): 825-838
Gorlach E., Gambuś F. 2000. Potencjalnie toksyczne pierwiastki śladowe (nadmiar,
szkodliwość, przeciwdziałanie). Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych. 472: 275-296
Iżewska A. 2009. The impact of manure, municipal sewage sludge and compost prepared from
municipal sewage sludge on crop yield and content of Mn, Zn, Cu, Ni, Pb, Cd in spring
rape and spring triticale. Journal of Elelementology. 14(3): 449-456
Jakubus M., Czekała J. 2001 Heavy metal speciation in sewage sludge. Polish Journal
of Environmental Studies. 10(4): 245-250
Jakubus M. 2006. Ocena przydatności osadów ściekowych w nawożeniu roślin. Woda-Środowisko-Obszary Wiejskie, 6, 2(18): 87-97
Kabata-Pendias A., Pendias H. 1999. Biogeochemia pierwiastków śladowych. Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa, 388 ss.
Kopcewicz J., Lewak S. 1998. Podstawy fizjologii roślin. Wydawnictwo Naukowe
PWN Warszawa, 774 ss.
Krajowy Plan Gospodarki Odpadami 2014. Monitor Polski Nr 101, Poz. 1183
Ostrowska A., Gawliński A., Szczubiałka Z. 1991. Metody analizy i oceny gleby i
roślin. Wydawnictwo Instytutu Ochrony Środowiska, Warszawa, 325 ss.
Małgorzata Koncewicz-Baran, Agnieszka Ozimek
Katedra Chemii Rolnej i Środowiskowej
al. Mickiewicz 21, 31-120 Kraków
Opiekun naukowy: dr hab. inż. Krzysztof Gondek
58
Jakub Kośmider
Magdalena Greczuk
EPISTEME
14/2012
s. 59-66
ISSN 1895-4421
POZIOM EDUKACJI PRZYRODNICZO-LEŚNEJ DOTYCZĄCEJ
GROMADY REPTILIA W WOJEWÓDZTWIE MAZOWIECKIM
THE LEVEL OF NATURAL AND FORESTRY EDUCATION
REGARDING THE CLASS REPTILIA IN THE PROVINCE OF
MAZOVIA, POLAND
Abstrakt. Na przestrzeni kilkudziesięciu lat formy ochrony przyrody jakim podlegają
gady okazały się mało skuteczne. Dewastacja naturalnych siedlisk, odłów młodych
węży do prywatnych hodowli oraz strach przed nimi, poważnie zagrażają wszystkim rodzimych populacjom gadów. W pracy określono różnice w poziomie wiedzy
i świadomości ekologicznej dotyczącej gadów wśród licealistów kształcących się
w szkołach o odmiennych profilach nauczania. Badania ankietowe zostały przeprowadzone na terenie województwa mazowieckiego (miasta stołecznego Warszawy
oraz Wołomina) w czterech typach szkół średnich wśród 240 respondentów.
Słowa kluczowe: gady, świadomość ekologiczna, badania ankietowe
Summary. Nature conservation methods applied over the last several decades for the
preservation of snakes did not prove to be efficacious enough. Natural habitat destruction, young snakes’ private rearings and the fear of these reptiles severly threaten
all native populations of reptiles. This article shows the effect of environmental and
silvicultural education on the raising of ecological awareness in society (secondaryschool pupils) regarding their knowledge of reptiles. Survey research has been carried
out in the area of Mazovian province, in four types of secondary schools, among 240
respondents.
Key words: nature and silvicultural education, surver research
59
WSTĘP
Edukacja leśna społeczeństwa jest obecnie jednym z priorytetowych zadań
realizowanych przez Lasy Państwowe. Podstawowym jej celem jest upowszechnienie wiedzy o środowisku leśnym, zrównoważonej gospodarce,
racjonalnym korzystaniu z dóbr leśnych oraz zapoznanie z pracą i zawodem
leśnika [Kraczek 2011]. Wskazane jest, aby była traktowana przez leśników
m. in. jako ważne narzędzie do ochrony lasu oraz otaczającego środowiska.
Podejmując się tak trudnego i jakże odpowiedzialnego zadania, jednostki administracyjne Lasów Państwowych nie mogą pominąć kwestii formalnego
nauczania oraz instytucji i organizacji, które specjalizują się w nieformalnej
edukacji ekologicznej społeczeństwa.
Najważniejszym partnerem w aktywności edukacyjnej leśników jest szkoła.
W nowej, zreformowanej szkole edukacja ekologiczna jest mocno osadzona
w działaniach edukacyjnych i wychowawczych, co jest wynikiem odpowiednich zapisów w podstawowym dla niej dokumencie jakim jest obowiązująca podstawa programowa. Twórcy podstawy programowej podkreślają,
że założone cele kształcenia ekologicznego będą osiągane wówczas, gdy
w pełni zostaną wykorzystane możliwości aktywizowania uczniów poprzez
organizowanie przez nauczycieli różnorodnych działań w dużo większym
niż dotychczas kontakcie z przyrodą. We współczesnej szkole, zważywszy na to, że znaczna część uczniów żyjących w miastach zatraciła kontakt
z przyrodą, konieczne stało się organizowanie zajęć w terenie, głównie po to,
aby dostarczyć uczestnikom indywidualnych doświadczeń przyrodniczych.
Jednocześnie skłania to nauczycieli do poszukiwania odpowiednich miejsc
poza szkołą, które byłyby odpowiednie do przeprowadzenia zajęć w ramach
edukacji przyrodniczej, ekologicznej czy regionalnej. Obie strony – leśnicy
oraz nauczyciele – mają sobie wiele do zaoferowania. Nauczyciele dysponują wiedzą metodyczną i pedagogiczną, atutem zaś leśników jest wiedza
szczegółowa z różnych dziedzin nauki oraz bardzo dobra znajomość lasu,
poza tym umiejętność całościowego spojrzenia na przyrodę, poczucia piękna
i estetyki oraz zdolność do zawierania konstruktywnego kompromisu między
środowiskiem przyrodniczym, a nieustannie zmieniającymi się potrzebami
człowieka [Mrowińska i Mrowiński 2003].
Lasy w Polsce zajmują niespełna 30 % powierzchni kraju, a z tego 78 %
pozostaje w zarządzie Lasów Państwowych. Publiczna własność lasów ma
swoje liczne zalety, a pierwszato ta, że pozostają one powszechnie dostępne
dla społeczeństwa. Rosnąca świadomość i wrażliwość społeczna na sprawy
związane z ochroną środowiska, w tym lasów powoduje, że coraz więcej
środowisk, grup, stowarzyszeń, a nawet pojedynczych osób chce współdecydować o lasach, które są „nasze”. To dobre pod warunkiem, że oprócz autentycznej troski, dobrych chęci i często wielkich emocji – uczestnicy debaty
dysponują wiedzą i odpowiedzialnością za wygłaszane opinie. Wiedza o lesie
60
Poziom edukacji przyrodniczo-leśnej dotyczącej Gromady Reptilia...
w społeczeństwie polskim jest bardzo mała. W formalnej edukacji szkolnej
las pojawia się sporadycznie i niemal wyłącznie jako obiekt przyrodniczy, na
który składają się gatunki roślin i zwierząt powiązane zależnościami i który
z pewnością trzeba chronić. Często brak całkowicie, choćby podstaw wiedzy,
o możliwościach i wiekowej praktyce racjonalnego użytkowania zasobów leśnych. Na ogół, niestety brak nawet świadomości, że las jest obiektem przyrodniczym odnawialnym, co przecież jest fundamentem współczesnej gospodarki
leśnej w Polsce [Chrzanowski 2009].
Celem podjętych badań oraz analiz było ukazanie poziomu wiedzy z zakresu tematyki dotyczącej gadów oraz zaproponowanie rozwiązań podnoszących świadomość
ekologiczną uczniów kształcących się w szkołach o odmiennych profilach.
MATERIAŁY I METODY
Do przedstawienia prezentowanego zagadnienia wykorzystano metodę sondażu (badanie ankietowe). W marcu 2011r. przygotowano kwestionariusze
ankiet, które następnie zostały rozdane 240 uczniom klas pierwszych (16-17
lat), wśród czterech typów szkół średnich znajdujących się na terenie miasta
stołecznego Warszawy oraz miejscowości Wołomin w województwie mazowieckim podczas zajęć godziny wychowawczej. Dawało to możliwość bezpośredniej odpowiedzi na pojawiające się pytania ze strony uczniów.
Opracowana ankieta zawierała pięć zadań, gdzie pierwsze trzy dotyczyły pytań
z zakresu biologii i ekologii polskich gadów, zaś pozostałe dwa tyczyły się podejścia respondentów do gromady Reptilia. Pytania zamieszczone w ankiecie
były typu otwartego. Tematyka pytań dotyczyła zagadnień, które uczeń powinien
znać po półrocznym kursie kształcenie w szkole średniej. Polecenia miały na
celu sprawdzenie zarówno wiedzy ogólnej dotyczącej polskich gadów jak również zobrazować czy uczeń zna nowoczesne metody czynnej ochrony zwierząt,
które w przypadku tej gromady kręgowców mają znaczenie priorytetowe.
Wybór placówek oświatowo – wychowawczych, XIV LO im. Stanisława
Staszica, gdzie wszystkie klasy w szkole realizują rozszerzony poziom nauczania biologii, XI LO im. Mikołaja Reja w Warszawie – klasa biologiczna, Technikum Ekonomicznie im. Stanisława Staszica w Wołominie oraz
Liceum Profilowane w Wołominie o wiodących przedmiotach ekonomiczno – administracyjnych, umożliwił zobrazowanie poziomu wiedzy z zakresu omawianego materiału tyczącego się przedmiotu jakim jest biologia. Na
uwagę zasługuje fakt, że jedynie XIV LO im. Stanisława Staszica i XI LO
im. Mikołaja Reja, realizuje tematy dotyczące gromady gadów (Reptilia)
w ramach rozszerzonego poziomu nauczania przedmiotu biologia. W pozostałych szkołach standardy wymagań wobec uczniów winny dotyczyć jedynie: fizjologii człowieka, podstaw genetyki i ekologii.
61
WYNIKI
Przeprowadzone badania dały jednoznaczną odpowiedź na temat celowości
podejmowania działań ochronnych dotyczących gadów. Poprawne odpowiedzi uczniów z czterech badanych szkół zostały przedstawione na poniżej zamieszczonych wykresach.
Rys. 1. Zestawienie poprawnych odpowiedzi dotyczących ilości występujących
węży w Polsce
Rys. 2. Zestawienie poprawnych odpowiedzi dotyczących ilości węży
stanowiących zagrożenie dla człowieka
Analizując wyniki uzyskanych odpowiedzi (Rys. 1, 2, 3) możemy zaobserwować kilka zależności. Poziom edukacji przyrodniczo-leśnej na terenie badanych szkół w województwie mazowieckim nie jest zadowalający, na mało
które pytanie ponad połowa uczniów z jednego typu szkoły odpowiedziała
poprawnie.
62
Rys. 3. Zestawienie poprawnych odpowiedzi dotyczących liczebności
gromady Reptilia
Dodatkowo zaobserwować można, że przeanalizowanie materiału na lekcjach biologii dotyczącego gromady gadów, niekoniecznie odzwierciedla
poprawność odpowiedzi w XIV LO im. Stanisława Staszica w Warszawie.
Prawdopodobnie wynika to z faktu, że nauczyciele dużo więcej uwagi poświęcają na zapoznanie uczniów z nowymi cechami ewolucyjnymi gadów
niż z potrzebami ochrony rodzimej herpetofauny. Nieoczekiwanym wynikiem okazało się wysokie miejsce w rankingu poprawnych odpowiedzi
w Liceum Profilowanym (Rys. 2, 3). Biorąc pod uwagę obowiązującą podstawę programową możemy zaobserwować, że nauczanie biologii w takiej
szkole jest bardzo zredukowane, co daje nam po raz kolejny informację
o tym, że wiedza zdobyta w ramach zajęć lekcyjnych nie zawsze pokrywa się
z umiejętnościami poruszania się i egzystencji uczniów w terenie. Najlepsze
rezultaty prowadzonej edukacji ekologicznej miałyby miejsce w przypadku
gdzie bezpośrednio po odbytych zajęciach w klasie, uczniowie mieliby szansę zweryfikować zdobyte informacje bezpośrednio w terenie.
W kolejnych dwóch pytaniach, 4 i 5, poruszono kwestie unormowań prawnych ochrony gadów w Polsce.
Wyniki powstałe z opracowania pytania nr 4, Rys. 4 okazały się satysfakcjonujące. Około 64% (154 osoby udzieliły poprawnej odpowiedzi) badanych
respondentów dostrzega konieczność ochrony gromady Reptilia. Uczniowie
zdają sobie sprawę z konieczności ochrony tych kręgowców jednak, mało
który z nich potrafi wymienić zabiegi pomagające chronić polskie gady. Ponadto 19% ankietowanych nie udzieliło żadnej odpowiedzi.
63
Rys. 4. Zestawienie poprawnych odpowiedzi dotyczących „ochronności” gadów
Pytanie piąte było pytaniem otwartym. Poproszono uczniów o wskazanie kilku przykładów czynnej ochrony gadów. Wyniki okazały się niezadowalające.
Rys. 5. Zestawienie poprawnych odpowiedzi dotczących metod ochrony czynnej gadów
Większość ankietowanych nie udzieliło odpowiedzi na postawione pytanie.
Jedynie 12% respondentów udzieliło poprawnej i wyczerpującej odpowiedzi. Kolejne 33% odpowiedziało częściowo poprawnie na zadanie piąte (respondenci udzieli informacji o jednej metodzie z co najmniej dwóch, o które
zostali poproszeni). Ponad połowa badanych uczniów (55%) pozostawiło
pytanie bez odpowiedzi.
64
DYSKUSJA
Pomimo już niemal trzydziestoletniego propagowania aktywnych metod
ochrony gadów i płazów w Polsce dostęp do informacji dla przeciętnego
odbiorcy jest znacznie utrudniony. Społeczeństwo często nie zdaje sobie
sprawy jakie działania ochronne są podejmowane w naszym kraju, a przede
wszystkim, czemu one służą. Żeby temu przeciwdziałać konieczne jest odpowiednie edukowanie społeczeństwa już od najmłodszych lat. Jednym z zadań
edukacji przyrodniczo - leśnej jest kształtowanie należytych postawy wobec
otaczającej przyrody oraz promowanie działań umożliwiających przełamanie negatywnego odbioru węży, kształtowanego przez szereg pokoleń. Węże,
z którymi to przede wszystkim utożsamiane są gady, w naszej kulturze praktycznie od zawsze wzbudzały negatywne emocje. Prawdopodobnie wynikało
to z licznych zabobonów dotyczących ich biologii czy specyficznego zachowania. Jeszcze do niedawna, na wsiach, można było usłyszeć opowiadania
o wężach, które pod osłoną nocy zbliżają się do wymion krów, aby pić ich
mleko. Stwierdzenia te, okazywały się na tyle realistyczne, że opisywano
przypadki jakoby węże podczas takiego procederu stawały się nad wyraz
niewrażliwe i można je było spokojnie złapać i unieszkodliwić. Zaskrońcom,
żmijom czy też innym gatunkom węży przypisywano zdolności hipnotyzerskie.
Kolejny sąd, którego interpretacja pozostawia wiele do życzenia. Zwierzęta te
posiadają „nieruchomy” wzrok a przypisywane zdolności hipnotyzerskie wynikają wyłącznie z wybujałej ludzkiej fantazji. Nie zawsze jednak mówiono
o wężach pejoratywnie [Jaroniewski 1984].
Wierzenia ludowe, pomimo, że nie zawsze prawdziwe przyczyniły się do
naszej odrębności kulturowej i indywidualności narodowej. Pamiętajmy,
jednak, że niski poziom edukacji i świadomości ekologicznej społeczeństwa
dotyczący, z jednej strony całej gromady zwierząt, z drugiej zaś strony pojedynczego gatunku w niedalekiej przyszłości może doprowadzić do zagłady
rodzimych gatunków gadów. Należy wspierać kampanie edukacyjne mające
na celu propagowanie zadań kształtujących poprawne postawy ekologiczne.
Nie możemy bowiem dopuścić, aby brak wiedzy oraz podtrzymywanie abstrakcyjnych opowieści doprowadził do wymarcia choćby jednego naszego
rodzimego gatunku gada.
WNIOSKI
Przeprowadzone badania na terenie województwa mazowieckiego, dotyczące wiedzy ogólnej z zakresu gromady gadów dały wynik niezadowalający.
Pokazały, że wiedza dotycząca otaczającego nas środowiska jest niepełna.
Uczniowie w wieku 16-17 lat nie potrafią trafnie wskazać przedstawicieli
gromady gadów, a świat płazów i gadów traktują jako jedność. Zajęcia do65
tyczące wyżej wymienionych gromad powinny być przeprowadzane w okresie wiosennym, kiedy po wstępie teoretycznym nauczyciel ma możliwość
i wykazuje na tyle zaangażowania, aby pokazać odpowiednie gatunki bezpośrednio w terenie, oczywiście na tyle, na ile pozwalają mu na to warunki
lokalizacyjne szkoły. Tego typu zabiegi umożliwiają niejako promowanie
zachowań proekologicznych i dostarczają wiedzy prakseologicznej z danego
zagadnienia. Chcąc uzyskać zadawalające efekty nauczania należy połączyć
teorię z praktyką. Uczeń powinien otrzymać podstawowe informacje dotyczące danego zagadnienia przyrodniczego, a następnie uzyskać możliwość
zweryfikowania go w przyrodzie, oczywiście na tyle, na ile jest to możliwe.
LITERATURA
Chrzanowski T. 2009. Edukacja leśna społeczeństwa w Lasach Państwowych - jaka
jest, jaka może być. Postępy techniki w leśnictwie, 105: 13-20.
Jaroniewski W. 1984. Jadowite węże świata. Wydawnictwo Szkolne i Pedagogiczne.
Warszawa.
Kraczek J. 2011. Lasy Lubelszczyzny Regionalny Przewodnik Leśny. Wojewódzki
Fundusz Ochrony Środowiska i Gospodarki Wodnej. Lublin.
Mrowińska I. Mrowiński P. 2003. Treści edukacji leśnej oraz ich realizacja. Poradnik
edukacji leśnej, 5: 7-9.
Wydział Leśny
Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie
ul. Nowoursynowska 166, 02-787 Warszawa
mail: [email protected], [email protected]
Opiekun naukowy: dr hab. Michał Wasilewski, prof. nadzw. SGGW,
prof. dr hab. Andrzej Grzywacz
66
Edyta Kruk
Kamila Dedio
Marek Ryczek
EPISTEME
14/2012
s. 67-76
ISSN 1895-4421
OCENA ZAGROŻENIA EROZJĄ WODNĄ ZLEWNI POTOKU SMUGAWKA W BESKIDZIE MAKOWSKIM Z WYKORZYSTANIEM
TECHNIK GIS
EVALUATION OF WATER EROSION THREAT OF THE SMUGAWKA
STREAM BASIN IN THE BESKID MAKOWSKI USING GIS
TECHNIQUES
Abstrakt. W pracy przedstawiono wyniki oceny potencjalnego zagrożenia erozją
wodną górskiej zlewni potoku Smugawka w Beskidzie Makowskim. Do oceny wykorzystano model USLE, którego parametry oszacowano z zastosowaniem technik
GIS. Powierzchnia zlewni wynosi 5,40 m2. Średnia wysokość zlewni osiąga 636,4
m npm. Średni spadek zlewni wynosi 21,31 %. Zlewnia w 54,26 % zajęta jest przez lasy,
w 34,63% przez grunty orne, a pozostały obszar stanowią użytki zielone i nieużytki.
Do oceny zagrożenia erozją wodną zastosowano 6-cio stopniową skalę. Obszary jednorodne pod względem zagrożenia erozyjnego wyróżniono na podstawie nakładania
się warstw tematycznych określających poszczególne parametry modelu. Zlewnia
charakteryzuje się korzystnym rozkładem lasów, pokrywają one miejsca o najwyższych spadkach. Silne zagrożenie erozyjne występuje jedynie na niewielkich obszarach użytkowanych jako grunty orne o nieprawidłowym kierunku upraw.
Słowa kluczowe: erozja wodna, model USLE, GIS
Summary. The results of evaluation of potential erosion water threat of the mountainous basin of the Smugawka basin located In the Beskid Makowski was presented in
the work. For the evaluation the model USLE was used. The parameters for the models the GIS techniques were used. The area of basin amounts 5,40 m2, mean height
636,4 m asl and mean basin slope 21,31 %. Forests occupy 54,26 % of the basin area,
while arable land 34,63%. The rest of the area is covered by grasslands and barren
land. For the evaluation of water erosion threat the six degree scale was used. The
homogenous areas regarding erosion threat were distinguished based on imposition
of overlayers determining the following model parameters. The basin is characterized
by very advantageous of forests distribution, they cover areas of the highest slopes.
The high erosion threat occurs only on small areas used as arable land of unsuitable
plough direction.
Key words: water erosion, model USLE, GIS
67
WSTĘP
Erozja wodna będąca naturalnym procesem, znacznie przyczynia się do formowania powierzchni zlewni [Józefaciuk i Józefaciuk 1992]. Skutki erozji
są powszechnie znane i znajdują swoje odzwierciedlenie przede wszystkim
w niszczeniu wierzchniej, próchniczej warstwy gleby. Nawet niewielkie
natężenie erozji negatywnie wpływa na warunki uprawne i plonowanie,
a zdzierana i spłukiwana warstwa humusu obniża żyzność gleby co w efekcie może doprowadzić do całkowitego wyłączenia danego obszaru z upraw
polowych lub do poważnych utrudnień w prowadzeniu zabiegów agrotechnicznych [Żmuda i in. 2005].
Celem pracy była ocena zagrożenia erozją wodną na przykładzie górskiej
zlewni potoku Smugawka w Beskidzie Makowskim. Potok ten jest częścią
zlewni potoku Lubieńka. Profil wodowskazowy zamyka obszar badawczy
w miejscowości Tenczyn - Smuga. Powierzchnia zlewni liczy 5,40 km2. Jest
słabo wydłużona i średnio zwarta (wskaźnik zwartości wynosi 1,27). Długość zlewni wynosi 3,08 km, szerokość 1,75 km, a obwód 10,85 km. Średnia wysokość zlewni to 636,4 m npm. Najwyższy punkt ma rzędną 857,9
m npm, a najniższy - 415,0 m npm. Potok główny ma długość 4,42 km
i spadek 6,22%. Gęstość sieci rzecznej wynosi 2,43 km·km-2. Charakteryzuje się dość korzystnym rozmieszczeniem lasów w zlewni. Zajmują one
głównie całą północną i część południowego fragmentu zlewni. Wskaźnik
rozwinięcia lesistości wynosi 0,85. Pod względem składu granulometrycznego badana zlewnia charakteryzuje się dużym zróżnicowaniem. Największą
powierzchnię zajmuje glina zwykła, która występuje w całej północnej i na
niewielkich obszarach w pozostałej części. Mniejszą powierzchnię zajmuje
glina piaszczysto-ilasta występująca w południowej części. Na niewielkich
powierzchniach w części wschodniej i południowej znajduje się glina ilasta,
pył ilasty i glina piaszczysta.
MATERIAŁY I METODY
W literaturze przedmiotu dostępnych jest kilka generacji modeli erozyjnych opisujących spływ wody oraz zjawiska erozji, z których najbardziej znanym i szeroko
w świecie wykorzystywanym jest propozycja Wischmeiera i Smitha (1978) w postaci tzw. modelu USLE. Formuła USLE ma postać [Banasik i Górski 1991]:
A = S · L · R · P ·C · K (t·ha-1·rok-1) (1)
gdzie: A – średnia z wielolecia roczna masa erodowanej gleby z jednostki
powierzchni (t·ha-1·rok-1), R – wskaźnik erozyjności deszczu (Je), K - wskaźnik podatności gleb na erozję (t·ha-1·Je-1), L – wskaźnik długości zbocza (-),
S – wskaźnik spadku zbocza (-), C – wskaźnik pokrywy roślinnej (-),
P –wskaźnik zabiegów przeciwdziałających erozji (-).
68
Ocena zagrożenia erozją wodną zlewni potoku Smugawka...
Poszczególne parametry modelu wyznaczono z wykorzystaniem technik
GIS, w wyniku nałożenia odpowiednich warstw tematycznych. Gleby występujące na terenie badanej zlewni zakwalifikowano do odpowiednich grup
na podstawie mapy glebowo-rolniczej w skali 1:25000 i badań terenowych.
Klasyfikację uziarnienia gleb określono na podstawie Normy BN/78/918011. Strukturę użytkowania zlewni sporządzono w oparciu o ortofotomapę
uzyskaną z panchromatycznego zobrazowania satelity IRS, w skali 1:25000.
Warstwy tematyczne zostały opracowane przy wykorzystaniu programu
komputerowego MapInfo Professional 8.0 (Rys. 1).
Rys. 1. Warstwy tematyczne opracowane przy wykorzystaniu technik GIS
zlewni potoku Smugawka
69
Wskaźnik erozyjności deszczu (R) wyznaczono na podstawie indeksu Fouriera w modyfikacji Arnouldsa (1977). Indeks wykazuje dobrą korelację
ze wskaźnikiem R (Licznar 2005). Indeks Fouriera obliczono jako średnią
z wielolecia dla całej zlewni, ze wzoru:
gdzie: m – liczba lat w wieloleciu, pi,j – suma miesięczna opadu w i-tym
miesiącu, w j-tym roku (mm), Pj – suma roczna opadu w j-tym roku (mm).
Bazując na wartości indeksu Fouriera wyznaczono wskaźnik erozyjności
deszczu, przystosowując wartość do jednostki Je (MJ·ha-1·cm·h-1), mnożąc
F przez 1,702 (Renard i in. 1996).
Wskaźnik podatności gleb na erozję (K) obliczono według Renarda i in. (1997):
(3)
gdzie:
Przy czym, dla każdej frakcji granulometrycznej cząstek glebowych:
di – maksymalna średnica ziaren w danej klasie (mm), di-1 – minimalna średnica ziaren w danej klasie (mm), fi – udział masowy (%). Współczynnik Dg
wyznaczono na podstawie oznaczeń składu granulometrycznego, metodą
Casagrande’a w modyfikacji Prószyńskiego, sklasyfikowano według BN78/9180-11.
Wskaźniki długości i spadku zbocza (L,S) połączono w jeden współczynnik
– wskaźnik rzeźby terenu – LS i wyznaczono z następujących wzorów (Mc
Cool i in. 1989):
- długość zbocza równa drodze spływu powierzchgdzie: niowego (m), DA–powierzchnia zlewni (m2), Ls – długość wszystkich cieków w zlewni (m), s – spadek zbocza (%), m – wykładnik potęgowy zależny od spadku zbocza [Stone i Hilborn 2000]: m = 0,2, gdy
s ≤ 1,0%, m = 0,3, gdy 1,0 < s < 3,0%, m = 0,4, gdy 3,0 ≤ s < 5,0%, m = 0,5, gdy s ≥ 5%.
70
Wskaźnik pokrywy roślinnej (C) przyjęto za Koreleskim (1992): dla owsa
jarego - 0,104, pszenicy ozimej – 0,100, ziemniaków – 0,229, użytków zielonych – 0,015, lasów – 0,002, terenów zabudowanych – 0 i obliczono jego
średnią ważoną wartość dla całej zlewni.
Wskaźnik zabiegów przeciwdziałających erozji (P) przyjęto za Koreleskim
(1992) w następujący sposób: dla upraw wzdłuż stoku P = 1, dla upraw
w poprzek stoku przyjmuje wartości w zakresie od 0,5 do 1,0 w zależności od
spadku. Kierunki upraw określono na podstawie ortofotomapy satelitarnej.
WYNIKI I DYSKUSJA
Poszczególne elementy USLE wyznaczono w niżej opisany sposób:
arametr R - przyjęto jako średnia z wielolecia 1999 - 2008, z posterunku
P
opadowego reprezentatywnego dla badanej zlewni, jego wartość średnia wyniosła 193,461 Je.
Parametr K – jego średnie wartości wyróżnionych grup granulometrycznych
wahały się od 0,279 do 0,430 t·ha-1·Je–1. Wartość średnia ważona dla całej
zlewni, obliczona według procentowego rozkładu grup granulometrycznych,
wyniosła 0,340 t·ha-1·Je–1. Ze względu na niewielkie zróżnicowanie tego
współczynnika przyjętą tą wartość jako charakterystyczną dla całego badanego obszaru (Tab. 1).
Grupa
granulometryczna wg
BN-78/9180-11
Powierzchnia
(km2)
Udział
w zlewni (%)
Wartość średnia K
dla grupy (t·ha-1·Je–1)
Liczba
próbek
gi
0,20
3,71
0,395
2
pyi
0,35
6,48
0,430
1
gp
0,02
0,37
0,219
2
gpi
gz
Razem
1,41
3,42
5,40
26,11
63,33
100,00
0,279
0,354
-
2
4
11
Tab. 1. Udział grup granulometrycznych w zlewni i obliczenie średnich wartości parametru K
Parametr LS - w zlewni przeważają spadki > 27% . Stanowią one 38,89%
powierzchni ogólnej. Znacznie mniej jest spadków najmniejszych < 5%
(1,30%) (Tab. 2). Średni spadek zlewni wynosi 21,32%. Ze względu na przeważające prostoliniowe kształty stoków nie uwzględniano ich niejednorodności. Wydzielono 4 obszary jednorodne pod względem wartości iloczynu
LS. W obszarze I wartość LS wyniosła 0,139, w 2 – 0,602, w 3 – 1,336,
a w 4 – 4,376. Największą powierzchnię (38,89%) zajmuje obszar IV.
71
Parametr C - w strukturze użytkowania przeważają lasy (54,26%), grunty
orne zajmują 34,63% natomiast użytki zielone 8,15%. Pozostałą część stanowią tereny zabudowane. Na gruntach ornych w roku wykonania zdjęć satelitarnych owies jary zajmował 42%, pszenica ozima 39% a ziemniaki 19%
ich powierzchni.
Parametr P - biorąc pod uwagę średni spadek zlewni (21,32%) oraz fakt iż na
terenie zlewni przeważa uprawa w poprzek stoku przyjęto wartość parametru
P równą 0,9.
Przedział
spadków (%)
Pow.
(km2)
Udział
w zlewni (%)
<5
0,07
1,30
5-10
0,58
10,74
10-18
1,37
18-27
1,28
Obszar
Udział w
Pow. (km2)
jednorodny
zlewni (%)
Wartość
LS (-)
I
0,65
12,04
0,139
25,37
II
1,37
25,37
0,602
23,70
III
1,28
23,70
1,336
>27
2,10
38,89
IV
2,10
38,89
4,376
Razem
5,40
100,00
-
5,40
100,00
-
Tab. 2. Rozkład spadków w zlewni potoku Smugawka i obszary jednorodne parametru LS
Obliczenie potencjalnej erozji wodnej
Przeprowadzone modelowanie doprowadziło do podziału obszaru zlewni na
strefy zagrożenia erozją wodną w oparciu o kryteria zaproponowane przez
Marksa i wsp. (1989) (Tab. 3). Po nałożeniu warstw tematycznych związanych z kolejnymi parametrami uzyskano łącznie 24 pola jednorodne, o takim
samym natężeniu erozji wodnej. Wielkość potencjalna strat z obszarów jednorodnych wahała się od 0,017 do 62,389 t·ha-1·rok-1. Skala wyróżniona na
podstawie rocznych strat w tonach na ha 6 klas natężenia: I (brak <1), II (bardzo małe 1-5), III (małe 5-10), IV (średnie 10-15), V (wysokie 15-30) i VI
(bardzo wysokie >30). W badanej zlewni największą powierzchnię zajmują
grunty nie zagrożone erozją. Są one zajęte przez lasy i użytki zielone. Prawie
23% powierzchni znajduje się w obszarach zagrożonych bardzo małym natężeniem erozji. Znajdują się one w terenach zajętych przez grunty orne. Łączna
potencjalna wielkość rocznej straty gleby na terenie zlewni wynosi 2009,54 t,
co w przeliczeniu na 1 ha daje średnią wartość 3,35 t, a to klasyfikuje badaną
zlewnię jako bardzo mało zagrożoną (II klasa). Zróżnicowanie erozji wodnej
gleb w przestrzeni zlewni przedstawiono na Rys. 2.
72
Średnie jednostkowe natężenie
erozji wodnej
Udział
Klasa⃰
Wielkość całkowita
erozji wodnej
%
km2
(t·ha-1·rok-1)
(t·km2·rok-1)
(t·rok-1)
I
63,33
3,42
0,342
34,2
116,96
II
22,59
1,22
2,822
282,2
344,28
III
4,82
0,26
8,617
861,7
224,04
IV
3,15
0,17
10,314
1031,4
175,34
V
2,78
0,15
23,691
2369,1
355,37
VI
3,33
0,18
44,086
4408,6
793,55
Total
100,00
5,40
-
-
2009,54
Tab. 3. Obliczenie potencjalnej wielkości erozji wodnej. * - Klasy zagrożenia erozją
wodną wg Marksa i wsp. (1989)
Rys. 2. Rozmieszcznie klas potencjalnego zagrożenia erozją wodną
w zlewni potoku Smugawka
73
WNIOSKI
• Potencjalna roczna strata gleby z całej badanej zlewni obliczona przy wykorzystaniu modelu USLE wynosi 2009,54 t.
• Obliczona jednostkowa strata gleby z 1 ha wyniosła 3,35 t, co pozwala na
ocenę badanej zlewni jako bardzo mało zagrożonej.
• Ponad 63% powierzchni nie wykazuje się zagrożeniem erozyjnym.
• Techniki GIS mogą stanowić istotne narzędzie do dalszego rozwoju modelu USLE. Szczególnej uwagi wymaga parametr LS, który w skali zlewni
charakteryzuje się największym zróżnicowaniem spośród pozostałych.
LITERATURA
Arnoulds H.M.J., 1977. Methodology used to determine the maximum potential average annual soil loss due sheet and rill erosion in Morocco, [w:] Assesing Soil
Degradation. FAO Soil Bulletin 34, Rome: 39-48
Górski D., Banasik K., 1992. Rozkłady prawdopodobieństwa erozyjności deszczy dla
Polski południowo-wschodniej. Zesz. Nauk. AR Kraków, Sesja Naukowa 35, 271:
125-131
Józefaciuk A., Józefaciuk Cz. 1992. Struktura zagrożenia erozją wodną fizjograficznych krain Polski. Pamiętnik Puławski, 101, 23-49
Koreleski K., 1992. Próby oceny natężenia erozji wodnej. Zesz. Nauk.
AR w Krakowie, Sesja Naukowa, z. 35:25-32
Licznar P., 2005. Ocena możliwości stosowania sztucznych sieci neuronowych dla
określenia średniej rocznej wartości wskaźnika erozyjności deszczy. ��
Acta Agrophisica, 5(1):65-74
Marks R., Müller M.J., Leser H., Klink H.J., 1989. Anleitung zur Bewertung des Leistungvermögens des Landschaftshaushaltes (BA LVL). Forschungen zur Deutschen
Landeskunde Band 229, Zentralaussuss für deutsche Landeskunde, Selbstverlag,
Trier.
Mc Cool D.E., Foster G.R., Mutchler C.K., Meyer L.D., 1989. Revised slope length factor for the Universal Soil Loss Equation. Trans. ASAE, 32:1571-1576
Renard K.G., Foster G.R., Weesies G.A., Porter J.P., 1996. RUSLE: Revised Universal Soil Loss Equation. Journal od Soil and Water Conservation, 46(1):30-33
74
Renard K.G., Foster G.R., Weesies G.A.,McCool D.K., Yoder D.C., 1997. Predicting
soil erosion by water: a guide to conservation planning with the revised Universal
Soil Loss Equation (RUSLE). USDA, Agricultural Handbook, 703
Stone R.P., Hilborn D., 2000. Universal soil loss equation (USLE). Ontario: Min.
Agricult. Food Rural Affairs
Wischmeier W.H., Smith D.D. 1978. Predicting Rainfall erosion losses – a guide to
conservation planning; Supersedes Agriculture Handbook No.282; Washington,
4-11.
Żmuda R., Sasik J., Szewrańska Sz. 2005. Analiza potrzeb zmian zagospodarowania
przestrzennego wzgórz trzebnickich w aspekcie ochrony przed erozją wodną gleb.
Acta Agrophysica 5 (1), 229-237, Wrocław
dr inż. Marek Ryczek, mgr inż. Edyta Kruk, mgr inż. Kamila Dedio
Katedra Rekultywacji Gleb i Ochrony Torfowisk
Wydział Inżynierii Środowiska i Geodezji
Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Krzysztof Boroń
75
Anna Lehmann
Marta Jabłońska
Magdalena Giemza-Mikoda
EPISTEME
14/2012
s. 77-83
ISSN 1895-4421
WALORY PRZYRODNICZE PARKU PRZYPAŁACOWEGO
W WOLSZTYNIE
NATURAL VALUES OF THE PALACE PARK IN WOLSZTYN
Abstrakt. Województwo wielkopolskie słynie z dużej ilości pałaców i towarzyszącym
im parków, które w wielu przypadkach zachowały się w dobrym lub nawet bardzo dobrym stanie. Park Miejski w Wolsztynie uważany jest za jedno z najciekawszych, pod
względem przyrodniczym i historycznym, założeń ogrodowych istniejących na terenie powiatu wolsztyńskiego. Informacje na temat bogactwa taksonomicznego gminy
Wolsztyn doczekały się swoich publikacji. Niestety szczegółowe dane dotyczące flory
Parku Miejskiego zostały w nich pominięte. Nieliczne z pojawiających się wzmianek dotyczących zieleni kompleksu pałacowego są ogólnikowe i nie odzwierciedlają
pełnej różnorodności badanego obiektu. Celem publikacji jest przedstawienie walorów przyrodniczych Parku Miejskiego w Wolsztynie, czyli zobrazowanie bogactwa
flory występującej na badanym terenie. Ze względu na znaczne rozmiary parku pałacowego, przy pracach badawczych wzięto pod uwagę wyłącznie pewną jego część.
W pracy określono również stopnie synantropizacji, a także wymagania siedliskowe
gatunków, przyporządkowanych do odpowiednich klas.
Słowa kluczowe: gatunki chronione, klasy fitocenotyczne, pomniki przyrody, rodziny
botaniczne, status synantropizacji, wymagania siedliskowe
Summary. Wielkopolskie province is famous for its large amount of palaces and accompanying parks, many of which are preserved in good or very good condition. City
Park in Wolsztyn is regarded as one of the most interesting, in terms of natural and
historical assumptions of the existing garden area of the district Wolsztyn. Information on taxonomic richness of Wolsztyn are comprised in some publications. Unfortunately, data on the flora of Town Park were omitted. Few mentions on palace greenery
complex are vague and do not express the whole diversity of test object. The purpose
of paper is presentation of environmental values of the City Park in Wolsztyn, which
illustrates the richness of flora occurring in the investigated area. Due to the large size
of the palace park, during research work the only a part of it was examined. In the
paper also degrees of synanthropisation and habitat requirements of species assigned
to the respective classes were determined.
Key words: botanical family, class phytocenotic, habitat requirements, natural monuments, protected species, synanthropisation status
77
WSTĘP
Parki przypałacowe uznawane są za cenne obiekty przyrodnicze oraz interesujące elementy krajobrazu miast i wsi. Pełnią one wiele funkcji, zarówno
estetycznych jak i poznawczych. Wspomniane założenia, wykorzystujące naturalność otaczającego je krajobrazu, cechują się roślinnością urządzoną oraz
rozwiniętą infrastrukturą wypoczynkową. Tereny zieleni miejskiej, dzięki
szczątkowo stworzonej i zachowanej strukturze przyrodniczej, zdolne są do
pełnienia funkcji ekologicznych. Jako najważniejsze wymienia się: funkcje
ekologiczne gleb, klimatyczne, hydrologiczne, a także biotyczne oraz pochłaniania zanieczyszczeń. Wytwarzające się między nimi zależności mają
znaczący wpływ na najbliższe środowisko [Szumacher 2005]. Dzięki dużej
liczbie roślin i zwierząt, parki odgrywają bardzo ważną rolę w zachowaniu
bioróżnorodności. Obszary te stanowią nierzadko miejsca gniazdowania licznego ptactwa, a ich teren porasta wiele okazałych drzew, które można uznać
za pomniki przyrody. W granicach zieleni miejskiej zachowały się również
zbiorowiska roślinne, których nie sposób spotkać w najbliższym sąsiedztwie
[Latowski, Zieliński 2001]. Zarówno współczesne jak i historyczne ukształtowane założenia ogrodowe odpowiedzialne są za proces neofityzacji rodzimej flory. Jako „otwarte” wyspy zieleni stanowią one dynamiczne układy
oddziaływujące na środowisko. Wymiana diaspor między parkami, a otaczającymi je obszarami wpływa m.in. na kształtowanie się zasięgów geograficznych gatunków [Latowski, Zieliński 2001].
Park Miejski w Wolsztynie założony został na przełomie XVII i XVIII wieku, na bazie pierwotnego lasu, który istniał na przesmyku między dwoma pobliskimi jeziorami. Większość starodrzewia stanowią przez to gatunki rodzime takie jak: dąb szypułkowy Quercus robur, lipa drobnolistna Tilia mordata
i lipa szerokolistna Tilia platyphyllos, klon polny Acer campestre, czy klon
jawor Acer pseudoplatanus. Najświetniejsze lata parku pałacowego przypadały na okres, gdy właścicielami majątku była rodzina Gajewskich. Osiągnął
on wówczas formę regularnego założenia z okazałymi alejami grabowymi
i lipowymi. Kolejni właściciele dóbr wolsztyńskich ograniczali swoją działalność do uzupełniania nasadzeń złożonych z ozdobnych drzew i krzewów.
Po II wojnie park administrowany był przez zmieniające się firmy, które pielęgnowały tylko część znajdującą się najbliżej pałacu, pozostawiając pozostałe jego fragmenty bez opieki. W efekcie zginęły cenne odmiany cyprysików
Chamaecyparis sp., żywotniki Thuja sp., brzoza Younga Betula pendula „Youngii”, a także wiele świerków Picea sp. oraz daglezje Pseudotsuga sp.. Sytuację
pogorszono dodatkowo poprzez wprowadzenie nasadzeń złożonych z topoli, jesionów oraz klonów jesionolistnych. Od 1993 roku na terenie parku prowadzone
są prace porządkujące mające na celu przebudowę struktury gatunkowej istniejącego drzewostanu [Mikołajczak 2000].
78
Walory przyrodnicze parku przypałacowego w Wolsztynie...
Obecnie park ma powierzchnię 17,76 ha i poprzecinany jest dróżkami spacerowymi. Położony jest on w ścisłym centrum Wolsztyna. Od południa
i wschodu jego granice wyznaczane są przez zabudowę miejską. W północnej i zachodniej części krańce analizowanego założenia ogrodowego stanowią brzegi jeziora. Opisywany obiekt cechuje się nieregularnym kształtem
oraz płaską powierzchnią.
MATERIAŁ I METODY
Celem publikacji jest przedstawienie walorów przyrodniczych Parku Miejskiego w Wolsztynie, czyli zobrazowanie bogactwa flory występującej na
badanym terenie. Prace terenowe przeprowadzone zostały w latach 2010
- 2011. Ze względu na znaczne rozmiary parku pałacowego, wzięto przy
nich pod uwagę wyłącznie pewną jego część. Przy wyborze kwater kierowano się bogactwem i różnorodnością składu gatunkowego występującego na
ich terenie. Wydzielono w ten sposób cztery reprezentatywne powierzchnie
badawcze. Okazy porastające omawiane obszary oznaczano przy pomocy
specjalistycznych kluczy oraz atlasów. W pracy określono również stopnie
synantropizacji, a także wymagania siedliskowe gatunków, przyporządkowanych do odpowiednich klas.
WYNIKI
Na badanym obszarze oznaczono 178 gatunków, w tym 53 drzewa i krzewy,
121 roślin zielnych, 3 paprocie oraz 1 skrzyp. Najbardziej urozmaiconym
fragmentem Parku Miejskiego okazała się część związana z wodami Jeziora Wolsztyńskiego w pobliżu której odnotowano wystąpienie niewielkiego
fragmentu podmokłego terenu, na którym wytworzył się ols. Najuboższy,
pod względem liczebności gatunkowej, fragment analizowanego założenia
ogrodowego związany jest z najbliższym otoczeniem pałacu, na który składają się w decydującej mierze gatunki dekoracyjne.
Na podstawie obserwacji składu gatunkowego analizowanych sektorów,
w oparciu o liczby wskaźnikowe [Zarzycki i in. 2002], określono wymagania
siedliskowe, preferowane przez porastające je osobniki. Niestety dla kilku
taksonów występujących na terenie Parku Miejskiego nie udało się podać
charakterystycznych dla nich wartości. W większości były to gatunki obcego
pochodzenia, które na omawiany obszar sprowadzono ze względu na ich walory estetyczne – 20 gatunków.
W oparciu o analizy, najczęściej występujących wartości wskaźnika świetlnego, ustalono, iż na badanym obszarze dominują gatunki preferujące półcień.
Stanowią one 75% wszystkich taksonów, a więc występują na trzech z czterech
wytypowanych części. Jedynie rośliny porastające brzegi Jeziora Wolsztyń79
skiego oraz wydzieloną „olszynkę” wolą umiarkowany cień (25%). Na podstawie, najczęściej występującej wartości wskaźnika troficznego, uznano iż
na objętych badaniami powierzchniach dominują gleby zasobne (eutroficzne).
Charakteryzują się one odczynem obojętnym, mieszczącym się w przedziale
6≤pH<7. Na wszystkich przebadanych powierzchniach dominującą wartość
wskaźnika kwasowości stanowiła liczba 4. Skład gatunkowy wytyczonych
sektorów wskazuje, iż tworzące je utwory należą do gleb świeżych, bowiem na
wszystkich powierzchniach dominował wskaźnik wilgotności równy 3.
Spośród wszystkich gatunków porastających analizowane sektory Parku
Miejskiego najwięcej, bowiem aż 5% należały do rodziny złożonych Asteraceae, turzycowatych Cyperaceae, wiechlinowatych Poaceae oraz wargowych Lamiaceae.
Analiza stopnia synantropizacji parku wykazała, iż wśród wszystkich rozpoznanych roślin gatunki niesynantropijne stanowią większość. Na drugim
miejscu pod względem ilościowości uplasowały się apofity, których najwięcej odnotowano w części porośniętej bluszczem (23 taksony). Największą
liczbę kenofitów, bowiem aż 8, również zaobserwowano na wyżej wspomnianym terenie. Spośród wszystkich rozpoznanych gatunków najmniej należało
do archeofitów – tylko 4 osobniki. Wyniki te świadczą o dużej naturalności
analizowanego założenia.
Część parku
Gatunek
I
II
III
IV
bluszcz pospolity, Hedera helix
+
+
+
grążel żółty, Nuphar lutea
+
grzybienie białe, Nymphaea alba
+
OCHRONA ŚCISŁA
przylaszczka pospolita, Hepatica triloba
+
śniadek baldzaszkowaty, Ornithogalum umbellatum
+
+
+
śnieżyczka przebiśnieg, Galanthum nivalis
+
+
+
OCHRONA CZĘŚCIOWA
konwalia majowa, Convallaria majalis
+
kopytnik pospolity, Asarum europaeum
+
+
kruszyna pospolita, Frangula alnus
+
+
porzeczka czarna, Ribes nigrum
+
Tab. 1. Gatunki objęte ścisłą i częściową ochroną prawną
80
O walorach przyrodniczych Parku Miejskiego świadczy także ilość występujących na jego terenie gatunków, które objęte zostały ochroną prawną. W myśl
Rozporządzenia Ministra Środowiska z dnia 9 lipca 2004 r. w sprawie gatunków
dziko występujących roślin objętych ochroną (Dz. U. z dnia 28 lipca 2004 r.) na
analizowanym obszarze udokumentowano 10 chronionych taksonów (Tab. 1).
Na obszarze Parku Miejskiego, w oparciu o literaturę [Żukowski i in. 1995],
stwierdzono również występowanie gatunków rzadkich i przez to potencjalnie zagrożonych (Tab. 2).
Gatunek / Część parku
I
II
III
IV
klon polny, Acer campestre
+
+
topola czarna, Populus nigra
+
+
+
zdrojówka rutewkowata, Isopyrum thalictroides
+
Tab. 2. Gatunki rzadkie i przez to potencjalnie zagrożone na terenie Wielkopolski.
Źródło: Żukowski i in. 1995
Park w Wolsztynie jest starym założeniem, dlatego też w jego granicach znajduje się wiele okazałych drzew, którym należy się status pomnika przyrody.
Aby drzewo zostało uznane za pomnik przyrody musi ono spełniać określone kryteria. Jego obwód w pierśnicy powinien być większy niż szacunkowe
wartości minimalne dla danego gatunku. W oparciu o dane literaturowe [Mikołajczak 2000] na terenie parku zlokalizowano sześć okazów, które spełniają to kryterium, a są nimi:
• dąb szypułkowy Quercus robur numer 461 o obwodzie 420 cm i wysokości 28
m, znajdujący się poza analizowanymi sektorami,
• topola kanadyjska Populus x canadensis numer 462 o obwodzie 490 cm i wysokości 30 m, porastająca teren usytuowany najbliżej pałacu,
• dąb szypułkowy Quercus robur numer 463, tzw. „Dąb Marcina Rożka” o obwodzie
420 cm i wysokości 30 m, rosnący na powierzchni III z wybranych sektorów,
• miłorząb dwuklapowy Ginkgo biloba numer 678 o obwodzie 150 cm i wysokości
19 m, zlokalizowany w najbliższym sąsiedztwie pałacu,
• dąb szypułkowy Quercus robur numer 708 o obwodzie 440 cm i wysokości 27
m, rosnący tuż przy parkingu należącym do pałacu,
• buk pospolity Fagus sylvatica numer 709 o obwodzie 360 cm i wysokości 28 m,
związany z otoczeniem pałacu.
Na analizowanym terenie stwierdzono również występowanie gatunków roślin uznawanych za lecznicze – 69 okazów. Zaliczono do nich zarówno drzewa jak i krzewy.
81
DYSKUSJA I WNIOSKI
Park Miejski w Wolsztynie charakteryzuje się dużym bogactwem florystycznym oraz różnorodnością występujących tam form. Najliczniej reprezentowaną grupę stanowią rośliny zielne, z których aż 7 gatunków objętych jest
ochroną prawną. Ze względu na ciekawą historię oraz przebogatą faunę opisane założenie uważane jest za jeden z najbardziej interesujących obiektów
architektoniczno-krajobrazowych powiatu. Różnorodna infrastruktura turystyczna zespołu pałacowo-ogrodowego sprawiła, iż jest to miejsce, w którym
zarówno turyści jak i mieszkańcy miasta chętnie spędzają swój wolny czas.
Szata roślinna Parku Miejskiego jest bardzo zróżnicowana. Wpływ na nią
ma przede wszystkim rzeźba terenu oraz stosunki wodne i glebowe. Dzięki
współwystępowaniu ze sobą różnych siedlisk drzewostan parkowy należy
do bardzo różnorodnych. Różnice w strukturze zadrzewień i zakrzewień poszczególnych sektorów powstały najprawdopodobniej podczas przystosowywania pierwotnie istniejącego na tym terenie lasu do warunków parkowych.
Zapewne wówczas nasadzone zostały ozdobne krzewy oraz unikatowe drzewa, które miały wzbogacić otoczenie pałacu. Na terenie omawianego obiektu
spotkać można przedstawiciela roślin reliktowych. Jest nim, sprowadzony
w celach dekoracyjnych, miłorząb dwuklapowy Ginkgo biloba, który usytuowany został w najbliższym otoczeniu pałacu. Rośliny zielne stanowią zaś
najliczniejszą grupę ukazującą różnorodność parkowej flory. Należą do nich
zarówno gatunki typowe dla siedlisk suchych i nasłonecznionych, jak również podmokłych i zacienionych.
82
LITERATURA
Latowski K. Zieliński J. 2001. Parki wiejskie – wybrane zagadnienia geobotaniczne
i kulturowe. Szata roślinna Wielkopolski i Pojezierza Południowopomorskiego.
Przewodnik sesji terenowych 52. Zjazdu PTB, 292-296.
Matuszkiewicz W. 2006. Przewodnik do oznaczania zbiorowisk roślinnych Polski.
Wydawnictwo Naukowe PWN.
Mikołajczak E. 2000. Przyroda ziemi wolsztyńskiej. Wydawnictwo „Biblioteka”.
Szumacher I. 2005. Funkcje ekologiczne parków miejskich. Prace i Studia Geograficzne, 36: 107-108.
Zając A. Zając M. Tokarska-Guzik B. 1998. Kenophytes in the flora of Poland: list,
status and ogigin. PHYTOCOENOSIS Vol. 10 (N.S). Supplementum Cartographae Geobotanicae 9, 108-109.
Zając E.U. Zając A. 1975. Lista archeofitów występujących w Polsce. Zeszyty naukowe Uniwersytetu Jagiellońskiego. Prace Botaniczne, 3: 9-12.
Zając M. Zając A. 1992. Prowizoryczna lista apofitów segetalnych i ruderalnych w Polsce.
Zeszyty naukowe Uniwersytetu Jagiellońskiego. Prace Botaniczne, 24: 10-15.
Zarzycki K. Trzcińska-Tacik H. Różański W. Szeląg Z. Wołek J. Korzeniak U. 2002.
Ekologiczne liczby wskaźnikowe roślin naczyniowych Polski. Wydawnictwo IB
PAN.
Żukowski W. Jackowiak B. 1995. Ginące i zagrożone rośliny Pomorza Zachodniego
i Wielkopolski. Prace Zakładu Taksonomii Roślin UAM w Poznaniu. Bogucki
Wydawnictwo Naukowe.
mgr inż. Anna Lehmann, mgr inż. Marta Jabłońska,
mgr inż. Magdalena Giemza-Mikoda
Katedra Kształtowania Argoekosystemów i Terenów Zieleni
pl. Grunwaldzki 24a, 50-363 Wrocław
Opiekun naukowy: dr hab. inż. Wiesław Wojciechowski
prof. dr hab. inż. Leszek Kordas, prof. dr hab. inż. Lesław Zimny
83
Małgorzata Leja
Agnieszka Hawryło
EPISTEME
14/2012
s. 85-91
ISSN 1895-4421
WALORYZACJA HYDROMORFOLOGICZNA NA PRZYKŁADZIE
ODCINKA RZEKI WISŁOKI OD MOKRZCA DO PUSTKOWA
HYDROMORPHOLOGICAL EVALUATION OF THE WISŁOKA RIVER
SECTION FROM MOKRZEC TO PUSTKÓW
Abstrakt. Niniejsza praca podejmuje problem waloryzacji hydromorfologicznej tj.
elementu wyznaczania stanu ekologicznego cieków w ramach obowiązujących w UE
przepisów. W artykule przedstawiono wyniki oceny hydromorfologicznej 30-kilometrowego odcinka Wisłoki wg normy EN-PN 14614 na podstawie, której wykazano
wpływ budowli hydrotechnicznych na jakość hydromorfologiczną rzeki. Uzyskano
duże zróżnicowanie klas jakości hydromorfologicznej na rozpatrywanym odcinku.
Odcinki wysoko ocenione występują na obszarze Natura 2000 co wskazuje na ich
wartość ekologiczną. Z drugiej strony te same stanowiska znajdują się w JCWP
o silnie zmienionej morfologii. Z wyników można wnioskować, że wpływ przegród
poprzecznych występujących w korycie na morfologię cieku zanika wraz z oddalaniem się od nich.
Słowa kluczowe: potencjał ekologiczny, waloryzacja hydromorfologiczna, budowle
hydrotechniczne
Summary. This paper addresses the problem of hydromorphological evaluation – assessing of the ecological status of river according to EU legislation. The paper presents
results of hydromorphological assessment of 30-kilometer section of Wisłoka made according to EN-PN-14614 and demonstrates the impact of hydraulic structures on the hydromorphological quality of the river. Obtained large variation of hydromorphological
quality classes in the research section. The sections which are rated highly, are located
in a Natura 2000 what indicates their ecological value. On the other hand, these sections
are located in a heavily modified SWB. From the results, it can be concluded that the
influence of weirs on stream morphology decreased with distance from them.
Key words: ecological potential, hydromorphological evaluation, hydraulic structures
85
WSTĘP
Ocena hydromorfologicznej jakości rzeki wspomaga ocenę biologiczną stanu ekologicznego zgodnie z wymaganiami Ramowej Dyrektywy Wodnej
[RDW]. Załącznik V RDW wymienia następujące niezbędne elementy hydromorfologiczne: reżim hydrologiczny, ciągłość rzeki (wraz z terenami lądowymi zależnymi od rzeki) oraz warunki morfologiczne(zmienność głębokości i szerokości strumienia, struktura i skład podłoża oraz struktura strefy
nadbrzeżnej). Zakres oceny hydromorfologicznej został ujednolicony przez
Europejski Komitet Normalizacji [CEN 2002].W ramach projektu: „Przywrócenie drożności korytarza ekologicznego rzeki Wisłoki i jej dopływów”,
dotyczącego poprawy struktury siedlisk dla ryb poniżej jazu w Mokrzcu wykonano ocenę morfologiczną odcinka. Celem pracy jest wykazanie wpływu
budowli hydrotechnicznych na jakość hydromorfologiczną rzeki.
MATERIAŁ I METODY
Ocenę stanu ekologicznego wykonano w korycie rzeki Wisłoka, jest to prawobrzeżny dopływ Wisły o długości ok. 160 km i powierzchni zlewni ponad
40 tys. km2. Na tym obszarze rzeka płynie po piaszczystych terenach rolniczych. Piaszczysto- żwirowe dno Wisłoki obniżało się od lat pięćdziesiątych
do dziewięćdziesiątych od 5 do 9 cm na rok, natomiast w ostatnich dwudziestu latach intensywność tego procesu się znacznie zmniejszyła. [Galarowski,
Klimek 1991; Wyżga 2008a]. Obecność łach żwirowych w korycie świadczy
o występowaniu transportu rumowiska dennego, natomiast materiał piaszczysty jest transportowany w formie unosin. Wisłoka w opisywanym biegu jest
jedną z trzech rzek o największym ładunku unosin [Klimek, Łajczak, 1991].
Waloryzacji hydromorfologicznej poddano około trzydziestokilometrowy
odcinek rzeki między Mokrzcem (km 73+120) a Pustkowem (km 42+560)
(Rys. 1). W zlewni wymienionego odcinka Wisłoki w ramach programu Natura 2000 wyodrębniony został Obszar o Znaczeniu Wspólnotowym (OZW)
o nazwie „Dolna Wisłoka z dopływami” (PLH180053). Do tego obszaru zalicza się bezpośrednio dwa odcinki cieku: od ujścia lewostronnego dopływu
–potoku Chotowskiego (km 67+120) do ujścia Czarnej (km 57+090) oraz od
ujścia Wielopolki (km 45+590) do Pustkowa. Obszar Natura 200 ustalony
w 2009 roku występuje na długości ok. 43% rozpatrywanego odcinka. Siedliska występujące na tym obszarze to w przeważającej części lasy łęgowe
obejmujące łęgi wierzbowe, połączone z ziołoroślami nadrzecznymi i pozostałościami wielkich kęp łęgu topolowego [GDOŚ 2001].
Według klasyfikacji scalonych Jednolitych Części Wód Powierzchniowych
(JCWP) opracowanej przez RZGW w Krakowie [2008] badany odcinek znajduje się w obrębie trzech JCWP, które określone zostały jako Silnie Zmienione JCWP.
86
Waloryzacja hydromorfologiczna na przykładzie...
Według wspomnianego dokumentu hydrologia i morfologia badanego odcinka do ujścia potoku Chotowskiego (km 67+120) są silnie zmienione, co
jest spowodowane wpływem zbiornika Klimkówka oraz stopniami uniemożliwiających wędrówkę ryb. Na kolejnym odcinku do ujścia Rzeki (km
49+570) morfologia pozostała silnie zmieniona, czego przyczyną są obwałowania oraz zabudowa podłużna na długim odcinku. Hydrologia od tego miejsca aż do końca opisywanego odcinka została zaklasyfikowana jako naturalna o stanie ekologicznym złym, słabym lub umiarkowanym. Natomiast pod
względem morfoloigcznym dopiero część badanego odcinka poniżej ujścia
Rzeki (km 49+570) została zakwalifikowana jako naturalna o stanie ekologicznym złym, słabym lub umiarkowanym, na co złożyły się takie czynniki jak: obwałowania oraz zabudowa podłużna ograniczająca różnorodność
siedliska dla ryb i bezkręgowców [RZGW 2008]. Na opisywanym odcinku
Wisłoki występuje pięć mostów oraz dwie przegrody: jaz w Mokrzcu (km
73+320) oraz stopień w Dębicy (km 57+850).
Ocena hydromorfologiczna została wykonano wg EN-PN
14614 [CEN 2002]. Na opisanym wyżej obszarze wybrano 10
jednolitych odcinków rzeki o
różnej morfologii, długości od
ok. 150-350 m oraz jeden odcinek referencyjny zlokalizowany
w miejscowości Pustków (Rys.
1). Do wyboru stanowiska referencyjnego przyjęto założenie, że
jest to naturalny lub bliski naturze
odcinek cieku z dopuszczalną presją, która ma jedynie nieznaczny
wpływ na występujące ekosystemy wodne i wodno-lądowe
[Czoch i Kulesza 2006].
Rys. 1. Odcinek Wisłoki od Mokrzca do
Pustkowa
Wszystkie wybrane stanowiska zostały ocenione wg wskazań ww. normy.
Oceniono stopień naturalności dla 10 kategorii cech, część z nich dotyczy
koryta (1-6), a część terenów zalewowych (7-10). Wzięto również pod uwagę
wskazówki Wyżgi i in. [2008], który z zespołem oceniał rzekę górską. Wskazówki dotyczą: oceny roślinności (włączono występowanie roślinności lądowej w korycie rzeki); stopnia naturalności reżimu oraz hydrauliki przepływu
w rzece, które uzupełniono o stopień łączności wód rzecznych z wodami
krążącymi w aluwiach.
87
WYNIKI I DYSKUSJA
Średnia ocena hydromorfologiczna została obliczona jako średnia arytmetyczna ocen 10 (12 liczb) kategorii określonych w skali: od 1 – bardzo dobry
stan, do 5 – stan bardzo silnie zmieniony (Tab. 1). Na podstawie średniej
przypisano poszczególnym odcinkom klasy jakości hydromorfologicznej
zgodnie z klasyfikacją zaproponowaną przez Wyżgę i in. [2008]: ocena
1–1,79 – jakość bardzo dobra (klasa 1); ocena 1,8–2,59 – jakość dobra (klasa
2); ocena 2,6–3,39 – jakość umiarkowana (klasa 3); ocena 3,4–4,19 – jakość
słaba (klasa 4); ocena 4,2–5 – jakość zła (klasa 5).
Wybór odcinka referencyjnego był poprzedzony wizją terenową oraz przestudiowaniem dokumentacji wykonanej w ramach programu ochrony siedlisk
Natura 2000. Stanowisko wybrane jako referencyjne reprezentuje wyżej opisane siedliska łęgowe na terasach zalewowych rzeki natomiast bezpośrednio
w korycie: rzadki typ siedliska stanowi łacha żwirowa na prawym brzegu,
która przy niskim stanie wody zajmująca większą część koryta rzeki [GDOŚ
2001]. Odsypisko przy wyższym stanie rozdziela nurt poniżej bystrza i tworzy łachę śródkorytowa porośnięta kępami wierzby wąskolistnej oraz roślinnością trawiastą. Uziarnienie żwirowiska nie jest jednolite, na początku łachy
występuje materiał kamienisty, natomiast za kępami wierzb, osadzony jest
piasek. Ponadto, na łasze występują liczne ziarna ponadwymiarowe, które
wzbogacają ten odcinek pod względem różnorodności siedlisk organizmów
wodnych [Wyżga i in. 2003].
Pierwszy odcinek został zlokalizowany tuż poniżej jazu w Mokrzcu (km
73+324), który stanowi poprzeczną przegrodę w korycie uniemożliwiającą
swobodną migrację organizmów wodnych (przepławka zlokalizowana przy
budowli nie funkcjonuje). Jaz również zaburza reżim hydrologiczny oraz
proces transportu rumowiska. Bardzo podobna sytuacja ma miejsce na odcinku 6 (km 57+500), gdzie budowlą poprzeczną jest stopień wodny w Dębicy.
Na tym odcinku ocena jest dodatkowo obniżona ze względu na zmienioną
geometrię koryta i zabudowę miejską na terenach przyległych do koryta.
Spośród ocenionych sekcji tylko ta została zaklasyfikowana do 5 klasy, która
oznacza złą jakość hydromorfologiczną.
Słaby stan hydromorfologiczny również został zidentyfikowany dla odcinka
8, w którym geometria koryta jak i reżim hydrologiczny zostały zmienione
ze względu na umiejscowienie wylotu oczyszczalni ścieków z miasta Dębica.
Zróżnicowanie prędkości nie było widoczne na rozpatrywanym odcinku.
Stanowisko 10 znajduje się tuż poniżej mostu w Brzeżnicy, gdzie zabezpieczenie konstrukcji mostu wymagało ubezpieczenia podłużnego brzegów
jak i zmianę geometrii koryta. Sekcja ta pomimo tego, że znajduje się już
w zasięgu JWCP o naturalnej morfologii
88
Stopień przekształcenia
Odcinek
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Kilometr rzeki
(środka odcinka)
73+120
71+680
68+235
64+890
61+300
57+620
56+990
55+680
54+570
48+380
42+560
Kategoria oceny
Geometria cieku 1.a.
4
4
1.5
1
1
5
3
5
3
5
1
Nr
1
1.b.
2
4
2
1.5
1
5
4
5
4
4
2
2
Materiał budujący
dno koryta
3
4
2.5
2
1.5
4
2
3
3.5
3
1
3
Roślinność w korycie,
rumosz drzewny
3
3
4
2
2
2.5
3
3
3.5
2.5
1
4
Erozja i depozycja
5
3
1.5
2
1.5
5
2
3
2.5
3
2
Przepływ 5.a.
zróżnicowanie v i h
2
2.5
1.5
3
1
4
3
4
4
4
1
5.b. reżim
hydrologiczny
5
2.5
1.5
2.5
1
5
3
5
3.5
3
1
6
Wpływ zabudowy
hydrotechnicznej na
ciągłość potoku
5
3
2
2.5
2
5
3
3
2.5
3
2
7
Charakter brzegów i
ich modyfikacje
4
5
3
2.5
2
4
4
4
3
4
2.5
8
Typ roślinności
nadbrzeżnej oraz
roślinność terenów
przyległych
3
5
4
3
2
4
3.5
3.5
2
3
3
9
Użytkowanie obszaru
zalewowego i inne
3
4
4
2.5
2
5
4
4.5
2.5
3.5
2
10
Stopień łączności
oraz mobilność
4
5
3.5
4
4
5
5
5
4
5
2.5
2.38
1.75
4.46
3.29
4.00
3.17
3.58
1.75
2
1
5
3
4
3
4
1
5
średnia ocena
3.58 3.75 2.58
klasa jakości
hydromorfologicznej
4
4
2
Tab. 1. Wyniki waloryzacji hydromorfologicznej
Na wykresie znajdującym się na Rys. 2 widać duże zróżnicowanie pomiędzy
ocenami poszczególnych odcinków oraz dwie wyraźne tendencje: pierwszą od
odcinka 1(km 73+120) do 5 (km 61+500), oraz drugą od odcinka 6 (km 57+750)
do odcinka 11 (km 42+560). W obu przypadkach poprawę stanu hydromorfologicznego można przypisać oddalaniu się od budowli poprzecznych w korycie.
89
Rys. 2. Średnia ocena jakości hydromorfologicznej
Poprzeczna i podłużna geometria cieku ulegają wyraźnemu pogorszeniu
poniżej stopnia w Dębicy. Najgorzej ocenionym parametrem jest stopień
łączności koryta oraz jego mobilność. Głęboko wcięte koryto uniemożliwia
migrację cieku w układzie poziomym oraz ogranicza łączność z terenami
zalewowymi. Większa część ocenianych kategorii wykazuje trendy zgodne
ze średnią oceną stanowisk. Jedynie ocena obecności roślinności w korycie
cieku ma odmienny przebieg, podnosząc średnią ocenę.
Stanowisko od 1 do 9 należą do JCWP o silnie zmienionej morfologii. Zdawać by się mogło, że nie mogą przedstawiać funkcjonalności ekologicznej,
jednak trzy kolejne odcinki (3,4 i 5) wg oceny hydromorfologicznej należą
do pierwszej bądź drugiej klasy jakości pod względem morfologii. Potwierdzeniem ich dobrego stanu jak i poprawności przeprowadzonej oceny jest
fakt, że dwa z nich znajdują się bezpośrednio w programie ochrony siedlisk
i gatunków Natura 2000 i zostały opisane jako cenne siedliska.
WNIOSKI
Wpływ budowli hydrotechnicznych zanika już w odległości 5 km od jej lokalizacji. Na obszarach zaklasyfikowanych jako JCWP silnie zmieniona pod
względem morfologicznym mogą występować odcinki o wysokiej jakości
hydromorfologicznej, uznane jako cenne również w ramach programu Natura
2000. Na obszarze JCWP o naturalnej morfologii nie wyklucza się wystąpienia
długich odcinków prostych z bardzo obniżoną użytecznością ekologiczną.
Pomimo występowania złego stanu hydromorfologicznego w górnym biegu
cieku w jego dolnym odcinku nadal mogą występować sekcje o dobry lub nawet bardzo dobrym stanie. Może to wskazywać na tendencję do odtworzenia
naturalnej hydromorfologii.
90
LITERATURA
CEN TC 230/WG 2/TG 5: N32. 2002. A Guidance standard for assessing the hydromorphological features of rivers.
Czoch K. Kulesza K. 2006. Warunki referencyjne specyficzne dla typów cieków
w Polsce jako podstawa do prac nad oceną ekologicznego stanu wód płynących.
Infrastruktura i Ekologia terenów Wiejskich. PAN. Kraków. 25-36.
Galarowski T. Klimek K. 1991. Funkcjonowanie koryt rzecznych w warunkach zagospodarowania. Dorzecze Górnej Wisły. red. Dynowska I. Maciejewski M. Warszawa-Kraków. 243.
GDOŚ Europejska Sieć Ekologiczna Natura 2000 2001. url: http://natura2000.gdos.
gov.pl/natura2000; [dostęp 01.02.2012]
Klimek K. Łajczak A. 1991.Transport materiału dennego. Dorzecze Górnej Wisły.
red. Dynowska I. Maciejewski M. Warszawa-Kraków. 249-254
PKN. 2008. PN EN 14614. Jakość wody. Wytyczne do oceny hydromorfologicznych
cech rzek. Warszawa.
RZGW 2008. Klasyfikacja Scalonych Jednolitych Części Wód Powierzchniowych. Kraków.
Wyżga B. Kaczka R. Zawiejska J. 2003. Gruby rumosz drzewny w ciekach górskich-formy występowania, warunki depozycji i znaczenie środowiskowe. Folia Geographica. Vol. XXXIII-XXXIV. 117-138.
Wyżga B. 2008a. Wcinanie się rzek polskich Karpat w ciągu XX wieku. Stan Środowiska rzek południowej Polski i możliwości jego poprawy-wybrane aspekty red.
Wyżga B. IOP PAN. Kraków. 7-39.
Wyżga B. Zawiejska J. Radecki-Pawlik A. Amirowicz A. 2008b. Ocena hydromorfologicznej jakości rzeki górskiej na przykładzie Czarnego Dunajca. Stan Środowiska
rzek południowej Polski i możliwości jego poprawy-wybrane aspekty red. Wyżga B.
Instytut Ochrony Przyrody PAN. Kraków. 103-118.
mgr inż. Agnieszka Hawryło, mgr inż. Małgorzata Leja
Opiekunowie naukowi: prof. dr hab. inż. Wojciech Bartnik
prof. dr hab. inż. Alicja Michalik, dr hab. inż. Leszek Książek
91
Agnieszka Listosz
EPISTEME
14/2012
s. 93-99
ISSN 1895-4421
BIOMASA NADZIEMNA TRZCINNIKA PIASKOWEGO NA GRUNTACH
ZDEGRADOWANYCH PRZY ZAKŁADACH AZOTOWYCH „PUŁAWY” S.A
W KONTEKSCIE WYKORZYSTANIA NA CELE ENERGETYCZNE
THE SUPERFICIAL BIOMASS OF WOOD SMALL-REED ON THE SOIL
DEGRADED AT ZAKŁADY AZOTOWE „PUŁAWY” S.A. IN THE CONTEXT
OF USING TO ENERGY PURPOSES
Abstrakt. Trzcinnik piaskowy (Calamagrostis epigejos (L.) Roth), to gatunek pospolicie występujący zwłaszcza na niżu Polski. Opanowuje łatwo gleby piaskowe: nieużytki, grunty rolne na których zaniechano użytkowania, często występuje również
w lasach wówczas, gdy nieprawidłowo prowadzone są powierzchnie odnowień. Celem badań było określenie ilości biomasy nadziemnej i wartości energetycznej trzcinnika piaskowego porastającego zdegradowane grunty przy Zakładach Azotowych
„Puławy” S.A. Określono wysokość i suchą masę części nadziemnych trzcinniczyska
oraz obliczono zagęszczenie łanu w gramach suchej masy na 1 dm3 objętości trzcinniczyska. Stwierdzono decydujący wpływ zagęszczenia na wielkość plonu biomasy
nadziemnej. W latach 2005, 2007 i 2011 sucha masa trzcinnika, w przeliczeniu na
1 ha wynosiła, odpowiednio: 1,88; 3,08; 3,95 ton. Przyjmując wartość opałową
1 kg suchej masy trzcinnika na poziomie 16 MJ∙kg-1 – uzyskano wartość energetyczną
plonu z 1 ha, w poszczególnych latach badań zawierającą się w przedziale od 30,1 do
63,2 GJ∙ha-1, średnio z trzech lat 47,5 GJ∙ha-1.
Słowa kluczowe: biomasa, trzcinnik piaskowy, grunty zdegradowane
Summary. The wood small-reed (Calamagrostis epigejos (L.) Roth) is a species commonly occurring especially in the Polish lowlands. It easily seizes sandy soils: wastelands, agricultural soils whose cultivation was halted, frequently occurs also in the
forests when there are inappropriately led new plantations. The aim of the research
was to ascertain the amount of aboveground biomass levels and the energy value of
wood small-reed growing over the areas degraded at the Zakłady Azotowe “Puławy”
S.A. The height and the dry mass of the superficial parts of the wood small-reed area
were measured, and the canopy of density was calculated in grams dry mass per 1 dm3
volume of wood small-reed area. It was a decisive influence of the density on value
aboveground biomass yield. In the years 2005, 2007 and 2011 the dry masses of reed,
per hectare, were accordingly: 1,88; 3,08; 3,95 tonnes. By adopting the average fuel
value of dry mass of reed at the level of 16 MJ∙kg-1 – obtained the energy value of
a single hectare crop, during the years of the research containing in the range 30,1 and
63,2 GJ∙ha-1, an average of three year: 47,5 GJ∙ha-1.
Key words: biomass, wood small-reed, degraded soil
93
Agnieszka Listosz
WSTĘP
Trzcinnik piaskowy to gatunek pospolity zwłaszcza na niżu Polski. Zaliczany
jest do roślin o niewielkich wymaganiach siedliskowych. Jest światłolubny,
ale występuje także w miejscach o umiarkowanym zacienieniu [Falkowski
1982]. Czyż i in. [2005] podkreślają ekspansywność tej trawy. Rozprzestrzenianiu jej sprzyjają niewielkie wymagania w stosunku do siedliska oraz
właściwości allelopatyczne. Trzcinnik piaskowy opanowuje łanowo gleby piaskowe: nieużytki, grunty rolne na których zaniechano użytkowania,
w lasach np. nieprawidłowo prowadzone powierzchnie odnowień. Jak podają Patrzałek i in. [2011], w siedliskach antropogenicznych, powstających na
nieużytkach poprzemysłowych i zdegradowanych gruntach rolnych, jest on
dominującym i długotrwałym komponentem zbiorowisk roślinnych. Podkreśla się, że trzcinnik piaskowy współcześnie zyskuje miano rośliny charakterystycznej dla stanowisk trudnych oraz nieużytków, a także ekstensywnych
łąk i odłogowanych pól [Gorzelak 2004]. Kozłowski i Swędrzyński [2010]
oraz Patrzałek i in. [2011] zwracają uwagę na możliwość pozyskiwania nadziemnych pędów trzcinnika piaskowego w aspekcie wykorzystania na cele
energetyczne, w procesie spalania.
Celem badań była ocena wielkości suchej masy części nadziemnych trzcinnika piaskowego na zdegradowanych, wylesionych glebach piaskowych przy
Zakładach Azotowych „Puławy” S.A., pod kątem możliwości pozyskiwania
biomasy na cele energetyczne.
MATERIAŁ I METODY
Badania wykonano na zdegradowanych, wylesionych wydmach, po północno- wschodniej stronie Zakładów Azotowych „Puławy” S.A. Teren ten został wylesiony w latach 1968-1971 z powodu dewastacji ekosystemu leśnego
przez imisje (głównie azotowe) i odwodnienie ujęciami wód podziemnych
[Kowalkowski i in. 1999, Siuta 1987].
Występujące tu gleby to industroziemy i urbanoziemy wytworzone z utworów o składzie granulometrycznym piasku luźnego [Pranagal i Słowińska-Jurkiewicz 2007], przekształcone w efekcie zabiegów rekultywacyjnych:
usuwanie karp drzew, ulepszanie przez dodawanie m.in. odpadów paleniskowych z węgla kamiennego, budowę dróg i instalacji podziemnych deszczowni. Według Hodary i Świcy [2007] gęstość tych gleb (w warstwie 0-35
cm) wynosiła 1,23-1,28 Mg∙m-3, porowatość ogólna 0,362-0,525 m3∙m-3,
a przepuszczalność wodna była duża w warstwie 0-10 cm (7 m∙d-1) oraz
bardzo duża w warstwie 25-35cm (22 m∙d-1). Jak podają Kowalkowski i in.
[1999] gleby te charakteryzują się rozregulowaniem równowagi biochemicznej oraz zaburzonym obiegiem składników pokarmowych. Pogorszeniu ule94
Biomasa nadziemna trzcinnika piaskowego na gruntach zdegradowanych...
gła również zdolność zatrzymywania wód opadowych. Procesy niszczenia
gleb wzmagane są głębokim odwodnieniem, będącym skutkiem eksploatacji
systemu ujęć głębinowych, zainstalowanych na wydmach. Według Falkowskiej i Filipka [2009] gleby w pobliżu Zakładów charakteryzują się silnym
zakwaszeniem, związanym z dużą imisją związków o charakterze kwasotwórczym. Falkowska i Filipek [2009] zwracają uwagę na dużą zmienność
(sezonowa i zależne od głębokości) zawartości mineralnych form azotu,
szczególnie N-NO3: 5,6-65,1 mg∙kg-1 w warstwie 0-5 cm i 0,1-65,6 mg∙kg-1,
w warstwie 5-20 cm. Według Bielińskiej i Domżała [2007] gleby w strefie wylenionej przy Zakładach w warstwie 5-20 cm cechuje odczyn bardzo
kwaśny (pH 3,4-4,3), mała pojemność sorpcyjna (6 mmol H+∙kg-1), zawartość
C org. 0,92%, stosunek C:N – 18 oraz zawartość: N-NH4 około 65 mg∙kg-1,
N-NO3: około 12 mg∙kg-1, P 13 mg∙kg-1, K 20 mg∙kg-1, Mg 5,5 mg∙kg-1.
Obszar na którym prowadzono badania – około 100 ha wydm dostępnych do
zbioru maszynowego (deniwelacje terenu do 15 m)– jest pokryty wieloletnim
trzcinniczyskiem. Lokalnie w łanie trzcinnika występuje domieszka innych
roślin zielnych, z reguły nie przekraczająca 10 % w pokryciu powierzchni.
Do analiz ilościowych i jakościowych biomasy nadziemnej trzcinnika wykorzystano wyniki badań własnych wykonanych w 2011 r. oraz wyniki badań z roku 2005 [Węgorek 2006] i niepublikowane z 2007 r. Próby pobierano w październiku, w 2005 r. z 5 stanowisk, w 2007 z 6, a w 2011 z 14.
Rośliny ścinano na wysokości około 5 cm nad ziemią, z powierzchni 1 m2,
w 3 powtórzeniach. Określono suchą masę po wysuszeniu w temperaturze
105 °C – metodą suszarkową, a następnie przeliczono na 1 ha. W latach 2005
i 2011 w każdym stanowisku mierzono wysokość roślin łatą mierniczą,
z dokładnością do 5 cm, w celu obliczenia zagęszczenia łanu (runi). Obliczając zagęszczenie roślin na stanowiskach w gramach suchej masy na dm3
dzielono plon suchej masy z 1 m2 przez objętość porostu roślinnego na danym stanowisku. Wyniki pomiarów przy pomocy programu Excel podano
analizie statystycznej. Oznaczono związki korelacyjne pomiędzy wielkością
plonu, a zagęszczeniem łanu oraz między wielkością plonu, a wysokością.
Istotność współczynnika korelacji sprawdzono przy pomocy testu t-Studenta
(dla poziomu istotności α=0,05).
WYNIKI I DYSKUSJA
Zróżnicowanie trzcinniczyska pod względem zagęszczenia oraz wysokości
było bardzo duże (Rys. 1). Zagęszczenie oraz wysokość trzcinnika piaskowego w latach 2005 i 2011, w poszczególnych stanowiskach kształtowało się
odpowiednio na poziomie: 0,21 g·dm-3 i 80-110 cm oraz 0,46 g·dm-3 i 50-140
cm. Również plonowanie trzcinniczyska w latach badań było zróżnicowane.
95
Agnieszka Listosz
(gs.m.∙dm )
-3
(m)
(t∙ha )
4,5
-1
1
0,90
3,95
0,9
0,85
0,8
3,5
3,03
0,7
3
0,6
2,5
0,46
0,5
1,88
2
0,4
0,3
0,2
4
1,5
0,21
1
0,5
0,1
0
0
zagęszczenie
wysokość
sucha masa
Rys. 1. Parametry charakteryzujące biomasę nadziemną trzcinnika piaskowego:
plony suchej masy (t·ha-1), zagęszczenie (g·dm-3), wysokość (m)
Uzyskane plony suchej masy w 2005 roku wahały się od 1,05 do 3,11 t·ha-1,
w 2007 roku od 0,75 do 2,28 t·ha-1, a w 2011 roku od 1,21 do 5,87 t·ha-1. Na
rycinie 1 przedstawiono wybrane parametry trzcinniczyska, w latach badań,
jako wielkości średnie.
Różnica średnich wysokości trzcinniczyska w latach 2005 i 2011 wynosiła
prawie 5%, ale średnie zagęszczenie kształtowało się na poziomie 0,34 g·dm3
. Średni plon trzcinnika w 2011 r. wynosił 3,95 t s.m.×ha-1 i był o 110%
większy w stosunku do średniej wielkości plonu w 2005 r. (1,88 t s.m.×ha-1).
Opracowanie statystyczne cech trzcinniczyska, określanych w latach 2005
i 2011 wykazuje, że decydujący wpływ na wielkość plonów suchej masy
miało z reguły zagęszczenie, a w mniejszym stopniu wysokość łanu (Tab.
1). Obliczona korelacja pomiędzy wielkością plonu suchej masy, a zagęszczeniem wynosi rxy= 0,89 co wskazuje na silną dodatnią zależność między
plonem, a zagęszczeniem (Tab. 1). W przypadku korelacji pomiędzy plonem
a wysokością zależność jest mniejsza.
Zagęszczenie oraz wysokość łanu to parametry bezpośrednio wpływające
na wielkość plonu biomasy. Są one zależne od warunków wzrostu roślin.
W wypadku prezentowanych badań własnych, warunki siedliskowe były
szczególnie niekorzystne z racji właściwości utworów glebowych (piaski
wydmowe) i głębokiego odwodnienie (ujęcia wód podziemnych) [Kowalkowski i in. 1999; Pranagal i Słowińska-Jurkiewicz 2007]. W takich warunkach, średni plon trzcinnika (z trzech lat) – 2,97 t s.m.×ha-1, w porównaniu do
średnich plonów siana uzyskiwanych z polskich łąk – 5 t s.m.×ha 1 [Sawicki
i Kościk 2003], można uznać za wysoki. Należy jednak nadmienić, że niepo96
0,39
0,15
3,41
1,51
0,87
0,18
19
0,89
0,79
Plon suchej masy
zagęszczenie
Plon suchej masy
wysokość
19
0,48
Wartość krytyczna testu
(significance level α=0,05)
Critical value of the test
(significance level α=0,05)
1,51
R (X,Y)
Wartość testu istotności
Value of the significance
test
3,41
N
Odchylenie standardowe
Standard deviation
Średnia arytmetyczna
Aritmetic mean
SR
Współczynnik korelacji
Pearsona Pearson
coefficient of corelation
R2
Liczebność grupy
Number of group
Oznaczenie
Signature
Korelacja
Correlation
Współczynnik determinacji
Coefficient of determination
równywalnie wyższe plony otrzymuje się z łąk w dobrych warunkach (nawet
do 15 t s.m.×ha-1), czy podczas intensywnej uprawy traw gatunków introdukowanych – 20-30 t s.m.×ha-1 [Sawicki i Kościk 2003].
S
t
tαkr
8,464
2,110
2,366
2,110
0,23
Tab. 1. Wybrane miary statystyczne badanych parametrów trzcinnika
Na znaczne zróżnicowanie wielkości masy nadziemnej trzcinnika piaskowego wskazują wyniki badań zamieszczane w literaturze przedmiotu. Według
Sobczaka [1976], na tzw. gruntach trudnych do zalesienia, sucha masa części
nadziemnych trzcinnika wynosiła 1,62-2,09 t×ha-1. Patrzałek i in. [2011] uzyskali plony trzcinnika w zakresie 4,5-11,4 ts.m.×ha-1, a według badań Kozłowskiego i Swędrzyńskiego [2010] – w niektórych stanowiskach plon trzcinnika piaskowego osiągał 6,47 t s.m.×ha-1.
Badania prowadzone przez Patrzałek i in. [2011] nad przydatnością trzcinnika do celów energetycznych wykazały, że wartość opałowa 1 kg części
nadziemnych tej rośliny wynosi 16,0 MJ×kg-1. Przyjmując tę wielkość do
obliczeń, można uznać, iż wartość energetyczna plonu trzcinnika brutto
w warunkach badań własnych zawierała się w przedziale od 30,1 GJ×ha-1
w 2005 r., do 63,2 w 2011 r., natomiast średnio z trzech lat badań – 47,5
GJ×ha-1. Dla porównania, wartość energetyczna słomy owsa uprawianego
na glebie kompleksu żytniego dobrego, według Kowalczyk-Juśko [2009]
wynosi 43,2 GJ×ha-1.
97
Agnieszka Listosz
WNIOSKI
• Plony biomasy nadziemnej trzcinnika piaskowego cechowało duże zróżnicowanie zarówno przestrzenne (w obrębie strefy zdegradowanej), jak
i pomiędzy kolejnymi latami badań.
• Średnio z trzech lat badań, uzyskano 2,97 t s.m.×ha-1, co w warunkach
silnie zdegradowanych wydm można uznać za plon stosunkowo wysoki.
• O wielkości plonów decydowało zagęszczenie łanu trzcinniczyska.
• Wartość energetyczna brutto plonu trzcinnika piaskowego wynosiła średnio 47,5 GJ×ha-1.
LITERATURA
Bielińska E.J. Domżał H. 2007. Właściwości fizykochemiczne i chemiczne gleb. [w:]
Ocena przeobrażeń środowiska glebowego i stabilności ekosystemów leśnych w
obszarze oddziaływania Zakładów Azotowych „Puławy” S.A., Acta Agrophysica,
145: 65-77.
Czyż H. Trzaskoś M. Kitczak T. 2005. Zbiorowiska trawiaste w warunkach skrajnie
suchych. Łąkarstwo w Polsce, 8: 35-44.
Falkowska K. Filipek T. 2009. Dynamika zmian zawartości azotu mineralnego
w wierzchniej warstwie gleb rejonu oddziaływania Zakładów Azotowych „Puławy” S.A., Ochrona Środowiska i Zasobów Naturalnych, 40: 96-102.
Falkowski M. (red.) 1982. Trawy polskie. Wyd. PWRiL, Warszawa: 169-175.
Gorzelak A. 2004. Trzcinniki – biologia i zwalczanie. Wyd. Centrum Informacyjne
Lasów Państwowych, Warszawa: 11-25.
Hodara J. Świca M. 2007. Właściwości fizyczne gleb. [w:] Ocena przeobrażeń środowiska
glebowego i stabilności ekosystemów leśnych w obszarze oddziaływania Zakładów Azotowych „Puławy” S.A., Acta Agrophysica, 145: 49-64.
Kowalczyk-Juśko A. Kościk B. Kwapisz M. 2009. Możliwości i ograniczenia wykorzystywania odpadów z rolnictwa na cele energetyczne. Południowo-Wschodni
Oddział Polskiego Towarzystwa Inżynierii Ekologicznej z siedzibą w Rzeszowie
– Polskie Towarzystwo Gleboznawcze, Oddział w Rzeszowie-Zeszyty Naukowe,
11: 155-160.
98
Kowalkowski A. Kopron H. Lewandowska J. Jedliczko S. Płecha R. 1999. Możliwości
przywracania funkcji leśnych w długotrwale niezrównoważonym ekosystemie leśnym
Nadleśnictwa Puławy. [w:] Funkcjonowanie gleb leśnych na terenach zagrożonych
i trendy jego zmian, Warsztaty Naukowe, Puławy: 49-63.
Kozłowski S. Swędrzyński A. 2010. Możliwości wykorzystania trzcinnika piaskowego w kontekście jego biologicznych, chemicznych i fizycznych właściwości. Łąkarstwo w Polsce, 13: 117-126.
Patrzałek A. Kozłowski S. Swędrzyński A. Trąba Cz. 2011. Trzcinnik piaskowy jako
potencjalna roślina energetyczna. Monografia, Wyd. Politechniki Śląskiej, Gliwice: ss.54.
Pranagal J. Słowińska-Jurkiewicz A. 2007. Pokrywa glebowa obszaru badań. [w:]
Ocena przeobrażeń środowiska glebowego i stabilności ekosystemów leśnych w
obszarze oddziaływania Zakładów Azotowych „Puławy” S.A., Acta Agrophysica,
Rozprawy i Monografie, 2: 11-27.
Sawicki B. Kościk K. 2003. Trawy i zbiorowiska trawiaste. [w:] Rośliny energetyczne, Wyd. Akademii Rolniczej w Lublinie: 111-135.
Siuta J. 1987. Ekologiczne skutki uprzemysłowienia Puław. Wyd. Instytut Ochrony
Środowiska, Warszawa: ss.263.
mgr inż. Agnieszka Listosz
Katedra Melioracji i Budownictwa Rolniczego
Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie
ul. Leszczyńskiego 7, 20-069 Lublin
Opiekun naukowy: dr hab. Tadeusz Węgorek
99
Mateusz Malinowski
EPISTEME
14/2012
s. 101-108
ISSN 1895-4421
UWARUNKOWANIA WYTWARZANIA PALIW ALTERNATYWNYCH
ZE ZMIESZANYCH ODPADÓW KOMUNALNYCH
THE RESTRICTIONS OF MIXED MUNICIPAL WASTE TREATMENT
TO ALTERNATIVE FUEL
Abstrakt. Postęp cywilizacyjny oraz związany z nim wzrost konsumpcji powodują
powstawanie coraz większych ilości odpadów komunalnych. Jednym z najważniejszych wyzwań stawianych współczesnej inżynierii jest zapobieganie ich nadmiernemu powstawaniu, następnie ponowne użycie, racjonalne wykorzystanie i ostateczne
unieszkodliwienie. Odpady komunalne stanowią nieograniczone źródło zasobów
energetycznych. Mogą być one spalane bezpośrednio w formie zmieszanej w spalarniach odpadów lub stanowić „surowiec” do wytwarzania paliw alternatywnych.
Wytwarzanie paliw alternatywnych z odpadowej frakcji palnej i spalanie ich w cementowniach przyczynia się między innymi do zmniejszenia ilości odpadów deponowanych na składowiskach. W pracy przedstawiono analizę możliwości uzyskiwania frakcji palnej w wyniku przetwarzania zmieszanych odpadów komunalnych
w procesie R15. Badania przeprowadzono w roku 2011 na terenie firmy MIKI Recykling. Analizie poddano odpady z dwóch rejonów Krakowa oraz obszarów wiejskich
(gminy Liszki i Mogilany). Z analizy przeprowadzonych pomiarów wynika, że ze
zmieszanych odpadów można uzyskać od 27% do 50% paliwa alternatywnego w zależności od charakteru miejsca ich gromadzenia i zbierania.
Słowa kluczowe: odpady komunalne, frakcja odpadów palnych, paliwo alternatywne
Summary. Civilization progress and the associated with them increase of consumption, generate increasing amounts of municipal waste. One of the main challenges of
today engineering is to prevent the waste excessive formation, next re-use of them,
recycle and final disposal. Mixed municipal waste are an unlimited source of energy
resources. Waste can be combusted directly in the mixed form in waste incinerators
or waste can be a „raw material” for the production of alternative fuels. Production
of alternative fuels from combustible waste fraction and incineration them in the cement plants reduces the amount of waste deposited in landfills. This paper presents
an analysis of possibilities of obtaining combustible waste fraction as a result of the
R15 process. The research was conducted in 2011 in MIKI Recycling company. The
analysis covered waste from two areas of Krakow city and the two rural communes:
Liszki and Mogilany. The study shows that the mixed municipal waste may be obtained from 30% to 50% alternative fuel, depending on the characteristic of their place
of gathering and collecting.
Key words: municipal waste, combustible wastes, alternative fuel
101
Mateusz Malinowski
WSTĘP
W Polsce w 2010 roku zebrano ponad 10 mln Mg odpadów komunalnych,
z czego 86% zdeponowano na składowiskach [Ochrona środowiska 2010].
Od lipca 2013 roku w pełni zacznie obowiązywać nowy system gospodarowania odpadami, zgodnie z Ustawą o utrzymaniu czystości i porządku
w gminach [Dz. U. 2011. Nr 152, poz. 897]. Nowy system głównie ze
względu na preferencyjne stawki opłat za wywóz odpadów, ma spowodować zwiększenie się ilości odpadów zbieranych selektywnie. Zwiększenie
ilości selektywnie zbieranych odpadów może nastąpić również w wyniku
planowanego podniesienia stawek opłaty marszałkowskiej za składowanie
odpadów. Równocześnie, ze względu na objęcie wszystkich mieszkańców
kraju obowiązkiem oddawania odpadów i odprowadzania do gminy opłaty za
ich zbiórkę i transport, prognozowane jest zwiększenie się całkowitej masy
zbieranych zmieszanych odpadów komunalnych. W 2010 roku systemem odbierania odpadów było objętych niecałe 80% mieszkańców kraju [Ochrona
środowiska 2010]. Zgodnie z zapisami ustawy, samorządy gminne przejmują
obowiązki właścicieli nieruchomości w zakresie gospodarowania odpadami,
a także stają się odpowiedzialne za budowę i utrzymanie infrastruktury wspomagającej procesy recyklingu i unieszkodliwiania odpadów.
Nowy system gospodarowania odpadami wprowadzany jest stopniowo od
1 stycznia 2012 roku. Jak wynika z analiz prowadzonych w gminach, które
od kilku lat posiadają taki system zarządzania strumieniem odpadów na swoim terenie, masa zbieranych odpadów w Polsce w 2014 roku może zwiększyć
się nawet o 51% w stosunku do aktualnie zbieranej masy i wynosić ponad 15,2
mln Mg.rok-1 [Malinowski 2011]. Taki strumień odpadów wymaga zapewnienia
odpowiedniej infrastruktury, która będzie mogła przetworzyć go (poddać odzyskowi, recyklingowi lub ponownemu przetworzeniu) lub zagospodarować. Za
niewykonanie obowiązku ograniczenia do 2020 roku składowania odpadów ulegających biodegradacji o 65% w stosunku do ilości odpadów zdeponowanych
w 1995 grożą Polsce wysokie kary mogące sięgać 300 tys. euro dziennie. Jedną
z alternatyw umożliwiających rozwiązanie tego problemu jest wykorzystanie
palnych właściwości odpadów w cementowniach [Pawlak i in. 2011].
Z szacunków Stowarzyszenia Producentów Cementu w Polsce wynika, że na
roczną produkcję klinkieru potrzebne jest 45500 tys. GJ ciepła, z czego 50%
mogłoby pochodzić z odpadów (paliwa alternatywnego produkowanego z odpadów) [SPC, 2008]. Przy takich założeniach przemysł cementowy mógłby spalić
1,13 mln Mg paliw alternatywnych. W krajach Europy zachodniej nawet 70%
ciepła wytwarzane jest w cementowniach ze spalania paliw alternatywnych,
w Polsce aktualnie jest to 15 do 25% w zależności od rejonu Polski [Duda, Lepucki 2009]. Dodatkową zaletą przetwarzania odpadów na paliwo jest fakt, iż w
procesie termicznego unieszkodliwiania odpadów w spalarni konwencjonalnej
powstaje ok. 30% żużli, które należy zdeponować na składowiska, natomiast
102
Uwarunkowania wytwarzania paliw alternatywnych...
w procesie współspalania paliw alternatywnych w piecu cementowym problem
ten znika, gdyż pozostałości po spaleniu stają się składnikiem klinkieru.
Niemal wszystkie odpady posiadające odpowiednią minimalną wartość energetyczną (powyżej 18 MJ.kg-1) mogą być używane do produkcji paliw alternatywnych [Duda, Lepucki 2009]. Należą do nich zarówno tworzywa sztuczne, papier, tekstylia, zużyte opony lub inne odpady gumowe, zużyte farby
i rozpuszczalniki, jak i osady z oczyszczalni ścieków, czy odpady zwierzęce (np. tłuszcze). W procesie przygotowania paliwa alternatywnego (proces
R15) wykorzystuje się te frakcje, których nie da się poddać recyklingowi na
przykład ze względu na poziom zanieczyszczeń. W przypadku zmieszanych
odpadów komunalnych samo wydzielenie frakcji palnej nie predysponuje
jej do zastosowania w piecu cementowym. Paliwo powinno charakteryzować się homogenicznością w całej masie, małą ilością substancji niepalnych.
Ograniczenia dotyczą także zawartości alkaliów, chloru, fluoru, metali ciężkich np. rtęci oraz związków aromatycznych. Szczególnie dotyczy to chloru,
który w sposób negatywny wpływa na proces wypalania i elementy pieca
cementowego [Pawlak i in. 2011]. Kluczowymi parametrami paliw alternatywnych decydującymi o ich przydatności do spalania w piecach cementowych są [SPC 2008]:
• wartości opałowa > 20 GJ.Mg-1
• wilgotność < 15%
• zawartość chloru < 0,8 %
• zawartość siarki < 1%
• zawartość metali ciężkich < 2.500 mg . kg-1
• zawartość popiołu <15%
W Polsce produkuje się dwa rodzaje paliwa alternatywnego z przeznaczeniem do odzysku energii głównie w piecach cementowych i wapienniczych.
Pierwszy typ to PASi – paliwo alternatywne impregnowane o kodzie 191211,
które uzyskuje się głównie z odpadów niebezpiecznych. Drugi typ – PASr,
to stałe paliwo alternatywne rozdrobnione o kodzie 191210 otrzymywane
z odpadów innych niż niebezpieczne, w tym ze zmieszanych odpadów komunalnych i przemysłowych. Eko-przedsiębiorstwa, zbierające i przetwarzające
odpady komunalne na paliwa alternatywne, takie jak np. REMONDIS podają,
że z 1 Mg zmieszanych odpadów komunalnych można uzyskać około 30%
paliwa alternatywnego (odpadów palnych) [www.remondis.pl].
Celem przeprowadzonych badań było określenie rzeczywistych możliwości
uzyskania paliwa alternatywnego ze zmieszanych odpadów komunalnych.
Badania miały na celu określenie ilościowych (masowych) ograniczeń związanych z produkcją paliw alternatywnych wynikających z właściwości zbieranych zmieszanych odpadów.
103
Mateusz Malinowski
MATERIAŁ I METODA
Badania przeprowadzono w trzech różnych środowiskach (3 różne trasy przejazdów śmieciarek): miejskim, ze zwartą zabudową jednorodzinną (Kraków
– Wola Justowska), wiejskim (gmina Liszki i Mogilany) oraz śródmiejskim
z ponad 50% udziałem firm i instytucji (centrum Krakowa). Każda z analizowanych tras charakteryzuje się innymi wskaźnikami nagromadzenia odpadów, gęstością usypową, składem morfologicznym, sitowym, etc. (Tab. 1).
W okresie od grudnia 2010 do grudnia 2011 w kolejnych kwartałach wykonano analizę masową uzyskiwanych frakcji z mechanicznego rozdziału zebranych zmieszanych odpadów komunalnych, które stanowiły surowiec do
produkcji paliwa alternatywnego (191210).
Jednostka
Wskaźniki nagromadzenia
Gęstość usypowa
kg os rok
m os rok
Tereny wiejskie
90 – 110
0,3 – 0,5
220 – 280
Tereny miejskie
180 – 330
1,5 – 1,9
160 – 240
Tereny miejskie nasycone
obiektami infrastrukturalnymi
220 – 400
1,8 – 2,5
110 – 180
.
.
-1
3.
.
-1
kg.m3
Tab. 1. Wybrane właściwości technologiczne odpadów komunalnych.
Źródło: opracowanie własne na podstawie [Szlaińska, d’Obyrn 2005]
Pomiary wykonano w instalacji przetwarzania odpadów MIKI Recykling
w Krakowie. Przedsiębiorstwo MIKI przetwarza odpady w procesie R15 - przetwarzanie odpadów w celu ich przygotowania do odzysku (w tym do odzysku
energetycznego), zgodnie z załącznikiem 5 do Ustawy o odpadach z dnia 27
kwietnia 2001r. [Dz. U. 2010. Nr 185, poz. 1243]. W każdym kwartale (porze
roku) wykonano dwie analizy dla każdej z trzech tras (6 w kwartale, 24 analizy
w ciągu roku). Pomiary wykonywano dla całej masy odpadów przywiezionych
przez śmieciarki w wybrane wcześniej dni, tak aby uniknąć odpadów, których
skład morfologiczny lub sitowy byłby zniekształcony przez okresy świąteczne
lub urlopowe itp. Średnia masa przeanalizowanych jednorazowo odpadów wynosiła 3,5 Mg. Niewielka liczba wykonanych pomiarów wynikała z potrzeby
zatrzymywania ciągłego procesu produkcji paliwa, tak aby możliwe było przetworzenie w instalacji odpadów tylko z wybranych śmieciarek.
Zmieszane odpady po rozładowaniu na placu magazynowym kierowano do
rozdrabniacza wstępnego (Hammel), następnie poddawano je separacji magnetycznej oraz ręcznemu wybieraniu szkła i metalu. Na separatorze sitowym firmy Doppstadt wydzielano ze strumienia frakcję mineralną, popiół,
gruz, odpady organiczne, stłuczkę szklaną i inne odpady o średnicy < 50 mm
(frakcja pod-sitowa). Następnie, z wykorzystaniem separatora balistycznego,
104
wydzielano frakcję lekką – palną (papier, karton, tekstylia i tworzywa sztuczne), które stanowiły pre-RDF (Refuse Derived Fuel) – ostateczny wsad do
produkcji paliwa. Frakcję ciężką (tzw. nad-sitową) stanowiły głównie: zawilgocony papier i karton, środki ochrony intymnej, ciężkie zanieczyszczenia
mineralne, duże elementy organiczne. Tak wyselekcjonowane odpady ważono z dokładnością do 1kg.
WYNIKI
W wyniku selekcji zmieszanych odpadów komunalnych wydzielono 5 frakcji: frakcja pre-RDF (stanowiąca paliwo alternatywne), frakcja metali (suma
metali wybranych ręcznie i oddzielonych na separatorze), frakcja szkła (białe
i kolorowe), frakcja pod-sitowa (frakcja o uziarnieniu do 50 mm), frakcja
nad-sitowa (o uziarnieniu powyżej 50 mm, ale nienadająca się do przetworzenia na paliwo). W tabelach 2, 3 i 4 przedstawiono procentowe zestawienie
mas wyselekcjonowanych odpadów w różnych porach roku.
W wyniku analizy stwierdzono prawidłowości dotyczące zmienności procentowego udziału masowego pre-RDF, jak i pozostałych frakcji odpadów.
Największe ilości paliwa alternatywnego ze zmieszanych odpadów uzyskiwane są w okresie letnim (lipiec, sierpień, wrzesień), w którym równocześnie
zawartość frakcji pod-sitowej (zawierającej w tym okresie głównie odpady
organiczne) jest najniższa. Najmniej paliwa alternatywnego można uzyskać
w okresie zimowym (styczeń, luty, marzec). W porównaniu do okresu letniego
masa uzyskanej frakcji paliwa alternatywnego była mniejsza o 4 do 8% w okresie zimowym. W okresie zimowym wzrastała zawartość frakcji pod-sitowej
zawierającej wówczas głownie popiół. Tendencja ta występuje we wszystkich
analizowanych przypadkach, zaś najsilniej uwidacznia się na terenach miejskich z zabudową jednorodzinną oraz na terenach wiejskich.
Zima
Wiosna
Lato
Jesień
Średnia
[%]
[%]
[%]
[%]
[%]
Pre-RDF
34,04
38,71
42,38
36,09
37,80
Metal
2,58
1,52
2,13
2,33
2,14
Szkło
4,23
1,80
3,72
3,68
3,36
Frakcja pod-sitowa
43,45
41,99
36,54
42,89
41,22
Frakcja nad-sitowa
15,70
15,98
15,22
15,01
15,48
Suma
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
Pora roku / Frakcja
Tab. 2. Udział procentowy frakcji odpadów komunalnych z krakowskich osiedli
105
Mateusz Malinowski
Zima
Wiosna
Lato
Jesień
Średnia
[%]
[%]
[%]
[%]
[%]
Pre-RDF
48,59
50,61
52,08
48,68
49,99
Metal
3,45
2,68
2,86
3,02
3,01
Szkło
3,52
3,13
6,83
5,28
4,69
Frakcja pod-sitowa
33,10
31,30
25,40
31,40
30,30
Frakcja nad-sitowa
11,34
12,28
12,83
11,62
12,02
Suma
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
Pora roku / Frakcja
Tab. 3. Udział procentowy frakcji odpadów komunalnych z krakowskich firm
Zima
Wiosna
Lato
Jesień
Średnia
[%]
[%]
[%]
[%]
[%]
Pre-RDF
24,57
26,34
30,44
27,03
27,10
Metal
2,55
2,39
3,47
2,83
2,81
Szkło
2,70
2,29
4,37
6,21
3,89
Frakcja pod-sitowa
61,43
57,92
47,57
54,00
55,23
Frakcja nad-sitowa
8,74
11,06
14,14
9,94
10,97
Suma
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
Pora roku / Frakcja
Tab. 4. Udział procentowy frakcji odpadów komunalnych z obszarów wiejskich
Najwięcej frakcji paliwa alternatywnego uzyskuje się z odpadów powstających w centrach miast, w których występuje bardzo duże nasycenie obiektami infrastrukturalnymi. W składzie morfologicznym odpadów komunalnych
z tych obszarów przeważają papier, karton, gazety i tworzywa sztuczne. Ponieważ w zakładach usługowych i innych obiektach infrastruktury nie ma
obowiązku prowadzenia selektywnej zbiórki odpadów, powstające zmieszane odpady komunalne trafiają do śmieciarek. Ta sytuacja determinuje ponad
50% udział frakcji pre-RDF w kwartałach wiosna i lato (Tab. 3).
Na osiedlach domów jednorodzinnych i terenach wiejskich, z których odpady były poddane analizie, firma MIKI Recykling prowadzi tzw. selektywną
zbiórkę odpadów. Odpady użyteczne (metal, szkło, papier i plastik) zbierane
są oddzielnie w różnokolorowych workach. Zebrane w ten sposób odpady są
106
sprzedawane do recyklingu i nie są przetwarzane na paliwo alternatywne. Na
obszarach tych znacznie większy jest udział frakcji pod-sitowej co powoduje
obniżony poziom uzysku frakcji pre-RDF (Mogilany – frakcja pod-sitowa
w jednym z transportów zimowych stanowiła aż 71%). Średni roczny uzysk
paliwa alternatywnego na terenach miejskich osiedli domów jednorodzinnych wynosi 37,8%, zaś na terenach wiejskich zaledwie 27,1% (Tab. 2 i 4).
Przyjmując za KPGO 2014, że masa odpadów wytwarzanych na obszarach
wiejskich stanowi 28% całego strumienia, zaś pozostała część powstaje na
obszarach miejskich, można przyjąć iż średnia ważona masa uzyskiwanego
paliwa alternatywnego z 1 Mg zmieszanych odpadów komunalnych wynosi
377 kg. Na tej podstawie można oszacować, że do wyprodukowania 1,13 mln
Mg paliwa alternatywnego należy przetworzyć ponad 3 mln Mg odpadów.
DYSKUSJA I WNIOSKI
• Przetwarzanie zmieszanych odpadów komunalnych na paliwa alternatywne jest szczególnie uzasadnione w przypadku odpadów z rejonów
typowo miejskich oraz odpadów z obiektów infrastruktury, co pozwala na zredukowanie masy tych odpadów nawet o 34% do 52%. Jest to
bezpośrednia korzyść dla środowiska, ponieważ po spaleniu odpadów w
piecach cementowych nie pozostanie żaden produkt uboczny, a także korzyść dla przedsiębiorcy, który nie poniesie opłaty za umieszczenie tej
masy odpadów na składowisku.
• Wytwarzanie frakcji paliw alternatywnych ze zmieszanych odpadów
ograniczone jest głównie miejscem generowania i zbierania tych odpadów oraz w mniejszym stopniu porą roku. Czynniki te determinują różnice w składzie morfologicznym odpadów. Jednym z kolejnych ograniczeń
w uzyskiwaniu paliwa jest skuteczność prowadzonej selektywnej zbiórki
odpadów. Im jest ona efektywniejsza tym, mniej frakcji odpadów palnych
wyrzucanych jest do pojemników na zmieszane odpady komunalne.
• Najmniejsze procentowe udziały frakcji paliwa alternatywnego otrzymano podczas przetwarzania zmieszanych odpadów komunalnych z terenów
wiejskich, największą masę zaś z silnie zurbanizowanych terenów nasyconych infrastrukturą społeczną.
• Uzyskane poziomy odzysku frakcji pre-RDF w badaniach prowadzonych
na instalacji firmy MIKI Recykling są znacznie wyższe niż podawane
przez firmy konkurencyjne.
107
Mateusz Malinowski
LITERATURA
Duda J., Lepucki M. 2009. Nowe możliwości wykorzystania paliw z odpadów
w procesie wypalania klinkieru. Gliwice, Wyd. KTiUZO. s. 191 – 199.
Malinowski M. 2011. Changes in municipal waste management following the amendment of the act on maintaining the cleanliness and order in communes. Infrastructure and ecology of rural areas. Nr 12/2011, s. 103 – 116.
Pawlak B., Hoppe G., Gaca J. 2011, Produkcja paliw alternatywnych dla cementowni.
Gospodarka odpadami komunalnymi. Tom VII Koszalin, s. 63 – 69.
Ochrona środowiska 2010. GUS. Warszawa, s. 336 – 338.
Stowarzyszenie Producentów Cementu (SPC), 2008. Paliwo alternatywne na bazie
sortowanych odpadów komunalnych dla przemysłu cementowego. Kraków, s. 3.
Szalińska E., d’Obyrn K. 2005. Odpady komunalne – zbiórka, recykling unieszkodliwianie, Wyd. PK w Krakowie, s. 55.
Ustawa o odpadach [tj. Dz. U. 2010. Nr 185, poz. 1243]
Ustawa o utrzymaniu czystości i porządku w gminach [t.j.Dz. U. 2011. Nr 152, poz. 897]
www.remondis.pl/rmpl/dla-prasy/informacje-prasowe/newsdetail/odpady-zrodlem-energii [dostęp: 22.01.12]
mgr inż. Mateusz Malinowski
Instytut Inżynierii Rolniczej i Informatyki
Zakład Infrastruktury Technicznej i Ekoenergetyki
ul. Balicka 116b, 30-149 Kraków
Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Stanisław Gruszczyński
108
Weronika Maślanko
Joanna Sender
EPISTEME
14/2012
s. 109-120
ISSN 1895-4421
STAN EKOLOGICZNY JEZIORA KRASNE W OPARCIU
O WSKAŹNIKI MAKROFITOWE ORAZ ANALIZA STRUKTURY
UŻYTKOWANIA JEGO ZLEWNI
KRASNE LAKE’ ECOLOGICAL STATE BASED ON MACROPHYTES
INDEXES AND ANALYSIS OF LAND USE IN THE CATCHMENT AREA
Abstrakt. Duże zainteresowanie turystów Jeziorem Krasne oraz bezpośredni wpływ
zlewni jeziora spowodowało podjęcie badań w celu określenia stanu ekologicznego jeziora w oparciu o porównanie trzech wskaźników makrofitowych. Mimo ponad 8-krotnego wzrostu liczby turystów nad badanym jeziorem na przestrzeni prawie 25 lat oraz
osiągnięcia jednego z najwyższych wskaźników obciążenia jezior ruchem turystycznym,
w badanym jeziorze oznaczono 11 zbiorowisk wchodzących w skład fitolitoralu jeziornego, wśród których największą powierzchnię zajmowały Phragmitetum australis oraz
Ceratophylletum demersi. Stwierdzono, że okresie 50 lat nastąpiły wyraźne zmiany
w strukturze jakościowej i ilościowej makrolitów, jednak zastosowane wskaźniki makrofitowe wskazały na dobry stan ekologiczny badanego jeziora.
Słowa kluczowe: fitolitoral, makrofity, jezioro Krasne, Pojezierze Łęczyńsko – Włodawskie, wskaźniki makrofitowe.
Abstrakt. Duże zainteresowanie turystów Jeziorem Krasne oraz bezpośredni wpływ
zlewni jeziora spowodowało podjęcie badań w celu określenia stanu ekologicznego jeziora w oparciu o porównanie trzech wskaźników makrofitowych. Mimo ponad 8-krotnego wzrostu liczby turystów nad badanym jeziorem na przestrzeni prawie 25 lat oraz
osiągnięcia jednego z najwyższych wskaźników obciążenia jezior ruchem turystycznym,
w badanym jeziorze oznaczono 11 zbiorowisk wchodzących w skład fitolitoralu jeziornego, wśród których największą powierzchnię zajmowały Phragmitetum australis oraz
Ceratophylletum demersi. Stwierdzono, że okresie 50 lat nastąpiły wyraźne zmiany
w strukturze jakościowej i ilościowej makrolitów, jednak zastosowane wskaźniki makrofitowe wskazały na dobry stan ekologiczny badanego jeziora.
Słowa kluczowe: fitolitoral, makrofity, jezioro Krasne, Pojezierze Łęczyńsko – Włodawskie, wskaźniki makrofitowe.
109
WSTĘP
Mezoregion Pojezierza Łęczyńsko - Włodawskiego w całości zaliczany jest
do makroregionu Polesia Lubelskiego. Otoczenie z trzech stron przez tereny bardziej wypiętrzone, takie jak Grab Włodawski, Zaklęsłość Sosnowicka
i Pagóry Chełmskie sprawia, że mezoregion ten położony jest w charakterystycznej, podmokłej depresji morfologicznej. Pojezierze Łęczyńsko - Włodawskie jest największym w Polsce zgrupowaniem jezior występujących
poza obszarami uformowanymi przez morfogenezę glacjalną ostatniego zlodowacenia. W obrębie tego wybitnie bogatego przyrodniczo terenu znajduje
się 60 jezior naturalnych, których wiek ocenia się na 11 300 lat [Wilgat 1954,
Wilgat i in. 1991, Harasimiuk i in. 1998, Chmielewski 2005].
Jeziora zasiedla specyficzna wodna roślinność zwana makrofitami. Makrofity
to morfologicznie bardzo zróżnicowana grupa roślin [Hartog, Segal 1964, Cook
1983, Wołek 1996]. Należą do nich wszystkie krajowe ramienice (Charophyta), część mszaków (Bryophyta), nieliczne paprotniki (Pteridophyta) oraz niewielka grupa roślin nasiennych (Spermatophyta) [Szmeja 2006]. Ze względu
na różne wymagania makrofity podzielono na: amfifity, helofity, nimfeidy, elodeidy, isoetidy oraz pleuston [Bernatowicz, Wolny 1974]. Makrofity spełniają
szereg ważnych funkcji ekologicznych w zbiornikach wodnych, m.in. wpływają na
żyzność wód oraz skład gatunkowy organizmów roślinnych i zwierzęcych. Stanowią miejsce żerowania, rozrodu oraz refugia dla wielu wodnych bezkręgowców
oraz ryb, a także sprzyjające siedliska dla awifauny [Kornijów, Radwan 2000]. Ich
obecność wpływa na wzbogacenie różnorodności biologicznej ekosystemów [Sender 2009, 2011, Maślanko i in. 2011a].
Pomimo objęcia obszaru Polesia Lubelskiego różnorodnymi formami ochrony przyrody, takimi jak: park narodowy, parki krajobrazowe, rezerwaty
przyrody czy statusem Rezerwatu Biosfery UNESCO „Polesie Zachodnie”,
z uwagi na silną antropopresję w tym regionie stan ekologiczny wielu jezior
użytkowanych rekreacyjnie oraz niekontrolowane rozprzestrzenianie się zabudowy letniskowej powinny być stałym obiektem badań i monitoringu.
Duże zainteresowanie turystów badanym jeziorem oraz wpływ zlewni na
stan ekologiczny jeziora spowodowało podjęcie badań mających na celu
określenie stanu ekologicznego jeziora w oparciu o porównanie trzech makrofitowych wskaźników oceny stanu ekologicznego jezior. Ponadto dokonano porównawczej analizy zagospodarowania zlewni jeziora Krasne w okresie
prawie 20 lat ukazującej kierunki przekształceń tego obszaru.
OBSZAR BADAŃ
Badania przeprowadzono w głębokim, mezotroficznym jeziorze Krasne
w mezoregionie Pojezierza Łęczyńsko - Włodawskiego na Polesiu Lubelskim
110
Stan ekologiczny jeziora Krasne...
. Jezioro Krasne jest położone w zlewni rzeki Tyśmienicy, administracyjnie
w gminie Uścimów. Znajduje się na obszarze parku krajobrazowego „Pojezierze Łęczyńskie”. Jest jeziorem dimiktycznym, o leszczowo-sielawowym
typie rybackim. Objętość jeziora wynosi 8180 tys. m3, natomiast głębokość
maksymalna 34 m, a średnia 10,8 m. Linia brzegowa jeziora wynosi 3514
m. Zasilane jest wodami gruntowymi, opadowymi i wodą z kanału Wieprz
- Krzna, doprowadzaną grawitacyjnie przy pomocy rowu. Brzegi jeziora są
piaszczyste, co niewątpliwie wpływa na jego atrakcyjność wśród turystów.
W latach 90-tych jezioro Krasne zostało zakwalifikowane do II klasy czystości, natomiast na początku XXI w. już do III klasy czystości, czyli do wód
silnie zanieczyszczonych [Raport… 1998, 2003]. Wg Raportu… z 2003 roku
jezioro zostało przyporządkowane do I kategorii odporności na degradację.
Nad jeziorem Krasne na przestrzeni prawie 25 lat ponad 8 krotnie wzrosła
liczba turystów [Chmielewski, Jankowska 2009]. Jezioro uzyskało jeden
z najwyższych wskaźników obciążenia jezior Pojezierza Łęczyńsko - Włodawskiego ruchem turystycznym [Maślanko i in. 2011], z liczbą turystów
nawet do 3200 osób w sezonie.
MATERIAŁ I METODY
Analizy florystyczne przeprowadzone zostały w okresie wegetacyjnym 20072009, z aktualizacją badań terenowych w 2011 r. Do określenia ekologicznej
struktury makrofitów zastosowano powszechnie przyjętą w Europie Środkowej metodę fitosocjologiczną Brauna-Blanqueta [1951]. Jednostki fitosocjologiczne (określone na podstawie gatunków dominujących) wyróżniono
stosując układ systematyczny i nomenklaturę Matuszkiewicza [2008]. Zdjęcie fitosocjologiczne obejmowało listę wszystkich gatunków stwierdzonych
w obrębie fitocenozy z uwzględnieniem ich liczby [Szmeja 2006]. W celu
określenia stanu ekologicznego jeziora zastosowano trzy wskaźniki: polski,
niemiecki oraz angielski [Palmer 2001, Stelzer i in. 2005, Ciecierska i in.
2006, 2010, Ciecierska 2008, Kolada i in. 2011].
Do obliczenia procentowego udziału poszczególnych zbiorowisk roślinnych jeziora Krasne wykorzystano oprogramowanie ArcGIS 10.0. Zlewnia jeziora została wyznaczona na podst. mapy topograficznej w skali 1:25000 w programie
ArcGIS 10.0 w celu przeprowadzenia analizy struktury jej użytkowania. Analizę
struktury użytkowania zlewni jeziora Krasne dokonano metodą fotointerpretacyjnej analizy retrospektywnej [Chmielewski i in. 1996], z wykorzystaniem zdjęć
lotniczych z roku 2007 r. i zdjęć satelitarnych z roku 2009. Dokonano porównania obecnej struktury użytkowania zlewni jeziora Krasne z jego zagospodarowaniem w latach 90-tych XX w. [Harasimiuk i in. 1998]. Mapy struktury obecnego
użytkowania zlewni jeziora Krasne oraz pomiary powierzchni poszczególnych
wydzieleń wykonano w środowisku ArcView.
111
WYNIKI I DYSKUSJA
Na podstawie przeprowadzonych analiz obliczono obecną powierzchnię
jeziora tj. 73,2 ha. Uległa ona w stosunku do lat 90-tych ubiegłego wieku
nieznacznemu zmniejszeniu o ok. 1,72 ha. Natomiast powierzchnia zlewni
jeziora Krasne oszacowana została na 328,85 ha (Tab. 1).
Parametry morfometryczne
Wartość
Powierzchnia jeziora [ha]
73,2
Powierzchnia lustra wody [ha]
55,32
Przezroczystość [m]
2,5
Powierzchnia fitolitoralu [ha]
17,88
[%]
24,4
Powierzchnia zlewni [ha]
328,85
Tab. 1. Charakterystyka podstawowych parametrów morfometrycznych badanego jeziora
W badanym jeziorze oznaczono 11 zbiorowisk wchodzących w skład fitolitoralu jeziornego, wśród których największą powierzchnię zajmowały Phragmitetum australis oraz Ceratophylletum demersi (Rys. 1). Zajmowały one
łącznie 17,88 ha, co stanowiło 24,4% powierzchni całego jeziora. W pasie
roślinności otaczającej jezioro oznaczono zbiorowisko Salicetum pentandro
- cinereae, które z uwagi na siedlisko występowania nie zostało włączone
do roślinności budującej fitolitoral jeziorny. Zbiorowisko stanowiące pas roślinności o powierzchni 7,08 ha pełni rolę strefy buforowej otaczającej jezioro
Krasne – na długości 3,05 km, wzdłuż prawie całej linii brzegowej (Rys.1).
Fitocenoza
Pow. [ha]
Udział [%]
Ceratophylletum demersi
3,95
22,1
Charetum fragilis
0,87
4,9
Eleocharitetum palustris
0,11
0,6
Juncus conglomeratus
0,27
1,5
Myriophyllo - Littorelletum
0,86
4,8
Myriophyllum spicati
1,47
8,2
Nitellopsidetum obtusae
1,79
10,0
Phragmitetum australis
5,85
32,8
Scirpetum lacustris
0,22
1,2
Hydrocharitetum morsus - ranae
1,97
11,0
Typhetum angustifoliae
0,52
2,9
Razem:
17,88
100
Tab. 2. Powierzchnia i udział poszczególnych zbiorowisk roślinnych w tworzeniu
fitolitoralu jeziora Krasne [ha, %]
112
Rys. 3. Rozmieszczenie zbiorowisk roślinnych jeziora Krasne
W badanym jeziorze rozwinęły się dwie grupy makrofitów: wynurzone
i zanurzone. Zdecydowaną większość w tworzeniu fitolitoralu stanowiły elodeidy, zajmując 61% jeziornego fitolitoralu, co z punktu widzenia ekologicznego jest korzystne ze względu na dobre warunki świetlne umożliwiające
rozwój tej grupie roślin. Natomiast helofity jako nieuzależnione od warunków świetlnych panujących w wodzie, zajmowały powierzchnię 6,97 ha,
co stanowiło 39% (Tab. 3).
Typ roślinności
Jez. Krasne
ha
% pow. fitolitoralu
% pow. jeziora z fitolitoralem
6,97
38,98
9,5
Elodeidy
10,91
61,02
14,9
Razem
17,88
100
24,4
Helofity
Tab. 3. Powierzchnia i udział poszczególnych zbiorowisk roślinnych w fitolitoralu jeziora
Krasne, zarówno w odniesieniu do samego fitolitoralu, jak i jeziora wraz z fitolitoralem
Wśród elodeidów obliczono stosunek zajmowanej powierzchni przez Chareta do Potametea. Duży udział wśród grupy elodeidów miały ramienice,
stanowiły bowiem 25%, co również wskazuje na dobry stan ekologiczny wód
badanego jeziora [Pełechaty, Pukacz 2006, Pełechaty i in. 2007].
113
Na podstawie uzyskanych wartości wskaźników makrofitowych miary stanu ekologicznego jeziora, badane jezioro wykazało dobry stan ekologiczny
(Tab. 4). Wartości wskaźnika TRS wskazywały nawet na oligotroficzny charakter wód tego zbiornika, podobnie jak w latach 50-tych XIX w. [Fijałkowski 1959]. Natomiast w latach 90-tych jezioro to było zaliczane do jezior
o charakterze mezotroficznym [Harasimiuk i in.1998].
Powierzchnia ograniczona izobatą 2,5 m [ha]
14,09
Powierzchnia fitolitoralu [ha]
17,88
Liczba zespołów (S)
11
Wskaźnik zróżnicowania fitocenotycznego (H)
1,1
Wskaźnik zasiedlenia (Z)
1,26
Wskaźnik maksymalnego zróżnicowania fitocenotycznego (Hmax)
2,39
Makrofitowy Indeks Stanu Ekologicznego (ESMI)
0,52
Reference Index (RI)
0,74
Trophic Ranking Score (TRS)
6,9
Tab. 4. Referencyjne wskaźniki zróżnicowania fitocenotycznego jeziora Krasne
Analizując zmiany w układzie roślinności na przestrzeni 50 lat (1959 – 2011)
na analizowanym transekcie E – SSW nastąpiła znaczna przebudowa struktury makrofitów (Rys. 2). Zbiorowisko Ranunculo – Juncetum zostało całkowicie wyparte przez Salicetum pentandro – cinereae, natomiast zbiorowisko
Myriophyllo – Littorelletum sięgające obecnie do nieco ponad 2m głębokości
wyparło całkowicie Eleocharitetum palustris i Charetum asperii. W latach
50-tych na brzegu wschodnim Ceratophylletum demersi zalegało znacznie
płyciej (1,5-3m) niż obecnie (5-7m). Jako nowe zbiorowisko na tym brzegu
pojawiło się Hydrocharitetum morsus - ranae (na głębokości 2-6m).
Z brzegu południowo - zachodniego wyznaczonego transektu całkowicie
ustąpiło Plantagineto Lolietum na rzecz Salicetum pentandro - cinereae, natomiast Elocharitetum palustris zostało całkowicie wyparte przez Phragmitetum australis. Na podobnej głębokości nadal znajdowało się Myriophyllum
spicati. Schodzące do głębokości ponad 3 m w latach 50-tych Ceratophylletum demersi zostało zastąpione przez Charetum fragilis (obecny zasięg do
7 m). Na obu brzegach analizowanego transektu zanotowano całkowity zanik
Plantagineto Lolietum oraz Ranunculo - Juncetum w wyniku ekspansji Salicetum pentandro - cinereae.
114
Rys. 2. Układ zbiorowisk roślinnych na analizowanym transekcie florystycznym (nomenklatura wg Matuszkiewicza, 2008): a) w roku 1959 [Fijałkowski 1959], b) w roku 2011
W trakcie analiz struktury użytkowania ziemi w zlewni jeziora Krasne
w okresie prawie 20 lat stwierdzono znaczne zmiany. W porównywanym
okresie czasu w zlewni jeziora Krasne powstały 3 nowe zbiorniki wodne,
tworząc z już istniejącymi kompleks sąsiadujących ze sobą 6 stawów. Utworzenie nowych stawów wraz z rozwijającą się roślinnością szuwarową wpływa na zwiększenie bioróżnorodności tego obszaru, stanowiąc potencjalnie
nowe refugia lęgowe dla wielu gatunków. Zbiorowiska zaroślowe w zlewni
zwiększyły swą powierzchnię o ok. 6,17 ha. Powierzchnia łąk zredukowana
została o ponad 8 ha, co wskazuje na wykorzystanie ich pod zabudowę rekreacyjną, nowe stawy oraz pola uprawne nawet znajdujących się w bliskim
sąsiedztwie jeziora powierzchni łąkowych (Tab. 4).
Jezioro Krasne posiada dwa dostępne dla turystów piaszczyste brzegi o powierzchni 0,47 ha (od strony północnej) i 0,06 ha (od strony południowo
– wschodniej). Łączna długość piaszczystych plaż nad jeziorem Krasne wynosi 299,2 m. Stanowi to jedynie 8,5% całej linii brzegowej, umożliwiając
swobodny (nieograniczony) rozwój roślinności fitolitoralowej na pozostałej
długości brzegów. Piaszczyste brzegi jeziora, pozbawione roślinności szuwarowej i wykorzystywane rekreacyjnie, bezpośrednio sąsiadują z zabudową
letniskową i rekreacyjną stwarzając dogodną bazę noclegową i wypoczynkową dla turystów (Rys. 3).
115
Formy użytkowania
ziemi w zlewni
Zmiany
powierzchni (ha)
Zmiany
powierzchni
Obecny udział
w zlewni [%]
1990 wg
Wilgata
2007/2009
Lustro wody jeziora Krasne
74,92
73,2
-1,72
22,3
Inne zbiorniki wodne
23,16
28,94
5,78
8,8
Zbiorowiska szuwarowe
b.d.
8,88
b.d.
2,7
Zbiorowiska zaroślowe
1,15
7,32
6,17
2,2
Torfowiska z sukcesją
0
0,07
0,07
0,02
Łąki
36,64
28,41
-8,23
8,6
Kompleksy leśne
40
45,9
5,9
14
Zieleń produkcyjna
0,32
0,24
-0,08
0,07
Pola uprawne
96,41
96,17
-0,24
29,2
Pojedyncze gospodarstwo rolne
b.d.
0,15
b.d.
0,05
Zwarta zabudowa wiejska
4,67
9,21
4.54
2,8
Zabudowa letnia i rekreacyjna
1,35
30,35
29
9,3
RAZEM
X
328,85
X
100
Tab. 4. Zmiany struktury użytkowania ziemi w zlewni jeziora Krasne
w latach 90-tych i obecnie
Wg analiz porównawczych lesistość zlewni jeziora Krasne niewiele się zwiększyła. Zabudowa wiejska (wieś Krasne) tworząc zwarty pierścień otacza zachodni brzeg jeziora. Najbardziej naturalny i najmniej podatny na wpływ antropogeniczny wydaje się być wschodni brzeg jeziora, otoczony dużym kompleksem leśnym, wychodzącym ponad granice zlewni, o pow. 51ha.
Zabudowa letniskowa i rekreacyjna w zlewni jeziora Krasne rozwinęła się
głównie przy piaszczystych brzegach jeziora, a także towarzysząc zwartej
zabudowie wiejskiej (przy wsi Krasne) (Rys. 3). W latach 90-tych XX w.
zabudowa ta zajmowała ok. 1,35 ha, a już pod koniec I dziesięciolecia XXI
w. – 30,35 ha. Intensywna rozbudowa bazy letniskowo – rekreacyjnej jest
częstym zjawiskiem nad jeziorami użytkowanymi turystycznie na Pojezierzu Łęczyńsko – Włodawskiego w okresie kilkudziesięciu lat [Chmielewski,
Chmielewski 2009]. Część północną oraz zachodnią badanej zlewni stanowią
wielkoobszarowe pola uprawne zajmujące łącznie 96,17 ha. Analizując formy
użytkowania zlewni jeziora Krasne można stwierdzić, że dominującymi są wciąż
rolnictwo (29,2 %), a w ostatnim dwudziestoleciu również rekreacja (9,3%).
116
WNIOSKI
• W użytkowanym typowo rekreacyjnie jeziorze zidentyfikowano aż 11 zbiorowisk makrofitów, zajmujących łącznie 17,88 ha. Największą powierzchnię zajmowało Phragmitetum australis (5,85 ha) oraz Ceratophylletum demersi (3,95
ha). W jeziorze dominowała roślinność zanurzona.
• W okresie 50 lat nastąpiły wyraźne zmiany w strukturze jakościowej
i ilościowej makrofitów.
• Zastosowane do oceny stanu ekologicznego jeziora wskaźniki makrofitowe wskazały na dobry stan badanego jeziora.
• Dominującymi formami użytkowania ziemi w zlewni jeziora Krasne są rolnictwo i rekreacja. Od lat 90-tych XX w. nastąpiło ponad 20-krotne zwiększenie
powierzchni wykorzystywanej pod zabudowę letniskową i rekreację.
Rys. 3. Obecna struktura
użytkowania ziemi
w zlewni jez. Krasne
117
LITERATURA
Bernatowicz S., Wolny P. 1974. Botanika dla limnologów i rybaków. Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i leśne, Warszawa.
Braun-Blanquet J. 1951. Pflanzensoziologie. Springer Verlag, Wien.
Chmielewski T. J., Olenderek H., Sielewicz B. 1996. Fotointerpretacyjna analiza retrospektywna zmian struktury ekologicznej Kampinoskiego Parku Narodowego w
ostatnim 40-leciu. [w:] Kistowski M. (red.): Badania ekologiczno – krajobrazowe
na obszarach chronionych. Uniwersytet Gdański, Polska Asocjacja Ekologii Krajobrazu, Gdańsk: 125-129.
Chmielewski T. J., Jankowska P. 2009. Changes in the level and structure of tourism on selected lakes of Łęczna – Włodawa Lakeland from 1985 to 2008. [In:]
Chmielewski T.J., Sławiński C. eds. Nature and Landscape Monitoring System in
the West Polesie Region. Lublin: 1-270.
Chmielewski Sz., Chmielewski T.J. 2009. Analiza zmian struktury użytkowania ziemi
w latach 1952-2007. [w:] Chmielewski T.J. red. Ekologia krajobrazów hydrogenicznych Rezerwatu Biosfery „Polesie Zachodnie”. Lublin: 1-344.
Ciecierska H., Kolada A., Soszka H., Gołub M. 2006. Methodological improvements in the macrophyte-based biological monitoring of surface waters
– a pilot study of waters representing selected categories and types. Stage II.
Methods for field investigations of macrophytes for the purpose of routine water
monitoring, and macrophyte-based assessment and classification of the ecological status of waters. Institute of Environmental Protection, Warszawa (in Polish).
Ciecierska H. 2008. Macrophytes as indicators of the ecological status of lakes.
Monographs and Dissertations, 139. University of Warmia and Mazury in Olsztyn (in Polish).
Ciecierska H., Kolada A., Soszka H., Gołub M. 2010. A Method for Macrophyte
Based Assessment of the Ecological Status of Lakes, Developed and Implemented
for the Purpose of Environmental Protection in Poland. BALWOIS 2010 – Ohrid,
Republic of Macedonia – 25, 29 May 2010.
Cook R. E. 1983. Clonal plant populations. Ann. Sci., 71 (1983), 244–253.
Fijałkowski D. 1959. Szata roślinna Jezior Łęczyńsko – Włodawskich i przylegających do
nich torfowisk. Annales UMCS, Lublin, Sec. B., vol. 14,3: 131-206.
Harasimiuk M., Michalczyk Z., Turczyński M. red. 1998. Jeziora łęczyńsko – włodawskie. Monografia przyrodnicza. Biblioteka Monitoringu Środowiska Lublin: 1-176.
Hartog C., Segal S. 1964. A New classification of the water plant communities. Acta
Bot. Neerl.,13, 3,367−393.
118
Kolada A., Ciecierska H., Ruszczyńska J., Mjelde M., Dziedzic J., Dynowski P., Jasnorzewski A. 2011. Makrofity. [w:] Soszka H. red. Ocena stanu ekologicznego
wód zlewni rzeki Wel. Olsztyn, 169- 185.
Kornijów R., Radwan S. 2000. Zasady zrównoważonego użytkowania i ochrony jezior
położonych na terenach wiejskich. [w:] Problemy ochrony i użytkowania obszarów
wiejskich o dużych walorach przyrodniczych. Wyd. UMCS, Lublin.
Maślanko W., Tajchman K., Chmielewski T.J. 2011. Selected indexes of anthropogenic
load of environment in the West Polesie Biosphere Reserve. Teka Komisji Ochrony
i Kształtowania Środowiska Przyrodniczego.Tom VIII, Lublin: 86-96.
Maślanko W., Sender J., Kułak A. 2011a. Hydrobotaniczna charakterystyka oczek wodnych w dolinie rzeki Ciemięgi na odcinku Jastków – Snopków. Nr 12 . t. 1.
Matuszkiewicz W. 2008. Przewodnik do oznaczania zbiorowisk roślinnych Polski.
PWN, Warszawa.
Palmer M. 2001. An approach to the use of macrophytes for monitoring standing
waters. Freshwater Forum, Vol 16, No 1, 82-90.
Pełechaty M., Pukacz A. 2006. Flora i roślinność ramieniowa jezior Poligonu
Wojskowego Wędrzyn oraz Łagowskiego Parku Krajobrazowego (środkowo-zachodnia Polska) na tle stanu roślinności wodnej i szuwarowej. Ekologia
i Technika, 14, 6: 237-245
Pełechaty M., Pełechata A., Pukacz A. 2007. Flora i roślinność ramieniowa na tle
trofii jezior Pojezierza Lubuskiego (środkowozachodnia Polska). Uniwersytet
Adama Mickiewicza w Poznaniu. Bogucki Wydawnictwo Naukowe, Poznań.
Raport o stanie środowiska województwa lubelskiego za rok 1998. Biblioteka Monitoringu Środowiska, Lublin. 1999, 1-256.
Raport o stanie środowiska województwa lubelskiego w 2002 roku. Biblioteka Monitoringu środowiska Lublin 2003, 1-256. Grzywna 123-135
Sender J. 2009. Changes in structure of macrophyte communities in the chosen lakes
of Łęczna-Włodawa Lake District. Ecohydrology & Hydrobiology. Vo. 9, No 2-4,
237-245.
Sender J. 2011. Directions of changes in the macrophyte structure of two depression reservoirs in Łęczna-Włodawa Lakeland. Teka Komisji Ochrony
i Kształtowania Środowiska Przyrodniczego.T. VIII,Lublin:151-158.
Stelzer D.,Schneider S.,Melzer A.2005. Macrophyte-Based Assessment of Lakes
– a Contribution to the Implementation of the European Water Framework Directive in Germany. Internat. Rev. Hydrobiol.90,2:223-237.
119
Szmeja J. 2006. Przewodnik do badań roślinności wodnej. Wyd. Uniwersytetu Gdańskiego.
Wilgat T. 1954. Jeziora łęczyńsko - włodawskie. Annales UMCS, s. B, t. VII, 37-122.
Wilgat T., Michalczyk Z., Turczyński M., Wojciechowski K. 1991. Jeziora łęczyńsko – włodawskie. Studia Ośrodka Dokumentacji Fizjograficznej, t. XIX, PAN.
O. Kraków, 23-140.
Wołek J. 1996. Occurrence and distribution of aquatic and rushes vegetation in the
Czorsztyn – Niedzica Sromowe Wyżne reservoirs before water damming (in Polish). Fragm. Flor. Geobot. ser. Polonica 3, 189–203.
Zakład Ekologii Krajobrazu i Ochrony Przyrody
ul. Dobrzańskiego 37, 20-262 Lublin
Opiekun naukowy: dr hab. Tadeusz J. Chmielewski, prof. nadzw. UP
120
Agnieszka Ozimek
Małgorzata Koncewicz-Baran
EPISTEME
14/2012
s. 121-128
ISSN 1895-4421
WPŁYW NAWOŻENIA KOMPOSTAMI Z DODATKIEM ODPADÓW
BIODEGRADOWALNYCH NA ZAWARTOŚĆ MANGANU
W GLEBIE I ROŚLINACH
EFFECT OF COMPOST BIODEGRADABLE WASTE FERTILIZATION
ON THE MANGANESE CONTENT IN SOIL AND PLANTS
Abstrakt. Celem badań prowadzonych w oparciu o dwuletnie doświadczenie wazonowe było określenie wpływu kompostu z dodatkiem odpadów biodegradowalnych
na zawartość manganu w biomasie roślin oraz formy przyswajalne tego pierwiastka
w glebie. Dla porównania wprowadzono nawożenie czystymi chemicznie solami
(NPK) oraz obornikiem od trzody chlewnej. Największe plony biomasy, przy założonych dawkach nawożenia, uzyskano w obydwu latach doświadczenia w obiektach, w których zastosowano obornik. Największe ilości manganu zawierały rośliny
w obiektach, w których zastosowano sole mineralne. Zawartość manganu w biomasie z obiektu z wprowadzonym kompostem z dodatkiem mączki mięsno-kostnej była
zbliżona do ilości w biomasie z obiektu z obornikiem. Po drugim roku badań najwięcej manganu przyswajalnego, wyekstrahowanego roztworem 0,01 mol ∙ dm-3 CaCl2,
oznaczono w glebie z dodatkiem soli mineralnych. Duża zawartość tej formy manganu była również w glebie z obiektu, w którym zastosowano obornik oraz kompost
z dodatkiem mączki mięsno-kostnej.
Słowa kluczowe: kompost, mangan, gleba, roślina
Summary. The aim of research conducted on the basis of a two-year pot experiment
was to determine the effect of the addition of compost biodegradable waste at the
manganese content in the plant biomass and absorbed forms this element in the soil.
For comparison, chemically pure salts fertilization (NPK) and manure from pigs. The
highest yields of biomass, with established doses of fertilization, were obtained in
both years of experience in facilities that use organic materials. The greatest amount
of manganese contained in the plant premises, using mineral salts. The manganese
content in the biomass of the object with the introduction of compost with the addition
of meat and bone meal was similar to the amount of biomass from the facility with
manure. After the second year of the study most of available manganese, the extracted
solution of 0.01 mol ∙ dm-3 CaCl2, were determined in soil supplemented with mineral
salts. High content of this form of manganese was also in the soil from the facility,
which uses manure and compost with the addition of meat and bone meal.
Key words: compost, manganese, soil, plant
121
WSTĘP
Kompostowanie odpadów, w tym odpadów biodegradowalnych, przynosi
wielostronne korzyści dla poprawy stanu środowiska. W ostatnich latach
proces jest wykorzystywany do zagospodarowania i redukcji odpadów trafiających na składowiska. W wyniku prawidłowo przeprowadzonego procesu
kompostowania, może powstać nawóz organiczny, który po zastosowaniu
powinien zwiększać zasobność gleby w próchnicę, makro i mikroelementy.
Jego działanie nawozowe zarówno na glebę, jak i rośliny jest rozłożone czasie [Jakubus 2009, Jasiewicz i Baran 2009].
W trakcie procesu kompostowania następuje kompleksowanie metali ciężkich z ustabilizowaną materią organiczną, co powoduje występowanie matali
w stabilnych chemicznie połączeniach i mniejszą ich przyswajalność przez
rośliny [Jakubus 2009].
Stosując doglebowo komposty należy zwrócić uwagę na analizę form metali
przyswajalnych dla roślin, gdyż ogólna zawartość składnika nie ma diagnostycznego znaczenia dla odżywiania roślin. Roztwór ekstrakcyjny 0,01 mol
∙ dm-3 CaCl2 pełniący funkcję „fizjologicznego” roztworu glebowego może
być przydatny do oceny dostępności składników pokarmowych dla roślin
[Burzyńska 2009, Jakubus 2009].
MATERIAŁ I METODY
Wpływ kompostu z dodatkami odpadów biodegradowalnych na zawartość manganu w glebie i roślinach oceniano w doświadczeniu wazonowym. Doświadczenie prowadzono w dwóch sezonach wegetacyjnych w latach 2010 – 2011 w hali
wegetacyjnej w Krakowie – Mydlnikach. Materiał glebowy – piasek gliniasty
mocny pylasty [wg BN-78/9180-11], pobrano z warstwy ornej 0-20 cm gruntu
ornego stacji doświadczalnej Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie - Mydlnikach. Wybrane właściwości materiału glebowego oznaczono przed rozpoczęciem badań metodami powszechnie stosowanymi w chemii rolnej [Ostrowska
i in. 1991]. Kwasowość hydrolityczna gleby wynosiła 19,4 mmol(+)·kg-1 s.m., zawartość węgla organicznego 7,90 g·kg-1 s.m., zaś ogólna zawartość azotu wynosiła 1,16 g·kg-1 s.m. Ogólna zawartość manganu w glebie wynosiła 323,3 mg·kg-1
s.m. W doświadczeniu wazonowym wykorzystana została frakcja przesiewowa
kompostu (Ø cząstek > 1cm). Charakterystykę materiałów organicznych wprowadzonych do gleby w doświadczeniu podano w tabeli 1. Schemat eksperymentu obejmował 9 obiektów prowadzonych w 4 powtórzeniach: bez nawożenia (0),
z dodatkiem soli mineralnych (M), z dodatkiem obornika od trzody chlewnej
(OB), z dodatkiem kompostu kontrolnego (KK), z dodatkiem kompostu z papierem gazetowym (KG), z dodatkiem kompostu z folią biodegradowalną (KF),
z dodatkiem kompostu z mączką mięsno-kostną (KM), z dodatkiem kompostu
z przepracowanym olejem jadalnym (KO).
122
Wpływ nawożenia kompostami z dodatkiem odpwadów...
Wraz z materiałami organicznymi wprowadzono następujące ilości manganu
w przeliczeniu na wazon poszczególnych obiektów: OB: 25,49 mg, KK: 8,83
mg, KG: 7,10 mg, KF: 7,96 mg, KM: 4,50 mg, KO: 8,06 mg.
Oznaczenie
obornik
kompost
kontrolny
kompost
+ papier
gazetowy
Sucha masa (g ∙ kg-1)
160
594
613
572
646
549
pH H2O
7,73
7,66
7,78
7,63
6,37
7,76
Materia organiczna (g ∙ kg-1 s.m.)
840
434
467
515
481
448
Przewod. elektrol. (mS·cm )
4,03
8,40
6,85
6,81
9,98
5,58
C organiczny (g ∙ kg s.m.)
169,29
169,30
195,0
206,55
180,21
163,14
N (g ∙ kg s.m.)
36,72
21,94
20,11
21,66
27,60
20,81
P (g ∙ kg s.m.)
11,72
3,76
4,05
3,96
9,47
5,42
-1
-1
-1
-1
kompost kompost
+ folia
+ mączka
biodegr. mięs.-kost.
kompost
+ olej
jadalny
K (g ∙ kg s.m.)
18,44
9,47
8,07
9,56
14,67
10,51
Mn (mg ∙ kg-1 s.m.)
226,7
275,85
213,41
260,88
212,92
262,15
-1
Tab. 1. Wybrane właściwości fizyczne i chemiczne materiałów użytych
w doświadczeniu wazonowym
Przed założeniem doświadczenia materiał glebowy w ilości 5,50 kg powietrznie suchej masy umieszczono w wazonach z tworzywa sztucznego
i stopniowo nawilżano, doprowadzając go do wilgotności 30% maksymalnej
pojemności wodnej. Następnie wprowadzono obornik, materiały organiczne
oraz sole mineralne i wymieszano je z glebą. W pierwszym roku doświadczenia zastosowano dawkę azotu na poziomie 0,15 g N ∙ kg-1 s.m. gleby. Dawkę
azotu wprowadzono w 80% z materiałami organicznymi i w 20% w formie
wodnego roztworu NH4NO3 (poza NPK i kontrolą). Fosfor w glebach wszystkich obiektów (poza kontrolą), uzupełniono do jednakowego, najwyższego
poziomu 0,049 g P ∙ kg-1 s.m. gleby, wprowadzonego z nawożeniem, a potas
do 0,18 g K ∙ kg-1 s.m. gleby. Fosfor wprowadzono formie wodnego roztworu
Ca(H2PO4)2 ∙ H2O, a potas w formie wodnego roztworu KCl.
Rośliną uprawianą w pierwszym roku badań był rzepak jary odmiany „Feliks”.
Rośliny zbierano w końcowej fazie kwitnienia z podziałem na części nadziemne oraz korzenie. Zebrany materiał roślinny suszono w temperaturze 70 °C
w suszarce z przepływem powietrza i określono plon suchej masy. Następnie
rośliny zmielono w młynku laboratoryjnym i poddano analizom chemicznym.
Po zbiorze roślin w każdym roku pobierano próbki materiału glebowego.
W drugim roku badań we wszystkich obiektach, oprócz kontrolnego zastosowano nawożenie uzupełniające azotem, fosforem i potasem w formie
123
związków soli mineralnych, jakie zastosowano w roku pierwszym. Ilości nawozów wynosiły: 0,15 g N ∙ kg-1 s.m. gleby, 0,051 g P ∙ kg-1 s.m. gleby oraz
0,24 g K ∙ kg-1 s.m. gleby. Azot został wprowadzony w dawce podzielonej:
80% dawki wprowadzono 9 dni przed siewem nasion, pozostałe 20% dawki
w fazie strzelania w źdźbło. Rośliną testową był owies nagoziarnisty odmiany „Siwek” [IUNG, 2005]. Rośliny zbierano w fazie dojrzałości mlecznej
ziarna z podziałem na części nadziemne i korzenie, suszono w temperaturze
70 °C i określono plon suchej masy.
W materiale roślinnym zarówno po I, jak i po II roku badań oznaczono: zawartość ogólną manganu po mineralizacji próbki w piecu muflowym (450
o
C przez 5 godz.) i roztworzeniu pozostałości w rozcieńczonym (1:2) kwasie
azotowym (V); następnie oznaczono metodą ICP-OES na aparacie Perkin
Elmer Optima 7300DV, a uzyskane wyniki przeliczono na absolutnie suchą
masę materiału roślinnego.
W materiale glebowym oznaczono: zawartość formy ogólnej manganu po
spopieleniu substancji organicznej w piecu muflowym (temp. 500 °C przez
8 godz.) i mineralizacji próbek w mieszaninie (2:1) stężonych kwasów azotowego (V) i nadchlorowego (VII) metodą ICP-OES na aparacie Perkin Elmer
Optima 7300DV, zawartość form przyswajalnych manganu po ekstrakcji roztworem CaCl2 o stężeniu 0,01 mol ∙ dm-3 – metodą ICP-OES.
Uzyskane wyniki poddano ocenie statystycznej z uwzględnieniem analizy
wariancji jednoczynnikowej (czynnik: nawożenie). Istotność różnic pomiędzy średnimi arytmetycznymi oszacowano za pomocą testu Duncana przy
poziomie istotności α < 0,05.
WYNIKI I DYSKUSJA
Największy plon biomasy zarówno rzepaku jarego, jak i owsa uzyskano
w przypadku obiektu z wprowadzonym obornikiem (Tab. 2). Podobne wyniki w plonowaniu życicy wielokwiatowej uzyskały Kalembasa i Wiśniewska
[2007]. Plony biomasy z obiektów z wprowadzonymi kompostami kształtowały się na nieco niższym poziomie. W pierwszym roku badań nie wykazano
różnic w plonach biomasy rzepaku z obiektów z wprowadzonymi kompostami oraz solami mineralnymi. W drugim roku badań ujawniło się działanie następcze materiałów organicznych, a plony owsa z obiektów z zastosowanym
nawożeniem obornikiem oraz kompostami były istotnie większe od plonów
z obiektu, w którym zastosowano nawożenie solami mineralnymi (Tab. 2).
W porównaniu z zastosowanymi doglebowo materiałami organicznymi
i obornikiem, nawożenie solami mineralnymi znacznie zwiększyło zawartość
manganu w biomasie zarówno rzepaku jarego, jak i owsa, co potwierdzają
badania innych autorów [Gondek 2008, Gondek i Koncewicz-Baran, 2011].
124
Owies
Obiekt*
Rzepak jary
części nadziemne
0
19,64 c**
3,34c
22,99c
26,75b
3,51b
30,26c
M
37,15ab
8,12d
45,27a
44,38c
5,01c
49,38d
OB
47,44d
6,11b
53,56d
51,88d
7,50a
59,38e
KK
38,36ab
5,68ab
44,04ab
50,13a
7,07a
57,20b
KG
38,78
5,46
44,25
50,0
6,97
a
56,97ab
KF
36,54a
5,36a
41,90b
49,25a
6,99a
56,23ab
KM
39,96b
5,75ab
45,71a
48,63a
6,63a
55,25a
KO
38,58ab
5,41a
43,99ab
48,88a
7,14a
56,02ab
korzenie
suma
części nadziemne
korzenie
suma
g s.m.∙ wazon-1
ab
a
ab
a
Tab. 2. Ilość biomasy części nadziemnych i korzeni rzepaku jarego i owsa (g s.m. ∙ wazon-1). * - Obiekty doświadczenia jak w metodyce: 0 – bez nawożenia, M - z dodatkiem soli mineralnych, OB - z dodatkiem obornika od trzody chlewnej, KK - z dodatkiem kompostu kontrolnego, KG - z dodatkiem kompostu z papierem gazetowym,
KF - z dodatkiem kompostu z folią biodegradowalną, KM - z dodatkiem kompostu
z mączką mięsno-kostną, KO - z dodatkiem kompostu z przepracowanym olejem
jadalnym. ** - Średnie oznaczone tymi samymi literami w kolumnach nie różnią się
istotnie wg testu Duncana przy α < 0,05; czynnik: nawożenie
Obiekt*
Biomasa owsa z obiektów z wprowadzonymi kompostami zawierała około
5-krotnie więcej manganu w porównaniu z biomasą rzepaku (Tab. 3). Zawartość manganu w korzeniach owsa była większa niż zawartość tego pierwiastka
w częściach nadziemnych. Korzenie owsa mają bardzo dużą zdolność pobierania składników pokarmowych znajdujących się w glebie w formie trudno
dostępnej dla roślin. Pod tym względem owies dominuje nad innymi zboża
[IUNG, 2005]. Znaczne ilości manganu w biomasie owsa dalekie były od zawartości toksycznych. Kabata-Pendias [1999] podaje zawartość 500 mg Mn ∙
kg-1 s.m. za stężenie toksyczne dla większości gatunków. W korzeniach rzepaku oznaczono dużo mniejsze ilości Mn niż w częściach nadziemnych.
Rzepak jary
części nadziemne
Owies
korzenie
części nadziemne
korzenie
mg Mn ∙ kg a.s.m.
-1
0
26,39a**
11,64a
67,86b
M
325,91
44,38
479,79
460,85f
OB
92,03d
23,50b
300,86e
258,79ab
KK
38,41
14,45
193,58
252,26ac
e
ab
c
a
109,02e
f
a
125
KG
41,36b
14,38a
187,63a
227,93c
KF
36,42ab
13,64a
205,46a
263,82ab
KM
55,67c
14,21a
279,62d
297,13d
KO
37,93ab
12,58a
244,65c
283,95bd
Tab. 3. Zawartość manganu w biomasie rzepaku jarego oraz owsa (mg ∙ kg-1 a.s.m.).
* - Obiekty doświadczenia jak w metodyce i Tab. 2. ** Średnie oznaczone tymi samymi literami w kolumnach nie różnią się istotnie wg testu Duncana przy α < 0,05;
czynnik: nawożenie
Zastosowane nawożenie mineralne przyczyniło się do zwiększenia zawartości przyswajalnych form manganu w badanej glebie (Rys. 1), zarówno
w pierwszym, jak i drugim roku badań. Zawartość manganu przyswajalnego, ekstrahowanego roztworem CaCl2 o stężeniu 0,01 mol ∙ dm-3, w glebie
nawożonej solami mineralnymi, wynosiła 55,23 mg ∙ kg-1 s.m. w pierwszym
roku, (co stanowiło 17% zawartości ogólnej), w drugim roku zawartość ta
zmalała do 42,64 mg Mn ∙ kg-1 s.m. gleby (14% zawartości ogólnej Mn). Po
zastosowaniu materiałów organicznych, zawartość mobilnych form manganu
była istotnie mniejsza od zawartości oznaczonej w glebach z obiektów nawożonych solami mineralnymi (Rys. 1). W przypadku zastosowanych kompostów zawartość manganu przyswajalnego wynosiła w pierwszym roku badań
od 23,87 (KG) do 28,34 mg ∙ kg-1 s.m. gleby (KM). Stanowiło to odpowiednio
8 i 9% zawartości ogólnej Mn i były to zawartości istotnie mniejsze w porównaniu z zawartościami w glebie z wprowadzonym obornikiem (35,36 mg Mn
∙ kg-1 s.m.). W drugim roku wyekstrahowano mniejsze zawartości manganu
przyswajalnego w każdym z obiektów, zwłaszcza z gleby bez nawożenia (0)
(Rys. 1). Zastosowane w procesie kompostowania dodatki odpadów biodegradowalnych na ogół nie modyfikowały w istotny sposób zawartości form przyswajalnych manganu w glebie.
Rys. 1. Zawartość Mn przyswajalnego, wyekstrahowanego z gleby roztworem CaCl2
o stężeniu 0,01 mol·dm-3, po 1 i 2 roku badań
126
WNIOSKI
• Najlepszy efekt, wyrażony ilością biomasy, uzyskano w obydwu latach
doświadczenia w obiekcie, w którym zastosowano nawożenie obornikiem. Nawożenie gleby kompostami z dodatkiem odpadów biodegradowalnych pozwoliło na osiągnięcie plonów biomasy rzepaku na poziomie
zbliżonym do obiektów z wprowadzonym, równoważnym nawożeniem
mineralnym już w pierwszym roku badań.
• Istotnie większe zawartości manganu zawierała biomasa owsa w porównaniu z biomasą rzepaku, które były jednak znacząco mniejsze od zawartości uważanej za ograniczającą wzrost.
• Zastosowane dodatki odpadów biodegradowalnych nie różnicowały
w istotny sposób zawartości manganu w biomasie roślin rzepaku i owsa,
jak również form przyswajalnych tego pierwiastka w glebie.
• Najwięcej form przyswajalnych manganu oznaczono w glebie z obiektu,
w którym zastosowano nawożenie mineralne.
127
LITERATURA
BN-78/9180-11 Gleby i utwory mineralne. Podział na frakcje i grupy granulometryczne.
Burzyńska I. 2009. Wpływ zróżnicowanego nawożenia na zawartość łatwo rozpuszczalnego manganu i cynku w glebie łąkowej. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 541:
81-87.
Charakterystyka i technologia uprawy odmian owsa. 2005. IUNG Puławy, IHAR Radzików, COBORU Słupia Wielka.
Gondek K. 2008. Contents of manganese in maize and soil fertilized with organic
materials. Ecological Chemistry and Engineering A, 15(10): 1057-1066.
Gondek K., Koncewicz-Baran M. 2011. Manganese content in biomass of spring
wheat, soil and soil effluents after fertilization with municipal sewage sludge and
kompost of municipal waste. Pol. J. Environ. Stud. 20(6): 1481-1489.
Jakubus M. 2009. Zawartość Fe i Mn w glebie ekstrahowane roztworami o różnej sile
jonowej podczas rozkładu kompostu. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 541: 121-131.
Jasiewicz Cz., Baran A. 2009. Wpływ odpadów organicznych na przyswajalność mikroelementów w glebie lekkiej. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 541: 147-156.
Kabata-Pendias A., Pendias H. 1999. Biogeochemia pierwiastków śladowych. Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa, 388 ss.
Kalembasa D., Wiśniewska B. 2007. Wpływ nawożenia obornikiem, kompostami i wermikompostami obornikowymi na plon i zawartość azotu w życicy wielokwiatowej
(Lolium Multiflorum Lam.) oraz w glebie. Acta Sci. Pol., Agricultura 6 (2): 39-45.
Ostrowska A., Gawliński A., Szczubiałka Z. 1991. Metody analizy i oceny gleby i roślin. Wydawnictwo Instytutu Ochrony Środowiska, Warszawa, ss. 325.
mgr inż. Agnieszka Ozimek, mgr inż. Małgorzata Koncewicz-Baran
Katedra Chemii Rolnej i Środowiskowej
Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Michał Kopeć
128
Krzysztof Stasiak
Karolina Piekarska
Ignacy Kitowski
EPISTEME
14/2012
s. 129-136
ISSN 1895-4421
THE BREEDING POPULATION OF MAGPIE PICA PICA IN CHEŁM
(EASTERN POLAND) – A COMPARISON OF SURVEYS OF 1991 AND 2011
POPULACJA LĘGOWA SROKI PICA PICA NA OBSZARZE CHEŁMA
(WSCHODNIA POLSKA) – PORÓWNANIE BADAŃ Z LAT 1991 I 2011
Summary. Magpie Pica pica is one of the species, which populated the urban environment relatively late. Paper compares the size of breeding population of magpie in
Chełm (eastern Poland) in 1991 and 2011 and selected aspects of ecology of the species. In 1991 magpies were occupying nesting almost only in the city suburbs and no
evidence of nesting in the inner city was found. The survey from 2011 revealed a significant decline in number of birds territories (n=27) comparing to 1991 (n=79). Same
time the species was locked on nesting in the inner city. The most used magpies nesting
habitat in 1991 were orchards and industrial area, and in 2011 meadows, orchards and
neighborhood blocks of flats. In 1991 the most frequently used plants were poplars
Populus spp and willows Salix spp, and in 2011 willows and hawthorns Crataegus spp.
Key words: Magpie, Pica pica, nest, city
Abstrakt. Sroka Pica pica należy do gatunków, które relatywnie późno zasiedliły
środowisko miejskie. Praca porównuje liczebności populacji lęgowej sroki na obszarze miasta Chełma (wschodnia Polska), w roku 1991 i w roku 2011, oraz wybrane
aspekty ekologii tego gatunku. W 1991 r. sroka zasiedlała niemal wyłącznie obrzeża miasta, natomiast nie odnotowano jej w śródmieściu. Podczas kontroli w 2011
r. wykazano spadek liczby zajmowanych rewirów (n=27), względem 1991 r. (n=79).
Wtedy też stwierdzono przypadki gniazdowania w strefie śródmiejskiej. Najczęściej
wybieranymi siedliskami były w 1991 r. sady i tereny przemysłowe, a w 2011 r. łąki,
sady i osiedla bloków. W roku 1991 sroki najchętniej gnieździły się na topolach Populus spp. i wierzbach Salix spp., a w 2011 na wierzbach i głogu Crataegus spp..
Słowa kluczowe: sroka, Pica pica, gniazdo, miasto
129
INTRODUCTION
In opposite to region’s capital, Lublin, in other cities of Lublin Region there
was no research held regarding magpie Pica pica. In many other Polish cities this kind of research was made during the species’ colonization and are
continued nowadays [Okulewicz 1971, Klejnotowski 1974, Harmata 1985,
Jerzak et al. 2009]. After the bird’s population was increasing in cities during latter half of the 20th century, a decrease of attention on this species was
noted [Jerzak et al. 2009]. The species can be considered as a good model for
describing behaviour and to follow processes within city birds’ populations,
for it’s been living in urban area for a long time.
The aim of the present study was to test two hypothesis. First one was the
process of settling the inner part of the town by magpie would provide to
increase of the species breeding density in 20 years period. The second hypothesis claimed that the breeding density increase would provide to changes
in most commonly used nesting places and nesting habitats. To test those
hypothesis, two surveys in 1991 and in 2011 were conducted.
STUDY AREA AND METHODS
Chełm is a town situated in eastern Poland, about 20 km from the Ukrainian Republic border. It lies upon the Uherka river, a left-bank tributary of
the Bug river. The city is placed in the western part of the Volhynian Polesie, on the south-eastern edge of Chełm Hills. The city has several parks,
and two cemeteries. The city area and the number of inhabitants remained
practically unchanged between 1991 and 2011 and have been approximately
35.3 km2 and 67 thousand inhabitants [Urząd Statystyczny w Chełmie 1998,
Urząd Statystyczny w Lublinie 2010]. According to Górski [1997], the area
of Chełm town was divided into urban zone and suburban zone. Urban zone
takes approximately 20 km2, which is 57,0 % of the city. Suburban zone takes
15.3 km2. The urban zone was the part of Chełm with predominantly built-up
areas with a highly developed transport infrastructure. The suburban zone
was the rest of the town, with lose buildings and barely developed transport
infrastructure. The inner city is defined as the oldest, central part of Chełm,
within 2 km from the highest point of the town, which is Górka Chełmska.
Spring nest counts were held between the end of March and mid May, before
or during the trees’ foliage development. Autumn counts were held since mid
November, just after leaf fall. In spring, each newly-built nest was accepted as
a breeding pair. During autumn surveys, intact nests situated at least 50 meters
from each other, have been treated as different nesting pairs. If the group of
nests has been found and only one was undamaged, it has been treated as one
nesting territory. Same protocols were used during surveys in 1991 and in 2011.
130
The breeding population of magpie Pica Pica...
RESULTS
During surveys held in 1991, 79 breeding pairs of magpie were found in the
whole Chełm area, which gives density of 2,2 pairs/km2. In the urban zone 32
pairs were found (1,6 pairs/km2). In the suburban zone 47 nesting pairs were
found, which means 3,1 pairs/km2. The survey from 2011 revealed a noticeably decline in number of the birds’ territories, only 27 breeding pairs were
found over the town (0,7 pairs/km2). In the urban zone 15 pairs were found,
which is 0,75 pairs/km2. Another 12 pairs were found in the suburban zone
and the breeding density there was 0,8 pairs/km2.
Up to 27,5% of 109 magpies’ nests found in 1991 were placed in orchards in
the suburbs. It was the most commonly used nesting habitat (Tab. 1). The second mostly chosen habitat was industrial area with manufactures, railways,
railway stations and magazines, where 24,8% of birds have brood. In housing
estate 13,8% of nests were located and only in 3,7% birds have chosen city
parks. Jointly 23,8% of breeding pairs were found in shrub on fields, meadows, allotment gardens and small anthropogenic woods. Birds were found
also on farmyards located inside the city borders. The important result of the
1991 survey is that, no nests on the neighborhood blocks of flats were found.
The inner city wasn’t occupied by the species then. It was settled in 1997. In
1991, 109 nests were found, however the number of territories was estimated
at 79, because in some cases, more than one nest was placed in one pair’s
territory. The localisations of whole 109 nests were used to assess breeding
habitats used by magpies.
Habitat
1991
2011
N
%
N
%
Orchards
30
27,5
5
18,5
Industrial area
27
24,8
3
11,1
Housing estate
15
13,8
2
7,4
Fields
11
10,0
2
7,4
Allotment gardens
7
6,4
1
3,7
Meadows
6
5,5
6
22,2
Farmyard
5
4,6
2
7,4
Neighborhood blocks of flats
-
-
5
18,5
Parks
4
3,7
-
-
Small anthropogenic woods
4
3,7
1
3,7
Total
109
100
27
100
Tab. 1. Breeding habitats of magpie Pica pica in Chełm
131
To further analyzes, only 79 settled nests were taken. In 2011 only 27 magpies nests were locked on. All of them were occupied. The
��
mostly used nesting area were meadows covered with small shrubs, adjacent to watercourses,
especially Uherka river, where 22,2% of nests were located, and 18,5% of
nests were built in neighbourhood blocks and orchards. Jointly 40,7% of
nests were placed in other habitats, e.g. housing estate or industrial area. In
1991 almost 39% of all nests sites were found in those places (Tab. 1).
In 2011 the non-significant decrease of importance of orchards (Fisher test, one
cut, p=0,24) industrial area (Fisher test, one cut, p = 0,10) and housing estate
(Fisher test, one cut, p=0,24), as a breeding habitat for magpies was noted.
1991
Tree and shrub species
2011
N
%
N
%
Populus spp.
32
29,3
2
7,4
Willow
Salix spp.
15
14,0
7
26,0
Common plum
Prunus domestica
13
11,9
2
7,4
Poplar
Ash
Fraxinus excelsior
8
7,3
3
11,1
Mirabelle plum
Prunus domestica L. subsp. syriaca
8
7,3
-
-
Cherry
Cerasus vulgaris
7
6,4
-
-
Maple
Acer platanoides
5
4,6
-
-
Peartree
Pyrus spp.
5
4,6
4
14,8
Hawthorn
Crataegus spp.
-
-
5
18,5
Blackthorn
Prunus spinosa
4
3,7
-
-
Black Alder
Alnus glutinosa
3
2,8
-
-
Lilac
Syringa vulgaris
1
0,9
-
-
Bird Cherry
Cerasus avium
1
0,9
-
-
Walnut
Juglans regia
1
0,9
-
-
Common Elder
Sambucus nigra
1
0,9
-
-
Black Locust
Robinia pseudoacacia
1
0,9
-
-
Ash Maple
Acer negundo
1
0,9
1
3,7
Small-lived Lime
Tilia cordata
1
0,9
2
7,4
European Larch
Larix decidua
1
0,9
1
3,7
Downy Birch
Betula pubescens
1
0,9
-
-
79
100
27
100
TOTAL
Tab. 2. Tree and shrub species used for magpies’ Pica pica nest sites in Chełm
132
In 1991 magpies were building nests on poplars Populus sp. (29,3%) and
willows Salix sp. (14,0%) most frequently (Tab. 2). From nests located on
poplars only 29,0% were built on lombardy poplars Populus nigra var. italica. Commonly used trees were also plums Prunus spp., especially common
plums Prunus domestica. Mirabelle plums Prunus domestica var. syriaca
(n=9) and blackthorns Prunus spinosa (n=4) were rarely chosen. In 2011 the
most commonly chosen trees for the birds to build nests on were willows Salix spp. (26,0%) and hawthorns Crataegus spp. (18,2%) (Tab. 2). Significant
decrease of nests number on plums Prunus spp. between study periods was
noted: 22,9% in 1991 vs. 7,4% in 2011 (Fisher test, one cut, p=0,0001) (Tab.
2). The significant decrease of the role of poplar Populus spp. as the nesting tree for magpie was noted (Fisher test, one cut, p=0,0001) (Tab. 2). The
role of peartrees Pyrus spp. has not changed (Fisher test, one cut, p=0,165,
respectively). The significant increase of number of nests found on willows
Salix spp. was noted (Fisher test, one cut, p=0,0001, respectively), which corresponds with high number of nests found in river Uherka valley.
In early 90’s birds built their nests on side branches more frequently (63,3%)
than near the tree-trunk (36,7%). In 2011 the proportion has changed and the
trunk-locations were found more often (55,6%) than those on branches (44,4%)
but differences were not statistically important (χ2=0.27, df=1, p=0.603). In
1991 the average height of the nest location was 9,3 ± 5,8 m, with the median of
8,5 m. The range was 1,8 to 22 m. In 2011 the average height was 8,9 ± 7,2 m,
with the median of 8,0 m (range 2,5 to 20 m). The difference in average nesting
height in 1991 and in 2011 was also not significant (Z=1,453, n1= 79, n2 = 27).
DISCUSSION AND CONCLUSIONS
• Nesting in cities can give magpies some measurable benefits. Analysis
made by Jerzak [2001] in Zielona Góra shows a higher nesting success
and earlier nesting period beginning, observed in magpies city population, than in other areas.
• There’s only fragmentary information of a beginning of magpies’ presence
in cities of Lubelszczyzna, because there’s only few data about the exact
moment of invasion. In Lublin it was in 80’s of the 20th century [Biaduń
2004]. In 50’s magpie was present in Poznań [Klejnotowski 1974], in 60’s
it settled Olsztyn [Okulewicz 1971], and Kraków [Harmata 1985] and in
early 80’s it was present in Zielona Góra [Jerzak et al. 2009].
• Revealed magpies breeding densities in Chełm in comparison with other
Polish cities (e.g. Zielona Góra, where the breeding density was 16,9
pairs/km2) are low values, and corresponds merely with breeding density
in agricultural landscape [Jerzak 2005].
133
• The process of settling the inner city of Chełm wasn’t associated with the
breeding density increase. This means the first hypothesis wasn’t confirmed.
• Nests located on a greater height are safer and the breeding success of
birds reaches higher values in comparison with those nesting lower [Antonov & Atanasova 2001]. In the city landscape magpies prefer to build
nests higher than in other areas [Mitrus & Woźniak 2002].
• Quantitative research of the use of specific trees by birds to nest on, held in
context of tree diversity in city areas [Jerzak 1997, Antonov & Atanasova
2002], has revealed the bird mostly likes poplars, especially lombardy
poplar. This results from height of the tree and characteristic monopodial
shape of the crown with thin upwarded branches. Antonov & Atanasova
[2002] points the fact of protective role of this kind of treecrown toward
ground predators. Despite of that lombardy poplar seems to be one of the
less important trees for the species in Chełm. Some authors confirm the
most preferred tree for the bird to build nests is the white poplar Populus
alba [Górska & Górski 1997, Jerzak 1997, 2001, Barszcz 1998, Mitrus &
Woźniak 2002, Meissner & Duś 2005]. This has been corroborated during
our surveys. In the period between surveys the number of nests located on
poplars has decreased.
• Generally, changes of the birds nesting places and breeding habitats were
observed. Thus, the second hypothesis was confirmed.
• Research held in Chełm in 2011 has shown a considerable decline of the
species (threefold) comparing to 1991, which corresponds with trends in
other Polish cities, where a clear downward trend was observed [Biaduń
2009, Jerzak et al. 2009]. Some authors attribute this state of affairs the
influence of such predators as the hooded crow Corvus cornix, jay Garrulus
glandarius or stone marten Marten foina [Jerzak et al. 2009]. Despite of the
downward trend, magpies managed to settle the inner part of Chełm.
134
REFERENCES
Antonov A. Atanasova D. 2002. Nest-site selection in the Magpie Pica pica in a highdensity urban population of Sofia (Bulgaria). Acta Ornithologica, 37: 55-66.
Barszcz P. 1998. Zagęszczenie i umiejscowienie gniazd sroki Pica pica w Krakowie-Krowodrzy. Chrońmy Przyrodę Ojczystą 54: 119-124.
Biaduń W. 2004. Ekspansja wybranych gatunków ptaków na terenach osiedli mieszkaniowych w Lublinie. [w:] Indykiewicz P. Barczak T. Fauna miast Europy XXI
wieku. Wydawnictwo LOGO, Bydgoszcz, 419-424.
Biaduń W. 2009. Dynamika populacji sroki Pica pica w Lublinie w okresie ostatnich
25 lat. [in:] Wiącek J. Polak M. Kucharczyk M. Grzywaczewski G. Jerzak L.
(eds.) Ptaki - Środowisko - Zagrożenia - Ochrona: wybrane aspekty ekologii ptaków. Lubelskie Towarzystwo Ornitologiczne. Lublin, 351-356
Górski W. 1997. Urban and rural populations of magpies in Koszalin region, NW
Poland. Acta Ornithologica 32 : 51–59.
Górska E. Górski W. 1997. Nest sites of the Magpie Pica pica in urban and rural
habitats in the Koszalin Region, NW Poland. Acta Ornithologica 32: 45-50.
Harmata W. 1985. Sroka Pica pica w Krakowie, jej znaczenie i rola w środowisku
miejskim. Chrońmy Przyrodę Ojczystą 4: 24-31.
Jerzak L. 1997. Magpie Pica pica nest sites in urban habitats in Poland. Acta Ornithologica 32, 1: 69 -76.
Jerzak L. 2001. Synurbanization of the magpie in the Palearctic. [in:] Marzluf J.M.
Bowman R. Donnelly R. (eds.). Avian ecology and conservation in an urbanizing
world. Kluwer Academy Publishers. 403 - 425.
Jerzak L. 2005. Sroka Pica pica w Polsce – przegląd badań. [Magpie Pica pica in
Poland-current state of knowledge] [in:] Jerzak L. Kavanagh B.P. Tryjanowski P.
(eds.) Ptaki krukowate Polski [Corvids of Poland]. Bogucki Wydawnictwo Naukowe Poznań. 36-51.
Jerzak L. Bocheński M. Ciebiera O. Słoma J. 2009. Wybrane parametry biologii lęgowej, miejskiej i niemiejskiej populacji sroki Pica pica [in:] Wiącek
J. Polak M. Kucharczyk M. Grzywaczewski G. Jerzak L. (eds.) Ptaki - Środowisko - Zagrożenia - Ochrona: wybrane aspekty ekologii ptaków. Lubelskie Towarzystwo Ornitologiczne. Lublin. 351-356.
Klejnotowski Z. 1974. Urbanizacja sroki Pica pica (L) w Polsce. Rocznik Akademii
Rolniczej w Poznaniu 56, Ornitologia Stosowana 7: 77-88.
135
Meissner W. Duś U. 2005. Liczebność i rozmieszczenie gniazd sroki Pica pica
w wybranych dzielnicach Gdańska [Number and distribution of Magpie Pica pica
nests in selected districts of Gdańsk] [in:] Jerzak L. Kavanagh B.P. Tryjanowski
P. (eds.). Ptaki krukowate Polski [Corvids of Poland]. Bogucki Wydawnictwo
Naukowe Poznań. 517-522.
Mitrus C. Woźniak B. 2002. Liczebność i preferencje siedliskowe sroki Pica pica w Białej Podlaskiej w latach 1998–1999. Notatki Ornitologiczne 43: 262- 266.
Okulewicz J. 1971. Ptaki miasta Olsztyna i okolic. Acta Ornithologica 13: 127-171.
Urząd Statystyczny w Chełmie. 1998. Rocznik Statystyczny Województwa Chełmskiego. Urząd Statystyczny w Chełmie. Chełm.
Urząd Statystyczny w Lublinie. 2010. Rocznik Statystyczny Województwa Lubelskiego. Urząd Statystyczny w Lublinie. Lublin.
Postal address:
Krzysztof Stasiak1, Karolina Piekarska2, dr Ignacy Kitowski1
1
Department of Zoology, Animal Ecology and Wildlife Management
University of Life Sciences in Lublin,
Akademicka 13, 20-950 Lublin, Poland.
2
ul Sierakowskiego 6a, 24-100 Puławy
e- mail: [email protected], [email protected], [email protected]
Supervisor: dr hab. prof. nadzw. Jacek Łętowski
136
Ewelina Szwaj
EPISTEME
14/2012
s. 137-145
ISSN 1895-4421
BIORÓŻNORODNOŚĆ RYJKOWCÓW (CURCULIONOIDEA)
KSEROTERMICZNYCH OBSZARÓW LUBELSZCZYZNY
WEEVILS BIODIVERSITY OF XEROTHERMIC AREAS OF THE
LUBLIN REGION
Abstrakt. Ryjkowce (Curculionoidea) to jedna z liczniejszych nadrodzin chrząszczy
obejmująca ponad 40 000 gatunków. Wśród nich około 1052 gatunków notowanych
jest z terenu Polski. Liczne obserwacje i badania pozwoliły na sformułowanie spostrzeżeń, iż szczególne bogactwo gatunkowe ryjkowców związane jestz siedliskami
kserotermicznymi, stąd wielu badaczy wybiera tę grupę jako reprezentacyjną dla całej
fauny chrząszczy związanych z tymi siedliskami. Celem badań było przeprowadzenie oceny fauny ryjkowców muraw kserotermicznych na wybranych stanowiskach,
znajdujących się na obszarze parków krajobrazowych i rezerwatów Lubelszczyzny oraz na terenach nie objętych żadnymi formami ochrony (Bychawa, Łysaków,
Łęczna, Gródek, Kąty, Spiczyn, Wólka). Materiał zbierany był za pomocą czerpaka entomologicznego w miesiącu intensywnego pojawów owadów (lipiec) w 2011
r. W wyniku badań stwierdzono 316 okazów ryjkowców przynależących do 56 gatunków z 3 rodzin, mianowicie: Apionidae, Nanophyidae i Curculionidae. Bioróżnorodność fauny ryjkowców pozwoli na ocenę wybranych muraw kserotermicznych pod
kątem bogactwa przyrodniczego oraz ukierunkowanie niezbędnych działań ochrony
czynnej na tych obszarach.
Słowa kluczowe: ryjkowce, ekologia, murawa kserotermiczna, bioróżnorodność
Summary. Weevils (Curculionoidea) is one from numerous superfamily including
beetles above 40 000 species. Among them of about 1052 species are given from
the area of Poland. Numerous observation and examinations allowed for formulating
observations, that special species richness of weevils is connected with xerothermic
areas, and therefore many researchers are choosing this group as representative for the
fauna of beetles connected with these areas. The purpose of the study was presentation
diversifying of the fauna of xerothermic weevils on selected areas, which being positions in the area of landscape parks and reserves of the Lublin region and on areas not
embraced with no forms of protection (Bychawa, Łysaków, Łęczna, Gródek, Kąty,
Spiczyn, Wólka). Collected material was in favour with ude of the entomological net
in July in 2011. As a result of the study, 316 specimens of weevils were obtained. The
insects of the weevils belonging to 56 species from 3 families, namely: Apionidae,
Nanophyidae and Curculionidae. Biodiversity of the weevils fauna will allow for the
evaluation of selected xerothermic grass in terms of the natural richness and directing
necessary actions of the active protection in these areas.
Słowa kluczowe: weevils, ecology, xerotermic grass, biodiversity
137
Ewelina Szwaj
WSTĘP
Ciepłolubne zbiorowiska, dość częste na słonecznych zboczach całej Wyżyny Lubelskiej, a unikatowe w skali naszego kraju są jednymi z najcenniejszych elementów krajobrazu Lubelszczyzny. O ich wyjątkowym charakterze
świadczy przede wszystkim bioróżnorodność flory i fauny wykazywana w
trakcie inwentaryzacji przyrodniczej. Pomimo, iż jednym z priorytetowych
zadań Unii Europejskiej jest ochrona szaty roślinnej tych niezwykle cennych
ekosystemów, stan zachowania muraw kserotermicznych jest zagrożony.
Znaczne zubożenie powierzchni muraw poprzez intensywne zalesianie czy
silną antropopresję oraz szybka sukcesja roślinności drzewiastej, na omawianych siedliskach są czynnikami wpływającymi na zmianę szaty roślinnej
oraz na liczbę notowanych gatunków bezkręgowców. Dotyczy to zwłaszcza
owadów, wśród których licznie występujące chrząszcze okazały się gatunkami wskaźnikowymi kserotermicznych stanowisk.
Jedną z liczniejszych nadrodzin chrząszczy są ryjkowce (Curculionoidea),
których liczbę na świecie określa się na ponad 40 000 gatunków. Wśród nich
około 1052 gatunków podawanych jest z terenu Polski [Wanat i Mokrzycki
2005]. Są to typowe fitofagi. Zamieszkują one zróżnicowane biotopy, żerują
na różnych częściach drzew, krzewów, roślin uprawnych muraw kserotermicznych i psammofilnych, suchych łąk, ugorów i ciepłych zarośli, wilgotnych środowisk łęgowych, wilgotnych łąk i torfowisk aż do partii górskich.
[Bogdanowicz i in. 2004]. Liczne obserwacje i badania pozwoliły na sformułowanie spostrzeżeń, iż szczególne bogactwo gatunkowe ryjkowcowatych
związane jest z siedliskami kserotermicznymi, stąd wielu badaczy wybiera
tę grupę jako reprezentacyjną dla całej fauny chrząszczy związanych z tymi
siedliskami [Mazur 2001].
Celem prowadzonych badań było poznanie składu fauny ryjkowcowatych
wybranych muraw kserotermicznych Lubelszczyzny oraz ocena jej struktury
jakościowej i ilościowej na poszczególnych siedliskach. Ustalenie bioróżnorodności owadów pozwoli na ocenę wybranych kserotermicznych obszarów Wyżyny Lubelskiej pod względem bogactwa przyrodniczego. Umożliwi
stwierdzenie zmian zachodzących na omawianych terenach i wpływ dotychczasowych form ochrony oraz właściwe ukierunkowanie niezbędnych działań ochrony czynnej na tych obszarach.
MATERIAŁ I METODY
Badaniami objęto osiem muraw kserotermicznych o zróżnicowanym podłożu
i składzie florystycznym z terenu Wyżyny Lubelskiej (Bychawa, Ciechanki
Łańcuchowskie, Gródek, Kąty, Łysaków, Nasutów, Spiczyn, Wólka) (Rys.
1). Tereny te znajdują się w strefach objętych różnymi formami ochrony:
138
Bioróznorodność ryjkowców (Curculion-Oidea)...
Bychawa – rezerwat Podzamcze, woj. lubelskie, powiat lubelski, Ciechanki Łańcuchowskie – Nadwieprzański Park Krajobrazowy, woj. lubelskie,
powiat łęczyński, Gródek – Nadbużański Obszar Chronionego Krajobrazu.
woj. lubelskie, powiat hrubieszowski, Kąty – specjalny obszar ochrony siedlisk, woj. lubelskie, powiat zamojski, Nasutów – Kozłowiecki Park Krajobrazowy, woj. lubelskie, powiat lubelski, Spiczyn – Nadwieprzański Park
Krajobrazowy, woj. lubelskie, powiat łęczyński. Terenami niechronionych
są: Łysaków – murawa kserotermiczna, woj. podkarpackie, powiat stalowowolski, Wólka (wąwóz Lipniak) – murawa kserotermiczna, woj. lubelskie,
powiat lubelski.
Próby pobierano w miesiącu intensywnego pojawu owadów – lipcu
2011 r., w dni słoneczne i bezwietrzne
między godziną 10.00 a 16.00. Do
odłowu owadów stosowano czerpak
entomologiczny ilościowy (w seriach
8 x 25). Zebrany materiał zatruwano
oparami octanu etylu, przebierano
i przechowywano w suchych warunkach. Wszystkie próby zostały zetykietowane z podaniem nazwy miejscowości. Owady należące do nadrodziny ryjkowców Curculionoidea
oznaczono do gatunku.
Rys. 1. Rozmieszczenie stanowisk, na których prowadzono badania w lipcu 2011 r.
WYNIKI
W rezultacie przeprowadzonych badań na wybranych ośmiu stanowiskach
Lubelszczyzny w lipcu 2011 r. stwierdzono 316 okazów ryjkowców reprezentowanych przez 56 gatunki. Należały one do rodzin: Apionidae (19 gatunków), Nanophyidae (1) i Curculionidae (36). Wśród odłowionych okazów
wykazano dwa zagrożone gatunki, tj. Pseudoprotapion ergenense (Becker,
1864) i Datonychus paszlavskyi (Kuthy, 1890) (Tab. 1).
Na obszarze kserotermicznego rezerwatu Podzamcze w Bychawie odłowiono
22 okazy ryjkowcowatych, które zaliczono do 7 gatunków. Najliczniejszym
w próbie był gatunek Sitona lineatus (Linnaeus, 1758) (13 osobn.). Odnotowano 3 gatunki rzadkie: Squamapion elongatum (Germar, 1817), Cleopomiarus graminis (Gyllenhal, 1813) i Larinus turbinatus Gyllenhal, 1835 (Tab. 1).
139
Ewelina Szwaj
W Ciechankach Łańcuchowskich odłowiono 9 ryjkowców, które należały do
3 gatunków. Najliczniej występująca była Sitona lineatus (Linnaeus, 1758)
(6 osobn.). Pozostałe 2 gatunki, tj. Sitona sulcifrons (Thunberg, 1798) i Protapion apricans (Herbst, 1797) wystąpiły w liczbie odpowiednio 6 i 1 okazów.
W Gródku badaniami objęto 2 murawy kserotermiczne. Na jednej z nich zebrano 16 osobników z 7 gatunków, wśród których najliczniejszym okazał się
rzadki, kserotermiczny gatunek Pseudoprotapion ergenense (Becker, 1864)
(6 osobn.), natomiast na drugiej odłowiono 67 osobników Curculionoidea
zaliczonych do 14 gatunków. W próbie przeważał kserotermiczny Stenopterapion tenue (Kirby, 1808) (18 osobn.), a następnie licznym był oligofag
żerujący na roślinach zielnych Catapion jaffense (Desbrochers, 1895) (15
osobn.). Na murawach kserotermicznych w Gródku odnotowano sześć gatunków ryjkowców: Pseudoprotapion ergenense (Becker, 1864), Ceutorhynchus pulvinatus Gyllenhal, 1837, Tychius quinquepunctatus (Linnaeus, 1758)
(stanowisko 1) oraz Squamapion elongatum (Germar, 1817), Cleopomiarus
graminis (Gyllenhal, 1813) i Tychius aureolus Kiesenwetter, 1851 (stanowisko 2). Wymienione gatunki uważane są za rzadko występujących w naszym
kraju.
W Kątach odłowiono 29 osobników ryjkowców, które reprezentowały 12
gatunków. Wśród nich przeważał rzadki, kserotermiczny gatunek Tychius
schneideri (Herbst, 1795) (6 osobn.), monofag żerujący na Anthyllis vulneraria L. Natomiast Stenopterapion intermedium (Eppelsheim, 1875) oraz
T. junceus (Reich, 1797) wykazano odpowiednio w liczbie 4 i 5 okazów.
W próbie odłowionej na murawie kserotermicznej w Łysakowie stwierdzono
10 osobników ryjkowców z 9 gatunków. Wśród nich 3 gatunki były rzadko
notowane w Polsce: Sitona languidus Gyllenhal, 1834, Tychius aureolus Kiesenwetter, 1851 i T. schneideri (Herbst, 1795). Dwa z nich są monofagami,
tj. Sitona languidus, żerujący na Coronilla varia L. oraz Tychius schneideri
– biologicznie związany z Anthyllis vulneraria L.
Na obszarze murawy kserotermicznej w Spiczynie zebrano 28 osobników
ryjkowców należących do 9 gatunków. Wśród nich licznie występowały kserotermiczne oligofagi, natomiast w przeważającej liczbie odłowiono Rhinoncus castor (Fabricius, 1792) (9 osobn.) – monofaga związanego z Rumex
acetosella L. Odnotowano również dwa gatunki: Apion cruentatum Walton,
1844 i Baris artemisiae (Herbst, 1795), które zaliczane są do rzadko występujących w naszym kraju.
140
Spiczyn
9
1
Wólka
Nasutów
Łysaków
Kąty
Gródek (stan. 2)
Gródek (stan. 1)
Ciechanki Łańcuchowskie
Gatunek
Bychawa
APIONIDAE
Apion cruentatum Walton, 1844
Catapion jaffense (Desbrochers, 1895)
15
Catapion seniculus (Kirby, 1808)
Ceratapion onopordi (Kirby, 1808)
3
1
3
Eutrichapion viciae (Paykull, 1800)
1
4
Ischnopterapion loti (Kirby, 1808)
2
Oxystoma craccae (Linnaeus, 1767)
1
1
Perapion curtirostre (Germar, 1817)
6
Protapion apricans (Herbst, 1797)
1
1
Protapion filirostre (Kirby, 1808)
4
2
21
1
8
Protapion fulvipes (Geoffroy, 1785)
1
Protapion ononidis (Gyllenhal, 1827)
2
Pseudoperapion brevirostre (Herbst, 1797)
8
Pseudoprotapion astragali (Payykull, 1800)
2
Pseudoprotapion ergenense (Becker, 1864)
6
Pseudostenapion simum (Germar, 1817)
Squamapion elongatum (Germar, 1817)
5
2
7
Stenopterapion intermedium (Eppelsheim, 1875)
Stenopterapion tenue (Kirby, 1808)
4
2
18
3
NANOPHYIDAE
Nanophyes marmoratus (Goeze, 1777)
1
CURCULIONIDAE
Baris artemisiae (Herbst, 1795)
1
Ceutorhynchus pulvinatus Gyllenhal, 1837
1
Ceutorhynchus typhae (Herbst, 1795)
Cleopomiarus graminis (Gyllenhal, 1813)
Cleopomiarus micros (Germar, 1821)
2
1
1
1
3
141
Ewelina Szwaj
Datonychus paszlavszkyi (Kuthy, 1890)
1
Eusomus ovulum Germar, 1824
1
2
Hypera plantaginis (De Geer, 1775)
1
Hypera arator (Linnaeus, 1758)
1
Hypera nigrirostris (Fabricius, 1775)
1
Hypera viciae (Gyllenhal, 1813)
Larinus turbinatus Gyllenhal, 1835
1
1
Marmaropus besseri Gyllenhal, 1837
2
Mecinus pascuorum (Gyllenhal, 1813)
1
Miarus ajugae (Herbst, 1795)
1
1
1
1
Parafoucartia squamulata (Herbst, 1795)
4
1
Polydrusus inustus Germar, 1824
2
1
Pseudorchestes ermischi (Dieckmann, 1958)
2
Rhinoncus castor (Fabricius, 1792)
31
Sibinia pellucens (Scopoli, 1772)
9
1
Sibinia pyrrhodactyla (Marsham, 1802)
1
Sitona humeralis Stephens, 1831
1
Sitona languidus Gyllenhal, 1834
Sitona lineatus (Linnaeus, 1758)
Sitona sulcifrons (Thunberg, 1798)
1
13
6
9
2
1
2
4
1
Sitona gressorius (Fabricius, 1792)
3
Sitona griseus (Fabricius, 1775)
2
Sitona macularius (Marsham, 1802)
1
1
Strophosoma capitatum (De Geer, 1775)
2
Strophosoma faber (Herbst, 1785)
3
Tanymecus palliatus (Fabricius, 1787)
1
Trachyphloeus bifoveolatus (Beck, 1817)
2
Tychius aureolus Kiesenwetter, 1851
3
Tychius junceus (Reich, 1797)
Tychius quinquepunctatus (Linnaeus, 1758)
Tychius schneideri (Herbst, 1795)
1
1
5
1
6
1
2
1
15
1
Tab. 1. Zestawienie liczbowe gatunków i okazów ryjkowców odłowionych na murawach kserotermicznych Lubelszczyzny w lipcu 2011 r. Gatunek zagrożony (EN) wg
kategorii zagrożeń na Czerwonej Liście Zwierząt Ginących i Zagrożonych w Polsce
142
W zbiorowiskach kserotermicznych w okolicach Wólki (wąwóz Lipniak)
odłowiono 64 osobniki ryjkowców należących do 15 gatunków. Najliczniejszym w próbie był Protapion apricans (Herbst, 1797) (21 osobn.). Licznie
występował również Tychius junceus (Reich, 1797) (15 osobn.) oraz Protapion filirostre (Kirby, 1808) (8 osobn.). Odnotowano jeden rzadki gatunek
- Tychius aureolus Kiesenwetter, 1851.
DYSKUSJA I WNIOSKI
Badania przeprowadzone na wybranych murawach kserotermicznych Wyżyny Lubelskiej w miesiącu intensywnego pojawu owadów (lipiec) w 2011
r. pozwoliły na ustalenie składu gatunkowego oraz ilości ryjkowców, które
zostały wybrane jako organizmy wskaźnikowe informujące o tendencji przyrodniczych na omawianych siedliskach.
Jak już zaznaczono w „Wynikach”, w rezultacie przeprowadzonych odłowów odnotowano 316 osobników ryjkowców, należących do 56 gatunków
z 3 rodzin (Tab. 1).
Wśród odłowionych chrząszczy przeważały formy łąkowe: Rhinoncus castor
(Fabricius, 1792) (40 osobn.), Sitona lineatus (Linnaeus, 1758) (34 osobn.),
Protapion apricans (Herbst, 1797) (23 osobn.), Stenopterapion tenue (Kirby,
1808) (23 osobn.) i Tychius junceus (Reich, 1797) (22 osobn.).
Wśród odnotowanych ryjkowców były gatunki charakterystyczne dla zbiorowisk kserotermicznych (formy kserotermiczne i termofilne), przeważały
oligofagi roślin zielnych. Odnotowano także 7 monofagów (Pseudoprotapion astragali, Marmaropus besseri, Mecinus pascuorum, Pseudorchestes
ermischi, Rhinoncus castor, Sitona languidus, Tychius schneideri), żerujących na roślinach ściśle związanych z kserotermicznymi murawami (Astragalus glycyphyllus L., Rumex acetosa L., Plantago lanceolata L., Centaurea
scabiosa L., Rumex acetosella L., Coronilla varia L., Anthyllis vulneraria
L.), co zwraca uwagę na konieczność ochrony termofilnej fauny w aspekcie
utrzymania bogactwa przyrodniczego.
Na badanych siedliskach odłowiono 16 gatunków rzadko występujących na
terenie Polski, z których 4 występowały dość licznie: Apion cruentatum Walton, 1844 w liczbie 10 osobników, Squamapion elongatum (Germar, 1817)
(9), Tychius schneideri (Herbst, 1795) (7), Pseudoprotapion ergenense (Becker, 1864) (6) oraz Tychius aureolus Kiesenwetter, 1851 (6). Na szczególną
uwagę zasługuje Pseudoprotapion ergenense, którego stwierdzono jedynie
na stanowisku nr 1 w Gródku. Liczba odłowionych ryjkowców na tym stanowisku oraz fakt, iż na analogicznym stanowisku nr 2 w Gródku osobników
143
Ewelina Szwaj
tego gatunku nie odnotowano może wskazywać na występowanie warunków
środowiskowych sprzyjających rozwojowi tego gatunku na stanowisku nr
1 (zespół Inuletum ensifoliae).
Najwięcej, tj. 78 osobników zebrano na śródleśnej murawie mezokserotermicznej w Nasutowie. Śródleśna lokalizacja oraz specyficzne warunki mikroklimatyczne tworzą swoistą enklawę dla rozwoju chrząszczy. Ryjkowce
liczne były także na siedliskach w Gródku (stanowisko 1 – 67 osobników)
oraz Wólce (64 osobniki). Na tych murawach odnotowano również najwięcej gatunków ryjkowców. Duża liczba gatunków na stanowisku 1 w Gródku
oraz znaczna różnica pomiędzy liczbą chrząszczy uzyskanych na stanowisku
1 i 2 potwierdza pogląd, iż postępująca eutrofizacja gleb w pobliżu murawy
na stanowisku 2 wpływa na zmiany struktury faunistycznej tego siedliska
[Trąba 2010]. Natomiast duża liczba odłowionych osobników i gatunków
na stanowisku w Wólce (wąwóz Lipniak) daje podstawę do stwierdzenia, iż
tor motokrosowy, który został utworzony na tych terenach i zabiegi związane z jego utrzymaniem wpływają pozytywnie na zmiany struktury roślin
i zwierząt. Na szczególną uwagę zasługuje również stanowisko kserotermiczne w Łysakowie, na którym 10 odłowionych osobników reprezentowało
9 gatunków ryjkowców. W tym przypadku liczba odłowionych owadów nie
wskazuje jednoznacznie na bogactwo faunistyczne tego miejsca. Murawa
kserotermiczna na tym terenie, o wyjątkowych walorach przyrodniczych,
jest najdalej na południe wysuniętym stanowiskiem badań, na którym okres
wegetacyjny roślin jest przyspieszony w stosunku do pozostałych stanowisk,
co zapewne mogło wpłynąć na liczbę odnotowanych chrząszczy.
Przeprowadzone badania potwierdzają pogląd, iż fauna ryjkowców zasiedlających zbiorowiska kserotermiczne na Wyżynie Lubelskiej jest bardzo bogata. Podobnie na innych obszarach, jak np. w rezerwacie biosfery „Tatry”,
fauna ryjkowców jest obfita i różnorodna [Knutelski 2005]. Na podstawie
oceny liczby odławianych osobników i gatunków wnioskować można o kondycji przyrodniczej badanych zbiorowisk kserotermicznych.
Duża bioróżnorodność przejawiająca się w składzie gatunkowym i liczebności okazów odławianej fauny wskazuje na bogactwo gatunkowe wybranych
ciepłolubnych muraw oraz ukierunkowują właściwą ochronę.
Badania potwierdzają pogląd, iż ochrona siedlisk kserotermicznych jest niezwykle ważna dla zachowania bogactwa flory i fauny muraw kserotermicznych. Jednocześnie wszelkie podejmowane działania, również na terenach
nieobjętych ochroną, będące przejawami aktywności człowieka mogą uchronić te siedliska przed szybka sukcesją. W omawianym przypadku właściwy
kierunek presji antropogenicznej jest pożądanym elementem mogącym aktywnie ograniczać proces zaniku tych wyjątkowych zbiorowisk.
144
LITERATURA
Bogdanowicz W., Chudzicka E., Pilipiuk I., Skibińska E. 2004. Fauna Polski. Charakterystyka i wykaz gatunków. Muz. i Inst. Zool. PAN. Warszawa: 61 – 71.
Knutelski S. 2005. Różnorodność, ekologia i chorologia ryjkowców rezerwatu biosfery “tatry” (Coleoptera: Curculionoidea). Monografie Faunistyczne, tom 23, Inst.
Zool. Syst. i Ewolucji Zwierząt PAN. Kraków: 340 ss.
Mazur M. 2001. Ryjkowce kserotermiczne Polski (Coleoptera: Nemonychidae, Attelabidae, Apionidae, Curculionidae). Studium zoogeograficzne. Monografie Fauny
Polski, tom 22, Kraków: 7 – 9, 15 – 23,
Pawłowski J., Kubisz D., Mazur M. 2002. Coleoptera Chrząszcze. [w:] Czerwona
lista zwierząt ginących i zagrożonych w Polsce. Z. Głowaciński (red.). Instytut
Ochrony Przyrody PAN, Kraków. 155 ss. + supl. 74 ss.
Trąba C. 2010. Różnorodność florystyczna i stan zachowania muraw kserotermicznych w okolicach Czumowa koło Hrubieszowa [w]: H. Ratyńska, B. Waldon (red).
Ciepłolubne murawy w Polsce – stan zachowania i perspektywy ochrony. Wyd.
UKW. Bydgoszcz: 446 – 457,
Wanat M., Mokrzycki T. 2005. A New checklist of the weevils of Poland (Coleoptera:
Curculionoidea). Genus, 16 (1): 69 – 117.
mgr inż. Ewelina Szwaj
Katedra Zoologii, Ekologii Zwierząt i Łowiectwa
ul. Akademicka 13, 20-950 Lublin
Opiekun naukowy: prof. dr hab. Jacek Łętowski
145
Krzysztof Wąs
EPISTEME
14/2012
s.147-159
ISSN 1895-4421
ANALIZA WARUNKÓW CIEPLNO-WILGOTNOŚCIOWYCH
W OKRESIE LATA W PASYWNYM PREFABRYKOWANYM
BUDYNKU SZKIELETOWYM
ANALYSIS OF HYGROTHERMAL��
CONDITIONS��
��
INSIDE A PREFABICATED FRAME PASSIVE HOUSE IN THE SUMMER PERIOD
Abstrakt. W sytuacji szybko rosnących cen nośników energii, coraz droższa staje się
eksploatacja budynków, dlatego konieczne jest poszukiwanie nowoczesnych, energooszczędnych rozwiązań, które pozwolą w znaczny sposób ograniczyć zapotrzebowanie na energię w tym sektorze. Budownictwo pasywne pozwala na znaczne obniżenie kosztów eksploatacji poprzez odpowiednie zaprojektowanie bryły budynku oraz
systemów grzewczo-wentylacyjnych. W artykule poddano analizie warunki cieplno-wilgotnościowe panujące w jednorodzinnym budynku pasywnym. Celem badań
było sprawdzenie, czy wysoka izolacyjność przegród minimalizująca straty ciepła w
okresie zimowym nie sprawia, że budynek przegrzewa się w okresie letnim. Badania
wykazały, iż rozpatrywanym okresie pomiary temperatury i wilgotności w zdecydowanej większości mieściły się akceptowanych zakresach. Wyniki pracy stanowią
wkład w badania nad szerszym zastosowaniem budownictwa pasywnego w Polsce.
Słowa kluczowe: budownictwo szkieletowe, budownictwo pasywne, temperatura
i wilgotność w budynkach
Summary. With the increasing costs of energy carriers, building operation becomes
more and more expensive. Therefore it is necessary to search for new, energy efficient solutions which would significantly contribute to limiting energy demand in this
sector. Passive building systems make it possible to decrease operation costs substantially through proper design of the body of the building and heating and ventilation
systems. The article analyses hygrothermal conditions inside a single-family passive
house. The aim of the research was to verify whether high insulation properties of
partitions, minimising heat losses in the winter period, do not make the house to overheat in the summer. The studies revealed that temperature and humidity values in the
period under examination mostly remained within the range of acceptable values.
The results of the study contribute to the development of passive buildings in Poland.
Key words: wooden frame buildings, passive houses, temperature and humidity in
buildings
147
Krzysztof Wąs
WSTĘP
Znaczący wzrost konsumpcji energii na przestrzeni ostatnich kilkudziesięciu lat oraz podwyższające się ceny jej nośników doprowadziły obecnie do
rozpowszechniania się działań mających na celu racjonalne wykorzystanie
zasobów energetycznych. Przyczyną takiego stanu rzeczy jest między innymi intensywny rozwój gospodarczy i cywilizacyjny państw oraz kurczące
się zasoby surowców naturalnych. Dodatkowo korzystanie na szeroką skalę
z tzw. „paliw kopalnych” powoduje duże spustoszenie w środowisku naturalnym, między innymi poprzez emisje znacznych ilości CO2 oraz innych gazów zanieczyszczających atmosferę. Jednym z pierwszych działań podjętych
na forum międzynarodowym w celu ograniczenia emisji zanieczyszczeń było
podpisanie porozumienia w tej sprawie na konferencji w Kioto w grudniu
1997 r. Kolejnym ważnym krokiem mającym na celu ograniczenie konsumpcji energii szczególnie w sektorze mieszkaniowym i usługowym, było wprowadzenie na terenie Unii Europejskiej dyrektywy 2002/91/WE. Jej głównym
założeniem „jest promowanie poprawiania charakterystyki energetycznej
budynków we Wspólnocie, z uwzględnieniem warunków klimatycznych zewnętrznych i lokalnych oraz wewnętrznych wymagań klimatycznych oraz
opłacalności.” [Dyrektywa 2002]. Budownictwo pasywne, które z założenia
spełnia wysokie standardy energooszczędności wychodzi naprzeciw tej idei.
Pozwala ono ograniczyć nawet kilkukrotnie zapotrzebowanie na energię konieczną do ogrzewania w stosunku do tradycyjnego budynku. Aby budynek
mógł być nazwany budynkiem pasywnym, musi spełnić szereg restrykcyjnych założeń [Wnuk 2006]; między innymi jego zapotrzebowanie na energię do ogrzewania nie może przekroczyć 15 kWh∙m-2∙rok-1, a współczynnik
przenikania ciepła U dla przegród nie może być większy niż 0,15 W∙m-2∙K-1.
Dlatego ważne jest dokładne poznanie funkcjonowania tego typu budynków,
w celu optymalizacji ich mikroklimatu tak, aby połączyć ich doskonałe parametry energooszczędne z komfortem zamieszkiwania.
MATERIAŁ I METODY
Przedmiotem badań jest prefabrykowany budynek pasywny o konstrukcji szkieletowej drewnianej zlokalizowany w miejscowości Boruszowice
w województwie śląskim. Budynek zamieszkiwany jest na stałe przez pięcioosobową rodzinę. Przegrody w obiekcie posiadają doskonałe właściwości izolacyjne. Budynek posiada różne rodzaje przegród zewnętrznych, a ich
średni współczynnik przenikania ciepła wynosi U = 0,08 W∙m-2∙K-1. System
wentylacyjny to instalacja nawiewno-wywiewna wyposażona w gruntowy
wymiennik ciepła oraz rekuperator przeciwprądowy. Badany obiekt posiada szereg czujników monitorujących różne parametry w budynku. W niniejszym artykule skoncentrowano się na wynikach pomiarów dwóch termohigrometrów typu LB-710HS mierzących temperaturę i wilgotność w dwóch
148
Analiza warunków cieplno-wilgotnościowych...
pomieszczeniach: salonie połączonym z kuchnią zlokalizowanym na parterze
budynku oraz sypialni znajdującej się na pierwszym piętrze. Pomieszczenia
te wybrano, ponieważ w typowym układzie funkcjonalnym budynku jednorodzinnego są to miejsca najczęściej użytkowane. Dodatkowo dla poznania
temperatury i wilgotności względnej panującej na zewnątrz budynku zainstalowano termohigrometr typu LB-710R w przydomowej stacji meteorologicznej. Obydwa typy urządzeń do pomiaru temperatury wykorzystują termometr
rezystancyjny typu PT1000, natomiast pomiar wilgotności względnej realizowany jest przy pomocy wilgotnościomierza pojemnościowego [Recknagel
i in. 1994]. Pomiary rejestrowane są w odstępach sześciominutowych, jednak
na potrzeby opracowania danych uśredniono wyniki do wartości godzinowych. Rozpatrywany okres badań to ciąg pomiarowy trwający od 11 lipca
2011 do 10 września 2011 roku. Jako punkt odniesienia, w celu określenia
dopuszczalnych temperatur, w obiekcie przyjęto klasyfikacje dopuszczalnych temperatur według normy [PN-EN 15251:2007]. Rozpatrywany budynek zaklasyfikowano do kategorii drugiej w celu przyjęcia przeciętnych wartości temperatury w okresie letnim tj. zakres 20‑26°C. Natomiast wilgotność
względna powietrza wewnętrznego nie powinna przekraczać 70%.
WYNIKI
Na wykresie poniżej (Rys. 1) zaprezentowano rozkład temperatur w rozpatrywanym okresie w salonie i sypialni oraz wartości temperatury zewnętrznej.
Rys. 1. Temperatura powietrza - parter, piętro oraz temperatura zewnętrzna [°C]
Kolejny wykres (Rys. 2) przedstawia rozkład wilgotności względnej w rozpatrywanym okresie w salonie i sypialni oraz wartości wilgotności względnej
panującej na zewnątrz budynku.
149
Krzysztof Wąs
Rys. 2. Wilgotność względna powietrza - parter, piętro oraz wilgotność zewnętrzna [%]
DYSKUSJA I WNIOSKI
Wartość temperatury w salonie w badanym okresie wynosiła średnio 23,7°C.
W przypadku sypialni usytuowanej na pierwszym piętrze temperatura powietrza wewnętrznego wynosiła średnio 23,4°C. Procentowy udział poszczególnych temperatur w rozpatrywanym okresie zaprezentowano na Rys. 3.
Rys. 3. Procentowy udział występowania poszczególnych temperatur [%]
Na podstawie (Rys. 3) można stwierdzić, iż najczęściej występującymi temperaturami w rozpatrywanym okresie były temperatury w przedziale 2224°C. Stanowią one 83,7% temperatur zaobserwowanych dla salonu i 69,3%
temperatur zaobserwowanych dla sypialni. Natomiast temperatury powyżej
26°C to 5,1% dla salonu i 6,0% dla sypialni.
Rozpatrując analogicznie rozkład wilgotności względnej w opracowywanym
okresie przedstawiono (Rys. 4) procentowy udział występowania poszczególnych przedziałów wilgotności. W przypadku salonu, wilgotność względna
z przedziału 50-65 stanowi 66,1%, natomiast w przypadku sypialni głów150
Analiza warunków cieplno-wilgotnościowych...
ny zakres wilgotności względnej to 55-70 i stanowi on 66% wartości wilgotności zaobserwowanych w badanym okresie. Przekroczenia wilgotności
względnej powyżej 70%, to dla salonu i sypialni odpowiednio 1,5% i 0,8%.
Rys. 4. Procentowy udział występowania poszczególnych przedziałów
wilgotności względnej [%]
Zaprezentowane wyniki badań pozwalają stwierdzić, iż w rozpatrywanym
okresie badań tj. 11.07.2011-10.09.2011r. warunki cieplno-wilgotnościowe
panujące we wnętrzu badanego budynku pasywnego można uznać za dobre.
W zdecydowanej większości rozpatrywanego okresu temperatura i wilgotność nie przekraczały zakładanych przedziałów. Pomimo występujących
niejednokrotnie wysokich temperatur zewnętrznych sięgających niekiedy
34°C budynek nie ulegał nadmiernemu przegrzewaniu. Uzasadnieniem tego
stanu może być zastosowanie gruntowego wymiennika ciepła, który pozwala
na schłodzenie powietrza nawiewanego do pomieszczeń na skutek przepuszczenia go przewodami przez znacznie chłodniejszy grunt. Dodatkowo wysoka
izolacyjność przegród chroni przed wysoką temperaturą zewnętrzną.
Wilgotność względna rzadko przekraczała założony próg, niemniej jednak szczególnie na piętrze przez około 24% zakładanego okresu przyjmowała wartości bliskie założonej granicy. Spowodowane może to być kilkoma czynnikami między
innymi: niekorzystnymi warunkami atmosferycznymi, faktem niedawnego oddania budynku do użytku i w konsekwencji wysokiej wilgotności wewnętrznej
obiektu. Inną możliwą przyczyną zaobserwowania wilgotności w takiej wartości
może być niewystarczająca wentylacja pomieszczeń.
Badany budynek posiada dobre parametry cieplno-wilgotnościowe powietrza. Obawy związane z możliwym jego przegrzewaniem z uwagi na wysoką
izolacyjność przegród są nieuzasadnione. Jak pokazują wyniki pomiarów,
przez zdecydowaną większość rozpatrywanego okresu budynek zachowuje
prawidłową temperaturę i wilgotność powietrza wewnętrznego a zastosowane systemy są efektywne.
151
Krzysztof Wąs
LITERATURA
Dyrektywa 2002/91/WE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 16 grudnia 2002 r.
w sprawie charakterystyki energetycznej budynków
PN-EN 15251: 2007 Kryteria środowiska wewnętrznego, obejmujące warunki cieplne, jakość powietrza wewnętrznego, oświetlenie i hałas. Wyd. PKN
Recknagel H. Sprenger E. Honmann W. Schramek R. 1994 Poradnik Ogrzewanie i
Klimatyzacja Wydawnictwo EWFE. Gdańsk
Wnuk R. 2006. Budowa domu pasywnego w praktyce. Wydawnictwo Przewodnik
Budowlany. Warszawa
Krzysztof Wąs
Wydział Inżynierii Środowiska i Geodezji
Opiekun naukowy: dr hab. inż. Jan Radoń prof. UR
152
II. TECHNOLOGIA ŻYWNOŚCI
Mariusz Adamski
Katarzyna Pisarska
EPISTEME
14/2012
s.155-160
ISSN 1895-4421
WYSTĘPOWANIE ENDOSYMBIOTYCZNYCH BAKTERII
W KOMÓRKACH BOCZNIAKA (PLEUROTUS (FR.) P. KUMM)
THE PRESENCE OF ENDOSYMBIOTIC BACTERIA IN OYSTER
MUSHROOM (PLEUROTUS (FR.) P. KUMM) CELLS
Abstrakt. W literaturze opisano kilka przypadków endosymbiozy wśród grzybów.
Celem niniejszej pracy była izolacja endosymbiontów boczniaka, analiza zróżnicowania, oraz ocena ich potencjalnej zdolności do wiązania wolnego azotu. Przebadano
9 linii boczniaka pochodzących z różnych rejonów świata. Za pomocą mikroskopu
florescencyjnego i specyficznego znacznika stwierdzono obecność bakterii wewnątrz
komórek wszystkich linii boczniaka. Endosymbionty izolowano na zmodyfikowanym
podłożu TSB. Izolaty poddano analizie z wykorzystaniem technik PCR. Wykorzystano primery SMY-F511 i SMY-F1382 dla markera 16S rDNA oraz PolF i PolR dla
genu nifH. Przeprowadzono próbę hodowli izolatów na różnych podłożach. Pośród
9 izolatów endosymbiontów wyróżniono 6 różnych wielkości produktu PCR. Badania
z markerem genu nifH dały wynik negatywny. Pojedyncze kolonie endosymbiontów
obserwowano jedynie na podłożu TSA w obecności grzybów lub ekstraktu z grzybni.
Słowa kluczowe: boczniak, endosymbionty, endobakterie, grzyby
Summary. Few papers reported presence of endosymbionts in fungal cells. The aim
of this study was to isolate oyster mushrooms endosymbionts, analyse their diversity,
and evaluation of their potential ability to nitrogen fixation. Nine oyster mushroom
lines originating from different regions of the world were studied. Bacteria living
inside cells of all oyster mushroom were revealed using a fluorescent microscope and
specific dye. Endosymbionts were isolated on a modified TSB medium. The isolates
were analyzed using PCR techniques. Primers SMY-F511 and SMY-R1382 for 16S
rDNA and PolF and PolR for nifH gene were used. Among the nine isolates of endosymbionts six different sizes of the PCR product were distinguished. The study of
nifH gene marker gave negative result. Single endosymbionts colonies were observed
only on TSA medium in the presence of mycelium or the extract from mycelium.
Key words: oyster mushroom, endosymbionts, endobacteria, fungi
155
WSTĘP
Zjawisko endosymbiozy jest dość dobrze poznane w królestwie roślin oraz
zwierząt. Niewiele natomiast wiadomo o występowaniu i funkcji endosymbiotycznych bakterii w komórkach grzybów. Dotychczas tego typu zależność
opisano u nielicznych gatunków grzybów. Obecność endosymbiontów obserwowano głównie u grzybów ektomikoryzowych z rodzaju Gigasporaceae [Bianciotto i in. 1996, Bonfante 2003, Cruz i in. 2008]. Stwierdzono tu
obecność nowego gatunku „Candidatus Glomeribacter gigasporum” wspomagającego proces tworzenia mikoryzy. Komórki patogena upraw Rhizopus
microsporus są również zasiedlane przez endosymbionty. Bakterie z rodzaju
Burkholderia są niezbędne gospodarzowi do rozmnażania wegetatywnego.
Produkują one również ryzoksynę, główną substancję odpowiedzialną za
patogeniczność tego gatunku [Partida-Martinez i in. 2007]. Wśród grzybów
wyższych stwierdzono występowanie endosymbiotycznych bakterii podstawczaka Laccaria bicolor [Bertaux i in. 2003]. Opisane bakterie to obligatoryjne endosymbionty a próby ich hodowli na podłożach kończyły się niepowodzeniem lub, jak w przypadku endosymbiontów R. microsporus, były
ograniczone czasowo. Stwierdzono również, że wewnątrzkomórkowe bakterie zasiedlające grzyby z rodzaju Gigasporacea mają zdolność do wiązania
wolnego azotu. Zaopatrują w ten sposób gospodarza w przyswajalne związki
azotowe i wspomagają jego rozwój [Bianciotto i in. 2003].
Literatura przedmiotu donosi o występowaniu bakterii związanych z tylko jednym szczepem boczniaka Pleurotus ostreatus [Yara i in. 2006]. Nie
stwierdzono natomiast czy te mikroorganizmy są endosymbiontami czy jedynie bakteriami związanymi z grzybem.
Celem niniejszej pracy było potwierdzenie endosymbiotycznej natury bakterii
związanych z boczniakiem, izolacja endosymbiontów, analiza zróżnicowania,
oraz ocena ich potencjalnej zdolności do wiązania wolnego azotu.
MATERIAŁY I METODY
Przebadano 9 linii boczniaka pochodzących z różnych rejonów świata: PxS,
PB 63S, P USA S, P Bo6 S – Poznań; P234, P112, PSC - Lublin; PB8, PB7’96
– Tokyo. Linie zostały udostępnione przez Katedrę Technologii Owoców,
Warzyw i Grzybów Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie. Do analiz wykorzystano grzyby z 7 dniowej hodowli prowadzonej na podłożu cebulowym
[za Kulnianin, dane niepublikowane] w 28ºC.
W celu stwierdzenia obecności endosymbiontów w komórkach grzybów zebraną grzybnię każdego izolatu roztarto w sterylnym 1 cm3 0,1M MgSO4.
Pobrano po 50 μl zawiesiny i barwiono znacznikiem fluorescencyjnym wg.
156
Występowanie endosymbiotycznych bakterii...
protokołu (Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Bacteria, Biotium). Obserwacje prowadzono przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Nikon Eclipse
90i z wykorzystaniem standardowych filtrów.
Izolację endosymbiontów przeprowadzono z wykorzystaniem dwóch metod. Pierwsza polegała na inokulacji roztartą zawiesiną z grzybni płynnego
podłoża TSB (Fluka) z dodatkiem 50 ppm nystatyny (Polfa Kraków). Druga metoda podzielona została na dwa etapy. W pierwszym przeprowadzono
hodowlę grzybów jak opisano powyżej. Z hodowli pobrano krążek grzybni
wraz z podłożem i umieszczono na zmodyfikowanym podłożu TSA (Fluka)
grzybnią do podłoża. Płytki inkubowano 14 dni w 28ºC. W drugim etapie
pobrano fragment podłoża (50 mm2) zawierającego endosymbionty i inokulowano nim płynne podłoże TSB (50 cm3) z dodatkiem 1% ekstraktu z boczniaka oraz 1% Tween 20 (Schuchardt, Munchen). Próby inkubowano 14 dni
w 28ºC stacjonarnie. Do dalszych analiz wykorzystano izolaty uzyskane za
pomocą drugiej metody.
Ektrakt z boczniaka uzyskano przez zhomogenizowanie 250 g owocników
boczniaka z uprawy towarowej w 1000 cm3 0,1M MgSO4. Zawiesina następnie poddana została fitracji przez filtr celulozowy (Filtrak) w celu usunięcia
resztek grzybni. Przesącz filtrowano przy wykorzystaniu filtra 0,2 μm (Sartorius Stedim Biotech ). Uzyskano w ten sposób 700 cm3 sterylnego ekstraktu
z boczniaka.
W celu potwierdzenia przynależności izolatów do domeny bakterii namnożone mikroorganizmy poddano izolacji DNA. Izolacji dokonano za pomocą
kitu Genomic Mini AX Bacteria (AA Biotechnology). Do reakcji PCR wykorzystano primery SMY-F511 i SMY‑R1382 [Yara i in. 2006] oraz bufor 5x
Hot FIREPol Blend Master Mix (Solid Biodyne). Produkt reakcji poddano
elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym (45 min., 100V). Żel barwiono roztworem bromku etydyny. Masy prążków zanalizowano przy użyciu programu GelixOne 1D Software (Biostep GmbH, Niemcy).
W celu identyfikacji genu nifH wykorzystano primery PolF i PolR [Poly i in.
2001] oraz bufor 5x Hot FIREPol Blend Master Mix (Solid Biodyne). Produkt reakcji poddano elektroforezie w 2% żelu agarozowym (60 min., 100V).
Żel bawiono jak opisano powyżej. Szczep referencyjny stanowił Azospirillum barsieliense 35Bb [Król i Perzyński 2005].
W celu określenia zdolności izolatów do wzrostu na różnych podłożach
wykorzystano podłoża TSA, MPA oraz King B. Wszystkie analizy przeprowadzone zostały w 4 wariantach: czyste podłoża, podłoża z dodatkiem
1% Tween 20, podłoża z dodatkiem 1% ekstraktu z boczniaka oraz podłoża
z obydwoma dodatkami.
157
WYNIKI
• W obrazie mikroskopowym stwierdzono obecność bakterii wewnątrz
komórek wszystkich analizowanych linii boczniaka. Były one widoczne
w postaci ruchliwych jasnozielonych punktów wewnątrz komórek grzybni.
• Obydwie metody izolacji endosymbiontów doprowadziły do uzyskania po
jednym homogennym izolatcie dla każdej linii boczniaka. Izolaty uzyskane
za pomocą pierwszej metody były zanieczyszczone martwą grzybnią z zawiesiny z której były izolowane, dlatego do dalszych analiz wykorzystano
czyste izolaty uzyskane za pomocą drugiej metody. Zostały oznaczone przez
dodanie litery „b” do nazwy linii z której zostały wyizolowane.
• Pośród 9 izolatów endosymbiontów wyróżniono 6 różnych wielkości
produktu PCR dla 16S rDNA (862 pz – P234.b, PxS.b; 839 pz – PB8.b,
PSC.b; 809 pz – P Bo6 S.b, P USA S.b; 829 pz – PB 63S.b; 819 pz
– PB7’96.b; 799 pz – P112.b) [Rys. 1].
Rys. 1. Elektroforeza produktów reakcji PCR z primerami dla 16S rDNA.
Ścieżka 1: marker Ideal (DNA Gdańsk)
•
Badania z markerem genu nifH, kodującego reduktazę nitrogenazy
wchodzącą w skład kompleksu nitrogenzy, we wszystkich przypadkach
dały wynik negatywny (obraz nie zamieszczony).
• Wzrost pojedynczych, niewielkich kolonii endosymbiontów obserwowano jedynie na podłożu TSA z dodatkiem 1% Tween 20 i ekstraktu z boczniaka.
158
Występowanie endosymbiotycznych bakterii...
DYSKUSJA I WNIOSKI
Obserwacje żywych bakterii w komórkach boczniaka dowodzą ich bezwzględnie endosymbiotycznej natury. Mimo udanej izolacji bakterie te nie
były zdolne do rozwoju na podłożach bez obecności grzyba lub jego ekstraktu. Obecność produktu PCR uzyskanego w reakcji z bakteryjnymi primerami
potwierdza ich bakteryjną naturę. Zróżnicowanie wielkości produktu może
sugerować zróżnicowanie gatunkowe uzyskanych izolatów. Zróżnicowanie
to równocześnie nie było zależne od pochodzenia badanej linii grzybów. Brak
genu nifH wskazuje, iż bakterie te nie funkcjonują jako symbionty zaopatrujące gospodarza w azot. Mechanizm wzajemnych zależności endosymbiont
– grzyb pozostaje nieznany.
LITERATURA
Bertaux J., Schmid M., Prevost-Boure N.C., Churin J.L., Hartmann A., Garbaye J.,
Frey-Klett P. 2003. In situ identification of intracellular bacteria related to Paenibacillus spp. in the mycelium of the ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor
S238N. Appl Environ Microbiol. Jul; 69(7): 4243-8.
Bianciotto V., Bandi C., Minerdi D., Sironi M., Tichy H.V., Bonfante, P. 1996. An obligately endosymbiotic mycorrhizal fungus itself harbors obligately intracellular
bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 62: 3005–3010.
Bianciotto V., Lumini E., Bonfante P., Vandamme P. 2003. ’Candidatus glomeribacter
gigasporarum’ gen. nov., sp. nov., an endosymbiont of arbuscular mycorrhizal
fungi. Int J Syst Evol Microbiol. Jan; 53(Pt1):121-4.
Bonfante P. 2003. Plants, mycorrhizal fungi and endobacteria: a dialog among Cells
and genomes. The Biological Bulletin, 204: 215-20.
Cruz A.F., Horii S., Ochiai S., Yasuda A., Ishii T. 2008. Isolation and analysis of
bacteria associated with spores of Gigaspora margarita. ��
Journal of Applied Microbiology, 104: 1711-1717.
Król M.J., Perzyński A. 2005. Wykorzystanie benzenu jako jedynego źródła węgla
w wiązaniu wolnego azotu przez bakterie z rodzaju Azospirillum i Pseudomonas
stutzeri. Pamiętnik Puławski, 140:103-116.
Partida-Martinez L.P., Groth I., Schmitt I., Richter W., Roth M., Hertweck C. 2007.
Burkholderia rhizoxinica sp. nov. and Burkholderia endofungorum sp. nov., bacterial endosymbionts of the plantpathogenic fungus Rhizopus microsporus. Int
J Syst Evol Microbiol, 57Pt 11): 2583-90.
159
Poly F., Monrozier L.J., Bally R. 2001. Improvement in the RLPH procedure for
studying the diversity of nifH genes in communities of nitrogen fixers in soil., Res.
Microbiol. 152: 95‑103.
Yara R., Maccheroni W. Jr, Horii J., Azevedo J.L. 2006. A bacterium belonging to the Burkholderia cepacia complex associated with Pleurotus ostreatus.
J Microbiol. Jun, 44(3): 263-8.
mgr Mariusz Adamski, mgr Katarzyna Pisarska
Zakład Mikrobiologii Rolniczej, Katedra Ochrony Roślin
ul. Norwida 25/27, 50-375 Wroclaw
*Stypendysta programu „Przedsiębiorczy doktorant - inwestycja w innowacyjny rozwój regionu”, realizowanego w ramach Programu Operacyjnego Kapitał
Ludzki, Priorytet VIII Regionalne Kadry Gospodarki, Działanie 8.2 Transfer
Wiedzy, Poddziałania 8.2.2 Regionalne Strategie Innowacji
Opiekun naukowy: prof. dr hab. Stanisław J. Pietr
160
Iwona Cieślik
Barbara Mickowska
Katarzyna Kluz
Władysław Migdał
EPISTEME
14/2012
s.161-167
ISSN 1895-4421
PRÓBA ZASTOSOWANIA CHROMATOGRAFII JONOWYMIENNEJ
DO ANALIZY AMIN BIOGENNYCH W MIĘSIE RYB
ATTEMPT TO APPLY ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY FOR
THE ANALYSIS OF BIOGENIC AMINES IN FISH MEAT
Abstrakt. Celem pracy było zbadanie możliwości wykorzystania chromatografii jonowymiennej do oznaczenia zawartości amin biogennych w mięsie ryb. Doświadczenie polegało na przygotowaniu ekstraktów, wykonaniu analiz chromatograficznych
na kolumnie kationitowej z zastosowaniem po-kolumnowego systemu derywatyzacji
z detekcją spektrofotometryczną. W badanych próbkach (liofilizat z filetu mintaja)
wykazano obecność trzech amin biogennych: putrescyny (1,16 x 10-3 mg·g-1- 3,20
x 10-3 mg·g-1) spermidyny (1,47 x 10-3 mg·g-1- 3,27 x 10-3 mg·g-1) oraz sperminy (5,64
x 10-3 mg·g-1- 11,2 x 10-3 mg·g-1). Stwierdzono, iż chromatografia jonowymienna pozwala na oznaczanie zawartości amin biogennych w mięsie ryb. Istotnym czynnikiem
wpływającym na wynik analizy jest dobór odpowiednich parametrów ekstrakcji amin
z badanych próbek.
Słowa kluczowe: aminy biogenne, mięso ryb
Summary. The aim of this study was to try to determine biogenic amines in fish meat
using ion exchange chromatography. The experiment consisted in the preparation of
extracts, chromatographic analysis performed on the cation exchange column with
post-column derivatization system and spectrophotometric detection. In the studied
samples (lyophilisate from pollock fillet) detected the presence of three biogenic amines: putrescine (1,16 x 10-3 mg·g-1- 3,20 x 10-3 mg·g-1), spermidine (1,47 x 10-3 mg·g1
- 3,27 x 10-3 mg·g-1) and spermine (5,64 x 10-3 mg·g-1- 11,2 x 10-3 mg·g-1). It can be
concluded that the ion exchange chromatography enables for the determination of
biogenic amines in fish meat. An important factor influencing on the analysis is the
selection of appropriate parameters of the extraction of amines from samples.
Key words: biogenic amines, fish meat
161
WSTĘP
Aminy biogenne są zasadami organicznymi o małej masie cząsteczkowej.
Występują zarówno w komórkach roślinnych, zwierzęcych, jak i bakteryjnych. Powstają w wyniku dekarboksylacji aminokwasów, a niektóre także
w wyniku aminacji i transaminacji odpowiednich ketonów i aldehydów [Berthold i Nowosielska 2008]. Spożycie żywności o wysokim stężeniu amin biogennych może być szkodliwe dla zdrowia. Wzrost ich stężenia może być
spowodowany obecnością bakterii odpowiedzialnych za dekarboksylację
aminokwasów, a co za tym idzie – jest oznaką psucia się danego produktu
żywnościowego. Znajomość czynników wywołujących powstawanie amin
w żywności oraz kontrola ich poziomu jest bardzo ważna z punktu widzenia
jakości i bezpieczeństwa żywności [Libudzisz 2008]. Aminy takie jak dopamina czy serotonina pełnią funkcję neuroprzekaźników w ośrodkowych
układzie nerwowym. Za regulację ciśnienia tętniczego odpowiedzialne są
fenyloetyloamina, tyramina i histamina. Dwie pierwsze podwyższają ciśnienie krwi, natomiast ostatnia powoduje obniżenie ciśnienia tętniczego krwi
[Silla Santos 1996]. Aminy biogenne takie jak putrescyna, kadaweryna czy
spermidyna mogą działać jak wolne rodniki, hamując utlenianie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. Efekt ten skorelowany jest z liczbą grup
aminowych w cząsteczce [Stadnik i Dolatowski 2010]. W wielu badaniach
stwierdzono ich obecność w komórkach nowotworowych. Wiąże się to z oddziaływaniem czynników nitrozujących występujących w żywności na aminy i powstawaniem rakotwórczych N-nitrozoamin. Dlatego niezwykle ważna
w terapii nowotworowej jest kontrola diety chorego pod względem zawartości poliamin. Aminy biogenne (histamina, putrescyna, kadaweryna, spermina, spermidyna) występują głównie w rybach, takich jak: makrele, tuńczyki,
śledzie, sardynki [Silla Santos 1996]
MATERIAŁ I METODY
Odczynniki. Wszystkie używane odczynniki były czystości analitycznej i pochodziły z Sigma-Aldrich (USA).
Aparatura. Chromatograficzny analizator aminokwasów z przystawką do
derywatyzacji po-kolumnowej i detektorem spektrofotometrycznym (Ingos,
Czechy).
Metody. Do analiz najbardziej odpowiednie okazały się próbki liofilizatu
mięsa mintaja, które przed liofilizacją było kilkukrotnie rozmrażane i zamrażane. Ekstrakty otrzymane z pozostałych gatunków ryb (panga, tilapia,
pstrąg, karp, szczupak, sandacz) nie spełniały warunków do analizy chromatograficznej. Główną przyczyną było zżelowanie próbek, taka konsystencja
uniemożliwiała zadozowanie ich na kolumnę chromatograficzną.
162
Próba zastosowania chromatografii jonowymiennej...
Do badań pobierano 1 g liofilizatu próbki mięsa mintaja pochodzącego
z tego samego filetu. Następnie przeprowadzono ekstrakcję w czterech
wariantach: przy użyciu 0,1 M HCl – w końcowej objętości 80 ml·g-1 liofilizatu (ekstrakcja I), buforu cytrynianowo – sodowego pH 2.2 (0,0067
M kwas cytrynowy, 0,02 M NaCl, pH 2.2) w końcowej objętości 80 ml·g-1
liofilizatu (ekstrakcja II), buforu cytrynianowo – sodowego pH 2.2 (0,067
M kwas cytrynowy, 0,2 M NaCl, pH 2.2)– w końcowej objętości 55 ml·g-1
liofilizatu (ekstrakcja III) oraz ten sam bufor w objętości 40 ml·g-1 liofilizatu (ekstrakcja IV).
Po dodaniu ekstrahentu próbki wytrząsano z użyciem mechanicznej wytrząsarki przez 1 godzinę, wirowano w wirówce laboratoryjnej oraz zlewano
otrzymane supernatanty. Czynności te powtarzano trzykrotnie. Po ostatnim
odwirowaniu supernatant liofilizowano. Po liofilizacji próbki rozpuszczano
w 1 ml wody dejonizowanej. Następnie powstały roztwór filtrowano przez filtr
strzykawkowy o wielkości porów 0,45 μm (Millipore, USA). Przed aplikacją do
analizatora otrzymane próbki rozcieńczano 10 – krotnie wodą lub buforem do
próbek (0,067 M kwas cytrynowy, 0,2 M NaCl, pH 2.2).
Przygotowane próbki analizowano na kolumnie jonowymiennej o wymiarach 3,7 x 60 mm, wypełnionej silnym kationitem z sulfonowanego polistyrenu OSTION Lg ANB (Spolchemie, Spolek pro chemickou a hutní výrobu
AS, Ústí nad Labem, Czechy). Elucję prowadzono przy użyciu buforów cytrynianowo-sodowo-potasowych o rosnącej sile jonowej oraz wzrastającym
pH. Detekcję produktów po-kolumnowej reakcji ninhydrynowej prowadzono
spektrofotometrycznie przy długości fali 570 nm (aminy biogenne dają dodatni wynik w reakcji ninhydrynowej).
System chromatograficzny skalibrowano używając roztworu wzorcowego,
będącego mieszaniną siedmiu amin biogennych, o stężeniu każdej aminy
wynoszącym 500 nmol/ml. Na podstawie przeprowadzonych analiz chromatograficznych obliczono zawartość oznaczonych amin biogennych w poszczególnych próbkach.
WYNIKI I DYSKUSJA
Kalibrację systemu chromatograficznego przeprowadzono używając roztworu zawierającego mieszaninę siedmiu amin biogennych: histaminy,
tyraminy, putrescyny, kadaweryny, agmatyny, spermidyny oraz sperminy
(o stężeniu każdej aminy wynoszącym 500 nmol/ml). Tab. 1 przedstawia
czasy retencji poszczególnych amin biogennych wchodzących w skład roztworu wzorcowego. Przykładowy chromatogram roztworu wzorcowego
przedstawiono na Rys. 1.
163
Czas retencji [min]
Amina biogenna
15.12
histamina
24.69
tyramina
31.89
putrescyna
42.39
kadaweryna
69.66
agmatyna
73.76
spermidyna
85.47
spermina
spermine 85.47
agmatine 69.66
spermidine 73.76
cadaverine 42.39
putrescine 31.89
histamine 15.12
tyramine 24.69
Tab. 1. Parametry retencyjne analiz chromatograficznych wzorcowej
mieszaniny amin biogennych
2.00000
1.00000
0.00000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Rys. 1. Chromatogram roztworu wzorcowego mieszaniny amin biogennych o stężeniu 500 nmol/ml
Na podstawie uzyskanych chromatogramów zidentyfikowano aminy biogenne obecne w analizowanych próbkach oraz oznaczono ich zawartość, w celu
porównania odzysku amin w zależności od zastosowanej metody ekstrakcji.
Zastosowanie ekstrakcji I dało dużo mniejszy odzysk wszystkich wykrytych
amin biogennych niż pozostałe ekstrakcje, odpowiednio: putrescyna 1,16 x 10-3
mg·g-1, spermidyna 1, 47 x 10-3 mg·g-1 oraz spermina 5,64 x 10-3 mg·g-1. Przy
zastosowaniu ekstrakcji III odzysk putrescyny oraz sperminy (odpowiednio 2,57
x 10-3 mg·g-1 i 7,53 x 10-3 mg·g-1) okazał się niższy niż w przypadku ekstrakcji
II (odpowiednio 3,20 x 10-3 mg·g-1 i 8,68 x 10-3 mg·g-1). Natomiast w przypadku
spermidyny, stężenia tej aminy w przypadku ekstrakcji III i ekstrakcji II były
porównywalne, odpowiednio 2,36 x 10-3 mg·g-1 i 2,38 x 10-3 mg·g-1. Użycie ekstrakcji IV dało najlepszy efekt, w przypadku spermidyny i sperminy odzysk był
najwyższy (3,27 x 10-3 mg·g-1 i 11,2 x 10-3 mg·g-1), niestety w analizowanym ekstrakcie w ogóle nie wykryto obecności putrescyny (Rys. 2, 3).
164
spermidine 73.60
putrescine 31.58
0.70
0.60
spermine 85.72
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
agmatine 73.35
spermine 85.35
Rys. 2. Analiza chromatograficzna amin biogennych ekstrahowanych
z liofilizowanego mięsa mintaja [ekstrakcja II]
0.70
0.60
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Rys. 3. Analiza chromatograficzna amin biogennych ekstrahowanych
z liofilizowanego mięsa mintaja [ekstrakcja IV]
165
Po porównaniu wyników analiz z użyciem buforu cytrynianowo–sodowego
rozcieńczonego i nierozcieńczonego jako ekstrahenta stwierdzono, że wydajność ekstrakcji sperminy i spermidyny zwiększyła się, gdy stężenie soli
w buforze było wyższe (ekstrakcja IV). Zadowalający odzysk tych amin uzyskano również stosując ekstrakcję II, ponadto w tym przypadku ekstrahowała
się także putrescyna (Tab. 2).
AMINA BIOGENNA
PUTRESCYNA
SPERMIDYNA
SPERMINA
Ekstrakcja I
0,1 M HCl, 80 ml/1g liofilizatu 1,16 x 10-3 mg·g-1
1,47 x 10-3 mg·g-1
5,64 x 10-3 mg·g-1
Ekstrakcja II, 10-krotnie rozc.
bufor*, 80 ml/1g liofilizatu
3,20 x 10-3 mg·g-1
2,38 x 10-3 mg·g-1
8,68 x 10-3 mg·g-1
Ekstrakcja III
2,57 x 10-3 mg·g-1
2,36 x 10-3 mg·g-1
7,53 x 10-3 mg·g-1
Ekstrakcja IV
Nie stwierdzono
3,27 x 10-3 mg·g-1
11,2 x 10-3 mg·g-1
Tab. 2. Zawartość amin biogennych w próbkach mięsa mintaja w zależności
od zastosowanego roztworu do ekstrakcji. *Bufor cytrynianowo-sodowy
(0,067 M kwas cytrynowy, 0,2 M NaCl, pH 2.2)
Według danych literaturowych, w makrelach, śledziach, tuńczyku i sardynkach oprócz histaminy zostały wykryte także inne aminy, w tym putrescyna,
kadaweryna, tyramina, spermina i spermidyna. W badaniach przeprowadzonych na rybach fermentowanych Ghananiam wykryto śladowe ilości putrescyny, tyraminy, agmatyny i tryptaminy [Silla Santos 1996]. Po fermentacji
ryb stwierdzono także wzrost zawartości spermidyny [Broczek i in. 2003].
Spermina i spermidyna są naturalnie występującymi aminami w mięsie. Zawartość spermidyny w mięsie wynosi zazwyczaj poniżej 5 mg·g-1 [Kalač
2006], a naturalna zawartość sperminy jest wysoka, waha się w granicach
20-60 mg·kg-1 [Kalač i Krausová 2005]. W przeprowadzonych badaniach
oznaczone zawartości tych amin biogennych były śladowe i nie stanowią zagrożenia dla zdrowia człowieka. Również stwierdzona zawartość putrescyny
nie stanowi zagrożenia dla naszego zdrowia.
WNIOSKI
Wyniki przeprowadzonych badań pozwalają stwierdzić, iż chromatografia
jonowymienna może być wykorzystana do oznaczania zawartości amin biogennych w mięsie ryb. Istotnym czynnikiem determinującym wyniki analizy
jest dobór odpowiednich metod i parametrów ekstrakcji amin z badanych
próbek. Zastosowana metoda pozwoliła na oznaczenie spermidyny, sperminy
oraz putrescyny w testowej próbce filetu rybnego.
166
LITERATURA
Berthold A. i Nowosielska D. 2008. Aminy biogenne w żywności. Medycyna Weterynaryjna, 64 (6):745-748.
Broczek M., Rautenstrauch D., Windyga B., Śnieżyńska H., Jędra M., Badowski P.,
Karłowska B. 2003. Zawartość histaminy i tyraminy w zależności od jakości mikrobiologicznej śledzi solonych, przechowywanych w różnych temperaturach.
Roczniki PZH, 4: 87-95.
Kalač P. 2006. Biologically active polyamines in beef, pork and meat products.
A review. Meat Science, 73: 1-11.
Kalač P., Krausová P. 2005. A review of dietary polyamines: Formation, implications
for growth and health and occurrence in food. Food Chemistry, 90: 219-230.
Libudzisz Z. 2008. Mikrobiologia techniczna – Mikrobiologia w biotechnologii,
ochronie środowiska i produkcji żywności (tom 2). Wydawnictwo Naukowe
PWN. Warszawa.
Silla Santos M.H. 1996. Biogenic amines: their importance in foods. International
Journal of Food Microbiology, 29: 213-225.
Stadnik J. i Dolatowski Z. 2010. Biogenic amines in meat and fermented meat products.
Acta Scientarium Polonorum. Technologia Alimentaria, 9 (3): 251-261.
mgr inż. Iwona Cieślik, dr Barbara Mickowska
Katedra Przetwórstwa Produktów Zwierzęcych, Wydział Technologii Żywności
e-mail: [email protected], [email protected], [email protected]
inż. Katarzyna Kluz
Małopolskie Centrum Monitoringu Żywności, Wydział Technologii Żywności
Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Władysław Migdał
167
Anna Dudzińska
Magda Filipczak-Fiutak
Jacek Domagała
EPISTEME
14/2012
s.169-176
ISSN 1895-4421
WPŁYW PRESURYZACJI NA PRZEŻYWALNOŚĆ MIKROFLORY JOGURTOWEJ
EFFECTS OF PRESSURIZATION ON VIABILITY OF YOGURT MICROFLORA
Abstrakt. Celem pracy było określenie wpływu presuryzacji, w warunkach różnych
wysokości ciśnienia hydrostatycznego, na przeżywalność mikroflory jogurtowej. Ciśnieniowaniu poddano dwa produkty: mleko kozie (350 MPa i 500 MPa), z którego
następnie wyprodukowano jogurt oraz jogurt (150 MPa i 250 MPa) uzyskany z mleka
koziego. Presuryzację prowadzono przez 15 min w temp. 25°C. W wytworzonych
metodą termostatową jogurtach zbadano przeżywalność drobnoustrojów z gatunku:
S. thermophilus i L. delbrueckii ssp. bulgaricus. W ciśnieniowanych jogurtach zaobserwowano spadek liczebności mikroorganizmów obu gatunków wraz ze wzrostem
ciśnienia. W jogurtach otrzymanych z mleka presuryzowanego w 350 MPa ilość żywych komórek była większa, a w 500 MPa mniejsza niż w jogurcie kontrolnym, co
sugeruje, że obróbka mleka przerobowego umiarkowanie wysokim ciśnieniem stymuluje wzrost bakterii kwasu mlekowego.
Słowa kluczowe: presuryzacja, wysokie ciśnienie hydrostatyczne, mikroflora jogurtowa
Summary. The aim of a study was to determine the influence of pressurization, in
terms of different heights of hydrostatic pressure, on viability of yogurt microflora.
Two products were treated at high pressure: goat’s milk (350 MPa and 500 MPa)
which was used to manufacture yogurt and yogurt (150 MPa and 250 MPa) obtained
from goat’s milk. High-pressure treatments were applied for 15 min at 25°C. In these
set style yogurts the viability of microbes of the species: S. thermophilus and L. delbrueckii ssp. bulgaricus was investigated. In pressurized yogurts bacterial counts of
both starter cultures tended to decrease with increasing pressure. In yogurts from milk
treated at 350 MPa, the number of viable cells was higher and at 500 MPa lower than
in control yogurt. It suggests that moderately high pressure treatment of processing
milk stimulates growth of lactic acid bacteria.
Key words: pressurization, high hydrostatic pressure, yogurt microflora
169
WSTĘP
W ostatnim czasie wzrasta zainteresowanie wpływem presuryzacji na mleko i przetwory mleczne. Zastosowanie ciśnienia od 300 do 600 MPa jest
skuteczną metodą inaktywacji mikroorganizmów, w tym najbardziej szkodliwych patogenów żywności. Wysokie ciśnienie wpływa również na właściwości fizyko - chemiczne i technologiczne mleka [Trujillo i in. 2002]. Micele
kazeinowe rozpadają się na mniejsze cząstki [Schmidt i Koops 1977], białka
serwatkowe, a zwłaszcza najbardziej wrażliwa β - laktoglobulina, ulegają denaturacji, a następnie agregacji i interakcji z kazeiną [Funtenberger i in. 1997,
Lopez-Fandino i in. 1997], natomiast kuleczki tłuszczowe - w zależności od
temperatury - łączeniu lub dezintegracji nie uszkadzając otoczek [Gervilla
i in. 2001]. Ciśnienie 100 - 400 MPa wywołuje krystalizację tłuszczu mlecznego [Buchheim i Abou El-Nour 1992]. Jednocześnie obróbka wysokociśnieniowa nie wywiera szkodliwego wpływu na istotne cechy jakościowe,
takie jak: smak, zapach, zawartość witamin i składników odżywczych. Presuryzacja poprawia koagulację podpuszczkową oraz kwasową mleka, zwiększa
sztywność, wytrzymałość i odporność na synerezę żelu jogurtowego. Opisany wpływ obróbki wysokociśnieniowej na składniki mleka znajduje coraz
szersze zastosowanie w przemyśle mleczarskim. Umożliwia wytwarzanie
bezpiecznych mikrobiologicznie i minimalnie przetworzonych produktów
mlecznych o wysokiej jakości odżywczej, ulepszonych cechach sensorycznych, nowej teksturze i przedłużonej trwałości [Johnston i in. 1993, Trujillo
i in. 2002].
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus oraz Streptococcus salivarius ssp.
thermophilus są typowymi szczepami stosowanymi do produkcji jogurtu.
Rola obu drobnoustrojów polega ogólnie na zakwaszeniu mleka oraz syntezie związków aromatycznych. Zarówno S. thermophilus jak i L. delbrueckii
ssp. bulgaricus wykorzystują laktozę w szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa na skutek czego utworzony pirogronian zostaje ostatecznie zredukowany
do kwasu mlekowego [Zourari i in. 1992]. W wyniku syntezy odmiennych
związków, istnieje wzajemna zależność pomiędzy wzrostem wymienionych
szczepów. Oznacza to, że L. delbrueckii ssp. bulgaricus stymuluje paciorkowce poprzez uwolnienie aminokwasów i peptydów na skutek proteolizy,
natomiast sam stymulowany jest przez dwutlenek węgla i kwas mrówkowy
wytwarzane przez S. thermophilus. Taka współzależność wzrostu może zostać zahamowana przez różne czynniki, jak wysoka liczba komórek somatycznych w mleku lub obecność nadtlenku wodoru, antybiotyków, detergentów oraz bakteriofagów. Także niektóre zabiegi technologiczne prowadzone
podczas produkcji jogurtu mogą skutkować zmniejszeniem liczby drobnoustrojów. Z drugiej strony kultury starterowe można stymulować na niektórych etapach przetwarzania mleka (obróbka cieplna, wzbogacanie mleka
białkami) [Tamime i Robinson 2007, Serra i in. 2009].
170
Wpływ presuryzacji na przeżywalność mikroflory jogurtowej...
Badania opisane w niniejszym artykule zostały przeprowadzone w celu określenia wpływu wysokiego ciśnienia hydrostatycznego na przeżywalność bakterii z gatunku L. delbrueckii ssp. bulgaricus i S. thermophilus w presuryzowanym jogurcie oraz jogurcie wyprodukowanym z presuryzowanego mleka.
MATERIAŁ I METODY
Materiał badawczy stanowiły dwa rodzaje jogurtów wyprodukowane w warunkach laboratoryjnych metodą termostatową:
• presuryzowany jogurt otrzymany z mleka koziego,
• jogurt otrzymany z presuryzowanego mleka koziego.
Doświadczenie przeprowadzono w następujących etapach:
• wytworzenie jogurtu oraz przygotowanie mleka do presuryzacji,
• odpowiednia obróbka wysokociśnieniowa obu produktów,
• wyprodukowanie jogurtu z presuryzowanego mleka,
• analizy mikrobiologiczne otrzymanych jogurtów.
Materiał kontrolny stanowił jogurt nie poddany presuryzacji na żadnym etapie produkcji.
Produkcja jogurtu. Surowe mleko kozie z okresu późnej laktacji poddano
pasteryzacji w temperaturze 85°C przez 15 minut, następnie schłodzono do
temperatury 44°C, po czym zaszczepiono szczepionką jogurtową YC - 180,
w ilości 2% w przeliczeniu na zakwas roboczy, rozpuszczoną w peptonie.
Całość dokładnie wymieszano i rozlano do jałowych opakowań jednostkowych. Próbki umieszczono w cieplarce w temperaturze 44°C do momentu
uzyskania pH 4,7.
W przypadku presuryzowanego jogurtu ciśnieniowanie prowadzono po inkubacji i jednodniowym przechowywaniu produktu w warunkach chłodniczych
(5 - 8°C).
W przypadku jogurtu otrzymanego z presuryzowanego mleka, obróbka wysokociśnieniowa mleka nastąpiła po jego pasteryzacji i również jednodniowym przechowywaniu chłodniczym (5 - 8°C). Analizy mikrobiologiczne
wykonano po 48 godzinach chłodniczego przechowywania jogurtów od zakończenia inkubacji. Schemat technologiczny produkcji obu jogurtów przedstawiono na Rys. 1.
171
PRESURYZOWANY JOGURT
OTRZYMANY Z MLEKA KOZIEGO
JOGURT OTRZYMANY Z
PRESURYZOWANEGO MLEKA KOZIEGO
Rys. 1. Schemat technologiczny produkcji presuryzowanego jogurtu
z mleka koziego oraz jogurtu z presuryzowanego mleka koziego
Obróbka wysokociśnieniowa. Presuryzację prowadzono w Instytucie Wysokich
Ciśnień PAN w Warszawie. Produkty umieszczono w pojemnikach wykonanych
z rozciągliwego materiału, nie pozostawiając wewnątrz pęcherzyków powietrza.
Tak przygotowane próbki wprowadzono do komory wysokociśnieniowej wypełnionej glikolem propylenowym i wodą w stosunku 1:1. Po zamknięciu tłoka
w komorze wygenerowano odpowiednio wysokie ciśnienie.
Dla jogurtu zastosowano pojemniki propylenowe o pojemności 120 cm3 oraz
ciśnienie 150 MPa i 250 MPa. Mleko umieszczono w pojemnikach polietylenowych o pojemności 500 cm3 i poddano presuryzacji przy ciśnieniu 350 MPa i 500
MPa. Próbki ciśnieniowano przez 15 minut w temperaturze 25°C.
Badania wykonano w trzech powtórzeniach. Presuryzowane produkty przechowywano w temperaturze 5 - 8°C przez około 24 godziny.
172
Analiza mikrobiologiczna. Badania mikrobiologiczne wykonano zgodnie
z Polską Normą [PN-A-86034-15] oznaczając charakterystyczne dla jogurtu drobnoustroje z gatunku Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus oraz
Streptococcus salivarius ssp. thermophilus. Z odpowiednich rozcieńczeń
badanych próbek jogurtów oraz jogurtu kontrolnego wykonano posiew
wgłębny do dwóch równoległych płytek Petriego dla każdego drobnoustroju. Do izolacji L. delbrueckii ssp. bulgaricus zastosowano pożywkę MRS
zakwaszoną do pH 5,4 o temperaturze 45°C. Płytki inkubowano w pozycji
odwróconej, w temperaturze 37°C przez 72h w warunkach beztlenowych.
W przypadku S. thermophilus użyto agar M-17 o pH uregulowanym do 7,2
i temperaturze 45°C. Płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 48h
w warunkach tlenowych.
Wyniki obliczeń mikrobiologicznych przedstawiono jako log10 jednostek
tworzących kolonie (jtk) na gram jogurtu.
WYNIKI I DYSKUSJA
Ponieważ przeżywalność kultur starterowych jest istotnym czynnikiem decydującym o bezpieczeństwie oraz jakości jogurtu [Ancos i in. 2000], w doświadczeniu dokładnie zbadano wpływ presuryzacji mleka przeznaczonego
do produkcji jogurtu jak i presuryzacji samego jogurtu na liczbę drobnoustrojów z gatunku S. thermophilus oraz L. delbrueckii ssp. bulgaricus w gotowym produkcie.
Na Rys. 2 przedstawiono liczebność drobnoustrojów z gatunku S. thermophilus oraz Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus w jogurcie kontrolnym,
jogurcie otrzymanym z koziego mleka presuryzowanego w 350 MPa i 500
MPa oraz jogurcie presuryzowanym w 150 MPa i 250 MPa otrzymanym
z koziego mleka.
Na podstawie przeprowadzonych badań jogurtu kontrolnego stwierdzono
większą liczbę żywych komórek bakterii z gatunku S. thermophilus (8,67 log
jtk · g-1) w porównaniu z L. delbrueckii ssp. bulgaricus (8,19 log jtk · g-1).
Paciorkowce zdominowały mikroflorę jogurtową przewyższając trzykrotnie
liczbę pałeczek kwasu mlekowego. Jak twierdzą Laye i in. [1993] duży stosunek paciorkowców do pałeczek mlekowych jest korzystny przy tworzeniu
pożądanego smaku i tekstury jogurtu, chociaż stosunek zbliżony do 1 uważany jest za optymalny.
Jak wykazano w wielu publikacjach wysokie ciśnienie wywiera istotne zmiany w składnikach mleka [Schmidt i Koops 1977, Funtenberger i in. 1997,
Lopez-Fandino i in. 1997, Gervilla i in. 2001], a przez to może wpływać
na aktywność drobnoustrojów wprowadzonych do niego podczas produkcji mlecznych napojów fermentowanych. W jogurcie otrzymanym z mleka
173
presuryzowanego w 350 MPa liczba żywych komórek S. thermophilus była
większa (o 0,10 jednostek log jtk · g-1) niż w jogurcie kontrolnym. Z kolei
poddanie mleka obróbce w 500 MPa nieznacznie ograniczyło aktywność tych
drobnoustrojów w porównaniu z jogurtem nieciśnieniowanym. Podobnie,
w przypadku komórek Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, zastosowanie do produkcji jogurtu mleka potraktowanego umiarkowanie wysokim
ciśnieniem (350 MPa) stymulowało wzrost omawianych mikroorganizmów
- zanotowano większą liczbę o 0,18 jednostek log jtk · g-1 w porównaniu
z jogurtem niepresuryzowanym. Natomiast w mleku poddanym obróbce
w 500 MPa wzrost pałeczek mlekowych był mniej intensywny skutkując
mniejszą liczbą bakterii niż w produkcie kontrolnym.
Rys. 2. Liczebność drobnoustrojów z gatunku S. thermophilus (A) oraz Lactobacillus
delbrueckii ssp. bulgaricus (B) w jogurcie kontrolnym (a), jogurcie otrzymanym z
koziego mleka presuryzowanego w 350 MPa (b) i 500 MPa (c) oraz jogurcie presuryzowanym w 150 MPa (d) i 250 MPa (e) otrzymanym z koziego mleka
Wielu naukowców donosiło o niszczącym działaniu wysokiego ciśnienia
na różne rodzaje mikroorganizmów [Trujillo i in. 2002], dlatego w przeprowadzonym doświadczeniu zbadano również wpływ presuryzacji jogurtu na
przeżywalność typowych dla tego produktu drobnoustrojów. W ciśnieniowanym jogurcie liczba żywych komórek obu gatunków mikroorganizmów była
znacznie niższa (zwłaszcza przy ciśnieniu 250 MPa), w porównaniu zarówno
do próbki kontrolnej, jak i napojów otrzymanych z presuryzowanego mleka.
Największy spadek przeżywalności mikroflory jogurtowej zaobserwowano
przy ciśnieniu 250 MPa. Szczególnie intensywna redukcja nastąpiła w liczebności komórek S. thermophilus, co wskazuje na dużą wrażliwość drobnoustroju na wysokie ciśnienia. Przy ciśnieniu 150 i 250 MPa liczba żywych
komórek paciorkowców zmniejszyła się odpowiednio o 0,34 i 2,26 jednostek log jtk · g-1, natomiast dla pałeczek kwasu mlekowego zaobserwowano,
w takich samych warunkach, spadek o 0,41 i 1,14 jednostek log jtk · g-1.
174
W przeciwieństwie do uzyskanych wyników, Tanaka i Hatanaka [1992] nie
stwierdzili zmian w przeżywalności bakterii kwasu mlekowego po poddaniu pełnotłustego jogurtu działaniu ciśnienia 300 MPa, natomiast Ancos i in.
[2000] wykazali większą odporność Streptococcus thermophilus niż Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus na 15 minutowe działanie ciśnienia 300
i 400 MPa w temperaturze 20°C oraz brak istotnych zmian przy ciśnieniu
100 i 200 MPa.
WNIOSKI
• W jogurcie kontrolnym, ciśnieniowanym w 150 MPa oraz wytworzonym
z ciśnieniowanego mleka (350 MPa i 500 MPa) dominowały bakterie
z gatunku S. thermophilus nad L. delbrueckii ssp. bulgaricus. Odwrotna
zależność występowała w jogurcie ciśnieniowanym w 250 MPa.
• Największą liczbą bakterii kwasu mlekowego charakteryzował się jogurt otrzymany z mleka presuryzowanego w 350 MPa, co sugeruje, że
obróbka mleka przerobowego umiarkowanie wysokim ciśnieniem może
stymulować kultury starterowe. Jednak wyższe ciśnienie powoduje ograniczenie ich wzrostu.
• Presuryzacja jogurtu powoduje spadek liczebności mikroflory jogurtowej
wraz ze wzrostem ciśnienia. Najmniej paciorkowców oraz pałeczek mlekowych zawierał jogurt ciśnieniowany w 250 MPa.
• Stwierdzono, że większą wrażliwość na działanie wysokiego ciśnienia
wykazuje S. thermophilus w porównaniu z L. delbrueckii ssp. bulgaricus.
LITERATURA
Ancos de B. Cano M. P. Gomez R. 2000. Characteristics of stirred low-fat yoghurt as
affected by high pressure. International Dairy Journal, 10: 105-111.
Buchheim W. Abou El-Nour A. M. 1992. Induction of milkfat crystallization in the
emulsified state by high hydrostatic pressure. Fat Science and Technology, 94:
369-373.
Funtenberger S. Dumay E. M. Cheftel J. C. 1997. High pressure promotes
β-lactoglobulin aggregation through SH/S–S interchange reactions. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 45: 912-921.
Gervilla R. Ferragut V. Guamis B. 2001. High hydrostatic pressure effects on colour and
milk-fat globule of ewe’s milk. Journal of Food Science, 66 (6): 880-885.
175
Johnston D. E. Austin B. A. Murphy R. J. 1993. Properties of acid-set gels prepared
from high pressure treated milk. Milchwissenschaft, 48: 206-209.
Laye I. Karleskind D. Morr C. V. 1993. Chemical, microbiological and sensory properties of plain nonfat yogurt. Journal of Food Science, 58: 999-995.
Lopez-Fandino R. Ramos M. Olano A. 1997. Rennet coagulation of milk subjected to
high pressures. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45: 3233-3237.
Schmidt D. G. Koops J. 1977. Properties of artificial casein micelles. Netherlands
Milk and Dairy Journal, 31: 342-357.
Serra M. Trujillo J. A. Guamis B. Ferragut V. 2009. Flavour profiles and survival of
starter cultures of yoghurt produced from high-pressure homogenized milk. International Dairy Journal, 19: 100-106.
Tamime A. Y. Robinson R. K. 2007. Yoghurt science and technology. Woodhead Publishing Ltd. Cambridge.
Tanaka T. Hatanaka K. 1992. Application of hydrostatic pressure to yoghurt to prevent
its after-acidification. Journal of Japanese Society of Food Science and Technology, 39: 173-177.
Trujillo J. A. Capellas M. Saldo J. Gervilla R. Guamis B. 2002. Applications of highhydrostatic pressure on milk and dairy products: a review. ��
Innovative Food Science and Emerging Technologies, 3: 295-307.
Zourari A. Accolas J. P. Desmazeaud M. J. 1992. Metabolism and biochemical characteristics of yoghurt bacteria. A review. Lait, 72: 1-34.
1995. Instrukcje technologiczne do produkcji artykułów mleczarskich. Oficyna Wydawnicza HOŻA. Warszawa.
1998. Polska Norma PN-A-86034-15. Mleko i przetwory mleczne. Badania mikrobiologiczne. Jogurt; oznaczanie liczby charakterystycznych drobnoustrojów.
mgr inż. Anna Dudzińska, mgr inż. Magda Filipczak-Fiutak
Katedra Przetwórstwa Produktów Zwierzęcych
Wydział Technologii Żywności
ul. Balicka 122, 30-149 Kraków
Opiekun naukowy: dr hab. inż. Jacek Domagała, prof. UR
176
Agnieszka Dylewska
EPISTEME
14/2012
s.177-184
ISSN 1895-4421
WPŁYW CZASU OGRZEWANIA ROZTWORÓW KONCENTRATU
BIAŁEK SERWATKOWYCH NA NAPIĘCIE POWIERZCHNIOWE
I LEPKOŚĆ
INFLUENCE OF HEATING TIME OF WHEY PROTEIN CONCENTRATE
SOLUTIONS ON SURFACE TENSION AND VISCOSITY
Abstrakt. Koncentrat białek serwatkowych WPC 80 stosowany jest często jako preparat zaspokajający zapotrzebowanie organizmu na białko, szczególnie przy intensywnym wysiłku fizycznym. Bogaty w aminokwasy egzogenne stanowi produkt metabolicznie aktywny, wykazuje działanie antykataboliczne oraz anaboliczne. Przeprowadzono modelowe badania z użyciem WPC 80 (w 15%-owym roztworze wodnym).
Roztwory ogrzewano w temp. 80°C i pobierano próby po różnym czasie ogrzewania
(od 5 do 80 min, co 5 min). Próbka nieogrzewana stanowiła próbę referencyjną. Przeprowadzono oznaczenia napięcia powierzchniowego z użyciem tensjometru optycznego (Theta optical tensiometer, KSV Instruments) oraz pomiary lepkości z użyciem
lepkościomierza ultradźwiękowego (ultrasonic viscometer, Unipan 505). Przeprowadzono analizę statystyczną wyników z użyciem programu STATISTICA 10. Obliczono współczynnik korelacji Pearsona między zmiennymi, wyznaczono linie regresji.
Słowa kluczowe: koncentrat białek serwatkowych, napięcie powierzchniowe, lepkość
Summary. Whey protein concentrate WPC 80 is often used as a specific satisfying the
need of organism on proteins, especially with intensive physical efforts. Rich with exogenous aminoacids, forms a metabolically active product and demonstrates anticatabolic and anabolic activity. Model research was engaged using WPC 80 (in 15% water
solutions). Solutions were heated in temperature 80°C and the samples were collected
after different time of heating (from 5 to 80 minutes, every 5 minutes). The unheated
sample represented referential sample. The assays of surface tension using optical tensiometer (Theta optical tensiometer, KSV Instruments) and viscosity measurements
using ultrasonic viscometer (Unipan 505) were carried out. Statistical analyses were
executed using the program STATISTICA 10. Pearson’s Correlation coefficient was
calculated among the variables, regression lines were determined.
Key words: whey protein concentrate, surface tension, viscosity
177
Agnieszka Dylewska
WSTĘP
Koncentrat białek serwatkowych (WPC) to źródło wysokiej jakości białek
mające zastosowanie w przemyśle spożywczym. Białka serwatkowe posiadają wyższą wartość biologiczną niż np. białka jaj czy soi [Smithers 2008].
Białka mleczne w formie rozpuszczalnej i zdyspergowanej w roztworze są
szeroko doceniane jako składniki żywności, posiadają bardzo dobre właściwości powierzchniowo czynne oraz właściwości stabilizacji koloidów. WPC
stosuje się w produkcji żywności funkcjonalnej. Enzymatyczne hydrolizaty
WPC stosowane są głównie jako źródło azotu w żywności dla dzieci oraz
w żywieniu dojelitowym [González-Tello i in. 2007]. Koncentrat białek serwatkowych może mieć zastosowanie w odżywkach dla dzieci, bezpośrednio
lub jako dodatek do zwykłych koncentratów mlecznych, dzięki czemu otrzymany produkt ma mieć skład jak najbardziej zbliżony do mleka kobiecego
[Westergaard 2004]. Zarówno koncentraty białek serwatkowych jak i izolaty
tych białek używane są jako emulgatory i stabilizatory ze względu na ich
właściwości międzyfazowe i żelowanie [Nicorescu i in. 2008].
Prozdrowotne właściwości koncentratu białek serwatkowych oraz napojów
z nich otrzymywanych związane są głównie z wysoką zawartością rozgałęzionych aminokwasów egzogennych (izoleucyny, leucyny i waliny), które stymulują syntezę białek mięśniowych [Katsanos i in. 2006]. W związku
z tym WPC jest chętnie spożywany przez sportowców i osoby aktywne fizycznie. Aminokwasy te dostarczają energię do mięśni i przyspieszają syntezę kwasu glutaminowego i alaniny podczas stresu (m.in. intensywnych ćwiczeń fizycznych czy urazów) [Pescuma i in. 2010]. Napoje dla sportowców
należą do żywności funkcjonalnej i mają zapewniać odpowiednią hydratyzację, być szybko absorbowane w organizmie i poprawiać osiągi sportowe.
Ponadto, sportowcy odczuwają mniejszy ból mięśni spożywając napoje z
dodatkiem białek serwatkowych i cukrów niż napojów zawierających tylko
cukry [Millard-Stafford i in. 2005].
Białka serwatkowe odzyskuje się przemysłowo w procesie ultrafiltracji i ze
względu na zróżnicowanie wielkości cząstek są oddzielane od laktozy i składników mineralnych, które następnie przechodzą przez membranę do permeatu.
Retentat suszy się zwykle w suszarkach rozpyłowych, w celu wyprodukowania
WPC o stężeniu białek w zakresie 35-80% [Yee i in. 2007; Pescuma i in. 2010].
Oznaczanie napięcia powierzchniowego jest wymagane do projektowania
i kontrolowania procesów związanych z przepływem ciepła i masy. Aby dobrze
zaprojektować proces suszenia rozpyłowego, pomiar właściwości fizycznych
jest niezbędny do wyliczenia średniej średnicy kropli oraz składu granulometrycznego substancji. Ciśnienie przepływu oraz przepływ masowy przesączu są
funkcją gęstości cieczy i lepkości, które z kolei zależą od stężenia i temperatury.
Proces ultrafiltracji dla roztworów koncentratu o stężeniach 10-20% musi być tak
178
Wpływ czasu ogrzewania roztworów koncentratu białek...
przeprowadzony, aby uniknąć zarówno zmian mikrobiologicznych jak i fizykochemicznych. Odpowiednie suszenie rozpyłowe ma na celu zapobieganie przed
tymi zmianami [González-Tello i in. 2007].
MATERIAŁ I METODY
Do badań zastosowano WPC 80 (SM Spomlek, Radzyń Podlaski). Sporządzono 15%-owe roztwory WPC w temperaturze 25ºC. Roztwory były następnie mieszane przez 1h z użyciem mieszadeł magnetycznych. W dalszej
kolejności roztwory ogrzewano w temperaturze 80ºC i pobierano próby po
różnym czasie ogrzewania (od 5 do 80 min, co 5 min). Próbka nieogrzewana stanowiła próbę referencyjną. Przeprowadzono oznaczenia napięcia powierzchniowego z użyciem tensjometru optycznego (Theta optical tensiometer,
KSV Instruments) oraz pomiary lepkości z użyciem lepkościomierza ultradźwiękowego (ultrasonic viscometer, Unipan 505). Pomiary wykonano w pięciu
powtórzeniach. Przeprowadzono analizę statystyczną wyników z użyciem programu STATISTICA 10. Obliczono współczynnik korelacji Pearsona między
zmiennymi, wyznaczono linie regresji.
WYNIKI I DYSKUSJA
Rys. 1 przedstawia zależność napięcia powierzchniowego 15% ogrzewanych
roztworów WPC w funkcji czasu. Wyniki wskazują jednoznacznie na wzrost
wartości napięcia powierzchniowego z upływem czasu ogrzewania. Wpływ
ogrzewania białek serwatkowych na ich właściwości strukturalne i chemiczne jest często rozpatrywanym zagadnieniem ze względu na obecność tego
procesu w przetwórstwie żywności. Budowa strukturalna łańcuchów polipeptydowych ulega wyraźnej zmianie; następuje odsłonięcie grup hydrofobowych, co może być procesem odwracalnym lub nie w zależności od typu
powstałych mostków S-S. Dłuższe ogrzewanie indukuje również agregację
globularnych białek serwatkowych. Kinetyka denaturacji i agregacji białek
zależy od warunków ogrzewania (temperatury, szybkości ogrzewania) oraz
czynników jak pH, siła jonowa czy stężenia białek [Nicorescu i in. 2008].
LaClair i Etzel [2010] podkreślają także, iż otrzymanie napojów o długim
okresie przydatności do spożycia na bazie białek serwatkowych jest dużym
wyzwaniem ze względu na możliwość denaturacji i agregacji białek podczas
ogrzewania, skutkujące zmętnieniem roztworu lub powstaniem białego osadu,
co konsumenci postrzegają jako wady produktu. W powyższych badaniach pojawienie się osadu zaobserwowano po 60 min ogrzewania w temp. 80ºC.
González-Tello i in. [2007] zbadali napięcie powierzchniowe (σ) roztworów
białek serwatkowych w temperaturze 25ºC. W tej temperaturze, dla stężenia
179
Agnieszka Dylewska
5%, zanotowano krytyczne napięcie powierzchniowe równe σc = 42,5 mN/m.
Dla stężeń białek ≥10%, średnia arytmetyczna napięcia powierzchniowego wynosiła 46,3 mN/m. Ogólnie, wartości σ uzyskane przez naukowców
dla stężeń 1-30% były niższe niż w przedstawionych powyżej badaniach ze
względu na niższą temperaturę (25 ºC), w której nie zachodzi jeszcze proces
denaturacji białka.
Nicoresceu i in. [2008] oznaczyli napięcie powierzchniowe 2% roztworów
izolatu białek serwatkowych w temperaturze 100ºC w funkcji czasu. Naukowcy stwierdzili, iż nieogrzewane roztwory białek wykazują niższe napięcie powierzchniowe niż próbki po ogrzaniu, co jest potwierdzone również
w powyższych badaniach (dla próby referencyjnej σ = 49,71).
60
napięcie powierzchniowe [mN/m]
59
58
57
56
55
54
5
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
czas [min]
Średnia
Średnia±Odch.std
Rys. 1. Wpływ czasu ogrzewania 15% roztworów WPC na napięcie powierzchniowe
Wyk. 1 jest to wykres rozrzutu wartości napięcia powierzchniowego roztworów WPC względem czasu. Odnotowano wysoki współczynnik korelacji
Pearsona pomiędzy zmiennymi (r = 0,9084). W związku z silną korelacją
dodatnią wyznaczono linię regresji, którą opisuje równanie: y = 0,0322x
+ 56,389. Współczynnik determinacji (R2) wyniósł 0,8252.
Rys. 2 przedstawia zależność lepkości 15% roztworów WPC w funkcji czasu. Widoczny jest wzrost lepkości roztworów w czasie ogrzewania. Agregacja ogrzewanych białek w niskich stężeniach białka wpływa zazwyczaj na
zwiększanie wartości lepkości [Purwanti i in. 2011]. Prawdopodobnie rozfałdowanie i agregacja białek w wysokiej temperaturze spowodowały wzrost
lepkości badanych roztworów w czasie.
180
59,5
59,0
58,5
58,0
57,5
57,0
56,5
56,0
55,5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
czas [min]
Wyk. 1. Wykres rozrzutu wartości napięcia powierzchniowego 15% roztworów WPC
względem czasu ogrzewania w temperaturze 80°C
3,0
2,8
2,6
lepkość [mPa s g cm-3]
2,4
2,2
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
5
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
czas [min]
Średnia
Średnia±Odch.std
Rys. 2. Wpływ czasu ogrzewania 15% roztworów WPC na lepkość
181
Agnieszka Dylewska
Wyk. 2 obrazuje wykres rozrzutu wartości lepkości roztworów WPC względem czasu. Współczynnik korelacji Pearsona między zmiennymi był tu jeszcze wyższy niż w przypadku zależności napięcia powierzchniowego od czasu
i wyniósł 0,9370. Występuje silna korelacja dodatnia między zmiennymi. Linię
regresji opisuje równanie: y = 0,011 x + 1,3735; R2 = 0,8779.
Wyk. 3 przedstawia wykres rozrzutu między wartościami lepkości a napięciem powierzchniowym roztworów. Współczynnik korelacji Pearsona był
wyższy niż 0,8, co świadczy również o silnej korelacji dodatniej. Linię regresji opisuje zależność: y = 0,2767 x -14,1362. R2 = 0,6922.
Wyk. 2. Wykres
rozrzutu wartości
lepkości 15%
roztworów WPC
względem czasu
ogrzewania w temperaturze 80°C
2,6
2,4
2,2
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
czas [min]
2,6
2,4
2,2
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
55,5
56,0
56,5
57,0
57,5
58,0
182
58,5
59,0
59,5
Wyk. 3. Wykres
rozrzutu wartości
lepkości 15%
roztworów WPC
względem napięcia powierzchniowego
WNIOSKI
• Wraz ze wzrostem czasu ogrzewania zaobserwowano wzrost napięcia
powierzchniowego 15% roztworów WPC w temperaturze 80 ºC. Wzrost
napięcia powierzchniowego związany jest ze zmianą konformacji białek
i ich agregacją.
• Wraz ze wzrostem czasu ogrzewania zanotowano wzrost wartości lepkości 15% roztworów WPC.
• Zaobserwowano silną korelację dodatnią między napięciem powierzchniowym a lepkością ogrzewanych roztworów WPC.
LITERATURA
Smithers G. W. 2008. Whey and whey proteins – from ‘gutter-to-gold’. Int Dairy
J. 18, 695-704.
González-Tello P., Camacho F., Guadix E. M., Luzón G., González P. A. 2009. Density, viscosity and surface tension of whey protein concentrate solutions. J Food
Process Eng. 32, 235-247.
Westergaard V. 2004. Milk powder technology. Evaporation and spray-drying
(5th ed.) Copenhagen: Niro A/S.
Nicorescu I., Loisel C., Vial C., Riaublanc A., Djelveh G., Cuvelier G., Legrand J. 2008.
Combined effect of dynamic heat treatment and ionic strength on denaturation and aggregation of whey proteins – Part I. Food Res Int. 41, 707-713.
Katsanos C. S., Kobayashi H., Sheffield-Moore M., Aarsland A., Wolfe R.
R. 2006. A high proportion of leucine is required for optimal stimulation
of the rate of muscle protein synthesis by essential aminoacids in the elderly.
Am J of Physiol Endocrinol and Metab. 291, E381-E387.
Pescuma M., María Hébert E., Mozzi F., Font de Valdez G. 2010. Functional fermented whey-based beverage using lactic acid bacteria. Int J Food Microbiol.
141, 73-81.
Millard-Stafford M., Warren G., Thomas L. Doyle J., Snow T., Hitchcock
K. 2005. Recovery from run training: efficacy of a carbohydrate-protein beverage? Int J Sport Nutr Exerc. 15, 610-24.
Yee K. W. K., Wiley D. E., Bao, J. Whey protein concentrate production by continuous ultrafiltration: Operability under constant operating conditions.
J Memb Sci 290, 125-137.
183
Agnieszka Dylewska
LaClair C. E., Etzel M. R. 2010. Ingredients and pH are key to clear beverages that
contain whey protein. J Food Sci 75, 21-27.
Purwanti N., Smiddy M., Jan van der Goot A., de Vries R., Alting
A., Boom R. 2011. Modulation of rheological properties by heat-induced aggregation of whey protein solution. Food Hydrocolloid. 25, 1482-1489.
mgr inż. Agnieszka Dylewska
Zakład Technologii Mleka i Hydrokoloidów
184
Agnieszka Gębusia
Ewa Cieślik
Anna Kościej
Agnieszka Siembida
EPISTEME
14/2012
s.185-192
ISSN 1895-4421
OCENA WIEDZY ORAZ POBRANIA KWASU FOLIOWEGO PRZEZ
MIESZKANCÓW WOJEWÓDZTWA MAŁOPOLSKIEGO
ASSESSMENT OF KNOWLEDGE AND INTAKE OF FOLIC ACID BY
THE INHABITANTS THE MALOPOLKA REGION
Abstrakt. W pracy podjęto próbę oszacowania spożycia kwasu foliowego oraz poziomu wiedzy żywieniowej na temat skutków jego niedoboru w diecie. Badaniem ankietowym objęto 126 mieszkańców województwa małopolskiego, w wieku 18-45 lat.
Narzędzie badawcze stanowił kwestionariusz ankiety skonstruowany specjalnie dla
celów badawczych. Ankietowane osoby, wśród skutków niedoboru kwasu foliowego,
najczęściej wybierali wady wrodzone cewy nerwowej. W badanej grupie, aż 70% osób
nie stosowało suplementacji kwasem foliowym w postaci tabletek, a 58% nie przyjmowało żadnych suplementów witaminowych. Ponad 60% respondentów umiało wskazać
przynajmniej jeden produkt spożywczy będący dobrym źródłem tej witaminy. Jednocześnie wykazano niski poziom spożycia produktów bogatych w foliany.
Słowa kluczowe: kwas foliowy, wiedza żywieniowa, suplementy diety
Summary. The aim of the study was the assessment of knowledge and intake of folic
acid consumption with food and supplements and awareness about the effects of its
deficiency in the diet. The survey included 126 residents of the Małopolska region
at the age of 18-45 years. The study was performed using a questionnaire prepared
for these tests. Respondents, among the effects of folic acid deficiency, most often
pointed neural tube defects. In the examined group as much as 70% of people did
not use folic acid supplementation, and 58% did not have any vitamin supplements.
Over 60% could identify at least one food product that is a good source of folic acid.
Simultaneously, the study showed low level of consumption of foods rich in folate.
Key words: folic acid, nutrition knowledge, dietary supplements
185
WSTĘP
Prawidłowy sposób odżywiania jest bezpośrednim czynnikiem odpowiadającym za utrzymanie dobrego samopoczucia i stanu zdrowia w każdym
wieku. Polega on na systematycznym dostarczaniu odpowiednio zbilansowanych składników odżywczych, zarówno z dietą jak i jej suplementami. Do
składników diety, których najczęściej dostarczamy w niedostatecznej ilości
należą foliany. Obejmują one liczną grupę związków zaliczanych do witamin
grupy B, które różnią się stanem utlenienia pierścienia pirazynowego, rodzajem jednowęglowych fragmentów oraz ilością reszt kwasu glutaminowego.
Kwas foliowy (kwas pteroilomonoglutaminowy) jest najbardziej utlenionym
stałym związkiem folianów. Organizm człowieka nie potrafi go syntetyzować, z tego względu kwas foliowy powinien być regularnie dostarczany
z dietą lub suplementami witaminowymi. Zgodnie z najnowszymi zaleceniami Instytutu Żywności i Żywienia z 2008 roku, dawka pokrywająca zapotrzebowanie kobiet w wieku rozrodczym to 600 mg dziennie na poziomie RDA.
W przypadku wcześniejszego wystąpienia wad cewy nerwowej płodu kobieta, w kolejnej ciąży pod opieką lekarza, powinna przyjmować nawet 10-krotnie większą dawkę. Dawka pokrywająca zapotrzebowanie osób powyżej
19 roku życia wynosi 320 mg (na poziomie EAR), a 400 mg (na poziomie
RDA), jednak należy również uwzględnić czynniki ograniczające wchłanianie folianów. Działanie kwasu foliowego zmniejszają środki przeciwbólowe,
leki przeciwpadaczkowe, kortyzon, sulfamidy i antybiotyki oraz antagoniści
kwasu foliowego. Na niedobory folianów narażone są także kobiety stosujące doustne środki antykoncepcyjne, osoby nadużywające alkoholu i palacze
papierosów [Jarosz i Bułhak-Jachymczyk 2008, Okumura i Tsukamoto 2011,
Duda i Saran 2008].
Kwas foliowy jest witaminą rozpuszczalną w wodzie, wrażliwą na wysoką
temperaturę i światło. Ulega zniszczeniu nawet na skutek zbyt długiego przechowywania produktów spożywczych. Należy zatem pamiętać, iż w procesie
przetwarzania żywności (gotowania, pieczenia, smażenia) oraz jej długiego
przechowywania, straty folianów mogą sięgać od 40 do nawet 70 % [Czeczot
2008]. Z tego względu najlepszym sposobem na dostarczenie organizmowi
odpowiedniej ilości tej witaminy jest spożywanie produktów zbożowych
(z pełnego ziarna zbóż) oraz surówek z różnorodnych warzyw, przyrządzonych bezpośrednio przed podaniem. Najkorzystniejszą obróbką termiczną
żywności jest gotowanie na parze lub w niewielkiej ilości wody. Wykazano
także, iż obecność witaminy C w produktach spożywczych znacznie zmniejsza straty kwasu foliowego [McKillop i in. 2002; McNulty i Pentieva 2004].
Kwas foliowy z pożywienia jest wchłaniany w przewodzie pokarmowym
człowieka w około 50-90% [Melse-Boonstra 2002; Molloy 2002]. Do najczęściej wymienianych skutków niedostatecznej podaży kwasu foliowego
i jego pochodnych należą: powstawanie wad cewy nerwowej oraz zaburzeń
186
Ocena wiedzy oraz pobrania kwasu foliowego...
w działaniu układu nerwowego, niedokrwistość megaloblastyczna, miażdżyca i związane z nią dysfunkcje układu sercowo-naczyniowego. Obserwacje
żywieniowe i epidemiologiczne wskazują także coraz częściej na korelację
niedoboru folianów z występowaniem zmian nowotworowych oraz rozwojem chorób neurodegeneracyjnych.
Biorąc pod uwagę tylko częściowe przyswajanie dostępnych z pożywienia
folianów, ich niestabilność podczas przechowywania i obróbki termicznej
oraz ich istotne funkcje w organizmie człowieka, celowe jest zwrócenie uwagi na konieczność spożywania suplementów tej witaminy. Celem przeprowadzonego badania było określenie poziomu wiedzy dotyczącej roli kwasu
foliowego i skutków jego niedoboru, a także oszacowanie poziomu pobrania
kwasu foliowego z produktów spożywczych i suplementów.
MATERIAŁ I METODYKA
Badania ankietowe przeprowadzono w 2011 roku z udziałem losowo wybranej
grupy 126 osób w wieku 18-45 lat, zamieszkujących na terenie województwa
małopolskiego. W badanej grupie znalazło się 75% kobiet oraz 25% mężczyzn.
Narzędzie badawcze stanowił kwestionariusz ankiety sporządzony specjalnie
do celów tego badania. Kwestionariusz zawierał 14 pytań. Były to zarówno
pytania zamknięte, jak i otwarte, a także wielokrotnego wyboru. Pytania dotyczyły wiedzy na temat znaczenia kwasu foliowego w organizmie człowieka
oraz skutków jego niedoboru, pobrania folianów z żywnością, a także nawyków związanych ze stosowaniem suplementów diety. Respondentów zapytano
także o częstotliwość spożycia wybranych grup produktów.
Uzyskane wyniki poddano analizie w programie Microsoft Office Excel 2007.
WYNIKI I DYSKUSJA
Wśród przebadanych osób prawie 60% odpowiedziało, że nie stosuje żadnych
suplementów diety. Ich przyjmowanie zdeklarowało zaledwie nieco ponad 40%
badanych. Osoby wzbogacające dietę wybierały zróżnicowane preparaty, były
to zarówno kompleksy witaminowo-mineralne jak i wybrane witaminy (Rys. 1).
W zakresie opinii na temat stosowania suplementów diety większość (57%)
badanych odpowiedziała, że jest to wskazane dla utrzymania dobrego stanu
zdrowia. Jednocześnie 28% osób uznała stosowanie suplementów diety za
modne, a 15% za niepotrzebne/zbędne. Badania Jarosza [2008] wykazały,
że 22% Polaków (w tym 16% mężczyzn i 28% kobiet) w ciągu roku zażywało, co najmniej 1 suplement diety. Wśród osób stosujących preparaty 29%
deklarowało, że przyjmuje je niemal codziennie przez cały rok. Przyjmo187
wane są one głównie z powodu zmęczenia, osłabienia lub choroby. Młodzi
stosowali je dla wspomagania organizmu w okresie zwiększonego wysiłku
(czynnikiem różnicującym była nie tylko płeć, ale również podjęty kierunek studiów), a także jako preparaty poprawiające urodę, podczas gdy osoby
w zaawansowanym wieku zażywali je w celu wzmocnienia serca, kości
i stawów [Jarosz 2008, Sigłowa i in., 2009].
Rys. 1. Wybór respondentów dotyczący stosowania preparatów farmakologicznych
Zdecydowana większość ankietowanych (78%) uważała, że wzbogacanie diety
w preparaty kwasu foliowego i innych witamin z grupy B jest ważne dla zdrowia.
Jednakże aż 18% przyznało, że nie wie czy ma to jakiś wpływ na organizm.
W badanej grupie aż 70% osób odpowiedziało, że nie stosuje suplementów
kwasu foliowego jako samodzielnego preparatu (Rys. 1). Może to wynikać
z faktu, że duża grupa osób zażywała kompleksy witaminowo-mineralne,
które zawierają w składzie także kwas foliowy. Natomiast 30% badanych
przyznało, że zażywa kwas foliowy w postaci tabletek. Odpowiedzi takiej
udzielały tylko kobiety. Zapytane o motywy takiego postępowania odpowiadały, że skłoniła je do tego obecna lub planowana ciąża. Wykazano także, iż
suplementy witamin z grupy B-complex nie cieszą się popularnością wśród
respondentów. Przyjmowało je zaledwie 15% przebadanych. Badania Chłopickiej i in. [2004], przeprowadzone wśród młodych kobiet zamieszkujących
Polskę południową w roku 2002/2003, wykazały znacznie wyższą popularność uzupełniania diety preparatami witaminowo-mineralnymi, w szczególności zawierającymi w swoim składzie kwas foliowy. Spożywanie powyższych preparatów zadeklarowało wówczas prawie 80 % kobiet. Natomiast
Grochans i in. [2005] oraz Twarduś i in. [2003] wykazali znikomą częstotliwość stosowania suplementów kwasu foliowego.
Kolejne pytanie dotyczyło wpływu witamin z grupy B (witaminy B6 i B12) oraz
witaminy C na przyswajalność kwasu foliowego. Niespełna 40% ankietowanych
osób wiedziało, że witaminy te wspomagają wchłanianie kwasu foliowego. Niestety prawie 60% osób przyznało, że nie potrafi odpowiedzieć na to pytanie.
188
Ankietowanych poproszono następnie o wskazanie produktów będących dobrym źródłem kwasu foliowego. Wyniki przedstawiono na Rys. 2. W odpowiedzi na to pytanie respondenci mogli wskazać kilka odpowiedzi. Znacząca
grupa badanych wybrała prawidłowo przynajmniej jeden produkt obfitujący
w kwas foliowy. Najczęściej wskazywane były nasiona roślin strączkowych
(70%) oraz ciemnozielone warzywa liściowe (60%). Połowa ankietowanych
osób wskazała wątróbkę, a 1/3 żółtko jaja oraz ryby morskie. Podobne wyniki otrzymano w badaniach Ehmke i Kunachowicz [2011], natomiast niższy
poziom wiedzy dotyczącej źródeł folianów stwierdzono wśród respondentów
Wyki i Mikołajczak [2007].
Następnie badane osoby zapytano także o częstotliwość spożycia wybranych
produktów. Odpowiedzi na to pytanie przedstawiono na Rys. 3.
Rys. 2. Opinia respondentów na temat źródeł kwasu foliowego
W znaczącej ilości odpowiedzi, prawidłowe wskazanie obfitego źródła folianów nie korelowało z częstotliwością jego spożywania przez respondentów.
Badani pomimo posiadanej wiedzy nie wykazywali prawidłowych nawyków
żywieniowych związanych ze spożyciem wybranych produktów. Również
badania Dybkowskiej i in. [2007] wśród mieszkańców Warszawy jak i Bronkowskiej i Biernat [2008] wśród mieszkańców Dolnego Śląska wykazały
niedoborowe ilości przyjmowanych folianów.
Ostatnie pytanie dotyczyło skutków niedoboru kwasu foliowego. Również
tutaj ankietowani mogli wybrać kilka odpowiedzi. Najwięcej, bo 75% osób
wskazało wady wrodzone cewy nerwowej. Pozostałe skutki deficytu folianów były mniej znane. Niecałe 40% badanych osób wskazało choroby degeneracyjne układu nerwowego, 1/3 osób wymieniła anemię, a zaledwie 20%
osób choroby układu krążenia.
189
Rys. 3. Częstotliwość spożycia wybranych grup produktów
Rys. 4. Skutki niedoboru kwasu foliowego w opinii respondentów
WNOSKI
• Pomimo posiadanej wiedzy dotyczącej skutków niedoborów kwasu foliowego zaledwie 40% respondentów stosowało suplementy diety.
• Najistotniejszym powodem motywującym kobiety do przyjmowania preparatów kwasu foliowego była ciąża lub jej planowanie w najbliższym
czasie.
• W zakresie świadomości dotyczącej konsekwencji niedoboru kwasu foliowego aż 75% respondentów zaznaczyło wrodzone wady cewy nerwowej, 40% choroby degeneracyjne układu nerwowego, 1/3 osób wskazała
anemię, a zaledwie 20% choroby układu krążenia.
• Posiadana wiedza przebadanych osób w zakresie obfitych źródeł kwasu
foliowego nie korelowała z częstotliwością spożycia produktów spożywczych będących źródłem folianów.
190
LITERATURA
Bronkowska M, Biernat J. 2008. Podaż kwasu foliowego i cyjanokobalaminy
w całodziennych racjach pokarmowych kobiet z terenu Dolnego Śląska. Roczn
PZH, 59: 203-9.
Chłopicka J., Zachwieja Z., Kowalski W. 2004. Folic acid supplement use among
women in Southern Poland. First Int. Conf. on Folates Analysis, bioavailability
and health, 11-14 February, 176-178.
Czeczot H. 2008. Kwas foliowy w fizjologii i patologii. Postepy Hig Med Dosw. 62:
405-419.
Duda G., Saran A. 2008. Polskie rekomendacje dotyczące spożycia witamin
i składników mineralnych przez osoby w starszym wieku. Farmacja Współczesna,
1, 16-23.
Dybkowska E, Świderski F, Waszkiewicz-Robak B. 2007. Zawartość witamin
w diecie dorosłych mieszkańców Warszawy. Roczn PZH, 58: 211-5.
Ehmke vel. Emczyńska E., Kunachowicz H. 2011. Badanie ankietowe wśród kobiet w
wieku rozrodczym dotyczące pierwotnej profilaktyki wad cewy nerwowej. Hygeia
Public Health, 46(1): 47-50.
Grochans E., Ćwiek D., Czajka R., Augustyniak K., Szych Z. 2005. Analiza wybranych
czynników wpływających na stan zdrowia kobiet w okresie przedkoncepcyjnym. An��
nales Universitatis Mariae Curie-Skłodowska, 60 (16): 134.
Jarosz M. 2008. Suplementy diety a zdrowie. Porady lekarzy i dietetyków. PZWL, W-wa.
Jarosz M., Bułhak-Jachymczyk B. 2008. Normy żywienia człowieka. Podstawy prewencji otyłości i chorób niezakaźnych, PZWL, Warszawa.
McKillop D.J., Pentieva K., Daly D., McPartlin J.M., Hughes J., Strain J.J., Scott
J.M., McNulty H. 2002. The effect of different coooking methods on folate retention in various foods that are amongst the major contributors to folate intake in
the UK diet. Br. J. Nutr., 88: 681–688.
McNulty H., Pentieva K. 2004. Folate bioavailability. Proc. Nutr. Soc. 63: 529-536.
Melse-Boonstra A., de Bree A., Verhoef P., Bjorke-Monsen A.L., Verschuren W.M.
2002. Dieatry monoglutamate and poliglutamate folate are associated with plasma folate concentrations in Dutch men and women aged 20–65 years. J. Nutr.,
2002; 132: 1307–1312.
Molloy A.M. 2002. Folate bioavailability and health. Int. J. Vitam. Nutr Res., 72:
46–52
191
Okumura K.,Tsukamoto H. 2011. Folate in smokers. Clinica Chimica Acta 412, 521–526.
Sigłowa A., Bertrandt B., Conder M., Bertrandt K., Lisiecka A., Kubiak P., Urbańska
A. 2009. Suplementacja diety wśród studentów. Żyw Nauka. Technol. Jakość,
4:236–249.
Twarduś K., Perek M, Krzeczowska B. 2003. Wiedza, postawy i zachowania studentek w zakresie profilaktyki wad cewy nerwowej. Annales Universitatis Mariae Curie-Skłodowska, 58: (13) 268.
Wyka J., Mikołajczak J. 2007. Podaż kwasu foliowego w racjach pokarmowych wrocławianek w wieku 20-25 lat oraz ocena wiedzy o jego znaczeniu dla zdrowia.
Roczniki PZH, 58 (4): 633-640.
Ewa Cieślik, Anna Kościej, Agnieszka Gębusia, Agnieszka Siembida
Katedra Technologii Gastronomicznej i Konsumpcji
Uniwersytet Rolniczyw Krakowie
Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Ewa Cieślik
192
Justyna Górecka
EPISTEME
14/2012
s.193-203
ISSN 1895-4421
WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNE MODELOWYCH PRODUKTÓW MIĘSNYCH, WYPRODUKOWANYCH Z WSTĘPNIE UTRWALONEGO MIĘŚNIA NAJDŁUŻSZEGO GRZBIETU DZIKA
PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF MODEL MEAT PRODUCTS,
PRODUCED FROM INITIAL STABILIZED THE LONGISSIUMUS
DORSI MUSCLE OF WILD BOAR
Abstrakt. Dziczyzna ze względu na tradycyjne metody jej pozyskania i obróbki
wstępnej narażona jest na zaawansowane zmiany biochemiczne i mikrobiologiczne.
W przeprowadzonych badaniach podjęto próbę zwiększenia trwałości mięsa z dzika
poprzez wprowadzenie na powierzchnię przechowywanych mięśni substancji bakteriostatycznych. Celem pracy była ocena wpływu zastosowania czynników bakteriostatycznych podczas składowania mięśnia najdłuższego grzbietu dzików na właściwości fizykochemiczne i teksturę ogrzewanych, modelowych produktów mięsnych,
wyprodukowanych z tego surowca. Wykonano następujące analizy: wyciek termiczny,
zawartość suchej substancji, tłuszczu, zdolności utrzymywania wody i liczby TBA.
Ponadto oznaczono trwałość barwy oraz przeprowadzono badania profilu tekstury.
Zastosowanie substancji bioaktywnych na powierzchnię przechowywanych mięśni,
a także temperatury bliskiej krioskopowej skutkowało zachowaniem ich przydatności
do produkcji modelowych produktów mięsnych nawet po 28 dobach składowania.
Słowa kluczowe: dziczyzna, substancje bakteriostatyczne, przechowywanie chłodnicze, modelowe produkty mięsne
Summary. The game meat from traditional obtaining methods and pre-treatment to
advanced biochemical and microbiological changes is exposed. In studies the attempt
to increase the sustainability meat of wild boar by introducing bacteriostatic substance
on the surface stored muscles were investigated. The aim of this study was to evaluate
the impact of the application during the storage of muscles longissimus dorsi bacteriostatic agents on the physicochemical properties and texture profile analysis of model
meat products, produced from experimental materials. The drip loss, dry matter content, fat content, water holding capacity and the value of TBA was performed. Color
stability and texture profile analysis were determined. The use of bioactive substances
on the surface of storage muscles, and temperatures close cryoscopic point resulted
in preservation of their usefulness for the model meat products, production even after
28 days of storage.
Key words: venison, bacteriostatic substances, refrigerated storage, model meat products
193
Justyna Górecka
WSTĘP
Podczas podziału tusz zwierząt dzikich na elementy zasadnicze uzyskuje
się pewną ilość mięsa drobnego, które może być zagospodarowane m.in. do
produkcji kiełbas [Czerwińska 2010; Paleari i in. 2003]. Ze względu na warunki pozyskania i wstępnej obróbki dziczyzna jest surowcem specyficznym
[Hoffman i Wiklund 2006; Marchioni i Felicio 2003]. Jest on narażony na
szybką utratę świeżości, pogorszenie wyróżników sensorycznych, technologicznych, na zaawansowane zmiany biochemiczne i mikrobiologicznych,
a nawet dyskwalifikację całej lub części tuszy [Szmańko i Górecka 2009].
Metod pozyskiwania dziczyzny praktycznie zmienić nie można. Należy natomiast stworzyć warunki sprzyjające mniejszej dynamice niepożądanych
zmian, np. poprzez wykorzystanie czynników bakteriostatycznych w trakcie
przechowywania surowca.
Celem badań była ocena wpływu zastosowania czynników bakteriostatycznych podczas składowania mięśnia najdłuższego grzbietu dzików na właściwości fizykochemiczne i teksturę modelowych produktów mięsnych, wyprodukowanych z tego surowca.
MATERIAŁY I METODY
Materiałem doświadczalnym były modelowe, mięsne przetwory homogenizowane wyprodukowane w warunkach laboratoryjnych z mięśnia najdłuższego grzbietu dzików, wstępnie utrwalonych eksperymentalnymi substancjami biologicznie aktywnymi wyizolowanych z jaj, przechowywanych
w temp. 3±1ºC lub -3±1°C, przez 0, 14, 21 i 28 dób. Surowiec pochodzący od
15. osobników o masie tusz w skórze około 70-90 kg, pozyskanych w lasach
północno-zachodniej Polski zakupiono w zakładzie przetwórstwa dziczyzny.
Zastosowano następujące substancje bakteriostatyczne: techniczny preparat inhibitorowo-lizozymowy, preparat lizozymu oraz preparat cystatyny. Charakterystyka tych substancji obejmowała oznaczenie: inhibującej aktywności cystatyny
wobec papainy [Siewiński 1991] oraz aktywności lizozymu metodą spektrofotometryczną [Canfield 1963]. Substancje bioaktywne na powierzchnię mięśni
nanoszono w sposób gwarantujący równomierne ich rozprowadzenie, a także
uniemożliwiający wystąpienie krzyżowego zakażenia mikrobiologicznego prób
(metoda będzie przedmiotem patentowania).
Po eksperymentalnym okresie przechowywania mięso z poszczególnych grup
doświadczalnych rozdrabniano, następnie homogenizowano z dodatkiem: 15%
wody, 2% peklosoli, 0,2% polifosforanów oraz 0,03% askorbinianu sodu. Tak
przygotowanym farszem napełniano polipropylenowy pojemniki, o średnicy
30 mm. Próby ogrzewano w temp. 85ºC do temp. 72ºC w centrum geometrycznym batonów, następnie schładzano w temp. 2ºC przez 24 godz.
194
L1
5
L2
6
L3
7
C
8
MS
9
CHŁ
10
KRIO
Aktywność właściwa
lizozymu [j/mg białka]
4
Aktywność właściwa
cystatyny [j/mg białka]
T3
938,00
-
6390,00
5,40 x 10-6
202,20
-
3,24 x 10-3
-
-
Chłodnicze przechowywanie
-
-
-
Przechowywanie w temperaturze
bliskiej krioskopowej
-
-
-
Poziom preparatu
[g/cm2]
3
15,01
Cystatyna
Chłodnicze przechowywanie
T2
Ekstrakt rozmarynu:
3,24 x 10-4 g/cm2
2
4,05 x 10-4
Mleczan sodu:
1,62 x 10-3 g/cm2
T1
Lizozym
Skrót grupy
1
Grupa doświadczalna
Techniczny
preparat
inhibitorowolizozymowy
Lp.
Właściwości fizykochemiczne modelowych produktów mięsnych...
Mleczan sodu
6,08 x 10-4
8,11 x 10-4
1,08 x 10-4
1,62 x 10-4
2,16 x 10-4
Tab. 1. Charakterystyka zastosowanych czynników bakteriostatycznych
Badania fizykochemiczne modelowych przetworów mięsnych obejmowały oznaczenie zawartości: suchej substancji i wody wg PN ISO 1442:2000,
tłuszczu wg PN ISO 1444:2001, kwasowości czynnej badanej bezpośrednio
w przetworach [PN ISO 2917:2000] oraz zdolności utrzymywania wody wg
Grau-Hamma w modyfikacji Szmańko [1987]. Przebieg zmian o charakterze
oksydacyjnym został określony poprzez oznaczenie zawartości aldehydu malonowego [Mei i in. 1998].
Oznaczenie parametrów tekstury wykonywano przy pomocy urządzenia do
badań wytrzymałościowych firmy Zwick/Roell, typ Z010. Próbki w kształcie
walca, o średnicy 27 mm i wysokości 15 mm, poddawano testom dwukrotnego ściskania przy 70% deformacji niszczącej (czas relaksacji międzykompresyjnej wynosił 30 sek.), prędkość przesuwu głowicy ściskającej ustalono na
60 mm/min. [Bourne 1982]. Analizowano następujące parametry profilu tekstury: twardość [N], żuwalność [Nm], sprężystość [mm] oraz spoistość [-].
195
Justyna Górecka
Pomiar barwy modelowych wyrobów mięsnych przeprowadzono w systemie
CIELab przy zastosowaniu kolorymetru odbiciowego MINOLTA CR 200b.
Trwałość barwy została ustalona na podstawie zmian parametrów L*a*b*
barwy [Hunter i Harold 1987] zapakowanych próżniowo plastrów modelowych produktów mięsnych po 3, 6, 12 i 24 godzinach ekspozycji na działanie
światła białego o natężeniu 250 lx. Stabilność barwy modelowych przetworów
obliczano wg następującego wzoru:
ΔEx (oznacza ΔE3 lub ΔE6 lub ΔE12 lub ΔE24) - stabilność barwy modelowych
produktów mięsnych po 3, 6, 12 lub 24 godzinach ekspozycji na działania
światła białego o natężeniu 250 lx. L*0, a*0, b*0 - wartości parametrów barwy L*, a*, b* modelowych produktów mięsnych niepoddanych na działanie
światła białego. L*x, a*x, b*x - wartości parametrów barwy L*, a*, b* modelowych produktów mięsnych po 3, 6, 12 lub 24 godzinach ekspozycji na
działanie światła białego o natężeniu 250 lx.
Wyniki badań poddano dwuczynnikowej analizie wariancji przy przedziale ufności 95%. O zmienności poszczególnych parametrów wnioskowano
w oparciu o test Duncana przy wykorzystaniu programu STATISICA 9.0.
Analiza statystyczna obejmowała wyliczenie: wartości średnich, odchyleń
standardowych i najmniejszych istotnych różnic (NIR).
WYNIKI I DYSKUSJA
Zawartość suchej substancji oraz tłuszczu w modelowych produktach mięsnych skorelowana była z zawartością tych składników w mięśniu najdłuższym grzbietu dzików. W miarę upływu czasu przechowywania surowca
użytego do produkcji modelowych przetworów poszczególnych grup doświadczalnych obserwowano statystycznie istotny wzrost zawartości suchej
substancji w doświadczalnych produktach z 24,31% do 30,58%, natomiast
ilość tłuszczu zmieniała się w zakresie od 0,67% do 3,94%.
W miarę upływu czasu przechowywania we wszystkich grupach eksperymentalnych zaobserwowano statystycznie istoty wzrost wycieku termicznego. Modelowe, ogrzewane przetwory mięsne wytwarzane z surowca przechowywanego w temperaturze bliskiej krioskopowej (-3ºC), w porównaniu
z wyrobami wyprodukowanymi z mięśni utrwalonych preparatem lizozymu,
niezależnie od ilości zastosowania tej substancji, charakteryzowały się dwukrotnie mniejszymi ubytkami podczas obróbki cieplnej. Po 28. dobach przechowywania dla grupy KRIO wyciek ten wynosił 8,88%, natomiast dla L3
- 18,76% (Tab. 2).
196
8,79B
0,45
0,45
0,67
0,79
1,52
0,45
0,65
0,84
0,47
0,40
3,84
3,84
3,84
x
54,19bB
3,84
53,32bB
3,84
58,32cC
3,84
53,43bC
3,84
58,30cC
3,84
56,83cC
3,84
52,94bB
3,84
50,13aA
sd
49,39aA
x
53,09B
0,60
53,09B
0,96
53,09B
1,08
53,09C
0,99
53,09A
1,16
53,09B
0,96
53,09B
0,75
53,09B
sd
53,09B
x
8,88aB
0,66
13,62bD
1,53
15,73cD
0,78
14,89bcD
0,42
18,76eD
0,65
17,71dC
0,88
17,10dD
0,81
14,10bC
sd
16,55dD
x
5,43aA
1,18
11,14bC
0,75
13,08cC
0,66
12,05bC
0,52
12,66bC
0,69
12,62bB
0,62
15,13dC
0,66
11,51bB
0,48
11,74bC
sd
12,52bB
x
5,13aA
8,79B
0,45
7,89bA
8,79A
0,45
11,00cB
8,79A
0,45
10,29cB
8,79A
0,45
10,95cB
0,45
7,95bA
0,45
11,77cB
0,45
11,52cB
0,45
10,56cB
sd
8,89bA
8,79A
KRIO
8,79A
CHŁ
8,79A
MS
8,79A
C
sd
2,80
2,67
2,64
4,24
3,32
3,55
2,66
2,83
3,09
4,17
48,97aA
53,88cB
3,48
1,50
3,00
2,56
x
51,14cA
53,23cB
4,21
46,89abA
50,13bB
2,96
50,01cA
52,86cA
3,85
45,78abA
49,81aA
3,59
51,37cA
52,31cB
3,42
47,70bA
49,47aA
3,06
44,74aA
48,73aA
sd
49,88cA
x
47,25bA
28
L3
x
14
21
L2
53,58cB
Zdolność utrzymywania wody [%], n=15
0
L1
13,79bC
28
T3
53,09B
21
T2
53,11bB
14
T1
51,15cA
Wyciek termiczny [%], n=5
0
Warianty doświadczalne
8,79A
Okres
przechowywania [doby]
Wyróżnik
sd
3,60
2,67
3,11
2,87
2,93
3,03
2,81
3,63
3,27
2,72
Tab. 2. Wyciek termiczny oraz zdolność utrzymywania wody modelowych produktów
mięsnych [%].x - średnie wartości w poszczególnych grupach; sd –odchylenie standardowe. a, b, c… - średnie wartości w tych samych wierszach oznaczone różnymi małymi
literami różnią się istotnie przy p≤0,05. A, B, C… - średnie wartości w poszczególnych
kolumnach oznaczone różnymi dużymi literami różnią się istotnie przy p≤0,05
197
Justyna Górecka
Największą zdolnością utrzymywania wody cechowały się próby wytwarzane z mięsa stabilizowanego wyłącznie mleczanem sodu oraz modelowe
wyroby wyprodukowane z surowca składowanego w temperaturze bliskiej
krioskopowej (Tab. 2). Wysokie wartości omawianego wyróżnika stwierdzono także w przypadku grup T1 oraz L3, które po 28. dobach przechowywania
kształtowały się odpowiednio na poziomie: 51,15% i 51,37%.
46,62aB
1,25
37,44aAB
2,98
37,10abAB
0,96
33,32A
KRIO
1,40
33,32A
0,96
39,78bcB
44,75aC
1,21
1,62
62,82cC
1,55
41,22abB
1,55
33,32A
0,96
53,85eB
43,19aC
1,63
1,81
57,29bD
1,75
62,59eC
1,70
33,32A
0,96
34,55aA
1,04
60,76bD
0,91
37,61aB
56,55bC
0,95
1,90
33,32A
0,96
42,66cB
1,07
1,42
44,49aD
1,82
2,11
1,35
48,97bcC
33,32A
0,96
46,41dB
2,12
CHŁ
46,70aC
57,90dC
MS
1,90
0,80
33,32A
0,96
48,51dB
2,45
C
1,16
50,47cB
L3
sd
28
1,38
33,32A
0,96
38,12bB
1,19
33,32A
0,96
41,65cB
33,32A
L2
x
sd
198
L1
47,55aC
21
41,49abB
x
1,17
sd
T3
2,55
Twardość [N]
14
T2
43,11bB
x
0,96
sd
T1
41,66bC
x
0
Warianty doświadczalne
1,02
Okres
przechowywania [doby]
41,48abB
Wyróżnik
Wstępne utrwalanie mięśnia najdłuższego grzbietu dzików preparatem lizozymu, niezależnie od poziomu zastosowania tej substancji biologicznie aktywnej, skutkowało statystycznie istotnie większymi wartościami twardości
i żujności modelowych wyrobów mięsnych, w porównaniu z produktami pozostałych grup doświadczalnych (Tab. 3). Analizując zmienność wyników
parametrów profilu tekstury doświadczalnych produktów mięsnych zaobserwowano, że największą twardością odznaczały się wyroby wytworzone
z mięśni stabilizowanych wyłącznie mleczanem sodu, po 14 i 28 dobach przechowywania, wynosiła ona odpowiednio: 53,85 i 62,82 N. Twardość innych
grup eksperymentalnych zmieniała się w zakresie od 34,55 N do 47,55 N.
0,01
0,74aA
0,78aB
0,79aB
0,76aAB
0,78aB
0,82cC
0,78aB
0,76aAB
sd
0,03
0,00
0,03
0,03
0,06
0,03
0,01
0,01
0,03
0,02
0,02
0,01
21
0,02
x
0,03
0,76aA
0,82bcC
0,82bC
0,79aB
0,81bC
0,78aB
sd
0,82bC
0,81aA
0,80bA
0,03
0,84bcB
0,81bA
0,84bB
0,84bB
0,83bB
0,81bA
0,02
0,02
0,01
0,02
0,03
0,01
14
0,02
x
0,82C
sd
0,81bcA
0,83c
0,83c
0,08
0,08
0,83c
0,83b
0,08
0,08
0,83b
0,83b
0,83b
0,83b
0,83c
0,08
0,08
0,08
0,08
0,08
x
0,02
sd
0,79bB
26,25bcC
28,53cdC
0,89
1,56
30,97dcB
22,27aB
0,49
2,77
36,86eC
34,02eB
34,65eC
25,76bcB
23,99abA
2,07
0,57
1,32
1,81
1,47
x
23,30abA
0,87
1,14
1,03
1,48
1,22
1,10
1,21
0,84
1,27
1,61
sd
1,90
23,95cAB
23,96cA
32,68cB
19,28aA
32,90eB
33,03eB
30,49dB
21,33abA
23,40bcA
22,79bcA
x
0,83a
20,22bA
0,63
1,26
20,97bA
22,98cA
15,24aA
0,94
1,87
27,24eA
25,20dA
27,55eA
20,84bA
22,40bcA
21,55bcA
1,33
1,38
2,49
1,22
0,73
1,26
sd
0,03
0,03
28
x
0,74aA
sd
0,03
0
x
0,08
2,64
2,64
2,64
2,64
2,64
2,64
2,64
2,64
2,64
2,64
sd
0,84aB
26,27B
26,27AB
26,27C
26,27C
26,27A
26,27A
26,27A
26,27B
26,27B
26,27B
x
0,03
0
0,80aBC
28
0,03
21
0,72bA
Żuwalność [Nm]
14
0,03
Spoistość [-]
199
0,94c
0,03
0,79bC
0,02
0,78bC
0,76aD
0,02
0,02
0,94c
0,78bC
0,77bC
0,68aB
0,02
0,01
0,02
0,03
0,94b
0,76aA
0,77aC
0,76aD
0,02
0,05
0,02
0,03
0,94c
0,75bA
0,77bC
0,68aB
0,03
0,02
0,04
0,03
0,94b
0,03
0,76aA
0,01
0,73aC
0,01
0,78aC
0,73aC
0,03
28
0,05
0,94b
0,03
0,77aB
0,01
0,77aD
0,01
0,76aC
0,02
0,63aA
0,04
sd
0,01
0,94b
0,03
0,79aC
0,02
0,01
0,67aB
sd
0,02
0,78aC
0,03
0,77bB
0,02
0,03
0,78bC
0,02
0,78bC
0,01
x
0,67aB
0,71bA
x
21
0,74bB
sd
0,02
x
0,74bB
14
0,02
Sprężystość [mm]
sd
0,03
0
0,01
0,94c
0,94c
x
0,94c
Justyna Górecka
Tab. 3. Parametry profilu tekstury modelowych produktów mięsnych, n=10.
Oznaczenia jak w Tab. 2
Najmniejsze wartości żujności oznaczono w próbach stabilizowanych technicznym preparatem inhibitorowo - lizozymowym oraz preparatem cystatyny (Tab. 3). Zauważono, że najmniejszą spoistością po 28. dobach przechowywania charakteryzowały się wyroby wytwarzane z surowca utrwalonego
technicznym preparatem inhibitorowo - lizozymowym (T1 - 0,72, T2 i T3
- 0,74), natomiast najwyższą wartość tego wyróżnika stwierdzono dla mięsnych produktów modelowych wyprodukowanych z mięśni stabilizowanych
mleczanem sodu (0,84). Modelowe przetwory wykonane z surowca utrwalonego preparatem lizozymu, po 28. dobach przechowywania, cechowały się
wyższymi wartościami sprężystości (L1 - 0,77 mm, L2 i L3 - 0,73 mm), podobnie jak produkty wytworzone z surowca utrwalonego wyłącznie mleczanem sodu oraz mięśni składowanych w temperaturze bliskiej krioskopowej
(0,76 mm).
Podobną tendencję w kształtowaniu się wartości parametrów tekstury przeprowadzonych na wędlinach średnio rozdrobnionych, składowanych w temp.
3ºC i -3ºC, odnotowano w innych badaniach własnych [Górecka i in. 2011a
i 2011b].
200
Zaobserwowano, że modelowe wyroby mięsne wyprodukowane z surowca
utrwalonego preparatem lizozymu oraz mleczanem sodu poddane działaniu
światła białego o natężaniu 250 lx charakteryzowały się mniejszą trwałością
barwy w porównaniu próbami pozostałych grup eksperymentalnych. Modelowe przetwory wytworzone z surowca wstępnie stabilizowanego ekstraktem
rozmarynu, w porównaniu z innymi próbami, nietraktowanymi tą substancją, cechowały się ciemniejszą barwą, co potwierdza wyniki badań Yu i wsp.
[2002]. Czas przechowywania miał istotny wpływ na trwałość barwy modelowych produktów mięsnych.
Jednym ze wskaźników stopnia zaawansowania procesów oksydacji frakcji lipidowej w produktach żywnościowych jest poziom zawartości aldehydu malonowego. Najmniejsza zawartość produktów reagujących z kwasem
2-tiobarbiturowym została oznaczona w modelowych produktach mięsnych
wyprodukowanych z mięśni przechowywanych w stanie głębokiego schłodzenia oraz utrwalonych mleczanem sodu (0,10 µg MDA/g produktu). Największą natomiast dynamikę utleniania lipidów zaobserwowano w próbach
z mięśni stabilizowanych technicznym preparatem inhibitorowo-lizozymowym w ilości 4,05 x 10-4 g/cm2 (0,16 µg MDA/g produktu).
WNIOSKI
• Modelowe produkty mięsne wyprodukowane z mięśnia najdłuższego
grzbietu dzików przechowywanych w temperaturze bliskiej krioskopowej (-3ºC), w porównaniu z wyrobami pozostałych grup eksperymentalnych, charakteryzowały się mniejszym wyciekiem termicznym i większą
zdolnością utrzymywania wody.
• Najmniejszą trwałością barwy charakteryzowały się modelowe wyroby
mięsne, do produkcji których użyto mięśnia najdłuższego grzbietu dzików wstępne utrwalonych preparatem lizozymu oraz stabilizowanych
wyłącznie mleczanem sodu.
• Stwierdzono wpływ czasu składowania surowca, niezależnie od zastosowanych na powierzchnię mięśnia najdłuższego grzbietu dzików substancji bakteriostatycznych, oraz warunków przechowywania na wzrost twardości i żujności, a także obniżenie spoistości i sprężystości modelowych
produktów mięsnych.
• Zastosowanie eksperymentalnych substancji biologicznie aktywnych na
powierzchnię mięśnia najdłuższego grzbietu dzików, a także składowanie
ich w temperaturze bliskiej krioskopowej skutkowało zachowaniem ich
technologicznej przydatności do 28 doby przechowywania.
201
Justyna Górecka
LITERATURA
Bourne M. 1982. Food texture and viscosity: Concept and measurement. Academic
Press, New York.
Canfield R.E. 1963. The amino acid sequence of egg white lysozyme. J. Biol. Chem.
238, 2698-2707.
Czerwińka D. 2010. Wykorzystanie dziczyzny w przetwórstwie mięsa. Gospodarka
Mięsna: 1, 10-12.
Górecka J. Szmańko T., Bilyk O., Kęsy Z., Świątkowski G. 2011a Sensory and rheological properties of the grill sausages, packed in vacuum or modified atmosphere
and cool storage or at near cryoscopic temperature. Product Development &
Quality Assurance. Wrocław, 126-143.
Górecka J., Szmańko T., Wereszczyński J. 2011b. Jakość kiełbas homogenizowanych
przechowywanych w temperaturze bliskiej krioskopowej. Zeszyt Naukowy Lwowskiego Narodowego Uniwersytetu Medycyny Weterynaryjnej i Biotechnologii im.
Grzyckiego we Lwowie, 13, 4 (50), 154-162.
Hoffman LC, Wiklund E. 2006. Game and vinison – meat for the modern consumer.
Meat Science, 74, 197-208.
Hunter R.S., Harold R.W. Eds. 1987. The measurement of appearance. Sec. Ed.
A Wiley-Interscience Publication John Wiley & Sons., New York
Marchiori A., Felicio P. 2003. Quality of wild boar meat and commercial pork. Scientia Agricola 60, 1, 1-5.
Mei L., Cromwell G.L., Crum A.D., Decker E.A. 1998. Influence of dietary β-alanine and
histidine on the oxidaive stability of pork. Meat Science, 49, 55-64.
Paleari M.A., Moretti M.V., Berenta T.M., Mentasti T, Bersami C. 2003. Credit products from different animal species. Meat Science. 63, 485-489.
PN ISO 1442. 2000. Mięso i przetwory mięsne. Oznaczanie zawartości wody (metoda
odwoławcza).
PN ISO 1444. 2001. Mięso i przetwory mięsne. Oznaczanie zawartości tłuszczu.
PN-ISO 2917:2000. Mięso i przetwory mięsne. Pomiar pH. Metoda odwoławcza.
Siewiński M. 1991. Method of purification of thiol proteinase inhibitors from human
urine. Cancer Biochemistry Biophysics, 12, 33-44.
Szmańko T. 1986. Urządzenie do pomiaru zdolności utrzymania wody. Wzór użytkowy nr 40767. Urząd Patentowy PRL Warszawa.
202
Szmańko T., Górecka J. 2009. Uwarunkowania sanitarne jakości dziczyzny. Prace Instytutu Zarządzania i Inżynierii Rolnej PWSZ w Sulechowie: 3, 85-90.
Yu L., Scanlin J., Schmidt G. 2002. Rosemary extracts as inhibitor soft lipid oxidation
and colour change in cooked turkey products during refrigerated storage. J. Food
Sci, 67, 582-585.
Justyna Górecka
Katedra Technologii Surowców Zwierzęcych i Zarządzania Jakością
Wydział Nauk o Żywności
ul. Norwida 25, 50-375 Wrocław
Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Tadeusz Szmańko
Badania wykonano w ramach realizacji projektu nr POIG.01.03.01-00-133/08pt. „Innowacyjne technologie produkcji biopreparatów na bazie nowej generacji
jaj (OVOCURA)”. Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego realizowany w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka 2007-2013.
203
Dorota Kowalewska
EPISTEME
14/2012
s.205-214
ISSN 1895-4421
WPŁYW KULTURY STARTOWEJ NA PROCESY LIPOLIZY W SERACH
MIĘKKICH Z MLEKA KROWIEGO
IMPACT OF THE START CULTURE ON THE LIPOLYSIS PROCESSES
IN COW MILK SOFT CHEESES
Abstrakt. Celem pracy było określenie wpływu stosowanej kultury startowej na procesy lipolizy w serach miękkich. Sery wyprodukowano z mleka krowiego w laboratorium w skali półtechnicznej. Używano dwie kultury startowe: termofilną i mezofilną. Sery przechowywano w temperaturze 4°C przez okres 7 i 14 dni. W serach
świeżych oznaczono skład podstawowy (zawartość wody, białka, tłuszczu, soli) oraz
profil kwasów tłuszczowych. W serach świeżych i przechowywanych oznaczono pH,
wolne grupy aminowe a celem określenia przemian lipolitycznych frakcji tłuszczowej badanych serów dokonano analizy zawartości wolnych kwasów tłuszczowych.
Rodzaj zakwasu wywarł wysoko istotny wpływ na zawartość białka i związków azotowych rozpuszczalnych. Zawartość wody była wyższa w serach wyprodukowanych
przy użyciu zakwasu termofilnego. Rodzaj stosowanej kultury startowej wpłynął na
ilość uwalnianych kwasów tłuszczowych. W serach wyprodukowanych przy użyciu
zakwasu mezofilnego stwierdzono istotnie mniej wolnego kwasu masłowego a więcej
palmitynowego, oleinowego i linolowego.
Słowa kluczowe: mleko krowie, sery miękkie, kwasy tłuszczowe, lipoliza
Summary. The purpose of the thesis was to determine the impact of the used start culture on the lipolysis processes in soft cheeses. The cheeses were made from cow milk
in a laboratory, in half-technical scale. Two start cultures were used: thermophilic and
mesophilic. The cheeses were stored in the temperature of 4°C for the period of 7 and
14 days. Both in milk and in fresh cheeses basic composition was marked (content of
water, protein, fat and salt) and, both in fresh cheeses and during storage, pH, content
of soluble nitric compounds and free amino groups were marked. Also, the profile of
fatty acids was marked and, in order to determine lipolytic changes of the fatty fraction of the tested cheeses, the analysis of the contents of free fatty acids was carried
out. The kind of the starter made a highly significant impact on the content of protein
and soluble nitric compounds. The content of water was higher in the cheeses made
with the use of thermophilic starter. The kind of the used start culture influenced the
amount of the released fatty acids. In the cheeses made with the use of mesophilic
starter, claimed was the significantly higher share of caproic acid, as well as significantly more free acid: butyric acid, cetylic acid, oleic acid and linolic acid.
Key words: cow milk, soft cheeses, fatty acids, lipolysis
205
Dorota Kowalewska
WSTĘP
Tłuszcz mlekowy stanowi 20-60% s.m. sera, odgrywa istotna role w formowaniu smaku i zapachu a także jest odpowiedzialny za konsystencję sera
[Cichosz 1997]. Procesy hydrolizy tłuszczu mlekowego mają miejsce w kolejnych etapach pozyskiwania i przerobu mleka oraz w trakcie dojrzewania
sera. Lipoliza jest nieunikniona ze względu na obecność endogennych lipaz
mlekowych oraz enzymów bakteryjnych ale także jest oczekiwana przez
konsumentów, bo miedzy innymi dzięki lipolizie w procesie dojrzewania
sery podpuszczkowe dojrzewające nabierają smaku i odpowiedniej tekstury.
W serach miękkich niedojrzewających przemiany te są znacznie mniejsze
i zachodzą głównie podczas procesu technologicznego, tym niemniej mogą
mieć wpływ na cechy organoleptyczne i trwałość tego rodzaju serów. W produkcji rzemieślniczej prowadzono badania nad zastosowaniem kultur termofilnych do wyrobu serów miękkich, lecz nie oceniano wpływu tej szczepionki na zakres lipolizy. Z uwagi na to celem badań było określenie wpływu
rodzaju kultury startowej na proces lipolizy i parametry jakościowe serów
miękkich niedojrzewających.
MATERIAŁ I METODY
Materiałem do badań było mleko od krów rasy fryzyjskiej pochodzące
z Rodzinnego Gospodarstwa Ekologicznego ,,Figa” w Mszanie. Po przewiezieniu w warunkach chłodniczych do laboratorium, mleko zostało poddane
odpowiednim analizom chemicznym a następnie dalszemu przerobowi. Po
normalizacji mleka do zawartości tłuszczu 2,9% mleko poddano pasteryzacji
w temp. 72 °C przez 15 s a następnie szybko ochłodzono do temp. 32 ±1°C.
Mleko podzielono na dwie części: do jednej dodano 1,5% zakwasu mezofilnego CH-N-19, do drugiej 1,5% zakwasu termofilnego YoFlex. Dodano roztwór podpuszczki w takiej ilości aby uzyskać skrzep po 1,5h. Po uzyskaniu
odpowiednią zwięzłości skrzepu krojono go na sześciany o bokach 2 cm. Po
30 minutach napełniano nim formy, które pozostawiono do odcieknięcia na
24 godziny. Podczas ociekania serów odwracano co 4 godziny. Po wyjęciu
z form sery solono w solance o zawartości soli 16% i pH około 5,1 w temperaturze 16-18°C przez 15-20 minut. Po obeschnięciu serów, pakowano je
w folię, analizowano następnego dnia i po przechowywaniu w temp. 4°C.
Produkcję i analizę serów wykonano w trzech seriach.
Zakres analiz. Analiza serów świeżych:
• Oznaczanie zawartości wody [PN-73/A-86232]
• Oznaczanie zawartości soli [PN-73/A-86232]
206
Wpływ kultury startowej na procesy lipolizy...
• Oznaczanie pH [PN-73/A-86232]
• Oznaczanie zawartości tłuszczu metodą Gerbera [PN- ISO 488: 2002].
• Oznaczanie zawartości związków azotowych ogółem [PN-ISO 6658:1998]
• Oznaczanie WKT metodą chromatografii gazowej [wg Huerta-Gonzales i Wilbey 2001]
• Profil kwasów tłuszczowych oznaczono przy użyciu chromatografu gazowego
(gaz nośny hel 40 psi) w kolumnie BPX 70 (60x0,22 mm), grubość fazy 0,25
µm. Analizy wykonywano w programie temperatury: 140°C (1 min)-1,5°C/min-210°C (5 min). Temperatura dozownika wynosila 220°C a detektora 240°C. Dozowanie dzielnikowe 100:1.
• Wolne grupy aminowe oznaczono wg metody z użyciem aldehydu ortodiftalowego OPA [Church i in. 1983]
• Oznaczenie zawartości związków azotowych rozpuszczalnych [PN-73 A-86232].
Analiza serów po 7 i 14 dniach przechowywania:
• Oznaczenie zawartości związków azotowych ogółem [PN-ISO 6658:1998]
• Oznaczenie WKT metodą chromatografii gazowej [wg Huerta-Gonzales i Wilbey 2001]
• Oznaczenie pH [PN-73/A-86232]
• Wolne grupy aminowe oznaczono wg metody z użyciem aldehydu ortodiftalowego OPA[wg Church i in. 1983]
• Oznaczenie zawartości związków azotowych rozpuszczalnych [PN-73 A-86232].
Analiza statystyczna. Doświadczenie wykonano w trzech powtórzeniach.
Uzyskane wyniki opracowano statystycznie przy zastosowaniu programu
Statistica 8.0 Przeprowadzono jedno i dwuczynnikową analizę wariancji
a istotność różnic pomiędzy średnimi oszacowano za pomocą testu Duncana.
WYNIKI I DYSKUSJA
Jednoczynnikowa analiza wariancji wykazała, że rodzaj zakwasu wywarł
wysokoistotny wpływ na zawartość wody, białka i związków azotowych rozpuszczalnych. W serach wyprodukowanych z udziałem kultury termofilnej
stwierdzono wyższą zawartość wody (66,03% wobec 61,42%), zawartość
białka była więc niższa. Wynika to z faktu, że mikroflora zakwasu termofilnego wytwarza więcej polisacharydów w związku z tym trudniej zachodzi
synereza, co automatycznie wpływa na zawartość wody i tym samym skutkuje niższą zawartością białka (Tab. 1).
207
Dorota Kowalewska
RODZAJ KULTURY
WSKAŹNIK JAKOŚCI
MEZOFILNA
TERMOFILNA
Woda [%]
a
61,42 ±6,31
66,03a±2,70
Tłuszcz[%]
16,50 ±2,50
16,77±1,75
Sól [%]
1,11±0,52
0,89±0,25
pH
5,01±0,24
5,13±0,38
Białko [%]
16,57A±1,90
11,28A±0,30
Związki azotowe rozpuszczalne w % N ogółem
3,61A± 0,14
4,94A± 0,45
Wolne grupy aminowe [µmol/g]
6,25±0,87
6,61±1,51
Tab. 1. Wartości średnie i odchylenia standardowe parametrów
jakościowych serów miękkich
A-stwierdzona statystycznie wysoko istotna różnica miedzy średnimi oznaczonymi tymi samymi literami w wierszach a- stwierdzona statystycznie istotna różnica
miedzy średnimi oznaczonymi tymi samymi literami w wierszach. Sery to produkty zawierające dużą ilość białka . Jego zawartość zależy od rodzaju i typu sera
a więc od zawartości w nich wody, tłuszczu i soli [Zmarlicki 1997]. Zawartość
białka w serach miękkich powinna zawierać się w przedziale pomiędzy 16-22%
[Pijanowski 1984, Renner 1993]. Sery z dodatkiem zakwasu mezofilnego zawierały 16,75% białka, natomiast z dodatkiem zakwasu termofilnego 11,28%. Wyższą
zawartość związków azotowych rozpuszczalnych stwierdzono w serach wyprodukowanych z uzyciem zakwasu termofilnego. Wynika to z większych właściwości proteolitycznych kultur termofilnych w porównaniu z kulturami mezofilnymi.
Zawartość tłuszczu w obu rodzajach sera była podobna. Analiza statystyczna nie
wykazała istotnego wpływu stosowanej kultury na kwasowość czynną.
RODZAJ KULTURY
Wskaźnik Jakościowy
Czas przechowywania [dni]
MEZOFILNA
TERMOFILNA
Kwasowość czynna, pH
1
7
14
5,01±0,24
4,81±0,16
4,80±0,01
5,13±0,38
4,76±0,13
4,49±0,20
Związki azotowe
rozpuszczalne % N ogółem
1
4,48 ± o,23
4,72 ± 0,25
7
4,97 ± 0,14
5,04± 0,35
14
1
7
14
5,78±5,78
5,97±0,32
6,15±0,09
6,29±0,25
5,57 ± 0,52
6,20±0,10
6,23±0,21
6,22±0,30
Wolne grupy aminowe
[µmol/g]
Tab. 2. Wartości średnie i odchylenia standardowe parametrów jakościowych serów
przechowywanych przez 14 dni w temp. 4°C
208
Z analizy statystycznej wynika, że rodzaj zakwasu nie wpłynął na badane
parametry, jednak dość znaczący wpływ wywarł czas przechowywania na
zmiany wyróżników jakościowych (Tab. 3). Kwasowość czynna serów z kulturą termofilną podczas przechowywania przez 14 dni w temp. 4°C w obniżyła się o 12,8% podczas gdy w przypadku kultury mezofilnej obniżyła się
tylko o 4,19% (Tab. 2). Ze względu na większe właściwości proteolityczne
kultury mezofilnej w temp. 4°C ilość związków azotowych rozpuszczalnych
wyrażonych w % N ogółem wzrosła w serach z kulturą mezofilną o 29%,
w przypadku kultury termofilnej tylko o 18%; podobnie w przypadku serów
z dodatkiem zakwasu mezofilnego zaobserwowano wzrost zawartości wolnych grup aminowych o 5,97% (Tab. 2).
WSKAŹNIK
JAKOŚCIOWY
RODZAJ KULTURY
CZAS
PRZECHOWYWANIA
MEZOFILNA
TERMOFILNA
1
7
14
pH
4,87
4,79
5,07aA
4,78a
4,65A
Azot rozpuszczalny w
% N ogółem
51,88
51,11
46,03A
50,01a
58,44Aa
Wolne grupy aminowe
[μmol/g]
6,13
6,22
6,09
6,19
6,25
Tab. 3. Średnie najmniejszych kwadratów parametrów jakościowych serów miękkich
z mleka krowiego
Tłuszcz
Profil kwasów tłuszczowych w serach był podobny (Tab. 4), niezależnie od
rodzaju użytego zakwasu, natomiast udział poszczególnych wolnych kwasów (WKT) był zróżnicowany (Tab. 5). Najwięcej w badanych produktach
znajdowało się kwasu palmitynowego 26%, oleinowego 22%, stearynowego
14-15% oraz mirystynowego około 10% (Tab. 3). Według Jansena [cytat za
Cichosz 2007] w tłuszczu mleka krowiego jest około 400 kwasów tłuszczowych, wiele z nich występuje w nieznacznych stężeniach. Według Żegarskiej [1998] wszystkie rodzaje tłuszczu zawierają w swym składzie najwięcej
kwasu palmitynowego, który także jest głównym kwasem nasyconym tłuszczu mlekowego; stanowi około 25-30% ogólnego składu kwasów tłuszczowych. Tłuszcz mlekowy zawiera około 30% kwasów monoenowych, głównie
oleinowego. Zawartość kwasu laurynowego i mirystynowego wynosi od około
13% (okres żywienia pastwiskowego) do około 16% (okres żywienia oborowego) [Ziajka 2008]. W serach wyprodukowanych z użyciem kultury mezofilnej
zwartość kwasu laurynowego i mirystynowego wyniosła 12,17% i była wyższa
niż w serach wyprodukowanym przy użyciu kultury termofilnej dla której wartości te wynosiły 11,46%.
209
Dorota Kowalewska
Kwasy Tłuszczowe
RODZAJ KULTURY
MEZOFILNA
TERMOFILNA
Kwas masłowy C 4:0
3,03±0,15
3,05±0,24
Kwas kapronowy C 6:0
2,0±0,09
1,84±0,14
Kwas kaprylowy C 8:0
1,05±0,05
0,95±0,08
Kwas kaprynowy C 10:0
2,26±0,05
2,05±0,12
Kwas oleokaprynowy C 10:1
0,19±0,01
0,17±0,02
Kwas laurynowy C 12:0
2,59±0,00
2,35±0,13
Kwas mirystynowy C 14:0
9,58±0,08
9,11±0,38
Kwas oleomirystynowy C 14:1
0,58±0,01
0,55±0,02
Kwas palmitynowy C 16:0
25,95±0,34
26,08±0,04
Kwas C 16:1n-9
0,32±0,00
0,30±0,01
Kwas C 16:1n-9
1,27±0,01
1,27±0,01
Kwas margarynowy C 17:0
0,86±0,01
0,90±0,01
Kwas oleomargaryn owy C 17:1
0,29±0,01
0,29±0,00
Kwas stearynowy C 18:0
13,99±0,02
14,55±0,63
Kwas oleinowy C 18:1n-9
21,59±0,10
22,04±0,34
Kwas wakcenowy C 18:1n-7
5,45±0,09
5,62±0,24
Kwas linolowy C 18:2n-6
1,88±0,01
1,92±0,06
Kwas C 18:3n-6
0,13±0,00
0,14±0,00
Kwas α- linolenowy C 18:3n-3
1,32±0,01
1,37±0,02
Sprzężony kwas linolenowy CLA
1,57±0,04
1,61±0,01
Kwas arachidowy C20:0
0,18±0,01
0,19±0,01
Kwas C20:1
0,11±0,00
0,10±0,00
Lotne C4-C10
8,53±0,35
8,06±0,6
Nienasycone
34,7±0,29
35,38±0,73
Jednonienasycone
31,37±0,27
31,95±0,65
Wielonienasycone
3,33±0,2
3,43±0,08
Nasycone
61,49±0,8
61,07±1,78
Tab. 4. Profil kwasów tłuszczowych w serach świeżych z mleka krowiego wyprodukowanych z dwoma rodzajami kultur startowych. (wartości średnie ±odchylenia standardowe)
210
Kwas tłuszczowy
4:0
6:0
8:0
10:0
12:0
14:0
16:0
18:0
18:1
18:2
RODZAJ KULTURY
Czas
przechowywania [dni]
MEZOFILNA
1
0,21±0,02
0,24±0,11
7
0,35±0,17
0,38±0,84
MEZOFILNA
14
0,18±0,13
1,44±0,74
1
5,49±2,51
6,10±0,71
7
10,57±9,06
17,31±1,50
14
6,09±10,31
35,24±10,32
1
0,59±0,36
0,44±0,74
7
0,89±0,79
0,58±0,19
14
0,41±0,34
0,53±0,34
1
1,60±0,85
1.04±0,19
7
2,34±2,30
1,14±0,36
14
1,00±0,96
0,76±0,26
1
2,12±0,96
1,58±0,29
7
2,62±2,49
1,49±0,43
14
1,38±0,46
1,08±0,21
1
5,39±1,86
14,18±0,81
7
5,80±5,19
3,47±1,13
14
3,87±1,18
2,00±0,78
1
16,81±5,37
13,31±1,49
7
17,58±12,48
9,81±2,90
14
28,98±19,16
7,32±0,87
1
7,09±2,42
5,76±0,2
7
5,93±4,52
4,21±0,92
14
10,47±7,02
3,51±0,92
1
14,70±6,19
10,36±1,97
7
12,91±9,19
8,23±2,75
14
18,54±11,42
4,45±0,91
1
0,77±0,26
0,43±0,54
7
0,75±0,60
0,49±0,83
14
0,78±0,35
0,15±0,21
Tab. 5. Procentowy udział wolnych kwasów tłuszczowych w serach miękkich z mleka
krowiego wyprodukowanych z użyciem dwóch kultur startowych i przechowywanych
przez 14 dni w temp. 4°C
211
Dorota Kowalewska
Porównując profil kwasów tłuszczowych w serach z zakwasem mezofilnym
i termofilnym stwierdzono istotne różnice w zawartości kwasu laurynowego,
którego poziom był wyższy w serach wyprodukowanych z dodatkiem kultury
mezofilnej. Przyczyna różnic może wynikać z innych szlaków metabolizowania kwasu laurynowego przez mikroflorę poszczególnych kultur startowych.
Natomiast w grupie kwasów wielonienasyconych stwierdzono wyższy ich poziom w serach wyprodukowanych z udziałem kultury termofilnej.
W serach wyprodukowanych z dodatkiem kultury mezofilnej w większości
przypadków stwierdzono przyrost udziału wszystkich wolnych kwasów po
7 dniach przechowywania, natomiast po 14 dniach wartości te uległy dość
znacznemu zmniejszeniu. Wyjątkiem jest kwas palmitynowy (C16:0) i linolowy (C18:2), których udział po 1, 7 i 14 dniach przechowywania uległ
wyraźnemu wzrostowi. W serach z zakwasem termofilnym po 7 i 14 dniach
przechowywania nastąpił wyraźny spadek udziału kwasu palmitynowego.
Natomiast udział kwasu linolowego po 7 dniach zwiększał się, ale po 14
dniach obserwowano zmniejszenie jego udziału (Tab.5).
Wyniki analizy statystycznej wskazują, że poza wolnym kwasem masłowym,
którego w serach wyprodukowanych z zastosowaniem kultury mezofilnej
było istotniej mniej, udział wolnych kwasów tłuszczowych takich jak palmitynowy, oleinowy i linolowy był istotnie większy w serach z tą kulturą.
Rodzaj WKT
RODZAJ KULTURY
CZASPRZECHOWYWANIA (dni)
MEZOFILNA
TERMOFILNA
1
7
14
4:0
0,25a
0,69a
0,22A
0,37b
0,81Ab
6:0
7,39a
19,56a
5,80A
13,94
20,67A
8:0
0,63
0,51
0,51
0,73
0,47
10:0
1,65
0,98
1,32
1,74
0,88
12:0
2,05
1,38
1,85
2,06
1,23
14:0
5,02
3,22
4,79
4,63
2,93
16:0
21,12a
10,15a
15,06
13,70
18,15
18:0
7,83
4,51
6,42
5,07
7,02
18:1
15,38a
7,68a
12,52
10,57
11,49
18:2
0,77a
0,34a
0,60
0,60
0,46
Tab. 6. Średnie najmniejszych kwadratów zawartości WKT w serach miękkich z mleka
krowiego wyprodukowanych z dwoma rodzajami kultur startowych. A-stwierdzona statystycznie wysoko istotna różnica miedzy średnimi oznaczonymi tymi samymi literami
w wierszach, a- stwierdzona statystycznie istotna różnica miedzy średnimi oznaczonymi tymi samymi literami w wierszach
212
WNIOSKI
• Sery wyprodukowane z kulturą mezofilną charakteryzują się wyższą zawartością białka i niższym poziomem związków azotowych rozpuszczalnych.
• W trakcie chłodniczego przechowywania serów wyprodukowanych
z użyciem kultury termofilnej zwiększa się udział wolnego kwasu masłowego i kapronowego a w przypadku użycia kultury mezofilnej zwiększa
się udział kwasu palmitynowego, oleinowego i linolowego.
• Użycie kultury termofilnej do produkcji serów miękkich skutkuje zwiększeniem w ich składzie zawartości wody.
LITERATURA
Cichosz G.,1997. Czynniki determinujące cechy sensoryczne serów dojrzewającychLipoliza Przegląd Mleczarski 10, 325-329.
Church F.C., Swaisgood H.E., Porter D.H., Catgnani G.L., 1983. Spectrophotometric
assai using o-phtaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins. Journal of Dairy Sci. 66, 1219-1227
Cichosz G.,2007. Prozdrowotne właściwości tłuszczu mlekowego. Przegląd Mleczarski 10, 4-6.
Huerta-Gonzales L., Wilbey R.A., 2001. Determination free fatty acids produced in
filled-milk emulsions as a result of the lipolytic activity of lactic acid bacteria.
Food Chemistry, 72, 301-307.
Pijanowski E., 1984. Zarys chemii i technologii mleczarstwa Tom I. PWRiL, Warszawa
Renner E., 1993. Nutritional aspects of cheese. Chemistry, Physics and Microbiology,
Volume 1.General Aspects P.F. Fox (Ed.), p.345—363. Elsevier Applied Science,
London and New York.
Ziajka s., 2008. Mleczarstwo. Tom I. Wydawnictwo Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego, Olsztyn.
Zmarlicki S., 1997: Ćwiczenia z analizy mleka i produktów mleczarskich. Skrypt
SGGW, Warszawa.
Żegarska Z.,1978. Tłuszcz mlekowy jako składnik diety człowieka. Przegląd Mleczarski 10, 369-371.
213
Dorota Kowalewska
Dorota Kowalewska
Katedra Przetwórstwa Produktów Zwierzęcych
Opiekun naukowy: dr hab. inż. Monika Wszołek
214
Karolina Królikowska
Sławomir Pietrzyk
Teresa Fortuna
EPISTEME
14/2012
s.215-222
ISSN 1895-4421
WPŁYW WYBRANYCH SKŁADNIKÓW MINERALNYCH NA
WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNE UTLENIONEJ SKROBI
KUKURYDZIANEJ
THE INFLUENCE OF SELECTED MINERALS ON
PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF OXIDISED MAIZE STARCH
Abstrakt. Celem pracy była ocena wpływu wybranych składników mineralnych na
właściwości fizykochemiczne skrobi utlenionych. Materiałem badawczym była skrobia kukurydziana utleniana chloranem(I) sodu, a następnie modyfikowana z jonami
metali: potasu, magnezu, miedzi i żelaza. W otrzymanych skrobiach modyfikowanych
określono: zawartość grup karboksylowych, karbonylowych, wbudowanych składników mineralnych, zdolność wiązania wody i rozpuszczalność w wodzie w temp. 60
i 80 oC, parametry barwy L*a*b*. Ponadto wyznaczono: lepkość graniczną, charakterystykę kleikowania oraz przeprowadzono test ekstruzji wstecznej. Na podstawie wyników stwierdzono, iż najlepiej wbudował się potas, a najgorzej magnez. Wbudowane
metale wpłynęły w większości przypadków na zwiększenie zdolności wiązania wody
i rozpuszczalności w wodzie uzyskanych skrobi. Modyfikacje z metalami wpłynęły
również na zmiany parametrów barwy i właściwości reologiczne otrzymanych skrobi.
Słowa kluczowe: skrobia kukurydziana utleniona, składniki mineralne
Summary. The aim of this study was to assess the influence of selected minerals on
physicochemical properties of oxidized starch. Maize starch was oxidized with sodium chlorate(I), and then modified with metal ions: potassium, magnesium, copper
and iron. In modified starches following analyses were conduced: the content of carboxyl and carbonyl groups, mineral elements, water-binding capacity and solubility in
water at 60 and 80 °C, and color parameters L*a*b*. Moreover there was determined:
intrinsic viscosity, gelatinization characteristics and back-extrusion test was performed. Potassium reacted with starch the most easily as compared to other elements. The
least reactive element in compared to the maize oxidized starch was magnesium. Metal
ions were received in most cases to increase the water binding capacity and water solubility of starch obtained. Modifications of the metals also contributed to changes in color
parameters and rheological properties of oxidized starch.
Key words: oxidized maize starch, minerals
215
WSTĘP
Wszechstronność oraz użyteczność skrobi wynika nie tylko z faktu, że jest
naturalnym i tanim surowcem, ale też ze względu na jej budowę i właściwości fizykochemiczne. Skrobia dzięki swojej specyficznej budowie łatwo
podlega reakcjom z różnymi substancjami chemicznymi. Proces utleniania
jest jednym z najpowszechniej stosowanych metod chemicznej modyfikacji
skrobi [Śmigielska i in. 2005]. Przez wiele lat skrobie utlenione ze względu
na swoje właściwości teksturotwórcze stosowane były jako składnik budyniów, kremów budyniowych, mieszanek ciast w proszku. Zawartość w skrobi
utlenionej oprócz grup hydroksylowych reaktywnych grup karboksylowych
i karbonylowych umożliwia wiązanie przez nią jonów metali. Dzięki temu
istnieje możliwość wykorzystywania skrobi jako nośnika składników mineralnych do wzbogacania żywności [Bączkowicz i in. 2010]. Celem niniejszej
pracy była ocena wpływu wybranych składników mineralnych na właściwości fizykochemiczne skrobi utlenionych.
MATERIAŁ BADAWCZY
Sporządzano 40 % zawiesinę wodną skrobi kukurydzianej (Cargill, Poland)
do której dodawano stopniowo wodnego roztworu NaOCl w ilości 20 gCl/
kg s.s. skrobi Modyfikację wykonano w temp. 20 ±2 °C, mieszając zawiesinę skrobi w środowisku alkalicznym (pH = 10,0) przez 50 min. Następnie
mieszaninę reakcyjną neutralizowano 1 M roztworem H2SO4 do pH = 7,0,
przemywano, suszono w temp. 20°C 48 godzin, rozdrabniano i przesiewano
przez sita mechaniczne [Forsell i in. 1997].
Skrobię utlenioną następnie modyfikowano z metalami: potasem, magnezem, miedzią i żelazem zgodnie z poniższą metodyką. 100 g skrobi mieszano
z 250 cm3 wody przez 5 minut i filtrowano. Następnie do skrobi dodano 200
cm3 roztworu z odpowiednim metalem (dla potasu - mieszaniny 1 % w/w
KCl i 0,05 M KOH w stosunku 1:1 i pH 12; dla magnezu - mieszaniny 1 %
w/w MgCl2 i nasyconego Mg(OH)2 w stosunku 1:1 i pH 8.5; dla miedzi – roztworu 3,96 % w/w CuSO4 dla żelaza - roztworu 1% w/w FeSO4) i mieszano
5 minut. Po tym czasie zawiesinę skrobi filtrowano i ponownie dodano 200
cm3 w/w roztworów i ponownie mieszano 5 minut. Czynność tą jeszcze raz
powtórzono. Następnie skrobię przemywano wodą destylowaną do zaniku
reakcji na chlorki (w przypadku skrobi modyfikowanej magnezem i potasem)
oraz do zaniku reakcji na siarczany (w przypadku skrobi modyfikowanej
z miedzią i żelazem), suszono 48 godzin i przesiewano. Efektywność procesów utleniania została sprawdzona poprzez wyznaczenie w skrobiach modyfikowanych zawartości grup karboksylowych [ISO 11214] i karbonylowych
[Whistler i in. 1967].
216
Wpływ wybranych skłądników mineralnych...
METODYKA BADAŃ
W celu wyznaczenia właściwości fizykochemicznych skrobi modyfikowanych oznaczono:
1. Zawartość wbudowanych składników mineralnych za pomocą atomowego spektroskopu absorpcyjnego (Avanta Sigma, GBC, Australia), wcześniej skrobię mineralizowano w mieszaninie stężonych kwasów azotowego(V) i siarkowego(VI) w temp. 250 °C;
2. Parametry barwy w systemie CIE L*a*b* (geometria pomiarowa d/8°,
illuminant D65, obserwator 10°) przy użyciu spektrofotometru Color 5i (X-Rite, USA). Bezwzględną różnicę barwy (DE) pomiędzy skrobią wyjściową, a skrobiami wzbogacanymi wyliczono według równania:
3. Zdolność wiązania wody i rozpuszczalność w wodzie w temp. 60 i 80 °C
zmodyfikowaną metodą Leach’a [Richter i in. 1968];
4. Lepkość graniczną w temp. 25 °C skrobi rozpuszczonej w 0,5
M KOH. Czas swobodnego opadania roztworu skrobi o stężeniach w zakresie 0,0006-0,01 g/cm3 był mierzony przy użyciu wiskozymetru kapilarnego Ubbelode (k=0,009631) z automatycznym systemem pomiaru czasu
ViscoClock (Schott Instruments, Niemcy). Na podstawie zależności ηsp/c
względem c wyznaczono lepkość graniczną stosując równanie Huggins’a:
ηsp/c = [η] + k’·[η]2·c, gdzie: ηsp – lepkość właściwa, c – stężenie [g/cm3], [η]
–lepkość graniczna [cm3/g], k’ – stała Huggins’a;
5. Charakterystykę kleikowania 5 % (w/w) zawiesin skrobiowych przy
użyciu Rapid Visco Analyser (Perten Instruments, Warriewood, Austarlia).
Próbki ogrzewano od temp. 50 °C do temp. 95 °C, przetrzymywano w temp.
95 °C przez 5 min., chłodzono do temp. 50 °C i na koniec przetrzymywane
w temp. 50 °C przez 5 min. Z wiskogramów odczytano: temperaturę kleikowania (Tp), lepkość maksymalną w czasie ogrzewania (PV), lepkość w temp.
95 °C (HPV), lepkość końcową w temp. 50 °C (FV), spadek lepkości przy
ogrzewaniu wartość: PV–HPV (BD), wzrost lepkości w trakcie chłodzenia
wartość: FV-HPV (SB);
6. Test ekstruzji wstecznej wykonano za pomocą teksturometru EZ Test-500N (Schimadzu, Japonia) używając jako elementu pomiarowego walca
o wysokości 3 mm i średnicy 30 mm. Do naczyńka pomiarowego o średnicy
wewnętrznej 32 mm, odważono 30 g żelu. Głębokość zanurzenia elementu
pomiarowego w próbce wynosiła 30 mm, a prędkość zanurzania – 10 mm/
min. Wyznaczono trzy wielkości: pracę wykonaną przez element pomiarowy P (N·mm), siłę maksymalną Fmax (N) oraz siłę średnią Fśr (N) potrzebną
do przeciśnięcia próbki przez szczelinę pomiędzy naczyńkiem, a elementem
217
pomiarowym. W celu określenia istotności różnic w badanych parametrach
zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji i test Tukeya na poziomie
istotności a=0,05.
WYNIKI I DYSKUSJA
Skrobia utleniona zawierała 0,036 ±0,004 % grup karboksylowych i 0,029
±0,004 % grup karbonylowych. Zawartość grup karboksylowych była mniejsza niż 1,1 %, więc mogą one być stosowane w przemyśle spożywczym
[Rozporządzenie Ministra Zdrowia 2010]. W Tab. 1 przedstawiono zawartości wbudowanych składników mineralnych w skrobiach utlenionych. Spośród zastosowanych do modyfikacji jonów metali najlepiej wbudował się
potas, którego zawartość po modyfikacji wynosiła 61,09 mg/100g. Najmniej
reaktywnym pierwiastkiem okazał się magnez którego zawartość w skrobi
wzbogacanej tymi jonami wynosiła 14,94 mg/100g. Zawartość pozostałych
dodanych pierwiastków (miedzi i żelaza) była na podobnym poziomie od 35,18
do 38,92 mg/100g. Lepsze wbudowanie potasu do skrobi utlenionych w porównaniu do pozostałych pierwiastków było spowodowane jego wartościowością.
Podobne wyniki uzyskali także inni badacze [Bączkowicz i in. 2010].
Skrobia
Potas
Magnez
[mg/100g s.s] [mg/100g s.s]
Miedź
Żelazo
[mg/100g s.s] [mg/100g s.s]
Utleniona
0,23 ±0,03
1,51 ±0,19
lod
lod
Utleniona i modyfikowana z K
61,09 ±5,10
lod
lod
lod
Utleniona i modyfikowana z Mg
lod
14,94 ±0,89
lod
lod
Utleniona i modyfikowana z Cu
lod
lod
35,18 ±0,65
lod
Utleniona i modyfikowana z Fe
lod
lod
lod
38,92 ±1,31
Tab. 1. Zawartość potasu, magnezu, miedzi i żelaza w modyfikowanej
skrobi kukurydzianej, lod- poniżej poziomu oznaczalności
W Tab. 2 przedstawiono wartości parametrów barwy. Stwierdzono, że największą jasnością (L*) charakteryzowały się skrobia niewzbogacona oraz
skrobia wzbogacona jonami magnezu, natomiast najmniejszą skrobia modyfikowana jonami żelaza. Przeprowadzone modyfikacje jonami miedzi i żelaza
istotnie wpłynęły na zmiany wartości parametrów a* i b*. W przypadku skrobi modyfikowanej jonami miedzi stwierdzono większy udział barwy zielonej
w porównaniu do pozostałych skrobi, natomiast modyfikacja jonami żelaza
wpłynęła na zwiększenie udziału barwy czerwonej. Wartości parametru b*
dla tych skrobi były również najwyższe. W przypadku skrobi kukurydzianej
modyfikowanej jonami żelaza wartość bezwzględnej różnicy barwy wynosiła powyżej 3,5, oznacza to, że obserwuje się wyraźne odchylenie barwy
w odniesieniu do wzorca.
218
Skrobia
Parametry barwy
ΔE
L*
a*
b*
Utleniona
94,68±0,09a
-0,49±0,03a
1,98±0,02a
wzorzec
94,06±0,08
-0,44±0,05a
1,80±0,05a
0,65
94,50±0,06a
-0,47±0,03a
1,71±0,03a
0,33
93,66±0,09
-1,22±0,02
2,15±0,06
1,27
90,83±0,16
0,56±0,08
9,51±0,21
8,52
Tab. 2. Parametry barwy modyfikowanej skrobi kukurydzianej.
Małymi literami oznaczono wartości w kolumnach nieróżniące się statystycznie
istotnie na poziomie α = 0,05
Rozpuszczalność i zdolność wiązania wody wszystkich skrobi wzrastała
wraz ze wzrostem temperatury oznaczania (Tab. 3). W temperaturze 60 oC
wartość powyższych parametrów wszystkich skrobi modyfikowanych jonami pierwiastków wzrastała względem skrobi niewzbogaconej. W temperaturze 80 oC jedynie skrobia wzbogacana w potas i miedź charakteryzowała się
większą rozpuszczalnością niż skrobia wyjściowa. Wzrost rozpuszczalności
skrobi modyfikowanych był spowodowany głównie depolimeryzacją amylozy która zaszła w trakcie modyfikacji skrobi z metalami. Analiza zdolności
wiązania wody w temperaturze 80 oC wykazała natomiast, że jedynie w skrobiach wzbogacanych jonami miedzi i żelaza zaobserwowano zmniejszenie
zdolności wiązania wody w odniesieniu do skrobi niewzbogacanej. Porównywalne wartości zdolności wiązania wody skrobi utlenionej kukurydzianej
uzyskali także inni autorzy [Wang i Wang 2003].
Skrobia
Rozpuszczalność [%]
Zdolność wiązania wody
[g/g s.s]
60 oC
80 oC
60 oC
80 oC
Utleniona
0,28±0,02
7,55±0,37a
1,43±0,08
10,20±0,70a
2,92±0,01
9,64±0,35b
3,32±0,10a
9,79±0,18ab
1,74±0,13a
8,04±0,32a
3,08±0,02a
10,24±0,25a
2,11±0,14
9,74±0,25b
3,03±0,20a
8,65±0,13b
1,44±0,07a
5,21±0,33
2,53±0,13
8,62±0,20b
Tab. 3. Rozpuszczalność w wodzie i zdolność wiązania wody modyfikowanych skrobi
kukurydzianych. Małymi literami znaczono wartości w kolumnach nieróżniące się
statystycznie istotnie na poziomie α = 0,05
219
Wartości lepkości granicznej są ściśle skorelowane z masą cząsteczkową
biopolimeru i pozwalają na ocenę wpływu procesów modyfikujących na degradację polimerów skrobiowych. Modyfikacje skrobi utlenionej z magnezem i potasem spowodowały obniżenie wartości lepkości granicznej (Rys.
1), natomiast pozostałe modyfikacje nie zmieniły wartości tego parametru
statystycznie istotnie. Zmniejszenie wartości lepkości granicznej preparatów
skrobi modyfikowanych związane było z częściową depolimeryzacją polimerów skrobiowych w zastosowanych warunkach modyfikacji i obniżeniem
masy cząsteczkowej.
NIR(α=0,05) = 4,36
200
Lepkość graniczna [mPa∙s]
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Utleniona
Utleniona z Utleniona z Utleniona z Utleniona z
K
Mg
Cu
Fe
Rys. 1. Wartości lepkości granicznej modyfikowanych skrobi kukurydzianych
Analizując przedstawione w Tab. 4 parametry charakterystyki kleikowania
stwierdzono występowanie różnic we właściwościach reologicznych pomiędzy badanymi skrobiami. Wzrost lepkości we wszystkich parametrach
kleikowania stwierdzono jedynie w skrobi utlenionej wzbogaconej jonami
żelaza. Skrobie wzbogacane w magnez i miedź natomiast miały mniejszą
lepkość we wszystkich punktach charakterystyki kleikowania niż skrobia
wyjściowa. Wzbogacanie skrobi utlenionej we wszystkie składniki mineralne spowodowało zmniejszenie stabilności reologicznej w trakcie ogrzewania
i przetrzymywania w temp. 95 °C, o czym świadczą wyższe wartości BD.
Zastosowane modyfikacje nie wpłynęły statystycznie istotnie na zmianę temperatury kleikowania, z wyjątkiem skrobi wzbogacanej w potas.
Zastosowane modyfikacje wpłynęły również na zmiany parametrów wyznaczanych za pomocą testu ekstruzji wstecznej (Tab. 5). Wzbogacanie skrobi
w jony żelaza wpłynęło na wzrost wszystkich wyznaczonych parametrów,
podobną tendencję zaobserwowano na podstawie analizy parametrów charakterystyki kleikowania. Pozostałe składniki mineralne natomiast obniżyły
wartości pracy i siły średniej. Niskie wartości oznaczonych parametrów dla
skrobi modyfikowanych obrazują, iż żele te były bardzo słabe co oznacza, że
charakteryzowały się teksturą tzw. „długą”.
220
SB
[mPas]
PT [°C]
264,7±2,1a
244,7±0,6
20,0±1,7a
268,0±11,4
28±4,0a
87,3±0,6a
Utleniona
i modyfikowana z K
272,3±7,5a
216,7±3,8a
55,7±3,8
245,3±2,1a
28,7±2,5a
72,5±1,1
Utleniona
i modyfikowana z Mg
242,7±10,4b
215,7±6,1a
27,0±4,4ab
228,0±7,5a
12,3±1,5
86,6±1,7a
Utleniona
i modyfikowana z Cu
236,3±3,1b
192,7±1,5
43,7±1,5
232,7±2,5a
40,0±1,0
85,4±0,9a
Utleniona
i modyfikowana z Fe
337,0±10,8
307,0±7,0
30,0±5,7b
335,3±11,2
28,3±4,5a
84,8±1,5a
FV
[mPas]
BD
[mPas]
Utleniona
Skrobia
PV
[mPas]
HPV
[mPas]
Tab. 4. Parametry charakterystyki kleikowania modyfikowanych skrobi kukurydzianych. Małymi literami znaczono wartości w kolumnach nieróżniące się statystycznie
istotnie na poziomie α = 0,05
Skrobia
P [N∙mm]
Fmax [N]
Fśr [N]
Utleniona
10,72±0,34
0,55±0,03a
0,36±0,01
8,94±0,32a
0,46±0,02
0,30±0,01a
8,76±0,11a
0,51±0,04a
0,29±0,01a
9,81±0,43
0,54±0,01a
0,32±0,02a
17,22±0,15
0,80±0,01
0,58±0,01
Tab. 5. Wartości pracy, średniej siły oraz siły maksymalnej uzyskane w wyniku testu
ekstruzji wstecznej skrobi kukurydzianych. Małymi literami oznaczono wartości
w kolumnach nieróżniące się statystycznie istotnie na poziomie α = 0,05
WNIOSKI
• Spośród zastosowanych do modyfikacji składników mineralnych najlepiej wbudował się potas, najgorzej magnez.
• Wbudowane metale wpłynęły zmianę zdolności wiązania wody i rozpuszczalności w wodzie oraz wartości lepkości granicznej uzyskanych skrobi.
Zmiany te były uzależnione od rodzaju wbudowanego pierwiastka.
• Wzbogacanie skrobi w jony żelaza wpłynęło na wzrost lepkości we
wszystkich parametrach kleikowania oraz wartości uzyskanych w wyniku testu ekstruzji wstecznej. Modyfikacja tym metalem w największym
stopniu wpłynęła na zmianę barwy skrobi.
221
LITERATURA
Bączkowicz M., Pietrzyk S., Gałkowska D., Rożnowski J., Tartanus I., Szkabar K. 2010.
Thermodynamic characteristic and susceptibility to retrogradation of starches modified
by incorporation of mineral elements. Proceedings of the international Conference on
Polysaccharides-Glycoscience. Prague 29.09-01.10, 173-177.
Hypochlorite oxidaForsell P., Hamunen A., Antio K., Suorti T., Poutanen K. 1995. ��
tion of barley and potato starch. Starch/Stärke, 47: 371-377.
der StärkecheRichter M., Augustat S., Schierbaum F. 1968. Ausgewählte Metoden ��
mie. VEB Fachbuchverlag, Leipzig.
Śmigielska H., Lewandowicz G., Walkowski A. 2005. Wpływ dodatku mikroelementów na właściwości użytkowe skrobi utlenionych. Folia Universitatis Agriculturae
Stetinensis, 246(4): 289-302.
Wang Y., Wang L. 2003. Physicochemical properties of common and waxy corn
starches oxidized by different levels of sodium hypochlorite. Carbohydrate
��
Polymers, 52: 207–217.
Whistler R. L. (red.), BeMiller E., Paschall E. F. 1967. Starch: Chemistry and Technology. Academic Press, New York, London.
PN-EN ISO 11214:2001. Modified starch. Determination of carboxyl group content
of oxidized starch.
Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 23 grudnia 2010 r. w sprawie specyfikacji i
kryteriów czystości substancji dodatkowych. Dz. U. 91. poz. 526.
mgr inż. Karolina Królikowska, dr inż. Sławomir Pietrzyk
Katedra Analizy i Oceny Jakości Żywności
Opiekun naukowy: prof. dr hab. Teresa Fortuna
Praca wykonana w ramach projektu finansowanego przez MNiSzW nr NN 312
438037
222
Krzysztof Kucharczyk
Monika Cioch
EPISTEME
14/2012
s.223-230
ISSN 1895-4421
WPŁYW TEMPERATURY FERMENTACJI BRZECZKI PIWNEJ NA
PROFIL WYBRANYCH ZWIĄZKÓW LOTNYCH PIWA
THE INFLUENCE OF WORT FERMENTATION TEMPERATURE ON
THE PROFILE OF SELECTED VOLATILE COMPONENTS IN BEER
Abstrakt. Celem doświadczeń było określenie wpływu temperatury fermentacji
brzeczki piwnej na kinetykę fermentacji, zawartość związków lotnych oraz wybrane
parametry fizykochemiczne piwa. Badania wykonano w warunkach przemysłowych,
a do fermentacji brzeczki, o początkowej zawartości ekstraktu 15,5oBlg, użyto czystą
kulturę drożdży, Saccharomyces carlsbergensis, szczep 34/70. Temperaturę procesu
fermentacji ustalano w zakresie od 8,5 do 11,50C. Podczas fermentacji i dojrzewania
piwa pobierano próby, w których oznaczano ilość komórek drożdżowych, ich witalność oraz koncentrację produktów ubocznych (diketony, aldehyd octowy, estry). Doświadczenia wykazały, że zróżnicowana temperatura fermentacji brzeczki ma istotny wpływ na kinetykę procesu oraz zawartość komórek drożdży. Wraz ze wzrostem
temperatury fermentacji, zwiększa się między innymi zawartość estrów, natomiast
zmniejsza się zawartość aldehydu octowego oraz wicynalnych dwuketonów. Wymienione komponenty miały wpływ na cechy sensoryczne i końcową jakość piwa.
Słowa kluczowe: brzeczka, temperature fermentacji, związki lotne piwa
Summary. The purpose of experiments was to investigate the influence of wort fermentation temperature on the kinetics of fermentation, the contents of volatile compounds and selected volatile physicochemical parameters of beer.
The study was performed in industrial conditions and in order to achieve wort fermentation with the initial 15,5°Blg extract content a pure culture of Saccharomyces
carlsbergensis strain 34/70 was used. The temperature of fermentation process was
fixed (in the range) from 8,5 to 11,5°C. During the fermentation and maturation of
beer the samples were taken in which the number of yeast cells, their vitality and the
concentration of by-products (diketones, acetaldehyde, esters) were indicated. The
experiments showed that varied temperature of fermentation wort substantially affects
the kinetics process and a content of yeast cells. With the increase of fermentation
temperature esters are increasing whereas the content of acetaldehyde and vicinal
diketones are decreasing. Enumerated components had an influence on sensory characteristics and a final quality of beer.
Key words: wort, fermentation temperature, volatile components
223
WSTĘP
Podczas procesu fermentacji alkoholowej, drożdże piwowarskie oprócz etanolu i dwutlenku węgla, syntetyzują szerokie spektrum różnych ubocznych
produktów przemiany materii, z których znaczna większość wydzielana jest
do środowiska. Ilość i jakość wydzielanych z komórek produktów i metabolitów pośrednich przemian, ma wpływ na właściwości organoleptyczne gotowego produktu. Związki te, obok składników chmielu, nadają specyficzny
i charakterystyczny dla tego produktu smak i aromat [Kordialik i Kuchciak
1998; Salamon 1999; Dziuba 2001, Saerens i in. 2008].
Złożony skład chemiczny brzeczki i piwa jest odzwierciedleniem wielu
czynników, procesów i przemian modyfikujących, które w efekcie powinny
zapewnić końcową stabilność fizyczną, chemiczną, biologiczną i sensoryczną [Kucharczyk i Tuszyński 2011].
Wiele technologicznych czynników, w tym napowietrzanie brzeczki [Verbelen i in. 2009], dozowanie drożdży [Erten i in. 2007, Verbelen i in. 2009]
i temperatura fermentacji ma ważny wpływ na zawartość produktów ubocznych fermentacji a później na właściwości smakowe piwa.
Celem badań było bliższe określenie wpływu temperatury fermentacji
brzeczki na tworzenie wybranych komponentów lotnych piwa.
MATERIAŁ I METODY
Przedmiotem badań był symultaniczny proces produkcji piwa w trzech tankofermentorach (ZKT), z których pobierano próby przez 18 dni całego cyklu produkcyjnego. Każdy tankofermentor (A, B, C) został napełniony trzema warkami brzeczki w ilości 1050 hl każda. Brzeczki HG (High Gravity
15,5°Blg) były przygotowane z tej samej partii słodu, w identycznych warunkach technologicznych. Proces fermentacji głównej prowadzono w trzech
odmiennych temperaturach (°C): A (8,5), B (10) i C (11,5). Do fermentacji
użyto drożdże Saccharomyces carlsbergensis zebrane po drugiej fermentacji
(trzeci pasaż) w ilości 7 mln komórek na cm3 brzeczki. Podczas fermentacji
i dojrzewania monitorowano ilość komórek drożdżowych w fermentującej
brzeczce i piwie (Nucleocounter YC-100 firmy Chemometec). Parametry
fizykochemiczne piwa odczytywano z analizatora Alcolyzer Plus firmy Anton Paar. Do analizy składu związków lotnych (aldehyd octowy, dwuacetyl,
estry) zastosowano chromatografię gazową (chromatograf GC 8000 Fisons
Instruments).
224
Wpływ temperatury fermentacji brzeczki piwnej...
WYNIKI I DYSKUSJA
Stwierdzono istotne zmiany badanych wyróżników podczas procesu fermentacji brzeczki i dojrzewania piwa na skutek zastosowania różnej temperatury
procesu.
Rys. 1 przedstawia zmiany zawartości liczby komórek drożdżowych w fermentującej brzeczce i dojrzewającym piwie w tankofermentorze, w zależności od temperatury fermentacji brzeczki.
Rys. 1. Ilość komórek drożdżowych w fermentującej brzeczce i dojrzewającym piwie
Badania wpływu temperatury fermentacji brzeczki dla 8,5; 10 i 11,5°C na
przyrost biomasy drożdży w piwie potwierdzają, że liczebność komórek
drożdżowych osiąga największe wartości w temperaturze 11,5°C. Do 6 dnia
procesu nastąpił ponad 6-krotny wzrost liczby komórek (do 42 mln jtk·ml-1),
po tym okresie miało miejsce rozpoczęcie procesu fermentacji. Podobne wyniki uzyskali Claro i in. (2007) w swoich badaniach, wykazując ścisłą zależność pomiędzy temperaturą a żywotnością oraz szybkością namnażania
drożdży.
We wszystkich trzech partiach piwa zaobserwowano wzrost ilości drożdży
w analizowanych próbkach w końcowej fazie fermentacji, co prawdopodobnie jest wynikiem powolnej sedymentacji komórek w strefie pobierania prób.
Następnie, po tym okresie odnotowano stały spadek ich zawieszenia w piwie
związany z procesem schłodzania w unitanku podczas procesu dojrzewania.
225
Rys. 2. Kształtowanie się zawartości aldehydu octowego w zależności od temperatury fermentacji
Zmiany zawartości aldehydu octowego w czasie fermentacji i dojrzewania
(Rys. 2) są m.in. uzależnione od temperatury fermentacji. Wraz ze wzrostem
temperatury od 8,5 do 11,5°C następowało obniżanie zawartości aldehydu
i końcowa jego ilość kształtowała się w granicach od 4,2 do 7 mg w 1 dm³.
Wcześniejsze badania Ramirez i Maciejowskiego [2007] wykazały podobną tendencję zmian. W badanych próbach fermentacyjnych, zawartość aldehydu przyrastała przez pierwsze trzy dni procesu, następnie jego zawartość
zmniejszała się, w zależności od temperatury procesu aż do momentu zebrania drożdży z tankofermentora.
Drożdże z każdego fermentora były zbierane po 100 h od rozpoczęcia procesu dojrzewania.
Fermentacja w temperaturze 8,5°C powodowała znacznie powolniejszy
proces redukcji aldehydu w odróżnieniu do dwóch pozostałych prób (10
i 11,5°C). Ze względu na wolniejsze tempo przemian w tym tankofermentorze (8,5°C), drożdże zostały zebrane dopiero w dwunastym dniu od napełnienia zbiornika. Jak można zauważyć na rysunku, redukcja aldehydu octowego
w sposób istotny występowała do momentu odbioru drożdży. W ostatnim
dniu procesu zebrano pozostałe drożdże i osady pofermentacyjne.
Na rys. 3 przedstawiono zmiany zawartości dwuacetylu w fermentującej
brzeczce i dojrzewającym piwie.
226
Rys. 3. Kształtowanie się zawartości dwuacetylu w zależności
od temperatury fermentacji
Na podstawie otrzymanych wyników można stwierdzić, że dynamika kształtowania się dwuketonów wicynalnych (identyczne zmiany obserwowano
również w przypadku 2,3-pentadionu) była również uzależniona od temperatury fermentacji. Dotychczasowe badania dowodzą, że ze wzrostem temperatury fermentacji następuje obniżenie zawartości dwuacetylu i 2,3-pentadionu. Powyższą tendencję potwierdzają liczne doniesienia literaturowe
[Masschelein 1986, Wieczorek 1995, Saerens i in. 2008]. W badanych tankofermentorach poziom dwuacetylu zwiększał się bardzo szybko i osiągał maksymalną zawartość od 5 do 7 dnia procesu (120-180 μg/dm³) w zależności
od temperatury fermentacji. W kolejnych dniach jego poziom zmniejszał się
z szybkością porównywalną do jego tworzenia. Na podstawie kształtowania się zawartości dwuacetylu można zatem stwierdzić, że wraz ze wzrostem
temperatury fermentacji następuje szybsza redukcja dwuketonów wicynalnych. Należy zauważyć, że spadek zawartości dwuacetylu w młodym piwie
pojawił się w momencie rozpoczęcia procesu flokulacji drożdży (Rys. 1).
Na Rys. 4 przedstawiono kształtowanie się zawartości octanu etylu w trakcie
procesu produkcji piwa szczególnie podczas fermentacji burzliwej. Przebieg
zmian na wykresie potwierdza, że kinetyka zmian zawartości octanu etylu w
piwie jest ściśle powiązana z fazami wzrostu drożdży. Na ilość octanu etylu
w piwie w sposób znaczący wpływa temperatura procesu. Wraz ze wzrostem
temperatury istotnie powiększa się ilość octanu etylu. Wcześniejsze prace
dowodziły [Nakatani i in. 1991; Riverol i Cooney 2007], że temperatura nie
ma większego wpływu na zawartość tego związku w piwie, a jedynie na zawartość octanu izo-amylu jako ważnego komponentu aromatu piwa. Różnice
w obserwacjach mogą być wynikiem zwiększonej rozpuszczalności dwutlenku węgla w tankofermentorach (15 m wysokości), który w sposób istotny
ogranicza ilość powstałych estrów.
227
Rys. 4. Kształtowanie się zawartości octanu etylu w zależności od temperatury fermentacji
Na ilość octanu etylu w piwie w sposób znaczący wpływa temperatura procesu. Wraz ze wzrostem temperatury istotnie powiększa się ilość octanu etylu.
Wcześniejsze prace dowodziły [Nakatani i in. 1991; Riverol i Cooney 2007],
że temperatura nie ma większego wpływu na zawartość tego związku w piwie, a jedynie na zawartość octanu izo-amylu jako ważnego komponentu
aromatu piwa. Różnice w obserwacjach mogą być wynikiem zwiększonej
rozpuszczalności dwutlenku węgla w tankofermentorach (15 m wysokości),
który w sposób istotny ogranicza ilość powstałych estrów.
WNIOSKI
• Temperatura fermentacji miała istotny wpływ na proces namnożenia
drożdży i kinetykę fermentacji. Zwiększenie temperatury fermentacji brzeczki z 10 do 11,50C przyczyniło się do skrócenia czasu procesu
o około jedną dobę.
• Wykazano wyraźny wpływ temperatury fermentacji na kształtowanie się
zawartości badanych składników lotnych. Zwiększenie temperatury fermentacji z 10 na 11,50C, przyczyniło się do wzrostu zawartości estrów,
a szczególnie octanu etylu.
• Zwiększona temperatura fermentacji powoduje zmniejszenie ilości aldehydu octowego i wicynalnych dwuketonów o około 30% .
228
LITERATURA
Akatani K. Fukui N. Nagami K. Nishigaki M. 1991. Kinetic analysis of ester formation during beer fermentation. American Society of brewing Chemists, 4: 152-157.
Claro F. Rijsbrack K. Soares E. 2005. Flocculation onset In Saccharomyces cerevisiae: effect of etanol, heat and Osmolic stress. Journal of Applied Microbiology,
102: 693-700.
Dziuba E. 2001. Rola drożdży w kształtowaniu cech sensorycznych piwa. Materiały
VI Szkoły Technologii Fermentacji, Szczyrk , 50-74.
Erten H., Tanguler H., Cakiroz H. 2007. The effect of pitching rate on fermentation
and flavour compounds in high gravity brewing. Journal of Institute Brewing,113,
(1), 75 – 79.
Guido L.F., Rodrigues P.G., Rodrigues J.A., Goncalves C.R., Barros A.A. 2003. The
impact of the physiological condition of the pitching yeast on beer flavour stability: an industrial approach. Foodchem 10: 50-57.
Kordialik-Bogacka E. Kuchciak T. 1998. Substancje smakowo-zapachowe piwa (1).
Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny, 8: 21-23.
Kucharczyk K. Tuszyński T. 2011. Aldehydy i wpływ wybranych czynników na ich zawartość w piwie. Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny, 10: 8-10.
Masschelein C. 1986. The biochemistry of maturation. Journal of Institute of Brewing, 92: 213 – 219.
Ramirez F. Maciejowski J. 2007. Optimal beer fermentation. The Institute of
Brewing&Distilling, 113: 325-333.
Riverol C. Cooney J. 2007. Estimation of ester formation Turing Beer fermentation
Rusing neural networks. Journal of Food Engineering, 82: 585-588.
Saerens S. Verbelen P. Vanbeneden N. 2008. Monitoring the influence of high-gravity
brewing and fermentation temperature on flavour formation by analysis of gene
expression levels in brewing yeast. Applied Genetics and Molecular Biotechnology, 80: 1039-1051.
Salamon A. 1999. Przemiany ubocznych produktów metabolizmu drożdży i możliwości regulowania ich syntezy. Materiały IBPRS, Warszawa 14.04.1999, 9-15.
Verbelen P., Dekoninck T., Saerens S., Mulders S., Thevelein J. Delvaux F. 2009.
Impact of pitching rate on yeast fermentation performance and Beer flavour. Applied Microbial and Cell Physiology, 82: 155-167
Verbelen P., Saerens S., Mulders S., Delvaux F., Delvaux R. 2009. The role of oxygen
in yeast metabolism during high cell density brewery fermentations. Applied Microbial and cell physiology. 82:1143-1156.
Wieczorek E. 1995. Dwuacetyl w piwie i metody jego oznaczania. Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny, 11:7-8.
229
mgr inż. Monika Cioch, mgr inż. Krzysztof Kucharczyk
Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej
ul. Balicka 122, 31 – 149 Kraków
Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Tadeusz Tuszyński
230
Gabriela Kulig
Monika Halik
Anna Ptaszek
EPISTEME
14/2012
s.231-237
ISSN 1895-4421
WŁAŚCIWOŚCI OSMOTYCZNE WODNYCH UKŁADÓW PVP- ŻELATYNA RYB MORSKICH-WODA
OSMOTIC PROPERTIES OF AQUEOUS SYSTEMS PVP-GELATIN
FROM COLD WATER FISH-WATER
Abstrakt. Celem pracy było określenie równowagi fazowej w układzie PVP- żelatyna ryb morskich-woda za pomocą pomiarów ciśnienia osmotycznego. W mieszaninie
tych trzech składników występuje zjawisko separacji faz wynikające z niezgodności
termodynamicznej między poliwinylopirolidonem a żelatyną ryb morskich. Poliwinylopirolidon (PVP) jest dodatkiem stosowanym do żywności i oznaczany jako E1200.
Dobra rozpuszczalność i duża lepkość roztworów PVP powoduje jego szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym. Innym ważnym biopolimerem wykorzystanym w badaniach a stosowanym w żywności jest żelatyna. W pracy przeanalizowano
zależność ciśnienia osmotycznego roztworów żelatyny rybiej, PVP oraz mieszaniny
żelatyna rybia i PVP w warunkach stałej temperatury (40°C ) i stałego pH. Badania
wstępne wskazują na możliwość wystąpienia separacji faz w szerokim zakresie stężeń
żelatyny ryb morskich- PVP.
Słowa kluczowe: PVP, żelatyna ryb morskich, równowaga fazowa, osmometria
Summary. The aim of this study was to determine the phase equilibrium in the system
PVP-marine fish gelatin-water by measuring osmotic pressure. The mixture of these
three components is occurring phase separation resulting from the thermodynamic
incompatibility between polyvinylpyrrolidone and gelatin of marine fish. Polyvinylpyrrolidone (PVP) is an additive used in food and denoted as E1200. It belongs to a
biocompatible polymer and is obtained by polymerization of vinylpyrrolidone. The
good solubility and high viscosity solutions of PVP makes it widely used in food industry. Another important biopolymer which used in our research is gelatin. The paper
analyzes the dependence of osmotic pressure of solutions of fish gelatin, PVP, and a
mixture of fish gelatin and PVP in a constant temperature (40 ° C) and constant pH.
Preliminary studies indicate the possibility of phase separation in a wide concentration range of marine fish gelatin-PVP.
Key words: PVP, gelatin of marine fish, the equilibrium phase, osmometriaosmo
231
WSTĘP
W przemyśle spożywczym na co dzień wykorzystuje się znajomość interakcji pomiędzy danymi składnikami mieszaniny. Istotnym z punktu widzenia
technologa jest dokładne zbadanie i poznanie tych oddziaływań kształtujących poszczególne cechy produktów żywnościowych. Jednym ze zjawisk
obrazujących oddziaływania w wodnych roztworach jest osmoza zachodząca pomiędzy roztworem a czystym rozpuszczalnikiem, przy założeniu,
że są one oddzielone membrana czyli przegrodą przepuszczalna tylko dla
cząsteczek rozpuszczalnika. W takim układzie dochodzi do osmozy czyli wędrówki cząsteczek rozpuszczalnika do roztworu, a nie wyrównania
stężenia substancji rozpuszczonej jak ma to miejsce w klasycznej dyfuzji.
Membranę półprzepuszczalną, tzn. taką która przepuszcza rozpuszczalnik,
a nie przepuszcza substancji rozpuszczonej, dopasowuje się w zależności
do rozmiarów cząsteczek, tak aby jej pory umożliwiały jedynie przenikanie
cząsteczek rozpuszczalnika. Jego przepływ zachodzi do momentu wyrównania potencjałów chemicznych rozpuszczalnika i substancji rozpuszczonej po
obu stronach przegrody i w efekcie do wzrostu objętości roztworu. Osmoza
jest procesem samorzutnym, jednak możliwe jest jej zahamowanie jak i odwrócenie. Pomiar ciśnienia osmotycznego umożliwia określenie równowagi
w układach dwu- lub więcej składnikowych.
CEL PRACY
Celem pracy było określenie równowagi fazowej w układzie PVP- żelatyna
ryb morskich-woda za pomocą pomiarów ciśnienia osmotycznego. W mieszaninie tych trzech składników występuje zjawisko separacji faz wynikające
z niezgodności termodynamicznej między poliwinylopirolidonem a żelatyną
ryb morskich. Tego typu badania nie zostały dotąd wykonane, dlatego możemy uznać je za innowacyjne i wnoszący istotny wkład w naukę.
MATERIAŁY I METODY
Żelatyna ryb morskich (gelatin from cold water fish skin), zakupiona została
w firmie Sigma-Aldrich. Jest to żółto-kremowy proszek o charakterystycznym zapachu. Do analizy użyto poliwinylopirolidonu o masie cząsteczkowej
55 kDa, który również zakupiono w firmie Sigma-Aldrich.
Etap 1. Do wialek o pojemności 25 ml odważono żelatynę i PVP w proporcjach ustalonych wcześniej na podstawie badań wstępnych. Każda z seria składała się z 17 naważek. Naważki zalano 10 ml wody destylowanej,
następnie mieszaninę wytrząsano przez około 3 minut, po czym wstawiono do łaźni wodnej o temperaturze 75°C aż do całkowitego rozpuszczenia.
232
Właściwości osmotyczne wodnych ukłądów PVP-żelatyna...
Jednolite roztwory przelano do falkonów, dodano azydku w celu stabilizacji, szczelnie zamknięto i termostatowano w cieplarce w temperaturze 35°C
przez okres 24h.
Rys.1. Na fotografii przedstawiono separację faz , która nastąpiła po etapie nr.1. Była ona
punktem wyjściowym do dalszym badań
Etap 2. Do szklanych butelek o pojemności 50 ml odważono kolejno żelatynę, PVP w ustalonych wcześniej proporcjach, tak aby masy naważek zawarte
były w przedziale od 0,12.g do 0,24 g. Zarówno dla żelatyny jak PVP sporządzono po 8 naważek. W przypadku mieszaniny PVP- żelatyna ryb morskich przyjęto stałą naważkę PVP o masie ok. 0,0610 g i zmiennej masie
żelatyny w przedziale wagowym od 0,0620 g do 0,1805 g tak, żeby ich suma
zawierała się w przedziale 0,12 g do 0,24 g. Naważki zalano 100 ml wody
destylowanej i następnie mieszano je przy użyciu mieszadła magnetycznego
w temperaturze 40°C do całkowitego rozpuszczenia. Jednolite roztwory badano z wykorzystaniem osmometru membranowego OSMOMAT 090 GONOTEC Gmbh z użyciem membrany 10kg/mol. Pomiary wykonano w pięciu
powtórzeniach dla każdego roztworu.
WYNIKI
Na poniższych rysunkach przedstawiono zależność ciśnienia osmotycznego
(π) od stężenia (c) w temperaturze 40°C i przy użyciu membrany 10kg/mol.
Natomiast w tabelach zestawiono po osiem powtórzeń i warunki w jakich
zostały wykonane.
233
Rys. 1. Zależność ciśnienia osmotycznego (π) od stężenia (c) w temperaturze 40°dla
żelatyny rybiej
234
Rys. 2. Zależność ciśnienia osmotycznego (π) od stężenia (c)
w temperaturze 40°dla PVP
235
Rys. 3. Zależność ciśnienia osmotycznego (π) od stężenia (c) w temperaturze 40°dla
układów poliwinylopirolidon- żelatyna rybia
236
DYSKUSJA I WNIOSKI
Z otrzymanych wyników można wnioskować, że masy molowe są zgodne
z podanymi przez producenta czyli dla żelatyny ok. 90kDa, a dla PVP 55kDa.
Na rysunkach 1 i 3 nachylenie krzywej, a w konsekwencji drugi współczynnik wirialu, są dodatnie. Pozwala nam to stwierdzić, że woda jest dobrym
rozpuszczalnikiem dla PVP i żelatyny w badanym przedziale gdzie masy naważek zawarto od 0,12 g do 0,24 g substancji na 100 ml wody. Natomiast
w przypadku mieszaniny PVP i żelatyny ryb morskich, gdzie przyjęto stałą
naważkę PVP o masie ok. 0,0610 g i zmienną masę żelatyny w przedziale
wagowym od 0,0620 g do 0,1805 g tak, żeby ich suma zawierała się w przedziale 0,12 g do 0,24 g , również występuje dodatnie nachylenie krzywej
czyli dodatni współczynnik wirialu. Następuje natomiast wzrost masy molowej co może wskazywać na agregację łańcuchów PVP i białka w wodnym
roztworze. W takim przedziale stężeń mieszaniny PVP i żelatyny woda jest
dobrym rozpuszczalnikiem. Fakt powstawania aglomeratów pozwala nam
przypuszczać, iż przy większych stężeniach w roztworze wodnym PVP- żelatyna prowadzi do separacji faz.
LITERATURA
Ptaszek A., Ptaszek P. Osmometria w badaniach właściwości biopolimerów. Laboratorium; Przegląd Ogólnopolski, 3/ 09.
J. F. Rabek. 1977. Podstawy fizykochemii polimerów. Politechnika Wrocławska. Wrocław.
mgr inż. Gabriela Kulig, mgr inż. Monika Halik
Katedra Inżynierii i Aparatury Przemysłu Spożywczego
237
Karolina Malecka, Ryszard Macura
Grzegorz Fiutak, Marek Szeląg
EPISTEME
14/2012
s.239-245
ISSN 1895-4421
WYKORZYSTANIE KRIOKONCENTRACJI DO PRODUKCJI
PREPARATÓW BARWIĄCYCH Z SOKU BURAKA ĆWIKŁOWEGO
PODDANEGO FERMENTACJI MLEKOWEJ I AKOHOLOWEJ
THE USE OF FREEZE CONCENTRATION IN THE MANUFACTURE
OF PIGMENTS OBTAINED FROM RED BEET JUICE SUBJECTED TO
LACTIC ACID AND ALKOHOLOIC FERMENTATIONS
Abstrakt. Znaczna zawartość cukrów w korzeniach buraka ćwikłowego umożliwia
utrwalanie otrzymywanego z nich soku metodą fermentacji mlekowej i alkoholowej.
Utrwalony sok może z kolei stanowić surowiec do produkcji naturalnych preparatów barwiących, które coraz częściej uwzględnia się podczas produkcji żywności
zamiast sztucznych barwników. Celem pracy była ocena stabilności barwników betalainowych (betacyjanów i betaksantyn) z buraka ćwikłowego w sokach poddanych
fermentacji mlekowej i alkoholowej, a następnie zagęszczonych metodą kriokoncentracji. Oznaczono również temperatury krioskopowe soków poddanych fermentacji
i otrzymanych z nich koncentratów. Temperatura krioskopowa po czwartym zagęszczeniu wynosiła w przypadku soku poddanego fermentacji alkoholowej -12,2 ºC,
a soku poddanego fermentacji mlekowej -4,5ºC. Większą trwałość żółtych barwników zaobserwowano w soku poddanym fermentacji alkoholowej. Straty barwników
czerwonych wynosiły po czwartym zagęszczeniu 24,79% w soku poddanym fermentacji alkoholowej i 15,35% po fermentacji mlekowej.
Słowa kluczowe: kriokoncentracja, fermentacja mlekowa, fermentacja alkoholowa,
burak ćwikłowy, barwniki betalainowe
Summary. A large sugar content in roots of red beet allows to preserve its juices by
means of lactic acid and alcoholic fermentations. Such preserved juice can in turn be
used for the production of natural coloring preparations. The aim of the dissertation
was to assess the stability of red beet betalain pigments (betacyanins, betaxantins) in
juices subjected to lactic acid and alcoholic fermentations, and then freeze concentrated. Moreover, freezing temperatures of alcoholic/lactic acid fermentation juices and
obtained concentrates have been determined. Thus, freezing temperatures after the
fourth concentration of alcoholic fermentation juices came to -12, 2˚C, whereas in the
case of lactic acid fermentation juices it amounted to -4.5˚C. Higher stability of yellow pigment has been observed in juices subjected to alcoholic fermentation. The loss
of red pigments after the fourth concentration came to 24.79% in the juice subjected
to alcoholic fermentation and 15.35% in the juice subjected to lactic fermentation.
Key words: freeze concentration, lactic acid fermentation, alcoholic fermentation,
red beet, betalain pigments
239
WSTĘP
Burak ćwikłowy stanowi surowiec wykorzystywany w przemyśle spożywczym głównie do produkcji soków, barszczu oraz naturalnych barwników
[Sobkowska 1979]. Charakterystyczna barwa soku otrzymywanego z buraków ćwikłowych jest związana z obecnością w nim barwinków betalainowych, do których zalicza się czerwone betacyjany i żółte betaksantyny
[Czapski i in. 2011]. Barwniki zawarte w burakach ćwikłowych są wykorzystywane między innymi do barwienia przetworów mięsnych, owocowych
oraz w cukiernictwie (żelki, pianki, masy, gumy do żucia) i przemyśle mleczarskim (jogurty smakowe, lody, desery mleczne) [Sobkowska 1979, Mosiewicz 2003]. Stanowią one alternatywę dla konsumentów, którzy unikają
spożywania syntetycznych dodatków. Ich wykorzystanie do produkcji żywności bywa jednak ograniczone zmianami jakim ulęgają podczas kontaktu ze
światłem i wysoką temperaturą. [Daeseok i in. 1998]
Zawartość cukrów prostych i sacharozy, która kształtuje się w burkach ćwikłowych na poziomie 8% [Krajewski 1991] stwarza warunki do utrwalania
otrzymanych z nich soków poprzez przeprowadzenie fermentacji mlekowej
i alkoholowej. Kwas mlekowy oraz alkohol etylowy, które powstają podczas
fermentacji stanowią naturalny czynnik przedłużający trwałość żywności.
W przypadku buraków fermentacja mlekowa wykorzystywana jest głównie
do produkcji barszczu.
Zastosowanie kriokoncentracji umożliwia dodatkowe utrwalenie fermentowanych soków z buraka ćwikłowego. Metoda polega na usuwaniu wody
z płynnych produktów poprzez wymrażanie. Wykorzystanie podczas zagęszczania niskich temperatur wpływa na lepsze zachowanie aromatu oraz składników, w tym barwników, wrażliwych na działanie ciepła. [Liu i in. 1999,
Dette i Jansen 2010].
Celem pracy była ocena stabilności barwników betalainowych (betaniny
i wulgaksantyny) z buraka ćwikłowego w sokach poddanych fermentacji
mlekowej i alkoholowej, a następnie zagęszczonych metodą kriokoncentracji. Oznaczono również temperatury krioskopowe soków poddanych fermentacji i otrzymanych z nich koncentratów.
MATERIAŁ I METODY
Do badań wykorzystano buraki czerwone (Beta Vulgaris L) zakupione
w lokalnym sklepie. Buraki umyto w letniej wodzie w celu usunięcia zanieczyszczeń z powierzchni. Po osuszeniu pozbawiono je ogonka oraz korony,
a następnie obrano i pokrojono na mniejsze cząstki. W sokowirówce firmy
Zelmer typ 177 przygotowano z rozdrobnionego surowca sok. Otrzymany
sok poddano fermentacji mlekowej i alkoholowej.
240
Wykorzystanie kriokoncentracji do produkcji preparatów barwiących...
Do fermentacji mlekowej wykorzystano sok rozcieńczony wodą w stosunku 1:1, który zaszczepiono bakteriami fermentacji mlekowej Lactobacillus plantarum. Sok z dodatkiem bakterii przetrzymywano przez 48 godzin
w szklanym słoju umieszczonym w cieplarce o stałej temp. 23°C.
Fermentacji alkoholowej poddano nierozcieńczony sok z buraka, który zaszczepiono drożdżami Sacharomyces cerevisiae. Sok z dodatkiem drożdży
przetrzymywano przez 24 godziny w szklanym słoju w temperaturze 22–
24°C. Po zakończeniu fermentacji mlekowej i alkoholowej sok zlano do czystych naczyń.
Przefermentowany sok poddano zagęszczaniu przez wymrażanie. Proces kriokoncentracji przeprowadzono w kriostacie MLW MK 70, w którym czynnikiem chłodzącym był etanol o temperaturze ok. – 25°C. Próbki
umieszczono w naczyniach ze stali nierdzewnej. Podczas wymrażania wody
próbki poddawano intensywnemu mieszaniu. Otrzymane kryształki lodu rozdzielano przez 15 minut w wirówce z chłodzeniem przy prędkości 2000 obr/
min. Przefermentowane soki zagęszczano 4 – krotnie. Po każdym kolejnym
zagęszczeniu wykonano pomiar zawartości barwników.
Widma barwników zawartych w świeżym soku z buraka ćwikłowego, barszczu oraz ich koncentratach wyznaczono wykorzystując spektrofotometr Cecil CE 9500. Pomiar absorbancji wykonano dla fal o długości 476 nm, 537
nm i 600 nm. Otrzymane wartości absorbancji wykorzystano do obliczenia
stężenia barwników czerwonych i żółtych metodą pośrednią według Nilssona [Wiley i in. 1978]. Zawartość barwników czerwonych wyrażono jako
betaninę, a barwników żółtych jako wulgaksantynę. Wszystkie oznaczenia
wykonano w trzech powtórzeniach, a wyniki przedstawiono jako średnie.
Dla soku z buraka ćwikłowego poddanego fermentacji alkoholowej oznaczono
również zawartość etanolu przed zagęszczeniem oraz po każdym kolejnym etapie kriokoncentracji. Dla próbek rozcieńczonego soku poddanego fermentacji
mlekowej i jego koncentratów zmierzono kwasowość, wynik podano jako procentową zawartość kwasu mlekowego. Pomiar kwasowości wykonano metodą
miareczkowania mianowanym 0,1 M roztworem NaOH. Miareczkowanie prowadzono do osiągnięcia pH mieszczącego się w przedziale 7,5 – 7,8.
Oznaczenie zawartości alkoholu etylowego w soku poddanym fermentacji
alkoholowej i jego koncentratach wykonano za pomocą areometru. Destylacji poddawano 100 cm3 soku i jego koncentratów. Po otrzymaniu ok. 75cm3
destylatu roztwór doprowadzono do temperatury 20°C i dopełniono do 100
cm3 wodą destylowaną o tej samej temperaturze. Wynik podano jako średnią
z dwóch kolejnych oznaczeń. Dla próbek soku poddanego fermentacji alkoholowej i mlekowej oraz ich koncentratów wykonano po każdym kolejnym
zagęszczeniu pomiar temperatury krioskopowej.
241
Rys. 1. Zmiany temperatury
krioskopowej w soku z
buraka poddanym fermentacji
alkoholowej na kolejnych
etapach zagęszczania metodą
kriokoncentracji
Rys. 2. Zmiany temperatury
krioskopowej w soku
z buraka poddanym
fermentacji mlekowej
na kolejnych etapach
zagęszczania metodą
kriokoncentracji
WYNIKI I DYSKUSJA
Podczas zagęszczania soku z buraka poddanego fermentacji mlekowej i alkoholowej zaobserwowano spadek temperatury krioskopowej. W przypadku
soku utrwalonego metodą fermentacji alkoholowej temperatura krioskopowa
przed zagęszczeniem, przy zawartości etanolu równej 2,6% wynosiła -2,0°C.
Po ostatnim zagęszczeniu zawartość etanolu wzrosła do 12,9%, a temperatura krioskopowa uległa obniżeniu do -12,2°C (Rys. 1)
Pomiar temperatury krioskopowej rozcieńczonego soku z buraka poddanego
fermentacji mlekowej wykonano w odniesieniu do zwartości kwasu mlekowego. Temperatura krioskopowa przefermentowanego soku przed zagęszczaniem wynosiła -0,4°C, przy zwartości kwasu mlekowego równej 0,63%.
Po czwartym zagęszczeniu temperatura krioskopowa soku poddanego fermentacji mlekowej spadła do -4,5°C, a zawartość kwasu mlekowego zwiększyła się do 2,97% (Rys.2).
Zawartość betacyjanów w korzeniach buraka mieści się w granicach od 0,3
do 3 mg/g świeżej masy [Czapski i in. 2009]. W korzeniu buraków z których
przygotowano sok oraz barszcz zawartość czerwonych barwników wynosiła
242
55,10 mg/100g świeżej masy, a żółtych 30,60 mg/100g świeżej masy. Po
przeprowadzeniu fermentacji alkoholowej zaobserwowano w soku z buraka stratę barwników żółtych wielkości 25,82% oraz 8,84% w przypadku
barwników czerwonych. Fermentacja mlekowa wpłynęła na zmniejszenie
o 61,44% zawartości barwników żółtych i o 28,02 % barwników czerwonych.
Podczas kolejnych zagęszczeń soku z buraka poddanego fermentacji mlekowej
i alkoholowej obserwowano wzrost zawartości barwników betalainowych.
Zagęszczenie soku z buraka poddanego fermentacji alkoholowej od zawartości etanolu równej 2,6% do zawartości etanolu wynoszącej 12,9% wpłynęło
na zwiększenie ilości czerwonych barwników z 50,23 mg/100g do 187,43
mg/100g. Zawartość barwników żółtych wzrosła z 22,70 mg/100g do 92,30
mg/100g (Tab. 1) Stosunek zawartości barwników czerwonych do żółtych
zmniejszył się po czwartym zagęszczeniu z 2,21 do 2,03 (Tab. 1).
Zawartość
alkoholu %
Zawartość
barwników
żółtych
mg/100g
Zawartość
barwników
czerwonych
mg/100g
Stosunek
zawartości
barwników
czerwonych
do żółtych
Świeży sok
----------
30,60 ± 0,45
55,10 ± 0,16
1,80
Sok po fermentacji
alkoholowej
2,6
22,70 ± 0,20
50,23 ± 0,50
2,21
Sok po I zagęszczeniu
4,3
34,63 ± 1,59
75,27 ± 3,18
2,17
Sok po II zagęszczeniu
8,0
51,20 ± 1,31
115,73 ± 1,02
2,26
Sok po III zagęszczeniu
12,2
81,87 ± 0,35
153,60 ± 2,29
1,88
Sok po IV zagęszczeniu
12,9
92,30 ± 1,78
187,43 ± 2,60
2,03
Tab. 1. Zawartość etanolu, barwników żółtych, czerwonych oraz stosunek barwników w soku buraczanym poddanym fermentacji alkoholowej i kriokoncentracji
Zawartość czerwonych barwników w przefermentowanym rozcieńczonym
soku z buraka, w którym ilość kwasu mlekowego kształtowała się na poziomie 0,63% przed zagęszczeniem wynosiła 19,83 mg/100g, a barwników
żółtych 5,90 mg/100g. Po czwartym zagęszczeniu zwartość kwasu mlekowego wzrosła do 2,97%, zawartość barwników czerwonych zwiększyła się do
79,10 mg/100g, a żółtych do 26,87 mg/100g (Tab. 2). Stosunek barwników
czerwonych do żółtych, który w nie zagęszczonym soku poddanym fermentacji mlekowej kształtował się na poziomie 3,36 zmniejszył się po czwartym
zagęszczeniu i wynosił 2,94 (Tab. 2).
243
Zawartość
kwasu
mlekowego %
Zawartość
barwników
żółtych mg/100g
Zawartość
barwników
czerwonych
mg/100g
Stosunek zawartości
barwników
czerwonych do
żółtych
Świeży sok
----------
15,30 ± 0,14
27,55 ± 0,29
1,80
Sok po fermentacji
mlekowej
0,63
5,90 ± 0,10
19,83 ± 0,12
3,36
Sok po I zagęszczeniu
1,08
10,50 ± 0,20
35,73 ± 0,40
3,40
Sok po II zagęszczeniu
1,44
15,53 ± 0,47
51,53 ± 1,16
3,32
Sok po III zagęszczeniu
1,89
21,37 ± 0,58
67,70 ± 0,35
3,17
Sok po IV zagęszczeniu
2,97
26,87 ± 1,42
79,10 ± 0,62
2,94
Tab. 2. Zawartość kwasu mlekowego, barwników żółtych, czerwonych oraz stosunek
barwników w soku buraczanym poddanym fermentacji i kriokoncentracji
Stosunek barwników czerwonych do żółtych wynosił w świeżym soku 1,80.
Po poddaniu soku fermentacji alkoholowej stosunek ten wzrósł do 2,21, a po
fermentacji mlekowej do 3,36. Większą trwałość barwników żółtych zauważono w soku poddanym fermentacji alkoholowej. Niższa zawartość żółtych
barwników w soku po fermentacji mlekowej jest związana z ich mniejszą
stabilnością towarzyszącą spadkowi pH [Czapski 1979].
W otrzymanych krio-koncentratach soków określono również straty barwników podczas zagęszczania. Obliczenia zawartości barwników w soku po
fermentacji alkoholowej wykonano względem zwartości etanolu. Straty
barwników czerwonych wynosiły w nim łącznie, po czwartym zagęszczeniu,
24,79%, a żółtych 18,05%. Straty barwników w soku poddanym fermentacji
mlekowej obliczano w stosunku do zmieniającej się zawartości kwasu mlekowego. Po czwartym zagęszczeniu wynosiły one łącznie 15,35% w przypadku barwników czerwonych i 3,73% dla barwników żółtych.
WNIOSKI
• Barwniki zawarte w buraku ćwikłowym są trwałe podczas zagęszczania
przez wymrażanie. Zastosowanie kriokoncentracji pozwala uzyskać ich
wysoką zawartość w soku z buraka poddanego fermentacji zarówno alkoholowej jak i mlekowej.
• Najwyższy stosunek barwników czerwonych do żółtych zaobserwowano
w soku poddanym fermentacji mlekowej.
• Wyższe starty barwników żółtych i czerwonych zaobserwowano w soku
z buraka, który poddano fermentacji mlekowej.
244
LITERATURA
Czapski J. 1979. Badania nad otrzymaniem soku o dobrej jakości z buraka ćwikłowego. Przemysł Fermentacyjny i Owocowo – Warzywny, 11, 23-25.
Czapski J., Gościnna K., Kidoń M., 2011. Sok z buraka ćwikłowego. Wpływ masy
i części korzenia buraka na wyróżniki soku. Przemysł Spożywczy, 65(11), 50-52.
Czapski J., Mikołajczyk K., Kaczmarek M. 2009 Relationship between antioxidantcapacity and of Reed beet juice and contents of its betalain pigments. Polish Journal of Food and Nutrition Science, 59(2), 119-122.
Daeseok H., Seok Joong K., Sang Hee K., Dong Man K. 1998. Repeated regeneration
of degraded red beet juice pigments in the presence of antioxidants. Journal of
Food Science, 63(1), 69-72.
Dette S.S., Jansen H. 2010. Freeze concentration of blackcurrant juice. Chemical
Engineering and Technology, 33( 5), 762-766.
Krajewski A. 1991. Kiszone buraki ćwikłowe w przerobie przemysłowym. Przemysł
Fermentacyjny i Owocowo – Warzywny, 8, 13-14
Liu L, Miyawaki O., Hayakawa K. 1999. Progressive freeze-concentration of tomato
juice. Food Science and Technology Research, 5(1), 108-112.
Mosiewicz R. 2003. Polski paradoks. Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny, 4, 4.
Sobkowska E. 1979. Burak ćwikłowy jako surowiec do produkcji soków. Przemysł
Fermentacyjny i Owocowo – Warzywny, 10, 25-28.
Wiley R.C., Lee Y. 1978. Recovery of betalaines from red beets by a diffusion– extraction procedure. Journal of Food Science, 43, 1056 – 1058.
mgr inż. Karolina Malecka, mgr inż. Grzegorz Fiutak, mgr inż. Marek Szeląg
Katedra Chłodnictwa i Koncentratów Spożywczych
Opiekun naukowy: dr hab. inż. Ryszard Macura
245
Agnieszka Siembida
Anna Kościej
Lidia Duda
Ewa Cieślik
EPISTEME
14/2012
s.247-254
ISSN 1895-4421
OSZACOWANIE SPOŻYCIA PRODUKTÓW ZAWIERAJĄCYCH
FRUKTANY
ESTIMATION OF INTAKE OF FOOD PRODUCTS CONTAINING
FRUCTANS
Abstrakt. W pracy podjęto próbę oszacowania spożycia produktów będących źródłem fruktanów oraz oceny poziomu wiedzy żywieniowej na temat tych polisacharydów. Badaniem ankietowym objęto 166 osób, w tym 86 kobiet i 80 mężczyzn,
w przedziale wiekowym 8-82 lat. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej za pomocą testu Chi2. Czynnikiem różnicującym badaną grupę była płeć oraz
wiek respondentów. Uzyskane wyniki wskazują, iż kobiety posiadały lepszą wiedzę
w zakresie źródeł fruktanów, zaś mężczyźni wykazali się lepszą wiedzą na temat ich
właściwości prozdrowotnych. Zarówno kobiety jak i mężczyźni swoją wiedzę czerpią głównie z Internetu. Codziennym źródłem fruktanów w diecie kobiet były: kawa
z dodatkiem cykorii, preparaty wspomagające odchudzanie zawierające inulinę oraz
cebula. W racji pokarmowej mężczyzn, głównym źródłem fruktanów były czosnek
oraz cebula.
Słowa kluczowe: fruktany, wiedza, źródła, częstotliwość spożycia
Summary. This paper attempts to estimate of intake of food products containing fructans and the level of nutrition knowledge about these polysaccharides. The study was
performed among 166 persons (86 women, 80 men) aged 8-82. Results were analyzed
with using the Chi2 test. Studied differentiating factors were gender and age of respondents. The results indicate that women had better knowledge about the fructans issue,
while men showed better knowledge about their healthy properties. Both women and
men obtained their knowledge mainly from the Internet. Daily sources of fructans in
the women`s diet were: coffee with chicory, dietary supplement with inulin which
reduce body mass and onion. Man’s daily diet, aimed to providing fructans, is based
mainly on the garlic and onions intake.
Key words: fructans, knowledge, sources, frequency of intake
247
WSTĘP
Obserwowany proces starzenia się społeczeństwa, w szczególności w krajach wysokorozwiniętych gospodarczo, wzrost zagrożeń cywilizacyjnych
oraz kosztów leczenia, jak również większe zaufanie konsumentów do żywności w tradycyjnej postaci niż do preparatów farmaceutycznych, spowodowały nasilenie prac nad opracowywaniem produktów prozdrowotnych, tzn.
żywności funkcjonalnej.
Mianem żywności funkcjonalnej określane są produkty spożywcze, które
mają udowodniony korzystny wpływ na jedną lub więcej funkcji organizmu,
polegający na poprawie stanu zdrowia oraz samopoczucia i/lub zmniejszenia ryzyka chorób, wynikający z obecności w nich substancji bioaktywnych
o określonym działaniu prozdrowotnym oraz z optymalnej fizjologicznie
proporcji tych składników.
W produkcji żywności funkcjonalnej nośnikami substancji bioaktywnych są
zwykle te produkty spożywcze, które są często kupowane i regularnie spożywane [Cieślik 2004].
Fruktany, nazywane inaczej polifruktozylocukrami, zaliczane są do rozpuszczalnej frakcji błonnika pokarmowego. Są polimerami zbudowanymi
z jednostek β-D-fruktofuranozy oraz z jednej, na ogół na końcu redukującego łańcucha, cząsteczki D-glukozy. W naturze występuje pięć różnych grup
fruktanów, które rozróżnia się zgodnie z typem występujących w ich strukturze połączeń oraz położeniem cząsteczki glukozy. Są to: inuliny, neoinuliny,
lewany (produkowane przez bakterie)/phlein (produkowane przez rośliny),
neolewany oraz fruktany mieszane (graminan). Powód różnorodności struktur i zawartości fruktanów u poszczególnych roślin jest nieznany, aczkolwiek
podsumowując wyniki licznych badań, przyjęto, iż kluczową rolę odgrywają
czynniki tj.: gatunek, część morfologiczna oraz stadium rozwoju (dojrzałości) danej rośliny, a także warunki środowiska, w tym temperatura (zwłaszcza
podczas wzrostu korzeni i pędów), intensywność nasłonecznienia i jego czas,
tudzież dostępność pożywienia i status wodny [Cieślik i Siembida 2010].
Wśród właściwości prozdrowotnych fruktanów wymienić należy: zmniejszanie ryzyka występowania hiperglikemii, przeciwdziałanie zaparciom, stymulacje działania układu odpornościowego, regulacje gospodarki lipidowej
w organizmie, zmniejszanie ryzyka występowania nowotworów jelita grubego, poprawę wchłaniania oraz stymulacje absorpcji związków mineralnych,
w tym głównie Ca, Mg, Zn i Fe, a tym samym stymulacje mineralizacji kostnej oraz odporności kości na złamania [Roberfroid 2007].
Oprócz licznych właściwości prozdrowotnych, fruktany charakteryzują się
również korzystnymi właściwościami technologicznymi tj.: strukturotwórczymi, zagęszczającymi, wodochłonnymi oraz zmniejszaniem wartości ener248
Oszacowanie pożycia produktów zawierających fruktany...
getycznej produktów poprzez zastępowanie cukru i tłuszczu. Z tego względu
fruktany mogą znaleźć zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu spożywczego: mleczarstwie, cukiernictwie i piekarstwie lub w przetwórstwie owocowo-warzywnym [Cieślik i Gębusia 2011].
Przetwarzanie żywności wpływa jednak na zawartość fruktanów w produktach spożywczych. Techniki których celem jest dehydratacja (np. suszenie)
zwiększają stężenie fruktanów w produkcie, z kolei przetwarzanie termiczne z udziałem wody (np. gotowanie) jest powodem zmniejszenia zawartości
fruktanów w produkcie, bowiem cześć fruktanów przechodzi do wywaru.
Przetwarzanie termiczne bez udziału wody (np. pieczenie, pasteryzacja) nie
przyczynia się istotnie do strat fruktanów. Z tego względu, zawartość fruktanów w gotowym produkcie będzie zależeć od jego składu recepturowego,
warunków przechowywania oraz zastosowanej metody obróbki termicznej
[Bartnikowska 2010].
MATERIAŁ I METODY
Badania ankietowe zostały przeprowadzone jesienią 2011 roku, za pomocą
anonimowego kwestionariusza ankiety, specjalnie opracowanego do celów
niniejszej pracy. Objęto nimi 166 osób, w tym 51,8% kobiet i 48,2% mężczyzn, w przedziale wiekowym od 8-82 lat. W badaniu uczestniczyły osoby
o różnym stopniu wykształcenia i zamożności. Kwestionariusz ankiety podzielono na dwie części. Pierwsze dwa pytania miały na celu dostarczenie
ogólnych informacji o ankietowanych osobach – dotyczyły płci oraz wieku
respondentów. Pozostałe pytania odnosiły się do oceny stanu wiedzy żywieniowej na temat fruktanów oraz jej źródeł, a także oszacowania spożycia produktów będących źródłem fruktanów w diecie przeciętnego Polaka.
Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej za pomocą testu Chi2,
z wykorzystaniem programu Statistica v.8.0., przyjmując za granicę istotności
p < 0,05. Czynnikiem różnicującym badaną grupę była płeć oraz wiek respondentów. Badaną populację podzielono na 14 grup wiekowych tj.: < 20;
20-24; 25-29; 30-34; 35-39; 40-44; 45-49; 50-54; 55-59; 60-64; 65-69; 7074; 75-79; 80-85 lat.
WYNIKI I DYSKUSJA
Na wstępie zwrócono się do ankietowanych z prośbą o odpowiedź na pytanie
„Czy wie Pani/Pan czym są fruktany?”. Udzielone odpowiedzi wskazują, iż
lepszą wiedzę w tym zakresie posiadają kobiety (30,23%) aniżeli mężczyźni (21,25%). Nie odnotowano różnic istotnych statystycznie pod względem
udzielonych odpowiedzi, w zależności od płci. Jednakże wiek okazał się
249
istotnym statystycznie czynnikiem różnicującym badaną grupę, ponieważ
20-24-latkowie (28,17%) wykazali się najwyższym poziomem wiedzy na temat pojęcia fruktanów. Niemniej jednak, spośród osób, które tej wiedzy nie
posiadały, 20-24-latkowie (28,93%) także stanowili największą grupę.
Z kolei, odpowiedzi na pytanie „Czy zna Pani/Pan prozdrowotne właściwości fruktanów?”, wykazały, iż lepszą wiedzę w tym aspekcie posiadają mężczyźni (16,28%) aniżeli kobiety (13,75%). W przypadku tego pytania, czynnikiem istotnie różnicującym badaną grupę okazała się być zarówno płeć, jak
i wiek respondentów. Spośród kobiet, najlepszą wiedzę na temat właściwości
prozdrowotnych fruktanów posiadają 20-24-latki (42,86%), natomiast najniższą kobiety w wieku 25-29 lat – 15% z nich nie znało odpowiedzi na to
pytanie. Z kolei wśród mężczyzn, najwyższy poziom wiedzy zaprezentowali 50-54-latkowie (27,27%), a najniższy mężczyźni w przedziale 20-24 lat,
wśród których 44% nie znało prozdrowotnych właściwości fruktanów.
Kolejne pytanie miało na celu określenie źródeł, z których ankietowani deklarujący posiadanie wiadomości o fruktanach, czerpią swoją wiedzę. Spośród
możliwych wariantów odpowiedzi, najczęściej wskazywany był Internet, zarówno w przypadku kobiet (17,35%) jak i mężczyzn (11,49%). W grupie kobiet kolejne miejsce zajmowała prasa (7%) oraz informacje pozyskiwane od
znajomych (6%). Tylko 5% pań wskazało na telewizję, zaś 3% odpowiedziało, iż korzysta z innych źródeł informacji. Wśród mężczyzn prasę i telewizję,
znajomych oraz inne źródło wskazało odpowiednio po 2,3%; 4,6% oraz 7%
ankietowanych. Różnice w odpowiedziach, w zależności od płci oraz wieku
respondentów, były nieistotne statystycznie.
Druga część ankiety miała na celu oszacowanie spożywania przez ankietowane osoby produktów będących źródłami fruktanów. Respondentów poproszono o podanie informacji obejmujących tydzień poprzedzający badanie.
Uzyskane wyniki przeanalizowano osobno dla osób, które uprzednio zadeklarowały posiadanie bądź też nie posiadanie wiedzy na temat fruktanów.
Pierwszą grupę stanowiły osoby deklarujące znajomość definicji i roli fruktanów. W codziennej diecie kobiet źródłem fruktanów okazały się być kawa
z dodatkiem cykorii (np. kawy śniadaniowe Ricore, Caro), preparaty wspomagające odchudzanie zawierające inulinę (np. Xena, Slim coffee) oraz cebula. Codzienna dieta mężczyzny, nakierowana na dostarczenie fruktanów,
opierała się głównie na spożywaniu czosnku oraz cebuli. Częstotliwość
spożycia poszczególnych źródeł fruktanów w całotygodniowej diecie zaprezentowano w Tab. 1. Płeć okazała się być czynnikiem istotnie różnicującym
badaną grupę zarówno pod względem wyboru źródeł fruktanów jak i częstotliwości ich spożywania wraz z tygodniową dietą.
250
Osoby, które uprzednio zadeklarowały brak wiedzy na temat fruktanów,
z codzienną dietą dostarczały tych związków z: czosnku, cebuli oraz kawy
z dodatkiem cykorii (np. kawy śniadaniowe Ricore, Caro).
Wśród ogółu respondentów, najrzadziej spożywanymi produktami były: cykoria, karczochy oraz syrop z agawy.
Płeć respondentów okazała się ponownie być czynnikiem istotnie różnicującym badaną grupę zarówno pod względem wyboru źródeł fruktanów w diecie jak i częstotliwości ich spożywania wraz z tygodniową dietą.
Źródło fruktanów
codziennie
5-6 razy
3-4 razy
1-2 razy
ani razu
A
A
A
A
A
B
B
B
B
B
A = kobiety, które zadeklarowały posiadanie wiedzy na temat fruktanów, B = kobiety, które
zadeklarowały brak wiedzy na temat fruktanów
cebula
1
8
0
3
12
24
12
22
1
3
czosnek
0
1
0
2
2
5
16
34
8
18
por
0
1
0
0
6
3
10
28
10
28
cykoria
0
0
0
0
3
2
2
2
21
56
karczoch
0
0
0
0
0
0
2
3
24
57
szparagi
0
0
0
1
3
2
10
17
13
40
kawa z dodatkiem cykorii
3
5
2
3
3
1
4
7
14
44
syrop z agawy
0
0
0
1
0
1
2
0
24
58
preparaty wspomagające
odchudzanie zawierające
inulinę
2
0
0
0
1
0
0
2
23
58
A = mężczyźni, którzy zadeklarowali posiadanie wiedzy na temat fruktanów, B = mężczyźni,
którzy zadeklarowali brak wiedzy na temat fruktanów
cebula
3
4
3
7
4
17
4
31
3
4
czosnek
3
4
2
1
4
11
3
24
5
23
por
1
0
0
0
3
7
5
26
8
30
cykoria
0
0
0
0
1
0
2
6
14
57
karczoch
0
0
0
0
0
0
5
3
12
60
szparagi
0
0
0
1
0
2
5
14
12
46
251
kawa z dodatkiem cykorii
0
4
0
1
0
1
2
4
15
53
syrop z agawy
0
0
0
0
0
0
0
1
17
62
preparaty wspomagające
odchudzanie zawierające
inulinę
0
0
0
0
0
0
3
0
14
63
Tab. 1. Częstotliwość spożycia produktów będących źródłem fruktanów, wśród ankietowanych
kobiet i mężczyzn, zależnie od posiadanej wiedzy na temat fruktanów
Dzienne pobranie niewchłanianych fruktanów jest trudne do oszacowania,
ponieważ zależy od ich typu oraz cech indywidualnych osób, które je spożywają. Jednym z najczęściej spożywanych przez respondentów źródeł fruktanów była cebula, której średnie spożycie w Polsce kształtuje się na poziomie
około 20 g/dobę. Biorąc pod uwagę zawartość FOS (fruktoologisacharydów)
w 100 g białej cebuli [Bartnikowska 2010], można przyjąć, iż codzienne spożywanie surowej, suszonej oraz gotowanej cebuli białej dostarczy organizmowi odpowiednio około 0,22-1,5 g; 0,94-6,38 g; 0,16-1,06 g FOS. Uważa
się, że dawka FOS, korzystnie działająca na organizm człowieka wynosi 3-6
g na dobę, a w szczególnych przypadkach do 10 g [Sucharzewska 2007].
Niemniej jednak, dotychczas w Polsce nie podjęto próby oszacowania spożycia fruktanów z całodziennej racji pokarmowej. Liczne badania wskazują
zaś na niedostateczne spożycie błonnika ogółem [Bolesławska i Przysławski
2007; Górecka i in. 2011; Szczepańska i in. 2010, 2011; Wyka i Żechałko-Czajkowska 2007]. Na podstawie badań Moshfegha i in. [1999] oszacowana została zwyczajowo spożywana całodobowa racja pokarmowa dorosłych
Amerykanów, która wynosiła średnio ok. 2,6 g inuliny i 2,5 g oligofruktozy.
Najbogatszym źródłem fruktanów w diecie Amerykanów były pszenica oraz
cebula. Natomiast spożycie fruktanów wśród mieszkańców Europy Zachodniej jest nieco wyższe. Roberfroid i Slavin [2000] wykazali, że zwyczajowo
spożywana całodobowa racja pokarmowa dorosłych Europejczyków zawierała 3,2-11,3 g fruktanów. Ich głównymi źródłami były: zupa cebulowa, pory,
czosnek. Wyniki przeprowadzonego badania są potwierdzeniem rezultatów
przytoczonych badań pod względem preferencji wyboru źródeł fruktanów
w diecie. Istnieje potrzeba dalszej analizy spożywania tych produktów,
w celu oszacowania dziennego spożycia ogółu fruktanów przez Polaków.
WNIOSKI
• Przeprowadzone badania wskazują, iż tylko 30% kobiet i niewiele ponad
20% mężczyzn potrafi wyjaśnić, czym są fruktany, zaś zaledwie 13% kobiet
oraz 16% mężczyzn zdołała wskazać prozdrowotne właściwości fruktanów.
252
• Płeć była czynnikiem istotnie determinującym poziom wiedzy respondentów.
• Najczęściej spożywanymi produktami, będącymi źródłem fruktanów,
były cebula, czosnek oraz kawa z dodatkiem cykorii.
• Kobiety istotnie częściej spożywały produkty zawierające fruktany, aniżeli mężczyźni.
LITERATURA
Bartnikowska E. 2010. Co producent i konsument powinni wiedzieć o fruktanach.
Przegląd Piekarski i Cukierniczy, 2: 12-16.
Bolesławska I., Przysławski J. 2007. Analiza sposobu żywienia kobiet i mężczyzn w
zróżnicowanych wiekowo okresach życia – energia oraz składniki podstawowe.
Roczniki PZH, 58(1): 171-176.
Cieślik E. 2004. Cechy funkcjonalne żywności pochodzenia roślinnego. VI Krajowe
Warsztaty Żywieniowe. Postępy w epidemiologii i ocenie żywności funkcjonalnej.
Sesja I, str. 11-12.
Cieślik E., Siembida A. 2010. Fruktany i ich występowanie w roślinach uprawnych.
Postępy nauk rolniczych, 4: 65-78.
Cieślik E. Gębusia A. 2011. Żywność funkcjonalna z dodatkiem fruktanów. Żywność.
Nauka. Technologia. Jakość, 2(75): 27-37.
Górecka D., Janus P. i in. 2011. Analiza spożycia błonnika pokarmowego i jego frakcji
w Polsce w ostatnim dziesięcioleciu w oparciu o dane GUS. Problemy Higieny i
Epidemiologii, 92(4): 705-708.
Moshfegh A.J., Friday J.E. i in. 1999. Presence of inulin and oligofructose in the diets
of Americans. Journal of Nutrition, 129: 1407-1411.
Roberfroid M.B., Slavin J. 2000. Nondigestible oligosaccharides. Critical Review in
Food Science and Nutrition, 40: 461-480.
Roberfroid M.B. 2007. Inulin-Type Fructans: Functional Food Ingredients. Journal
of Nutrition, 137: 2493-2502.
Sucharzewska D. 2007. Właściwości i przydatność fruktanów do produkcji wyrobów
ciastkarskich. Przegląd Piekarski i Cukierniczy, 7: 59-31.
Szczepańska J., Wądołowska L. i in. 2010. Ocena częstości spożycia wybranych źródeł błonnika pokarmowego oraz ich związku z masą ciała studentów. Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, XLIII, 3: 382- 390.
253
Szczepańska J., Wądołowska L. i in. 2011. Badanie wpływu częstości spożycia wybranych źródeł błonnika na skład ciała studentek. Problemy Higieny
i Epidemiologii, 92: 103-109.
Wyka J., Żechałko-Czajkowska A. 2007. Ocena sposobu żywienia studentów
I roku Akademii Rolniczej we Wrocławiu. Roczniki PZH, 58(1): 327-332.
prof. dr hab. inż. Ewa Cieślik, mgr inż. Agnieszka Siembida,
mgr inż. Anna Kościej, inż. Lidia Duda
Małopolskie Centrum Monitoringu Żywności
Katedra Technologii Gastronomicznej i Konsumpcji
e-mail: [email protected], [email protected], [email protected],
[email protected]
Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Ewa Cieślik
254
Dagmara Stangierska
Monika Świątkowska
EPISTEME
14/2012
s.255-262
ISSN 1895-4421
WYBRANE DETERMINANTY DECYZJI PODEJMOWANYCH PRZEZ
KONSUMENTÓW NA RYNKU USŁUG GASTRONOMICZNYCH
NA PRZYKŁADZIE McDONALD’S
SELECTED DETERMINANTS OF CONSUMER’S DECISION ON THE
FOODSERVICE MARKET – CASE McDONALD’S
Abstrakt. W artykule przedstawiono wpływ wybranych czynników na decyzje konsumentów a rynku usług gastronomicznych ze szczególnym uwzględnieniem McDonald’s.Na podstawie wyników badań pierwotnych zrealizowanych w 2010 roku
w formie zogniskowanych wywiadów grupowych wykazano, iż jakość oraz walory
smakowe potraw serwowanych w lokalach McDonald’s należą do głównych przyczyn korzystania z usług tej sieci. W opinii klientów, sieć McDonald’s wyróżnia się
powtarzalnością, przejawiającą się w stałej jakości produktów oraz zunifikowanym
menu całej sieci. Wyniki badań wykazują, iż produkty oferowane w tej sieci są postrzegane jako niezdrowe, ale jednocześnie smaczne. Inne badania dotyczące sektora
fast food potwierdzają, że jakość potraw oraz ich walory sensoryczne są czynnikami
istotnie wpływającymi na decyzję konsumentów.
Słowa kluczowe: usługi gastronomiczne, jakość, smak, McDonald’s
Summary. The paper presents influence of selected determinants on consumer choice
on the foodservice market. The results of primary research performed in 2010 in the
form of focus group interviews showed that the quality and taste of meals offered by
McDonald’s are the most important factors in choosing the services of this catering
net. In the opinion of clients, McDonald’s network is distinguished by repeatability manifested in the constant quality of products and the unified menu across the
network. The results show that the products offered at McDonald’s are considered
as unhealthy , but tasty. Other studies on the fast food sector confirms that the quality of meals as well as their sensory attributes significantly influence the decision of
consumers.
Key words: foodservice, quality, taste, McDonald’s
255
WSTĘP
Postępująca serwicyzacja życia społeczeństwa powoduje coraz częstsze
spożywanie posiłków poza domem. W ostatnich latach miał miejsce wzrost
liczby transakcji przeprowadzonych w placówkach żywienia poza domem.
W 2009 roku klienci indywidualni dokonali ponad 3 mld transakcji. Prognoza platformy Datamonitor [2010] na 2014 rok wskazuje, że liczba transakcji w placówkach żywienia poza domem może osiągnąć wartość 3,5 mld.
W 2009 roku sektor fast food z udziałem na poziomie 39% zajmował drugą
pozycję po sektorze restauracji pod względem udziałów w wartości rynku
usług gastronomicznych w Polsce [Datamonitor 2010]. Mając na uwadze
opisane powyżej trendy, zakłady gastronomiczne chcąc odnieść sukces na
rynku muszą sprostać oczekiwaniom konsumentów poprzez oferowanie produktów atrakcyjnych o satysfakcjonującej jakości.
Pojęcie jakości nie jest jednoznaczne z uwagi na jego wieloaspektowość.
W literaturze można spotkać się z dwoma głównymi sposobami definiowania jakości. Pierwsze z nich utożsamia jakość produktu z jego cechami
i własnościami, drugie zaś odwołuje się do określenia jakości jako stopnia
zaspokojenia potrzeb użytkownika przez produkt. Na potrzeby niniejszego
opracowania bardziej adekwatne jest podejście drugie, którego centralnym
punktem jest utrzymanie stałej jakości surowców i powtarzalności w procesie technologicznym, co gwarantuje utrzymanie jakości produktu końcowego
[Jeznach, 2008]. W tym ujęciu można mówić o jakości jako o powtarzalności,
stałości parametrów procesów, cech produktów. Z drugiej strony, trudno jest
określić jakie standardy są stawiane wobec jakości usługi, w tym usługi gastronomicznej, ponieważ percepcja jest kształtowana pod wpływem doświadczeń
oraz oczekiwań konsumenta [Czarnecka-Skubina 2006].
Na poziom satysfakcji z usługi gastronomicznej istotnie wpływają walory
sensoryczne dań, do których zalicza się: smak, zapach, wygląd zewnętrzny
oraz konsystencję [Gawęcki i Mossor-Pietraszewska 2004]. Cechy sensoryczne są oceniane za pomocą zmysłów: wzroku, węchu, dotyku i smaku.
Preferencje sensoryczne zależą od wrażliwości oraz indywidualnych upodobań konsumentów [Procner 2009].
McDonald’s jest jedną z najbardziej rozpoznawalnych marek gastronomicznych na polskim rynku. W ostatnich latach koncern McDonald’s promuje się
poprzez podkreślanie standardów jakości oraz walorów sensorycznych swoich potraw. Celowe jest zatem poznanie opinii konsumentów na temat jakości
oraz cech produktów serwowanych w lokalach tej sieci.
256
Wybrane determinanty decyzji podejmowanych przez konsumentów...
MATERIAŁY I METODYKA
W pracy zostały wykorzystane dane pierwotne pochodzące z badań jakościowych zrealizowanych w formie zogniskowanych wywiadów grupowych
z konsumentami odwiedzającymi placówki McDonald’s.
W ramach badań przeprowadzono 6 zogniskowanych wywiadów zrealizowanych w mini‑grupach (5-6 osobowych) w okresie od lutego do maja 2010
roku. W badaniu uwzględniono zarówno grupy jednorodne pod względem
płci i wieku (grupy 1,2,4,5),jak również grupy mieszane (grupy 3 i 6) [Tab.
1]. Badanie zrealizowano w Warszawie, a uczestnicy zostali pozyskani metodą kuli śnieżnej. Metoda ta przyczyniła się do większej homogeniczności
badanych grup pod względem sytuacji życiowej i zawodowej badanych.
W przypadku grupy wiekowej 20-29 lat uczestnicy badania w większości
byli studentami SGGW, natomiast badani powyżej 30 roku życia zazwyczaj posiadali wyższe wykształcenie, byli aktywni zawodowo oraz prawie
wszyscy mieli dzieci. Charakterystyka uczestników badania była podobna
w grupach mieszanych i jednorodnych pod względem płci. W doborze
uczestników kierowano się wyłącznie dwoma kryteriami: wieku i płci.
Uczestnicy
Liczba
uczestników
Stosowane oznaczenie
1
Kobiety, 20-29 lat
6
K 20-29
2
Mężczyźni, 20-29 lat
6
M 20-29
3
Kobiety i Mężczyźni 20-29 lat
6
k- kobieta, m-dla
mężczyzna, K+M 20-29 lat
4
Kobiety, powyżej 30 lat
5
K>30
5
Mężczyźni, powyżej 30 lat
5
M>30
6
Kobiety i Mężczyźni, powyżej
30 lat
6
k-kobieta,
m-dla mężczyzna, K+M>30
Tab. 1. Charakterystyka badanych grup. Źródło: badania własne, 2010
Wywiady grupowe przeprowadzono w oparciu o specjalnie opracowany scenariusz, który umożliwił uzyskanie informacji na temat sposobu postrzegania
firmy McDonald’si jej oferty przez konsumentów. Ze względu na charakter
badań jakościowych, analiza wyników miała również charakter jakościowy
[Maison 2010].
257
WYNIKI BADAŃ I ICH DYSKUSJA
Jakość i powtarzalność produktów w McDonald’s. Większość uczestników
badania była zdania, że McDonald’s wyróżnia się identyczną jakością oferowanych produktów, niezależnie od lokalu czy miasta. Badani uważali to
za bardzo istotną cechę, ponieważ niezależnie od restauracji zamówiony
produkt zawsze jest taki sam, co daje poczucie komfortu i bezpieczeństwa.
Uczestnicy badania twierdzili, że ważna jest również dostępność lokali oraz
zunifikowany charakter zarówno sposobu obsługi, jak i wystroju lokali.
Wskazano, że restauracje przy większych trasach są dobrze oznaczone, co
poza stałą jakością serwowanych potraw, zwłaszcza według mężczyzn po 30
roku życia, jest ważnym czynnikiem wyboru tych restauracji jako miejsca
przerwy obiadowej w trakcie podróży czy wyjazdów. Natomiast większość
kobiet zwracała uwagę na wysoki poziom czystości i schludny ubiór personelu w restauracjach McDonald’s.
Wypowiedź
Grupa
W różnych miastach ten sam produkt smakuje tak samo
K 20-29
McDonald’s jest to „dobra” jakość produktów, jest ogólnie dostępny,
bezpieczny i komfortowy.
M 20-29
W McDonald’s wiem przynajmniej jak dana potrawa smakuje i nie
będę zaskoczona
K>30
W McDonald’s zawsze smakuje tak samo.
M>30
Zawsze ten sam na całym świecie, lubię, że jest przewidywalny.
k,K+M>30
Tab. 2. Opinie uczestników badania dotyczące jakości i powtarzalności produktów
w McDonald’s. Źródło: badania własne, 2010
Warto w tym miejscu przytoczyć inne badania charakteryzujące jakość dań
dostępnych w lokalach gastronomicznych. Z badań Nowaka i wsp. [2008]
wynika, że w grupach wiekowych ze zbliżonego przedziału wiekowego co
w badaniach własnych, jakość posiłku była postrzegana jako cecha bardzo
ważna przez osoby w wieku 30-39 lat 68,4 % (sumy ocen przyznanych temu
atrybutowi) i 20-29 lat (64,4 %). Ponadto więcej mężczyzn (18,25 %) niż
kobiet (11,1 %) uznało ten atrybut za nieważny, natomiast za ważny - więcej
kobiet (30,1 %) niż mężczyzn (19,3 %). Wyniki badań Dąbrowskiej [2010]
potwierdzają, że dla Polskich konsumentów jakość jest drugim najważniejszym po cenie czynnikiem wyboru produktów żywnościowych.
Wyniki badań Adamczyk [2005] potwierdzają popularność korzystania z lokali typu fast food podczas podróży, zarówno krajowych, jak i zagranicznych. Prawie 3/4 respondentów deklarowało korzystanie z usług tego typu
placówek podczas wyjazdów. Respondenci podkreślali przy tym, że głównym powodem ich wyboru jest szybkość obsługi, oraz lokalizacja.
258
Cechy potraw serwowanych w McDonald’s. Większość osób uczestniczących w wywiadach, poproszona o podanie skojarzeń związanych z firmą
McDonald’s, używała określeń odnoszących się w głównej mierze do samych restauracji oraz potraw w nich oferowanych. Badani we wszystkich
grupach zauważali, że jest to globalna sieć restauracji oferujących dania typu
fast food. Mówiąc o McDonald’s uczestnicy badania najpierw skupiali się na
cechach i rodzaju oferowanych produktów, a następnie na elementach towarzyszących usłudze gastronomicznej.
Produkty dostępne w restauracjach McDonald’s są określane przez większość
respondentów jako niezdrowe, bardzo kaloryczne, o wysokiej zawartości tłuszczu. Określenia używane przez badanych w kontekście wartości odżywczej
potraw serwowanych w restauracjach McDonald’s mają często charakter negatywny, a takie podejście jest częściej reprezentowane przez kobiety.
Pomimo, iż większość badanych uważała produkty oferowane w McDonald’s za niezdrowe, jednocześnie twierdzili, że dania tam oferowane są smaczne. Badane osoby można podzielić na dwie grupy. Grupę pierwszą stanowiły
osoby odwiedzające restauracje McDonald’s ze względu na rodzaj serwowanych produktów, zamawiające zestawy, porcje większe objętościowo jako
substytut jednego z posiłków (np. obiadu), natomiast grupę drugą - osoby
traktujące posiłki w lokalach McDonald’s jako rodzaj przekąski (lody, ciastka, frytki, shake). Grupę pierwszą stanowili głównie młodsi mężczyźni,
a w skład grupy drugiej weszły przede wszystkim kobiety.
Wypowiedź
Grupa
Ludzie uzależniają się od jedzenia z McDonalda. Nie zdają
sobie sprawy, że jest niezdrowy.
K 20-29
Jem tylko wybrane produkty, nigdy nie chodzę do Mc na obiad.
K 20-29
Jest bardzo kaloryczne i dlatego jak zjem mam wyrzuty
sumienia.
k,K+M 20-29
Według mnie jedzenie w McDonald’s jest pyszne.
m,K+M 20-29
Lubię tam ciasteczka, reszta mi nie odpowiada.
k,K+M>30
W McDonald’s jest bardzo tłuste jedzenie
m,K+M>30
Tab. 3. Opinie uczestników badania dotyczące cechy potraw serwowanych w McDonald’s. Źródło: badania własne, 2010
Badania Kowalczuk [2010] wykazały , iż głównym powodem korzystania
z oferty usług gastronomicznych jest smak dań (54,3%) na drugiej pozycji
znajdowała się cena (49,8%). W tych samych badaniach ankietowani jako
jeden z najmniej istotnych powodów żywienia poza domem wskazali wysoką
wartość odżywczą dań (3,9%) oferowanych w lokalach gastronomicznych.
W badań Prybutok i wsp. [2010] wykazano największą zależność pomiędzy
259
takimi cechami jak: świeżość, atrakcyjność wizualna i sensoryczna, a także szerokość asortymentu oferowanych potraw oraz napojów, a satysfakcją
klientów z usługi gastronomicznej. Zbliżone opinie na temat czynników
wpływający na decyzje konsumentów na rynku usług gastronomicznych
uzyskał w swoich badaniach Geissler [2010] respondenci za najważniejsze
uznali jakość i cechy sensoryczne żywości (53%), następnie cenę (17%), bardzo ważna okazała się też różnorodność asortymentu (11%) zajmując trzecią
pozycję.W badaniach Adamczyk [2005] konsumenci za najbardziej istotny
czynnik decydujący o wyborze restauracji typu fast food uznali smakowitość serwowanych dań, a także różnorodność i duży wybór potraw. Ponadto
w tym samym badaniu respondenci jako negatywne atrybuty dań typu fast
food podkreślali ich niezdrowy charakter.
Wyniki przytoczonych badań są zbieżne z uzyskanymi w badaniach własnych, a mianowicie konsumenci w pierwszej kolejności zwracają uwagę
na cechy hedonistyczne żywności oferowanej w lokalach gastronomicznych
(atrakcyjność sensoryczną ), w dalszej kolejności maja znaczenie cechy utylitarne takie jak wartość odżywcza.
WNIOSKI
W porównaniu do innych firm z sektora gastronomicznego, McDonald’s
charakteryzuje się największą rozpoznawalnością wśród konsumentów.
W opinii klientów, sieć McDonald’s wyróżnia się powtarzalnością usługi gastronomiczne, przejawiającą się w stałej jakości produktów oraz zunifikowanym menu całej sieci. Jakość jest pozytywnym atrybutem usług oferowanych
przez firmę McDonald’s.
Cechy serwowanych produktów są kolejnym elementem charakteryzującym
firmę. Dania dostępne w tej sieci są postrzegane jako smaczne, ale też niezdrowe. Konsumenci charakteryzują potrawy serwowane w lokalach McDonald’s zarówno poprzez określenia odnoszące się do wartości odżywczej, jak
i walorów sensorycznych. Należy zauważyć, że pomimo dominującej negatywnej opinii na temat wartości odżywczej potraw serwowanych w McDonald’s ich walory sensoryczne są oceniane pozytywnie.
260
LITERATURA
Adamczyk G. 2005. Popularność restauracji typu fast food wśród mieszkańców Poznania. Stowarzyszenie Ekonomistów Rolnictwa i Agrobiznesu. Roczniki Naukowe t. VII, z.3: 7-11
Czarnecka-Skubina E. 2006. Jakość usługi gastronomicznej w aspekcie żywieniowym, technologicznym i higienicznym. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość. nr 46: 25 – 34
Datamonitor 2010. Foodservice in Poland. Industry Profile. Wyd. Datamonitor, Londyn
Dąbrowska A. 2010. Consumer behaviour in the market of catering services in selected
countries of Central-Eastern Europe. British Food Journal t. 113, nr 1: 96-108
Gawęcki J., Mossor-Pietraszewska T. 2004. Kompendium wiedzy o żywności, żywieniu i zdrowiu. PWN, Warszawa, s. 23-56
Geissler G. L. 2010. Healthy food At work? An examination of a proposed catering
service conept. Journal of Food Products Marketing, nr 16: 350-360
Jeznach M. 2008. Uwarunkowania ekonomiczno-organizacyjne
i bezpieczeństwa żywności. Wyd. SGGW, Warszawa, s. 32-41
jakości
Kawa M. 2008. Oddziaływanie marki na decyzje zakupowe konsumentów. Zeszyty
Naukowe Uniwersytetu Szczecińskiego, nr 510: 223-230
Kowalczuk I. 2010. Oferta usługowa a oczekiwania konsumentów na rynku usług
gastronomicznych, w: Gastronomia w ofercie turystycznej regionu, red. Z. J. Dolatowski, D. Kołożyn-Krajewska, Wyd. Wyższa Szkola Hotelarstwa i Turystyki
w Częstochowie, Częstochowa, s. 224-246
Maison D. 2010. Jakościowe metody badań marketingowych. Jak zrozumieć konsumenta. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa, s. 14-23
Nowak M. i wsp. 2008. Pozycja jakości posiłków wśród czynników kształtujących
preferencje nabywców usług gastronomicznych. Żywność. Nauka. Technologia.
Jakość, nr 3: 132-40
Procner A. 2009. Technologia gastronomiczna z towaroznawstwem. cz. 1. WSIP,
Warszaw, s. 37-48
Prybutok V. R. i wsp. 2010. Perceived service quality in fast-food restaurants: empirical evidence from China. International Journal of Quality & Reliability Management t. 27, nr 4: 424-437
261
mgr inż. Dagmara Stangierska, dr Monika Świątkowska
Katedra Organizacji i Ekonomiki Konsumpcji
Wydział Nauk o Żywieniu Człowieka i Konsumpcji
Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie
ul. Nowoursynowska 166, 02-787 Warsaw
Opiekun naukowy: prof. dr hab. Barbara Kowrygo
262
Agnieszka Staszowska
Anna Litwińczuk
Monika Kędzierska
Piotr Skałecki
EPISTEME
14/2012
s.263-268
ISSN 1895-4421
ZAWARTOŚĆ MIKRO- I MAKROELEMENTÓW W TKANCE MIĘŚNIOWEJ
WYBRANYCH GATUNKÓW RYB Z MORZA BAŁTYCKIEGO
CONTENT OF MICRO- AND MACROELEMENTS IN THE MUSCLE
TISSUE OF SELECTED FISH SPECIES FROM THE BALTIC SEA
Abstrakt. Mięso ryb jest uznawane za wysokowartościowe pod względem odżywczym oraz łatwo strawne. Jednak spożycie ryb w Polsce jest niższe w porównaniu
z większością krajów Unii Europejskiej. Największą popularnością wśród Polaków
cieszą się ryby morskie. Celem pracy była ocena zawartości mikro- i makroelementów w mięsie trzech gatunków ryb morskich – dorsza, gładzicy i śledzia. Badaniami
objęto łącznie 60 ryb pozyskanych w Morzu Bałtyckim, po 20 osobników każdego
gatunku. W pobranych próbach oznaczono zawartość mikro- i makroelementów techniką płomieniowej atomowej spektrometrii absorpcyjnej z wykorzystaniem spektrometru SOLAR 939 (Unicam). Porównując zawartość składników mineralnych wykazano, że mięso pochodzące z dorsza okazało się najlepszym źródłem Fe, natomiast
najwyższe stężenie Cu, Mn, Zn oraz Na oznaczono w mięsie gładzicy. Biorąc pod
uwagę pozostałe makroelementy (Mg, Ca, K) stwierdzono ich najwyższą zawartość
w mięsie śledzi.
Słowa kluczowe: ryby morskie, mięso, mikroelementy, makroelementy
Summary. Fish meat is considered as highly nutritive and easily digested. However,
the fish consumption in Poland is lower than in majority countries European Union.
Among Polish consumers the sea fish are the most popular. The aim of this work
was to evaluate the content of micro- and macroelements in meat of 3 species of
sea fish: cod, plaice, herring. The study was conducted on a total of 60 fish obtained
from the Baltic Sea, i.e.: 20 fish from each species. Micro- and macroelements were
determined with the usage of the flame atomic absorption spectrometry (SOLAR 939
Unicam Spectrometer). Comparing the mineral content it has been shown that meat
obtained from cod was the best source of Fe, whereas the highest concentration of Cu,
Mn, Zn and Na was found in the meat of plaice. The highest amounts of other macroelements (Mg, Ca, K) were determined in the herring’s meat.
Key words: sea fish, meat, microelements, macroelements
263
WSTĘP
Właściwości żywieniowe ryb i produktów rybnych czynią je bardzo cennymi
artykułami spożywczymi, które korzystnie wpływają na organizm człowieka.
Ryby, zwłaszcza morskie, są źródłem nie tylko niezbędnych nienasyconych
kwasów tłuszczowych i pełnowartościowego białka, ale również składników
mineralnych [Łuczyńska i in. 2011; Usydus i in. 2011].
Spożycie ryb w Polsce jest znacznie niższe w porównaniu z większością krajów Unii Europejskiej. W 2008 roku wynosiło zaledwie 13,01 kg/osobę, natomiast średnie spożycie ryb na świecie około 30 kg/osobę [Seremak-Bulge
i in. 2008]. Niewielka konsumpcja ryb i produktów rybnych może wynikać
z braku odpowiedniej informacji dla konsumenta dotyczącej ich wysokiej
wartości odżywczej.
Mimo to, jak pokazują badania Trondsen i in. [2004] konsumenci generalnie
uważają, że spożycie ryb jest zdrowe. Zatem ze względu na wzrost świadomości konsumentów, zwiększa się zainteresowanie spożywaną żywnością,
jej składem i pochodzeniem. Ryby, głównie morskie, ze względu na bogactwo składników odżywczych (PUFA, białko o wysokiej wartości odżywczej,
witaminy i składniki mineralne) zalecane są w diecie każdego człowieka,
a w szczególności w diecie osób zagrożonych chorobami serca i układu krążenia [Grela i in. 2010].
Według Górskiej-Warsewicz [2007] w strukturze preferencji ryb najwyższą
pozycję zajmuje karp (20,4 % wskazań), następnie makrela (19,9 %), śledź
(17,4 %), dorsz (16,6 %), łosoś (13,8 %), mintaj (13,5 %) oraz panga (13
%). Najczęściej konsumenci wybierają ryby mrożone – 90 % deklaracji, następnie ryby wędzone (86 %) i konserwy rybne (85 %). Ryby świeże natomiast spożywane są najczęściej przez ludność miejską. Powodów takiego
stanu rzeczy należy upatrywać w dostępności tego typu asortymentu w sieciach handlowych. Dodatkowym czynnikiem ograniczającym spożycie ryb
świeżych są limity połowowe na Bałtyku, dotyczy to głównie droższych gatunków ryb (dorszy, łososi). Dlatego jadłospis uzupełniają przetwory rybne,
które są obecne na rynku przez cały rok [Skałecki i in. 2008].
Skład mięsa ryb zarówno pod względem ilościowym jak i jakościowym jest
zróżnicowany. Wpływa na to wiele czynników, takich jak: gatunek, wiek,
miejsce żerowania i rodzaj spożywanego pożywienia, a także czas i sposób
połowu oraz czynniki związane z transportem [Rywotycki 2005].
Celem podjętych badań była ocena zawartości mikro- i makroelementów
w mięsie trzech gatunków ryb z Morza Bałtyckiego – dorsza, gładzicy i śledzia.
264
Zawartość mikro- i makroelementów w tkance mięśniowej wybranych gatunków ryb...
MATERIAŁ I METODY
Materiał badawczy stanowiły trzy gatunki ryb: dorsz (Gadus morhua callarias), gładzica (Pleuronectes platessa) i śledź (Clupea harengus membras).
Łącznie badaniami objęto 60 ryb, po 20 osobników każdego gatunku. Ryby
zostały odłowione w Morzu Bałtyckim w 2010 roku.
W celu oznaczenia składników mineralnych pobrane próbki mięsa ryb poddano mineralizacji na mokro w mieszaninie HNO3 i HClO4 zgodnie ze standardami AOAC 986.15 [2000]. W zmineralizowanych próbach oznaczono
zawartość mikroelementów: cynku, żelaza, manganu i miedzi oraz makroelementów: potasu, sodu, wapnia, magnezu. Analizę mikro- i makroelementów przeprowadzono techniką płomieniowej atomowej spektroskopii absorpcyjnej (płomień powietrze-acetylen) przy użyciu spektrometru SOLAR 939
(Unicam) z zastosowaniem korekcji tła w czasie analizy oraz z uwzględnieniem limitu oznaczalności (LOQ) oraz limitu wykrywalności (LOD). W celu
wyeliminowania oddziaływania fosforu, podczas analizy zawartości wapnia,
do wszystkich próbek oraz wzorców dodawano chlorek lantanu. Oznaczenie
ilościowe zostało przeprowadzone metodą krzywej wzorcowej.
Analiza została wykonana przez Centralne Laboratorium Agroekologiczne
w Lublinie. Otrzymane wyniki wyrażono w mg · kg–1 świeżej masy. Analizę statystyczną wykonano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji,
wykorzystując program StatSoft STATISTICA ver. 6.0. Istotność różnic pomiędzy średnimi w poszczególnych grupach zweryfikowano testem rozstępu
Duncana na poziomie istotności α = 0,01 i α = 0,05.
WYNIKI I DYSKUSJA
Analizując zawartość mikroelementów (Tab. 1) w mięsie badanych ryb stwierdzono, że zawartość miedzi kształtowała się na poziomie 1,16 mg · kg–1 (gładzica), 1,13 mg · kg–1 (dorsz) i 0,89 mg · kg–1 (śledź). Nieco niższe stężenie miedzi
w mięsie podaje Polak-Juszczak [2009], w zakresie 0,45 – 0,70 mg · kg–1 dla śledzia oraz 0,12 – 0,25 mg · kg–1 dla dorsza. Zbliżone wyniki do uzyskanych przez
Polak-Juszczak [2009] podaje również Szlinder-Richert [2011].
Zawartość manganu w mięśniach badanych ryb mieściła się w granicach od
1,07 mg · kg–1 (dorsz) do 1,61 mg · kg–1 (gładzica). Znacznie niższy zakres
zawartości manganu dla mięsa śledzia pochodzącego także z Morza Bałtyckiego podaje Tahvonen i in. [2000] 0,30 – 0,63 mg · kg–1.
Omawiając poziom cynku w mięsie badanych ryb stwierdzono jego najwyższe stężenie w przypadku gładzicy, podobnie jak miedzi i manganu. Badania
przeprowadzone przez Szlinder-Richert [2011] potwierdzają wyniki otrzymane dla mięsa śledzia, natomiast w przypadku mięsa dorsza zarówno Szlin265
der-Richert [2011] jak i Polak-Juszczak [2009] podają niższe zawartości,
odpowiednio 4,7 mg · kg–1 oraz 3,97 – 5,15 mg · kg–1.
1
1.0.0.1
Wyróżnienie
Cu
Mn
Zn
Fe
[mg · kg świeżej masy] / [mg · kg wet weight]
–1
–1
Dorsz
Gadus morhua callarias
x
s
1,13
0,09
1,07
0,17
6,81
0,92
9,54
2,87
Gładzica
Pleuronectes platessa
x
s
1,16
0,13
1,61
0,41
10,25
1,50
8,58
1,28
Śledź
Clupea harengus
membras
x
s
0,89
0,19
1,32
0,53
8,99
1,90
9,34
2,41
Tab. 1. Zawartość mikroelementów w mięsie badanych ryb. Różnice statystycznie istotne: a,b
przy P£ 0,05; A,B przy P£ 0,01
Najwyższy poziom żelaza stwierdzono w mięsie dorsza (9,54 mg · kg–1), a najniższy w mięsie gładzicy (8,58 mg · kg–1). W mięsie śledzia zawartość tego pierwiastka wynosiła 9,34 mg · kg–1 i była wyższa w porównaniu z wynikiem uzyskanym
przez Tahvonen i in. [2000], natomiast niższa niż podaje Du i in. [2012].
Oceniając stężenie magnezu (Tab. 2) stwierdzono istotnie (P≤0,05) niższą zawartość tego pierwiastka w mięsie dorsza i gładzicy w porównaniu do mięsa
śledzia. Mniejsze stężenie magnezu i wapnia w mięsie śledzia bałtyckiego
oznaczyli Tahvonen i in. [2000], odpowiednio dla magnezu 282 mg · kg–1
i wapnia 874 mg · kg–1. Stężenie wapnia w tkance mięśniowej śledzi było
również przedmiotem badań Szlinder-Richert i in. [2011] oraz Du i in.
[2012]. Oznaczyli oni zawartość tego pierwiastka na poziomie, odpowiednio
736 mg · kg–1 oraz 770 mg · kg–1.
2
Mg
Wyróżnienie
Ca
Na
K
[mg · kg świeżej masy] / [mg · kg wet weight]
–1
–1
Dorsz
(Gadus morhua callarias)
x
s
303,14a
22,52
583,69
82,39
545,15A
20,38
2055,80
119,49
Gładzica
(Pleuronectes platessa)
x
s
383,30a
74,88
981,26
127,49
670,18B
67,23
1970,88
160,89
Śledź
(Clupea harengus membras)
x
s
432,38b
52,98
1269,91
735,32
580,94AB
52,02
2242,60
309,13
Tab. 2. Zawartość makroelementów w mięsie badanych ryb. Różnice statystycznie istotne: a,b
przy P£ 0,05; A,B przy P£ 0,01
266
Zawartość mikro- i makroelementów w tkance mięśniowej wybranych gatunków ryb...
W przypadku zawartości sodu odnotowano istotne (P≤0,01) różnice międzygatunkowe. Najwyższą zawartość sodu stwierdzono w mięsie gładzicy,
najniższą natomiast u dorsza. Zawartość potasu nie różniła się istotnie pomiędzy gatunkami i mieściła się w zakresie od 1970,88 mg · kg–1 do 2242,60
mg · kg–1. Wykazana zawartość sodu i potasu w mięsie śledzia mieściła się
w zakresach podanych przez Tahvonen i in. [2000] i wynosiła odpowiednio
580,94 mg · kg–1 oraz 2242,60 mg · kg–1.
WNIOSKI
• Nie wykazano istotnego zróżnicowania zawartości manganu, miedzi,
cynku, żelaza oraz wapnia i potasu w tkance mięśniowej ocenianych ryb
(dorsza, gładzicy i śledzia). Istotny wpływ gatunku stwierdzono w przypadku sodu i magnezu.
• Najwyższy poziom miedzi, manganu, cynku, sodu stwierdzono w mięsie
gładzicy, magnezu, wapnia, potasu w mięsie śledzia natomiast poziom
żelaza był zbliżony w mięsie dorsza i śledzia.
BIBLIOGRAFIA
AOAC. 2000. Official Methods of Analysis of the AOAC 986.15. Multielement method. 17th ed. Arlington. Virginia USA
Du Z-Y. Zhang J. Wang Ch. Li L. Man Q. Lundebye A-K. Froyland L. 2012. Riskbenefit evaluation of fish from Chinese markets: Nutrients and contaminants in 24
fish species from five big cities and related assessment for human health. Science
of the Total Environment, 416: 187-199
Grela E.R. Pisarski R.K. Kowalczuk-Vasiliev E. Rudnicka A. 2010. Zawartość składników odżywczych, mineralnych i profil kwasów tłuszczowych w mięsie wybranych gatunków ryb w zależności od terminu odłowu. Żywność Nauka Technologia
Jakość, 4 (71):63-72
Górska-Warsewicz H. 2007. Konsument na rynku ryb i przetworów rybnych. Przemysł Spożywczy, 5: 48-50
Łuczyńska J. Tońska E. Borejszo Z. 2011. Zawartość makro- i mikroelementów oraz
kwasów tłuszczowych w mięśniach łososia (Salmo salar l.), pstrąga tęczowego
(Oncorhynchus mykiss walb.) i karpia (Cyprinus carpio l.). Żywność Nauka
Technologia Jakość, 3 (76): 162-172
Polak-Juszczak L. 2009. Temporal trends in the bioaccumulation of trace metals in
herring, sprat, and cod from the southern Baltic Sea in the 1994-2003 period.
Chemosphere, 76: 1334-1339
267
Rywotycki R. 2005. Wpływ czynników ilościowo-jakościowych, przetwórczych oraz
chłodniczych kształtujących wartości surowców rybnych dla konsumentów,
Chłodnictwo, XL (5): 45-48
Seremak-Bulge J. Kuzebski E. Pieńkowska B. Rakowski M. Szostak S. Hryszko
K. 2008. Rynek ryb. Stan i perspektywy. Analizy rynkowe. Wydawnictwo IERiGŻ-PIB. Warszawa
Skałecki P. Litwińczuk A. Florek M. Kędzierska-Matysek M. Domaradzki P. 2008.
Ocena wartości użytkowej i jakości mięsa dwóch gatunków ryb morskich. Roczniki
Naukowe Polskiego Towarzystwa Zootechnicznego, 4 (4): 169-174
Szlinder-Richert J. Usydus Z. Malesa-Ciećwierz M. Polak-Juszczak L. Ruczyńska W.
2011. Marine and farmed fish on the Polish market: Comparison of the nutritive
value and human exposure to PCDD/Fs and other contaminats. Chemosphere,
85: 1725-1733
Tahvonen R. Aro T. Nurmi J. Kallio H. 2000. Mineral Content in Baltic Herring and Baltic
Herring Products. Journal of Food Composition and Analysis, 13: 893-903
Consumption of seafood – the influTrondsen T. Braaten T. Lund E. Eggen A.E. 2004. ��
ence of overweight ond health beliefs. Food Quality and Preference, 15: 361-374
Usydus Z. Szlinder-Richert J. Adamczyk M. Szatkowska U. 2011. Marine and farmed
fish in the Polish market: Comparison of the nutritional value. Food Chemistry,
126: 78-84
dr Piotr Skałecki, mgr inż. Agnieszka Staszowska,
prof. dr hab. Anna Litwińczuk, dr inż. Monika Kędzierska-Matysek
Katedra Towaroznawstwa i Przetwórstwa Surowców Zwierzęcych
Opiekun naukowy: dr hab. Mariusz Florek
268
Marek Szeląg
Karolina Malecka
EPISTEME
14/2012
s.269-275
ISSN 1895-4421
WPŁYW PARAMETRÓW TECHNICZNYCH UKŁADU ROBOCZEGO
KUTRA NA OGRANICZENIE PRZYROSTU TEMPERATURY I MIGRACJI ZUŻYTYCH CZĄSTEK DO ROZDRABNIANEGO SUROWCA
PODCZAS KUTROWANIA
INFLUENCE OF TECHNICAL PARAMETERS WORK OF CUTTER
ON REDUCING TEMPERATURE RISE AND MIGRATION OF WORN
PARTICLES TO THE SHREDDED RAW MATERIAL
Abstrakt. W pracy przedstawiono zagadnienia dotyczące kształtowania krawędzi
tnących noży kutra w odniesieniu do ilości generowanego ciepła, a także zużywania ściernego i wykruszeniowego, jako efektu procesu kutrowania. Sformułowanie:
kształtowanie krawędzi tnących noży, odnosi się do kształtu geometrycznego, a także do struktury materiału, z którego wykonano noże. Za miarę generowanego ciepła
przyjęto przyrost temperatury farszu mięsnego, uzyskanego przy stosowaniu: a) oryginalnego kompletu noży i kutra laboratoryjnego, b) kompletu noży według projektu
autorskiego i tego samego kutra laboratoryjnego. Na podstawie obrazów mikrostruktury zużytego noża pracującego w kutrze przemysłowym dokonano analizy przyczyn
zużycia ściernego powierzchni ostrza oraz powstawania mikropęknięć. Stwierdzono,
iż wprowadzenie do mikrostruktury węglików pierwotnych oraz wtórnych sprzyja
zwiększaniu odporności na zużycie, ale jednocześnie w przypadku ich niekorzystnej
morfologii może skutkować niebezpieczeństwem występowania dużych wykruszeń
noża.
Słowa kluczowe: kutrowanie, temperatura farszu mięsnego, kształt ostrza zużycie
ścierne, migracja cząstek
Summary. The paper presents issues concerning design of the cutting edge of knife
in relation to heat generated, abrasive wear and cracking, as a result of the cutting
process. Formulation: shaping edge of knife, refers to geometric shape and structure
material from which knives were made. As a measure of the generated heat adopted
rise of meat batter temperature obtained in application of: a) original set of knives and
cutter, b) designed by author set of knives and the same cutter. Based on the microstructure of cutter knife was made analysis of the causes of abrasive consumption of
blade and formation of micro cracks. It was found that the introduction to microstructure of carbides primary and secondary, influences to increase in resistance to wear,
but in case of unfavorable morphology can cause a danger of cracking knife.
Key words: cutters, temperature of meat batter, the shape of the blade, wear abrasive, migration of particle
269
WSTĘP
Kutrowanie jest najważniejszym etapem w procesie produkcji kiełbas drobno rozdrobnionych. Podczas kutrowania następuje rozdrobnienie surowca,
wyekstrahowanie i uwodnienie białek mięśniowych, zemulgowanie tłuszczu
oraz – w wyniku mieszania i homogenizacji – wyrównanie przestrzennej
dyspersji wszystkich składników [Pisula, Pospiecha i inni, 2011]. Podstawowymi czynnikami technicznymi wpływającymi na efekt kutrowania są:
prędkość obrotowa noży i misy, kształt geometryczny krawędzi tnącej noży,
kąt i stopień zużycia ostrza noży, liczba i sposób zamontowania noży na wale
nożowym, stopień wypełnienia misy. Wśród szeregu problemów technologicznych związanych z zabiegiem kutrowania należy wymienić dwa podstawowe: przechodzenie produktów zużycia noży i obudowy do rozdrabnianego surowca oraz wzrost temperatury surowca podczas procesu kutrowania
[Dolata 2001, Fabian 2010, ]. Wzrostem temperatury podczas procesu kutrowania zajmuje się wielu autorów [Dolata 1998, Szeląg 2011]. Natomiast
problem zużycia ściernego noży i migracji cząstek metalu do farszu mięsnego wciąż oczekuje na badania eksperymentalne i opracowania naukowe
charakteryzujące problem w sensie jakościowym i ilościowym. Prace mające
na celu obniżenie temperatury rozdrabnianego surowca sprowadzają się do
projektowania nowych kształtów elementów roboczych (noży) nie uwzględniając zmian w materiale, z którego są wykonane. W literaturze przedmiotu
próżno szukać opracowań na temat migracji zużytych cząstek metalu do rozdrabnianego surowca, a jeśli już gdzieś się spotyka takie opracowania to nie
są one poparte wiarygodnymi badaniami naukowymi.
Celem badań było:
• przeprowadzenie mikrostrukturalnej analizy stali, z której wykonano
noże do kutra przemysłowego Kramer Greber (K+G 200) i określenie
przyczyn zużycia ściernego,
• określenie wpływu kształtu noży kutra na ograniczenie przyrostu temperatury sporządzanego farszu mięsnego,
• zaprojektowanie nowego kształtu ostrza noża, z równoczesnym wyborem materiału i jego struktury wpływającego na obniżenie temperatury
podczas kutrowania oraz na zmniejszenie intensywności zużywania połączonego z migracją zużytych cząstek metalu do farszu mięsnego.
MATERIAŁ I METODY
Badania podzielone zostały na dwie części. Pierwsza dotyczyła analizy mikrostrukturalnej noża kutra przemysłowego, a druga zaprojektowania, wykonania i przeprowadzenia badań laboratoryjnych na autorskich nożach do
270
Wpływ parametrów technicznych układu roboczego kutra...
kutra laboratoryjnego. Analizę mikrostrukturalną stali, z której wykonano
noże do kutra przemysłowego przeprowadzono w Katedrze Metaloznawstwa
i Metalurgii Proszków Akademii Górniczo-Hutniczej w Krakowie. Przedmiotem analizy mikrostrukturalnej był nóż pracujący przez cały cykl produkcyjny (6 miesięcy) w zakładzie przemysłowym. Z badanego noża pobrano trzy próbki przez wycięcie materiału w miejscach: 1, 2, 3, leżących
w obszarze krawędzi tnącej widocznej na Rys. 1.
Rys. 1. Schemat
rozmieszczenia pobranych
próbek do badań
W celu zdiagnozowania przyczyn zużywania ściernego noży dokonano obserwacji powierzchni oraz analizy mikrostruktury na zgładach poprzecznych
(prostopadłych do krawędzi ostrza). Otrzymane wyniki i ich analiza posłużyły do doboru odpowiedniego materiału i jego obróbki na zaprojektowane
i wykonane noże w części laboratoryjnej badań.
W drugiej części badań została przeprowadzona analiza istniejących kształtów ostrza noży do kutra i wykonany projekt autorskiego kształtu ostrza, który miał wpłynąć na obniżenie temperatury rozdrabnianego surowca. Badania
polegały na sporządzeniu dwóch jednakowych farszów co do składu surowca
i czasu kutrowania z wykorzystaniem dwóch różnych zestawów noży. W czasie kutrowania periodycznie dokonany został pomiar przyrostu temperatury
We współpracy z firmą zewnętrzną został wykonany komplet noży do kutra
laboratoryjnego według projektu autorskiego i jego efekty pracy porównane
z oryginalnym kompletem zamontowanym w kutrze. Badania porównawcze
przeprowadzono w Katedrze Przetwórstwa Produktów Zwierzęcych, Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie na kutrze laboratoryjnym MADO Garant
MTK 661. W standardowym wyposażeniu kuter ten posiada komplet 3 sztuk
noży o kształcie przedstawionym na Rys. 2, jest to kształt jednej linii łukowej. Taki mało agresywny kształt ostrza przyczynia się do wydłużenia czasu
kutrowania, ale uzyskany stopień rozdrobnienia farszu nie jest zadowalający.
271
Rys. 2. Model przestrzenny oryginalnego noża do kutra laboratoryjnego.
Rys. 3. Model przestrzenny autorskiego noża do kutra laboratoryjnego
Kształt ostrza zaproponowany przez autora przedstawiony na Rys. 3 składający się z bardziej agresywnych odcinków tworzących linię łamaną wpłynął
na skrócenie procesu kutrowania poprzez szybsze uzyskanie porównywalnych parametrów farszu, a przede wszystkim w istotny statystycznie sposób
przyczynić się do obniżenia temperatury rozdrabnianego mięsa.
WYNIKI I DYSKUSJA
Analiza mikrostruktury noża do kutra przemysłowego. Badana stal, z której
wykonano nóż kutra przemysłowego charakteryzowała się twardością 500
HV30. Mikrostruktura w obszarze ostrza charakteryzuje się osnową martenzytyczną z wydzieleniami węglików pierwotnych oraz węglików wtórnych
tworzących ciągłą siatkę po granicach byłego ziarna byłego austenitu. Pasma węglików pierwotnych są równoległe do powierzchni płaszczyzny noża,
co powoduje, że są ułożone prostopadle do krawędzi tnącej ostrza (Rys. 4).
Takie ułożenie węglików pierwotnych może w istotny sposób wpływać na
mechanizm zużycia krawędzi tnącej ostrza. Obraz powierzchni krawędzi tnącej ostrza przedstawiono na Rys. 5. Oddziaływanie węglików pierwotnych
na proces zużycia dobrze obrazują zgłady metalograficzne wykonane przy
powierzchni kątowej ostrza. Węgliki te oddziaływają hamująco na zużycie
(Rys. 6), jednakże wykazują one również skłonność do pękania (fragmentacji) w wyniku oddziaływania tribologicznego (Rys. 7).
Pęknięcia zainicjowane w ww. węglikach mogą rozwijać się w głąb materiału. W rozwoju pęknięć w głąb materiału noża istotną rolę odgrywają wydzielenia węglików wtórnych przekazując pęknięcia od jednego do drugiego
węglika wtórnego. Dekohezja następuje albo na granicy fazowej węglik pierwotny – osnowa lub w obszarze węglika pierwotnego. Tego typu pęknięcia
stwarzają niebezpieczeństwo przedostania się do farszu dużych fragmentów
noża. Należy więc rozważyć możliwość zastosowania do wykonania noży
do kutra innego rodzaju stali, która w mikrostrukturze nie będzie zawierała
272
węglików rozmieszczonych w postaci pasm. Należy przy tym zaznaczyć, że
zarówno pierwotne jak i wtórne węgliki wykazują pozytywny wpływ na odporność na zużycie noża.
Rys. 4. Ułożenie węglików pierwotnych w
stosunku do krawędzi natarcia noża – próbka
nr 2
Rys. 5. Powierzchnia tnąca ostrza noża kutra próbka nr 3
Rys. 6. Mikrostruktura w pobliżu powierzchni
kątowej noża – próbka nr 2
Rys. 7. Rozwój pęknięcia w mikrostrukturze
noża - próbka nr 3
273
Wpływ kształtu ostrza noży na obniżenie temperatury podczas kutrowania
W celu wykazania różnic występujących miedzy tymi dwoma kompletami
noży przeprowadzono badania polegające na sporządzeniu dwóch jednakowych farszów co do składu objętości przy użyciu dwóch różnych zespołów
rozdrabniających. Farsz 1 został sporządzony przy pomocy noży oryginalnych natomiast drugi z wykorzystaniem noży autorskich. Pomiar temperatury odbywał się periodycznie po 4, 8, i 14 minutach, kiedy to zakończono
kutrowanie. Odpowiednio w 4 i 6 minucie dodawano lód po połowie zaplanowanej masy, a w 12 minucie dodano tłuszcz. Składnikami do sporządzanego farszu było: mięso wieprzowe (łopatka 2,5 kg), słonina (1,65 kg), lód
(0,8 kg), dodatki (Vitakut VFe Parówka Burgundzka II - g·kg-1, mieszanka
peklująca - g·kg-1). Surowiec został poddany procesowi rozdrobnienia na
wilku laboratoryjnym i schłodzony do temperatury 0 oC. Przed rozpoczęciem
rozdrabniania surowca misa kutra została schłodzona lodem łuskowym do
temperatury 3,8 oC.
Temperatura rozdrabnianego surowca [oC]
Lp.
Czas kutrowania i dodane składniki
1.
Farsz I
(noże oryginalne)
Farsz II
(noże autorskie)
Temperatura mięsa przed kutrowaniem
0,0
0,0
2.
Temperatura misy przed kutrowaniem
23,0
23,0
3.
Temperatura misy po schłodzeniu
3,8
3,8
4.
Po 4 min. dodano połowę lodu i
zmierzono temp.
7,0
6,0
5.
6.
7.
8.
Po 6 min. dodano resztę lodu
Po 8 min. temperatura farszu wynosiła
9,5
8,5
Po 12 min. dodano tłuszcz
Po 14 min. temperatura farszu wynosiła
12,5
11,1
Tab. 1. Zmiana temperatury podczas kutrowania w zależności od stosowanych noży
Temperatura farszu mięsnego w badaniach laboratoryjnych przy stosowaniu
noży wg projektu autorskiego, po czasie kutrowania 4, 8 i 14 minut była
niższa średnio o 1,13 oC w odniesieniu do stosowanych noży oryginalnych.
Natomiast największa różnica w pomiarze temperatury wynosiła 1,4 oC na
korzyść noży wg projektu autorskiego po czasie kutrowania 14 minut.
274
WNIOSKI
• Z dużym prawdopodobieństwem można stwierdzić, że największa różnica
w temperaturze farszu mięsnego przy najdłuższym czasie kutrowania wynika stąd, iż kształt geometryczny noży oryginalnych ma większą zdolność
kumulowania ciepła, aniżeli noże wg projektu autorskiego.
• Częściowe znaczenie na zachowanie niższej temperatury kutrowanego
farszu ma także kształt samego ostrza krawędzi tnącej noża. Ostrze noża
wg projektu autorskiego ma kształt klina o pochyleniu jednostronnym,
natomiast nóż oryginalny posiada ostrze zakończone promieniem.
• Pęknięcia i wykruszenia na ostrzu noża kutra przemysłowego powodowane
są niewłaściwą strukturą materiału otrzymaną po procesie hartowania.
BIBLIOGRAFIA
Dolata W. 1998. Ocena efektywności pracy noży kutra o różnych kształtach krawędzi
tnącej. Mięso i Wędliny. 6: 48-52.
Dolata W. 2001. Wpływ warunków kutrowania surowców mięsnych i tłuszczowych na
jakość farszów i wędlin. Mięso i Wędliny. 3: 26-29.
Fabian M. 2010. Chłodzenie podczas kutrowania. Gospodarka Mięsna. 9: 17-23.
Pisula A., Pospiecha E. 2011. Mięso – podstawy nauki i technologii. Wydawnictwo
SGGW. Warszawa.
Szeląg M. 2011. Analiza teoretyczna procesu kutrowania w aspekcie termodynamicznym. Inżynieria Rolnicza. 4 (129): 257-264.
Marek Szeląg
Katedra Inżynierii i Aparatury Przemysłu Spożywczego
Karolina Malecka
Katedra Chłodnictwa i Koncentratów Spożywczych
Opiekun naukowy: dr hab. inż. Jan Zwolak
275
III. BIOLOGIA I BIOTECHNOLOGIA
Łukasz Dyba
EPISTEME
14/2012
s.279-286
ISSN 1895-4421
ANALIZA SEKWENCJI INTRONÓW GENÓW IPI I CRTISO
MARCHWI CHARAKTERYZUJĄCYCH SIĘ OBECNOŚCIĄ
TRANSPOZONÓW TYPU MITE
SEQUENCE ANALYSIS OF CARROT IPI AND CRTISO GENE
INTRONS CARRYING MITE INSERTIONS
Abstrakt. Transpozony to ruchome elementy genetyczne zdolne do zmiany swej
pozycji w obrębie genomu. Stanowią ważny czynnik zmienności genetycznej. Celem prowadzonych badań była analiza sekwencyjna intronów genów IPI i CRTISO
marchwi zawierających insercje transpozonowe. Analizy wykonano na genomowym DNA 21 odmian marchwi (Daucus carota L. ssp. sativus) o różnym pochodzeniu. Fragmenty genów IPI i CRTISO zamplifikowano metodą PCR, sklonowano
w E. coli i zsekwencjonowano. Zidentyfikowano 14 haplotypów intronu genu IPI. Dwa
z nich zawierały insercję miniaturowego elementu transpozycyjnego o odwróconych
powtórzeniach należącego do nadrodziny PIF/Harbinger. Pozostałe różnice między
haplotypami wynikały z obecności indeli i polimorfizmów pojedynczego nukleotydu. Pośród 8 haplotypów genu CRTISO, dwa zawierały nieautonomiczny transpozon
z nadrodziny hAT. Ponadto w intronie genu CRTISO odmiany ‘Tropical’ odnaleziono
sześcionukleotydowy ślad po wycięciu transpozonu. Wykryte insercje i transpozycja
wskazują na niedawną aktywność tych mobilnych elementów w genomie marchwi.
Słowa kluczowe: MITE, miniaturowe elementy transpozycyjne o odwróconych powtórzeniach, transpozon, Daucus carota
Summary. Transposons are mobile genetic elements capable of changing their position within the genome. They are important factors driving genetic diversity. We
sequence-characterized of two carrot IPI and CRTISO gene introns harboring nonfixed transposon insertions. Analyses were performed on genomic DNAs of 21 carrot (Daucus carota L. ssp. sativus) cultivars. Fragments of IPI and CRTISO genes
were amplified by PCR, cloned in E. coli, and sequenced. Fourteen haplotypes of
the IPI gene intron were identified. Two of them possessed insertion of a minature
inverted-repeat transposable element belonging to the PIF/Harbinger superfamily. Other differences among haplotypes resulted from indels and single nucleotide
polymorphisms. Among eight haplotypes of the CRTISO gene intron, two contained
a nonautonomous transposon belonging to the hAT superfamily. Additionally, a six
nucleotide-long footprint resulting from the element’s transposition, was found in the
CRTISO gene intron of cv. ‘Tropical’. Detected insertions and the transposition event
indicate recent activity of these genetic elements in cultivated carrot.
Key words: MITE, miniature inverted-repeat transposable elements, transposon, Daucus carota
279
Łukasz Dyba
WSTĘP
Miniaturowe elementy transpozycyjne o odwróconych powtórzeniach
(MITE, ang. Miniature Inverted-Repeat Transposable Elements) to elementy klasy II (transpozony DNA). Charakteryzują się wielkością do 600
pz (Feschotte i in. 2002) oraz terminalnymi odwróconymi powtórzeniami
o długości 10-15 pz (Oki i in. 2008). MITE występują powszechnie u roślin,
stanowią na przykład blisko jedną trzecią genomu ryżu (Juretic i in. 2004).
Powstają najprawdopodobniej z elementów autonomicznych w wyniku ich
wewnętrznych delecji, a następnie proliferują w genomie na drodze trans-mobilizacji (z udziałem transpozazy elementu wyjściowego) lub mobilizacji
krzyżowej (dzięki transpozazom elementów spokrewnionych).
Pierwszym zidentyfikowanym w genomie marchwi transpozonem był Tdc1
zlokalizowany w rejonie 5’ flankującym gen gDcPAL1 (Ozeki i in. 1997).
W genomie marchwi zidentyfikowano również elementy DcMaster należące
do nadrodziny PIF/Harbinger (Grzebelus i in. 2006) oraz pokrewne do nich
rodziny transpozonów: KrakL1, KrakL2 oraz Midi (Grzebelus i Simon 2009).
Celem niniejszej pracy było scharakteryzowanie intronów genów IPI oraz
CRTISO marchwi pod względem insercji transpozonów, indeli oraz polimorfizmów pojedynczego nukleotydu, a także wyprowadzenie haplotypów dla
obu badanych genów.
MATERIAŁ I METODY
Badaniem objęto 21 obiektów marchwi uprawnej (Daucus carota L. ssp. sativus). Każdy obiekt reprezentowany był przez 1-3 rośliny. Źródłem materiału były kolekcje hodowlane, instytuty badawcze oraz banki genów. Obiekty
obejmowały pierwsze pokolenie mieszańców F1 (‘Deep Purple’, ‘White Satin’), odmiany lokalne (Gajar IND, Gajar PAK, Long Red, Mestnaya, Panipat
Special, Persia No. 242, Pusa Kesar, Shahpur Special, Syrian Purple), populacyjne (‘Blanche ½ longue des vosges’, ‘Hakata Kintoki’, ‘Himuro Fuyugosi Gosun No. 2’, ‘Nutrired’, ‘Shima Ninjin’, ‘Tropical’, ‘White Belgian’,
‘Yellow Belgian’, ‘Yellowstone’) oraz linie hodowlane (BL-JKI-2). Materiałem analitycznym było genomowe DNA wyizolowane z liofilizatów młodych
liści pobranych z pojedynczych roślin w fazie wzrostu wegetatywnego.
Reakcję PCR przeprowadzono z wykorzystaniem starterów flankujących
rejony genów IPI (IPI3’F: 5’-CTGTACAGGGAGTCCGAGCTTATC-3’ iIPI3’rs: 5’-AGCAACTTCATCAGGGTTGG-3’) i CRTISO (CRTISO3’F:
5’-TTTGCCTCCAGATACGGATT-3’ i CRTISO3’rs: 5’-GGAAGACTGGAGACCAGGAA-3’) zawierające sekwencje intronowe. Startery kotwiczyły
przy końcach 3’ egzonów sąsiadujących z analizowanymi intronami. Jako
280
Analiza sekwencji intronów genów IPI I CRTISO marchwi
matrycę do reakcji PCR wykorzystano genomowy DNA analizowanych
obiektów. Dla sekwencji trudno poddających się amplifikacji stosowano
reakcję typu long-PCR. Reakcje PCR prowadzono w mieszaninie o objętości 20 µl (1x bufor PCR; 0,25 mM dNTP Mix; 0,5 µM startery; 0,05 u/
µl polimeraza DreamTaq lub LongPCR Enzyme Mix; 2 ng/µl DNA). Stosowano następujące warunki reakcji PCR (94°C 2 min, 35 cykli [94°C 30 s,
54°C 30 s, 68°C 2 min], 68°C 10 min) oraz long-PCR (94°C 2 min, 35 cykli
[94°C 30 s, 58°C 30 s, 68°C 7 min], 68°C 15 min). Amplifikacje prowadzono
w termocyklerach Mastercycler (Eppendorf).
Produkty reakcji PCR rozdzielano w 1% żelu agarozowym, a następnie wycinano z żelu i oczyszczano korzystając z zestawu Wizard SV Gel and PCR
Clean-Up System (Promega). Oczyszczone fragmenty DNA poddawano ligacji z wektorem pGEM-T lub pGEM-T Easy (Promega). Mieszaninę ligacyjną inkubowano przez noc w temperaturze 4°C, a dalej wykorzystywano
do transformacji bakterii kompetentnych E. coli JM109. Podczas klonowania
stosowano selekcję na białe i niebieskie kolonie. Szalki ze stałą pożywką LB
zawierającą ampicylinę w stężeniu 100 mg/l i z posianymi bakteriami po transformacji inkubowano całą noc w temperaturze 37°C. Białe kolonie pobierano
i przenoszono do płynnej pożywki LB z ampicyliną (100 mg/l), po czym inkubowano całą noc na wytrząsarce laboratoryjnej w temperaturze 37°C.
Plazmidowe DNA izolowano z wykorzystaniem zestawu Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega). Wyizolowane plazmidy poddawane były reakcji sekwencjonowania techniką Sangera z wykorzystaniem
starterów SP6 i T7. Sekwencje edytowano oraz analizowano w programie
BioEdit. Przeprowadzono również analizę dystansu genetycznego. Nieukorzenione drzewa wygenerowano z zastosowaniem metody najbliższego sąsiada (program Neighbour z pakietu Phylip). Podczas tworzenia dendrogramów brano pod uwagę polimorfizmy pojedynczego nukleotydu i indele.
WYNIKI I DYSKUSJA
W wyniku reakcji amplifikacji fragmentu genu IPI otrzymano produkty
wielkości ok. 1100 pz oraz ok. 600 pz. Dłuższe produkty reprezentowały
sekwencje zawierające wbudowany transpozon, krótsze produkty pozbawione były insercji. Podobnie rozdział elektroforetyczny produktów PCR reprezentujących gen CRTISO wykazał obecność produktów większych (ok. 1300
pz), charakteryzujących się insercją transpozonu, oraz krótszych, o długości
ok. 500 pz, pozbawionych insercji. W przypadku obu genów produkty reakcji
PCR występowały w wariantach dwóch prążków w jednej ścieżce elektroforetycznej (heterozygoty) oraz jednego prążka (homo- lub heterozygoty).
281
Łukasz Dyba
Sekwencjonowaniu poddano w sumie 88 produktów PCR genu IPI uzyskanych z 28 roślin należących do 18 obiektów doświadczalnych oraz 96 produktów PCR genu CRTISO uzyskanych z 28 roślin należących do 20 obiektów doświadczalnych.
829
860
862
901
902
918
936
1016-1021
-
T
T
A
G
G
T
A
C
A
C
Del
T
-
G
T
G
G
T
G
A
T
T
T
-
3
A
-
G
C
T
A
T
T
Ins
T
T
A
C
G
T
A
C
A
T
-
822
T
T
782
T
G
771
A
T
684
T
C
715-758
C
G
585
G
-
582
P/H
T
564
65-513
A
534
27
1
2
514
Haplotyp
Stwierdzono obecność transpozonu w pozycji 65-513 pz fragmentu genu IPI.
Transpozon ten charakteryzował się TSD (ang. Target Site Duplication) o sekwencji TAA i TIR (ang. Terminal Inverted Repeats) o sekwencji GGGGCCGTTTGGTTC, co pozwoliło na zakwalifikowanie go do nadrodziny PIF/
Harbinger. Wszystkie otrzymane sekwencje porównano między sobą i na tej
podstawie wyprowadzono 14 haplotypów w obrębie badanych obiektów (Tab.
1). Tylko haplotypy IPI-1 i IPI-10 charakteryzowały się insercją transpozonu.
4
A
-
G
C
T
A
T
T
-
T
T
A
G
G
T
A
C
A
C
5
A
-
C
C
T
A
T
T
-
T
T
A
G
G
T
A
C
A
C
-
6
A
-
G
A
C
A
T C
-
T
T
A
G
T
T
G
C
A
T
-
7
A
-
G
A
C
A
T C
-
T
T
A
G
T
T
A
C
A
C
-
8
A
-
G
A
C
A
T C
-
T
T
A
G
T
T
G
C
A
T
Del
9
A
-
G
C
C
A
T
T
-
T
T
A
G
G
T
A
C
A
C
-
10
A
P/H
G
C
T
A
T
T
-
T
T
A
G
T
T
G
C
A
T
Del
11
A
-
G
C
T
A
T
T
-
T
T
A
G
G
T
A
C
A
T
-
12
T
-
G
C
T
A
T
T
-
T
T
A
G
G
T
A
C
A
C
-
13
A
-
G
C
T
G
T
T
-
T
T
A
G
G
T
A
C
A
C
-
14
A
-
G
C
T
A C T
-
T
A
A
G
G
T
A
C
A
T
-
Tab. 1. Haplotypy genu IPI (P/H – transpozon z nadrodziny PIF/Harbinger;
Ins – insercja; Del – delecja)
Podczas analizy genu CRTISO wykryto transpozon w pozycji 65-845 nt.
Transpozon ten charakteryzował się TSD o sekwencji GTTGGGAT i TIR
o sekwencji TAGGGCTGAGCA, co było podstawą do zakwalifikowania go
do nadrodziny hAT. Nadano mu nazwę Dc-hAT1. Wyprowadzono 8 haplotypów w obrębie badanych obiektów (Tab. 2). W haplotypie CRTISO-5, w pozycji 65-70 nt, stwierdzono obecność footprintu powstałego prawdopodobnie
w wyniku wycięcia transpozonu.
282
1092
1118
1132
T
-
G
G
T
A
Del
T
G
-
T
A
A
T
T
T
1137
1062
1
2
14
933
65-845
Haplotyp
3
G
-
G
A
A
T
T
T
4
G
-
G
G
T
A
Del
T
5
G
TGGGAT
T
A
A
T
T
A
6
G
Dc-hAT1 (del. 675-728)
T
A
A
T
T
A
7
G
Dc-hAT1
T
A
A
T
T
A
8
G
Dc-hAT1
T
A
A
T
T
T
Tab. 2. Haplotypy genu CRTISO (Dc-hAT1 – transpozon z nadrodziny hAT; Dc-hAT1 (del.675-728) - transpozon z wewnętrzną delecją; Del – delecja)
Haplotypy CRTISO-6 i CRTISO-7 są niemal identyczne, różni je tylko insercja transpozonu (Rys. 1). W haplotypie CRTISO-7 jest to pełna insercja,
a w haplotypie CRTISO-6 – insercja z wewnętrzną delecją. Haplotyp CRTISO-8 również posiada insercję, ale różni się od wyżej wymienionych obecnością T w pozycji 1137 (zamiast A). Sekwencja go reprezentująca odpowiada
sekwencji haplotypu CRTISO-2. Sugeruje to, iż haplotypem wyjściowym dla
powyższych był haplotyp CRTISO-2, a insercja transpozonu lub insercja w
połączeniu z substytucją (T/A) doprowadziły do wykształcenia odpowiednio haplotypów CRTISO-8 oraz CRTISO-6 i CRTISO-7. Haplotyp CRTISO-2
często pojawia się u roślin heterozygotycznych ze względu na insercję Dc-hAT1. Wyjątkiem jest roślina nr 1 odmiany lokalnej Gajar IND reprezentowana przez haplotypy CRTISO-1 oraz CRTISO-7. U ‘Tropical’ odnaleziono
w pozycji 65-70 nt sekwencję 5’-TGGGAT-3’. Wykazuje ona duże podobieństwo do sekwencji TSD Dc-hAT1. Jak pokazano na dendrogramie (Rys. 1),
haplotyp CRTISO-5 charakteryzujący się obecnością footprintu jest podobny
do haplotypów z pełną insercją transpozonu i haplotypu z delecją w obrębie
Dc-hAT1. Sugeruje to, że haplotyp CRTISO-5 powstał w wyniku wycięcia
transpozonu Dc-hAT1 z omawianego locus. Możliwe, że haplotypem wyjściowym był CRTISO-8 reprezentowany w populacjach BL-JKI-2, ‘Shima
Ninjin’ oraz ‘Tropical’. U ‘Deep Purple’ zaobserwowano delecję (53 nt; haplotyp CRTISO-6) w obrębie samego transpozonu (pozycja 675-728). Może
to sugerować, że Dc-hAT1 jest elementem „młodym”, stosunkowo niedawno
powstałym w genomie marchwi, aktywnym transpozycyjnie (footprint po
jego wycięciu, występowanie tylko w ściśle określonych haplotypach i nie
u wszystkich badanych roślin w obrębie odmian), a jego długość podlega
dalszym modyfikacjom poprzez wewnętrzne delecje.
283
Łukasz Dyba
Pośród sekwencji IPI nie odnotowano obecności śladów po wycięciu transpozonów, jednakże transpozony PIF/Harbinger mogą się wycinać w sposób doskonały, nie pozostawiając footprintu. Insercja transpozonu występuje
tylko w dwóch haplotypach: IPI-1 oraz IPI-10 (Rys. 2). Ponieważ oba te
haplotypy obecne są u ‘Hakata Kintoki’, możliwe jest, że haplotyp IPI-10
powstał w wyniku rekombinacji pomiędzy haplotypem IPI-1 i IPI-6. Oprócz
MITE, w analizowanym obszarze genu IPI, obecna jest także niewielka (43
nt) insercja, która jednak nie jest podobna do TSD czy TIR zidentyfikowanego elementu ruchomego.
Rys. 1. Dendrogram haplotypów genu CRTISO uzyskany metodą najbliższego sąsiada (Dc-hAT1 – obecność transpozonu; Dc-hAT1 (delecja) – obecność transpozonu
z wewnętrzną delecją; footprint – obecność śladu po wycięciu transpozonu)
Rys. 2. Dendrogram
haplotypów genu
IPI uzyskany
metodą najbliższego
sąsiada (PIF/
Harbinger – obecność
transpozonu)
284
LITERATURA
Feschotte C. Jiang N. Wessler SR. 2002. Plant transposable elements: where genetics
meets genomics. Nat Rev Genet, 3: 329-341.
Grzebelus D. Yau YY. Simon PW. 2006. Master: a novel family of PIF/Harbingerlike transposable elements identified in carrot (Daucus carota L.). Mol Gen Genomics, 275:450-459.
Grzebelus D. Simon PW. 2009. Diversity of DcMaster-like elements of the PIF/Harbinger superfamily in the carrot genome. Genetica, 135: 347-353.
Juretic N. Bureau TE. Bruskiewich RM. 2004. Transposable element annotation of
the rice genome. Bioinformatics, 20: 155-160.
Oki N. Yano K. Okumato Y. Tsukiyama T. Teraishi M. Tanisaka T. 2008. A genomewide view of miniature inverted-repeat transposable elements (MITEs) in rice,
Oryza sativa ssp. japonica. Genes Genet Syst, 83: 321-329.
Ozeki E. Davies Y. Takeda J. 1997. Somatic variation during long term subculturing of plant cells caused by insertion of a transposable element in
a phenylalanine ammonia-lyase (PAL) gene. Mol Gen Genet, 254: 407-416.
mgr inż. Łukasz Dyba
Katedra Genetyki, Hodowli i Nasiennictwa
al. Mickiewicza 21, Kraków
Opiekun naukowy: dr hab. Dariusz Grzebelus, dr hab. Rafał Barański
285
Agnieszka Fornal
Anna Radko
EPISTEME
14/2012
s.287-292
ISSN 1895-4421
OCENA POLIMORFIZMU MARKERÓW MIKROSATELITARNYCH
DNA U KONIKÓW POLSKICH
EVALUATION OF POLYMORPHISM OF DNA MICROSATELLITES
OF POLISH KONIK
Abstrakt. Tematem prezentowanej pracy była analiza polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych DNA u 118 osobników rasy konik polski. Zastosowano zautomatyzowaną technikę analizy wielkości fragmentów DNA wykorzystując komercyjny
zestaw starterów przeznaczony do kontroli pochodzenia koni. Identyfikowano allele
z 17 następujących mikrosatelitarnych loci: AHT4, AHT5, ASB2, HMS2, HMS3,
HMS6, HMS7, HTG10, HTG4, VHL20, ASB17, ASB23, HTG6, HTG7, CA425,
HMS1, LEX3. Wszystkie badane mikrosatelitarne markery DNA charakteryzowały
się wysokim polimorfizmem za wyjątkiem loci HTG4 i HTG6. Najwyższe wartości szacowanych parametrów Ho, PIC i PD dotyczyły locus HMS6 (Ho = 0,822, PIC
= 0,728 i PD = 0,903). Prawdopodobieństwo wykluczenia ojcostwa obliczone dla
zestawu 17 STR wynosiło 0,9996 dla PE1 i 0,9981 dla PE2.
Słowa kluczowe: mikrosatellity, kontrola rodowodów, konie
Summary. The aim of the present study was the evaluation of microsatellite DNA
markers for paternity control in horses. Polymorphism of 17 microsatellite markers
were studied in 118 Polish Konik. Under consideration were markers from commercially available kit for horses parentage verification (AHT4, AHT5, ASB2, HMS2,
HMS3, HMS6, HMS7, HTG10, HTG4, VHL20, ASB17, ASB23, HTG6, HTG7,
CA425, HMS1, LEX3). The allele identification was performed using automated
DNA sizing technology. All
��
the DNA microsatellite markers were highly polymorphic except for HTG4 and HTG6 loci. The highest values of estimated coefficient of
heterozygosity (Ho), the polymorphic information content (PIC) and power of discrimination (PD) parameters concerned locus HMS6 (Ho = 0,822, PIC = 0,728, PD
= 0,903). The probability of sire exclusion calculated for the set of 17 STR were
0,9981 for PE1 and 0,9998 for PE2.
Key words: microsatellites, parentage control, Polish Konik
287
WSTĘP
Sekwencje mikrosatelitarne, określone również jako STR (short tandem repeat), są fragmentami DNA o długości od 60 do 300 par zasad (pz), występującymi głównie w regionach niekodujących genów i rozproszonymi równomiernie w genomie co 6 do 10 tysięcy par zasad (kpz). Składają się one z 10
do 50 powtórzeń jedno- do sześcionukleotydowego motywu i charakteryzują
się wysokim polimorfizmem [Tautz 1989]. Znaczący postęp w badaniach nad
identyfikacją, charakterystyką i polimorfizmem sekwencji mikrosatelitarnych
DNA przyniosło zastosowanie multipleksowych reakcji PCR oraz zautomatyzowanej techniki analizy wielkości fragmentów DNA. Mikrosatelity stały się powszechnie stosowanymi markerami między innymi w programach
mapowania genomu [Botstein i in. 1980], analizie zróżnicowania wewnątrz
i międzyrasowego [Curik i in. 2003, Groeneveld L.F. i in. 2010, Sávio P.R.
i in. 2008] oraz w identyfikacji i mapowaniu loci cech ilościowych (QTLs)
[Diesterbeck i in. 2007]. STR szczególne znaczenie znalazły w identyfikacji
osobniczej i kontroli pochodzenia [Luís i in. 2002, Lee i Cho 2006]. W kraju
przeprowadzono badania nad polimorfizmem mikrosatelitarnym DNA u koni
arabskich i pełnej krwi [Gralak i in. 1998] oraz koni małopolskich [Ząbek
i in. 2006]. W prezentowanej pracy przedstawiono analizę markerów mikrosatelitarnych wytypowanych przez Międzynarodowe Towarzystwo Genetyki
Zwierząt (International Society for Animal Genetics – ISAG) u konika polskiego będącego rodzimą rasą koni wywodzącą się od tarpana.
Celem przeprowadzonych badań była analiza polimorfizmu 17 loci mikrosatelitarnych DNA u konika polskiego oraz ocena przydatności zestawu markerów do kontroli pochodzenia w tej rasie.
MATERIAŁ I METODY
Materiał do badań stanowiły próbki krwi od 118 koników polskich (kn) pochodzących po 20 ogierach, zgromadzone w ramach kontroli pochodzenia
koni w IZ PIB. Krew do analiz przechowywano w probówkach z dodatkiem
EDTA w temperaturze -20oC. DNA izolowano przy użyciu zestawu Wizard
DNA purification kit (Promega) wg procedur podanych przez producenta.
Reakcję PCR przeprowadzono za pomocą komercyjnego zestawu do jednoczesnej amplifikacji 17 sekwencji mikrosatelitarnych specyficznych dla koni
produkcji Finnzymes Diagnostics. Zestaw ten zawiera mieszaninę 17 par
sekwencji starterowych, jeden z każdej pary starterów znakowany jest na
końcu 5’ fluorescencyjnym barwnikiem - 6-FAM, JOE i NED. Umożliwia
on oznaczenie 12 loci: AHT4, AHT5, ASB2, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7,
HTG10, HTG4, VHL20, ASB17, ASB23 podstawowy i 5 dodatkowych loci:
HTG6, HTG7, CA425, HMS1, LEX3 stanowiących panel STR rekomendo288
Ocena polimorfizmu markerów mikrosatelitarnych DNA...
wanych przez ISAG do weryfikacji rodowodów koni. Do amplifikacji zastosowano warunki zgodne z protokołem producenta zestawu. Produkty reakcji PCR poddano elektroforezie kapilarnej w 4% żelu poliakryloamidowym
w sekwenatorze ABI 3130xl (Applied Biosystems), z użyciem standardu
wielkości LIZ500. Analizę uzyskanych fragmentów DNA i weryfikacji profili w 17 mikrosatelitarnych loci wykonano w programie GeneMapper 4.0.
Na podstawie częstości występowania zidentyfikowanych alleli wyliczono
heterozygotyczność obserwowaną (Ho) i oczekiwaną (He) [Nei 1978], indeks
stopnia polimorfizmu (PIC) [Botstein i in. 1987] oraz siłę dyskryminacji
(PD). Oszacowano także prawdopodobieństwo wykluczenia pochodzenia na
podstawie pojedynczego locus w przypadku, gdy znany jest genotyp jednego
z rodziców (PE1) i obojga rodziców (PE2) oraz prawdopodobieństwo wykluczenia ojcostwa - PEC na podstawie wszystkich 17 analizowanych loci
[Jamieson i Taylor 1997, Kimberly 1998]. Obliczenia wykonano z wykorzystaniem własnego programu statystycznego Imgbov-Stat, obsługującego
bazę danych IZ PIB.
WYNIKI I DYSKUSJA
Sekwencje mikrosatelitarne DNA są grupą markerów genetycznych, która
zgodnie z zaleceniem Międzynarodowego Towarzystwa Genetyki Zwierząt
z 1996 r. powinna być stosowana równolegle z grupami krwi do kontroli pochodzenia koni. Dotychczas wyniki różnych badań wskazują, że do kontroli
pochodzenia powinny być wybrane sekwencje mikrosatelitarne DNA charakteryzujące się wysokim polimorfizmem, dobrze zrównoważoną częstością
występowania alleli w poszczególnych loci, dla których wartości wskaźników PIC, Ho oraz PE2 dla pojedynczych loci osiągają wartość powyżej 0,5.
Ponadto, powinny charakteryzować się dobrą rozdzielczością elektroforetyczną produktów amplifikacji w żelu poliakrylamidowym i powtarzalnością wyników przy określaniu wielkości poszczególnych alleli [Botstein i in.
1980]. W badanej rasie koni, w trakcie elektroforezy, poszczególne produkty
PCR wyraźnie się rozdzielały, słabszy sygnał wynikający ze słabszej amplifikacji zaobserwowano jedynie w locus AHT5 u 15 osobników oraz w HMS3
u 12 osobników.
Łącznie w 17 analizowanych mikrosatelitarnych loci zidentyfikowano ogółem 114 alleli, których liczba w zależności od locus wynosiła od 3 (locus
HTG6) do 10 (locus HTG10), średnia liczba alleli wynosiła 6,71. W większości przypadków allele zidentyfikowane w poszczególnych loci występowały ze zróżnicowaną częstością. Na podstawie częstości alleli oszacowano
wskaźniki polimorfizmu badanych markerów. W tabeli 1. zostały zestawione
parametry dla każdego polimorficznego locus badanej populacji. Większość
289
analizowanych STR charakteryzowała się wysokimi wartościami wskaźników
Ho, He, PIC i PD wynoszącymi wartość ponad 0,5. Wyjątek stanowiły markery
HTG4 z podstawowego panelu STR wymaganego do weryfikacji pochodzenia
koni oraz HTG6 z panelu dodatkowego. Wartości Ho i PIC dla HTG4 wyniosły
odpowiednio 0,466 i 0,382 oraz dla HTG6 - 0,076 i 0,073.
Wyliczona siła dyskryminacji dla tych markerów również przyjęła najniższe,
spośród badanych loci, wartości 0,646 dla HTG4 i jedynie 0,144 dla HTG6.
Natomiast najwyższym polimorfizmem odznaczał się marker HMS6, dla
którego wartości Ho, PIC i PD osiągnęły odpowiednio 0,822, 0,728 i 0,903.
Wysokim polimorfizmem (Ho, PIC i PD wyższym od 0,7) charakteryzowało
się aż 8 badanych loci (Tab. 1).
Locus
Liczba alleli
Ho
He
PIC
PD
PE1
PE2
AHT4
6
0,7542
0,7379
0,6962
0,8808
0,3349
0,5111
AHT5
7
0,7627
0,7743
0,7407
0,9140
0,3878
0,5666
ASB2
8
0,7797
0,7218
0,6945
0,8947
0,3375
0,5236
HMS2
7
0,6441
0,6837
0,6360
0,8505
0,2730
0,4443
HMS3
6
0,7542
0,7731
0,7419
0,9115
0,3892
0,5700
HMS6
6
0,8220
0,7640
0,7277
0,9028
0,3671
0,5469
HMS7
7
0,5763
0,6965
0,6416
0,8607
0,2762
0,4423
HTG10
10
0,6780
0,7798
0,7468
0,9138
0,3957
0,5741
HTG4
4
0,4661
0,4048
0,3816
0,6462
0,0865
0,2303
HTG6*
3
0,0763
0,0741
0,0727
0,1438
0,0027
0,0374
HTG7*
4
0,5593
0,5973
0,5402
0,7703
0,1880
0,3428
VHL20
9
0,7966
0,7665
0,7320
0,8901
0,3806
0,5585
ASB17
9
0,7542
0,7415
0,7068
0,8778
0,3515
0,5311
ASB23
8
0,7119
0,7346
0,6878
0,8723
0,3222
0,4950
CA425*
6
0,6780
0,6849
0,6514
0,8687
0,2865
0,4699
HMS1*
7
0,7288
0,7448
0,7054
0,8986
0,3452
0,5228
LEX3*
7
0,4661
0,7732
0,7408
0,8992
0,3887
0,5683
Średnia
6,71
0,6476
0,6737
0,6379
1-0,3x10
0,998092
0,999986
-14
Tab. 1. Wskaźniki polimorfizmu dla każdego locus zestawu 17 mikrosatelitarnych
loci. * dodatkowe markery mikrosatelitarne
290
Ocena polimorfizmu markerów mikrosatelitarnych DNA...
W przeprowadzonych badaniach zaobserwowano wyraźną różnicę w wartościach Ho i He dla LEX3 (Ho = 0,466, He = 0,773) może to być spowodowane
faktem, że marker ten zlokalizowany jest na chromosomie X.
Kumulatywna wartość siły dyskryminacji (PDC) jest ważnym parametrem
określającym przydatność zestawu STR do identyfikacji osobniczej. W badaniach własnych, na podstawie 17 loci mikrosatelitarnych parametr ten osiągnął wartość bliską jedności (PDC = 1-0,3x10-14).
W celu określenia przydatności ocenianych markerów do kontroli pochodzenia wyliczono prawdopodobieństwo wykluczenia pochodzenia dla każdego
locus i dla wszystkich 17 loci łącznie, gdy znany jest genotyp jednego rodzica (PE1) i obojga rodziców (PE2). Wartość PE1 w badanej rasie koni obliczone
na podstawie pojedynczych loci mieściło się w przedziale od 0,003 w locus
HTG6 do 0,396 w HTG10, natomiast PE2 od 0,0374 do 0,5741 odpowiednio
dla tych samych markerów (Tab. 1). Łączne prawdopodobieństwo wykluczenia ojcostwa (PEC) na podstawie 17 analizowanych STR dla PE1 wyniosło
99,809%, a dla PE2 powyżej 99,998%.
WNIOSKI
Wysokie wartości omawianych wskaźników Ho, PIC i PD oraz wyliczone
wysokie łączne prawdopodobieństwo wykluczenia pochodzenia wskazują na
znaczny stopień zmienności genetycznej analizowanej populacji koni oraz
świadczą o przydatności analizowanego zestawu 17 markerów mikrosatelitarnych DNA do badań weryfikacji rodowodów konika polskiego.
LITERATURA
Botstein D. White R.L. Skolnick M. Davis R.W. 1980. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphism. Am.
J. Human Genet., 32: 182 – 190.
Curik I. Zechner P. Sölkner J. Achmann R. Bodo I. Dovc P. Kavar T. Marti E. Brem
G. 2003. Inbreeding, Microsatellite Heterozygosity, and Morphological Traits in
Lipizzan Horses, Journal of Heredity 94 (2): 125-132.
DAD-IS (Domestic Animal Diversity Information System hosted by FAO) 2012.02.12
http://dad.fao.org
Diesterbeck U.S., Hertsch B. & Distl O. 2007. Genome-wide searchfor microsatellite
markers associated with radiologic alterations in the navicular bone of Hanoverian warmblood horses. Mamm. Gen. 18: 373–81.
291
Gralak B., Kuryl J. and Niemczewski C. 1998. Usefulness of a set of seven microsatellites for parentage control in Arabian Horse and Thoroughbreds in Poland. Anim.
Genet. 29 (Suppl. 1):16.
Groeneveld L.F. Lenstra J.A. Eding H. Toro M.A. Scherf B. Pilling D. Negrini
R. Finlay E.K. Jianlin H. Groeneveld E. Weigend S. 2010. Genetic diversity in
farm animals - a review. Animal Genetics 41: 6-31.
Jamieson A., Taylor S.C.S. 1997. Comparisons of three probability formulae for parentage exclusion. Anim. Genet., 28: 397 – 400.
Kimberly A.H. 1998. Statistical Analysis of STR Data. Profiles in DNA 3: 14-15.
Lee S, i Cho G. 2006. Parentage testing of Thoroughbred horse in Korea using microsatellite DNA typing. J. Vet. Sci. 7: 63-67.
Luís C., Cothran E Gus and Oom M.M. 2002. Microsatellites in Portuguese autochthonous horse breeds: usefulness for parentage testing. Genet. Mol. Biol., 25:
131-134.
Nei M. 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from
a small number of individuals. Genetics 89: 583–590.
Sávio P.R. Evonnildo C.G. Artur S. Maria P.C.S. 2008. Genetic variability and efficiency
of DNA microsatellite markers for paternity testing in horse breeds from the Brazilian
Marajó archipelago. Genetics and Molecular Biology, 31 (1): 68-72.
Tautz D. 1989. Hypervariability of simple sequences as general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Res 17 (16): 6463-6471.
Ząbek T., Żyga A., Radko A., Słota E. 2006. Analysis of genetic variation in Małopolski
horses using molecular and pedigree data. Ann. Anim. Sci. 6: 13-27.
dr hab. Anna Radko, mgr Agnieszka Fornal
Instytut Zootechniki – Państwowy Instytut Badawczy
Opiekun naukowy: prof. dr hab. Ewa Słota
292
Marta Głogowska, Grzegorz Formicki
Bogdan Kosowski, Robert Stawarz
EPISTEME
14/2012
s.293-299
ISSN 1895-4421
KUMULACJA RTĘCI W LUDZKICH TKANKACH NOWOTWOROWYCH
ŻOŁĄDKA I JELITA GRUBEGO W ZALEŻNOŚCI OD WIEKU I PŁCI
ACCUMULATION OF MERCURY IN HUMAN NEOPLASTIC TISSUES OF
STOMACH AND LARGE INTESTINE IN RELATION AGE AND THE SEX
Abstrakt. Badania przeprowadzono na fragmentach tkanek ludzkich pochodzących z guzów
nowotworowych żołądka i jelita grubego. Materiał do badań pobierano w trakcie zabiegów
operacyjnych przeprowadzanych w Niepublicznym Zakładzie Opieki Zdrowotnej PROSMED
w Krakowie. W dalszej kolejności wycinki kierowane były do badania histopatologicznego, przeprowadzanego w Zakładzie Patomorfologii wyżej wymienionej jednostki i stamtąd ostatecznie
odbierane. Na badania uzyskano zgodę lokalnej komisji bioetycznej (opinia nr KBET/95/B/2009).
W badaniach wykorzystano także grupę kontrolną, którą stanowiły tkanki zdrowe, niezmienione
histopatologicznie, pochodzące z żołądka, jelita grubego, a także z przełyku i jelita cienkiego.
Tkanki zdrowe były pobierane w trakcie biopsji lub autopsji. Zawartość rtęci w próbkach zmierzono metodą spektrofotometryczną zimnych par (CVAAS). Metoda ta nie wymaga mineralizacji
wstępnej i umożliwia precyzyjny pomiar bezpośrednio w tkance. Niewielkie fragmenty tkanek,
umieszczano w specjalnym tyglu bezpośrednio po rozmrożeniu i uprzednim precyzyjnym zważeniu ich. Wyniki ważenia wpisywane były do programu obsługującego analizator MA2, dzięki czemu, po zakończeniu cyklu pomiarowego uzyskiwano automatycznie wyliczony wynik w
ppm. Pomiar dla każdej próbki powtarzano trzy razy. Grupę kobiet i mężczyzn podzielono odpowiednio na 2 klasy wiekowe: 20-60 lat oraz 61-90 lat. Średnia zawartość rtęci w tkankach przewodu
pokarmowego jest prawie identyczna u kobiet chorych zarówno z przedziału wiekowego 20-60 lat, jak
i 61-90 lat, w porównaniu z zawartością tego pierwiastka u kobiet zdrowych. W przypadku mężczyzn,
średnia zawartość rtęci jest zdecydowanie wyższa u pacjentów chorych z grupy wiekowej 61-90 lat.
Słowa kluczowe: rtęć, żołądek, jelito grube, nowotwór, metale ciężkie
Summary. The studies were carried out on samples of human neoplastic tissues coming from
stomach and large intestine. Material was taken during surgeries carried out in the Non-public
Health Care Facility PROSMED in Cracow. First the samples were directed to histopathologic
studies which were carried out in Pathomorphology Department PROSMED, Cracow. Metal
content analysis was performed in Institute of Biology, Cracow Pedagogical University. The investigations were supported by permission of the local bioethical committee (KBET/95/B/2009).
Healthy, unchanged histopathologically, tissues coming from the stomach and large intestine
served as control. Healthy tissues were taken during the biopsy or the autopsy. The samples coming from women and men were divided suitably into 2 age classes: 20-60 years and 61-90 years.
Small fragments of tissues were weight before the analysis. The content of mercury was measured using the cold vapor atomic absorption spectrometry (CVAAS). Each sample was analyzed
three times for mercury content. The average content of mercury was almost identical comparing
neoplastic and health tissues of women from both age classes. In 61-90 years old men the average
content of mercury was significantly higher in neoplastic tissues comparing to healthy tissues.
Key words: mercury, stomach, large intestine, neoplasm, heavy metals
293
WSTĘP
Rocznie około 12 000 mężczyzn i 11 000 kobiet umiera w Polsce z powodu raka
przewodu pokarmowego [Wronkowski 2001]. Nawet niewielkie zmiany w stylu
życia wyrażone w nawykach żywieniowych, takie jak ograniczenie spożycia soli
kuchennej, żywności marynowanej, tłuszczów, a wzrost konsumpcji świeżych
warzyw, owoców i bogatej w błonnik żywności, sprawia, że ryzyko rozwoju chorób nowotworowych jest znacznie mniejsze [Tanaka 1997] .
Palenie i picie alkoholu aktywuje rozwój raka przełyku i jamy ustnej [Van
Halteren i in. 1995, Warnakulasuriya 2009]. Rak żołądka zajmuje ważne
miejsce wśród nowotworów złośliwych. Znajomość czynników genetycznych i żywieniowych jest niezbędna jeśli chodzi o powstawanie raka żołądka
[Kotynia 2006]. Głównymi czynnikami ryzyka są: dieta bogata w sól, mięso
i marynaty. Rak jelita cienkiego występuje głównie w krajach wysoko zurbanizowanych, z podobną częstością u kobiet i mężczyzn. Ryzyko tego nowotworu jest związane z dietą pełnomięsną [Key i in. 2002].
Metale biorą udział w różnych procesach fizycznych i chemicznych, które
są powszechne w procesach związanych z rozwojem raka. Różne są ścieżki
kancerogenności metali:
• Indukcja zniszczenia DNA
• Tworzenie cross-linków DNA
• Interferencja metali z enzymami naprawczymi DNA
Niektóre metale wpływają na sygnał transdukcyjny przez promowanie zaburzeń w ekspresji genów i komunikacji wewnątrzkomórkowej, a także mogą
powodować efekt w postaci odpowiedzi immunologicznej i zaburzeń homeostazy komórkowej. Wpływ metali na drogi kancerogenezy jest określony
przez liczne czynniki tj.: typ metalu, specjacja, rozpuszczalność, interakcje
metal-metal i inne [Hayes 1996].
MATERIAŁ I METODY
Badania przeprowadzono na wycinkach ludzkiego żołądka i jelita grubego. Materiał do badań był pobierany w trakcie operacji oraz sekcji zwłok,
przeprowadzanych w 5 Wojskowym Szpitalu Klinicznym z Polikliniką
w Krakowie oraz w Niepublicznym Zakładzie Opieki Zdrowotnej PROSMED
w Krakowie. W dalszej kolejności wycinki kierowane były do badania histopatologicznego, przeprowadzanego w Zakładach Patomorfologii wyżej wymienionych jednostek i stamtąd ostatecznie odbierane. Na badania uzyskano
zgodę komisji bioetycznej UJ (opinia nr KBET/95/B/2009).
294
Kumulacja rtęci w ludzkich tkankach nowotworowych...
Tkanki ważące 0,5 – 1 g bezpośrednio po pobraniu były umieszczane w pojemnikach wykonanych z polietylenu, szczelnie zamykane, opisywane oraz
zamrażane. Pobrany materiał był świeży. Zebrane probówki z zawartością
(fragmenty tkanek zdrowych, jak i zmienionych nowotworowo) przewożono
do laboratorium Instytutu Biologii UP w specjalnym termosie wyposażonym
we wkłady mrożące, w celu utrzymania niskiej temperatury - następnie przenoszono je do zamrażarki.
Po zebraniu odpowiedniej ilości materiału każdą próbkę poddano procedurom umożliwiającym oznaczanie w tkankach zawartości rtęci. Zawartość rtęci w próbkach zmierzono metodą spektrofotometryczną zimnych par (CVAAS). Metoda ta nie wymaga mineralizacji wstępnej i umożliwia precyzyjny
pomiar bezpośrednio w tkance. Niewielkie fragmenty tkanek, umieszczano
w specjalnym tyglu bezpośrednio po rozmrożeniu i uprzednim precyzyjnym
zważeniu ich. Wyniki ważenia wpisywane były do programu obsługującego spektrofotometr MA2, dzięki czemu, po zakończeniu cyklu pomiarowego uzyskiwano automatycznie wyliczony wynik w ppm. Pomiar dla każdej
próbki powtarzano trzy razy.
WYNIKI
Wyniki pomiarów opracowano statystycznie za pomocą pakietu Statistica
wersja 7.1. W opisie statystycznym badanych cech wykorzystano następujące statystyki: średnią arytmetyczną, odchylenie standardowe, błąd standardowy średniej. Za pomocą testu W Shapiro-Wilka określono normalność
rozkładu w poszczególnych grupach badawczych. Ponieważ stwierdzono
występowanie licznych rozkładów nienormalnych w celu zbadania, które
z porównywanych średnich różnią się istotnie, a które nie, stosowano test
Kruskala - Wallisa dla prób niezależnych. Ten test jest nieparametryczną
alternatywą ANOVA (w klasyfikacji pojedynczej). Po odrzuceniu hipotezy
zerowej stosowano właściwy dla tego testu test wielokrotnych porównań.
Dla sprawdzenia hipotezy o braku istotnej różnicy między dwoma próbami
stosowano test U Manna Whitney’a.
W obliczeniach statystycznych posłużono się testem U Manna Whitney’a,
w celu sprawdzenia różnic między dwoma próbami. Różnice pomiędzy średnią zawartością Hg u kobiet zdrowych i chorych, oraz u mężczyzn zdrowych
i chorych, przedstawiono na wykresie nr 1.
Średnia zawartość rtęci w tkankach przewodu pokarmowego jest prawie
identyczna u kobiet chorych zarówno z przedziału wiekowego 20-60 lat, jak
i 61-90 lat, w porównaniu z zawartością tego pierwiastka u kobiet zdrowych.
W przypadku mężczyzn, średnia zawartość rtęci jest zdecydowanie wyższa
u pacjentów chorych z grupy wiekowej 61-90 lat (wykres 2).
295
Rys. 1. Średnia zawartość rtęci w przewodzie pokarmowym kobiet i mężczyzn
zdrowych i chorych (µg•g-1 s.m.)
Średnia zawartość rtęci jest wyższa w tkankach nowotworowych przewodu
pokarmowego zarówno u kobiet, jak i u mężczyzn, w porównaniu do tkanek
zdrowych przewodu pokarmowego kobiet i mężczyzn (wykres 1).
W celu sprawdzenia różnic w średniej zawartości badanych pierwiastków pomiędzy dwoma grupami wiekowymi, osobno dla kobiet zdrowych i chorych
i dla mężczyzn zdrowych i chorych, zastosowano test U Manna – Whitney’a.
Otrzymane wyniki ilustruje wykres nr 2.
Rys. 2. Średnia zawartość rtęci w tkankach zdrowych i nowotworowych przewodu
pokarmowego kobiet i mężczyzn w wieku 20-60 i 61-90 lat (µg•g-1 s.m.)
296
DYSKUSJA I WNIOSKI
Toksyczne metale są często transportowane do wnętrza komórki w postaci
rozpuszczalnych kompleksów organicznych. Metionina jest aminokwasem,
który może być transportowany do wnętrza komórki za pośrednictwem przenośnika aminokwasów obojętnych typu L, obecnych w błonie komórki [Ballatori 2002]. Jak na złość toksyczny metal w postaci metylortęci może wiązać
się do aminokwasu biogennego - cysteiny, formując w ten sposób kompleks,
który przypomina budową strukturalną metioninę, będącą aminokwasem endogennym, dzięki czemu może być transportowana do wnętrza komórki przy
pomocy przenośnika aminokwasów typu L [Aschner i Clarkson 1988; Kerper
i in. 1992]. Rtęć nie jest składnikiem potrzebnym do prawidłowego funkcjonowania organizmów zwierzęcych. Niektóre badania wykazują, że rtęć w związkach metylowych jest znacznie szybciej wchłaniana przez organizmy zwierzęce,
a więc i bardziej toksyczna od rtęci metalicznej, podobnie jak metylortęć pochodzenia organicznego wykazuje aktywniejsze działanie w blokowaniu procesów
metabolicznych od chemicznej soli metylortęci [Kabata-Pendias i Pendias 1979].
Związki metylowe rtęci wchłaniane są w ponad 90% przez człowieka drogą pokarmową [Kowalak 1991].
Kumulacja rtęci w tkankach zdrowych jelita grubego wynosi 0.012 µg•g-1
s.m., z kolei nieco mniejszą średnią zawartość ma śluzówka żołądka (0.008
µg•g-1 s.m). Należy podkreślić, że wyniki te są znacznie niższe od wyników
uzyskanych w tkankach nowotworowych, co wskazuje na możliwy udział
rtęci w transformacji nowotworowej - nie jest jasne jednak, czy podwyższona
jej zawartość jest przyczyną czy skutkiem zaburzenia homeostazy.
W przypadku żołądka stwierdzono negatywny wpływ metylortęci na ryzyko
rozwoju raka żołądka, co jest związane z dostawaniem się do organizmu jej
soli [Yorifuji i in. 2007]. Kumulacja rtęci jest wyższa w tkance guza żołądka
(0.015 µg•g-1 s.m.), w porównaniu do zdrowej śluzówki (0.008 µg•g-1 s.m.).
W przypadku jelita grubego sytuacja jest odwrotna - większą zawartością
odznacza się śluzówka zdrowa (0.032 µg•g-1 s.m.), niż tkanka guza (0.017
µg•g-1 s.m.). Zróżnicowane miejsce koncentracji Hg w żołądku i jelicie grubym osób chorych, jest ważną informacją dla etiologii tych nowotworów.
Wykazano, że różnice w zawartości poszczególnych pierwiastków w przewodzie pokarmowym zależą od: płci, stanu zdrowia, wieku, badanego odcinka przewodu pokarmowego oraz stanu patologicznego tkanki. Średnia
zawartość rtęci jest wyższa w tkankach kobiet i mężczyzn chorych, w porównaniu do tkanek osób zdrowych obu płci. Spośród osób chorych, największą
zawartość rtęci wykazano u mężczyzn z przedziału wiekowego 61-90 lat.
Wykazano istotne różnice w zawartości rtęci w zależności od płci (najwięcej
Hg skumulowane jest u chorych mężczyzn), co może być konsekwencją różnic
w ilości spożywanych pokarmów, różnic w metabolizmie oraz narażeniem poprzez miejsce pracy (górnictwo, przemysł) [Ashe 2012].
297
LITERATURA
Aschner M. Clarkson T.W. 1988. Uptake of methylmercury in the rat brain: effects of
amino acid. W: Brain Research, 462: 31-39.
Ashe K. 2012. Elevated mercury concentrations in humans of madre de dios, peru.
W: PLoS One, 7, 3.
Ballatori N. 2002. Transport of toxic metals by molecular mimicry. W: Environmental
Health Perspectives, 110: 689-694.
Hayes R.B. 1997. The carcinogenicity of metals in humans. W: Cancer Causes and
Control 8, 371-385.
Kabata - Pendias A., Pendias H. 1979. Pierwiastki śladowe w środowisku biologicznym.
Wydawnictwo Geologiczne. Warszawa. 78-100, 100-145, 240-257.
Key T.J., Allen N.E., Spencer E.A., Travis R.C. 2002. The effect of diet on risk of
cancer. W: Lancet. 360: 861-868.
Kotynia J. 2006. Rak żołądka. 49-55. W: Małecka – Panas E. Zarys gastroenterologii.
Wydawnictwo Uniwersytetu Medycznego. Łódź.
Kowalak A. 1991. Metale śmierci. CEEW. Krosno. 18-27.
Tanaka T. 1997. Effect of diet on human carcinogenesis. W: Critical Reviews in Oncology/ Hematology. 25: 73-95.
Van Halteren H.K., Taal B.G., Van Tinteren, H., Van Leeuwen F.E. 1995. Risk Factors for the Development of Oesophageal Cancer as a Second Primary Tumor. W:
European Journal of Cancer. 11: 1836-1839.
Warnakulasuriya S. 2009. Global epidemiology of oral and oropharyngeal cancer. W:
Oral Oncology. 45: 309-316.
Wronkowski Z. 2001. Epidemiologia nowotworów złośliwych przewodu pokarmowego. 15-77. W: Krawczyk M. Nowotwory przewodu pokarmowego. Wydawnictwo
Lekarskie PZWL. Warszawa.
Yorifuji T., Tsuda T., Kawakami N. 2007. Age standardized cancer mortality ratios in
areas heavily exposed to methyl mercury. W: International Archives Occupational
Environmental Health. 80: 679-688.
298
mgr Marta Głogowska
Zakład Zoologii Kręgowców i Biologii Człowieka
Uniwersytet Pedagogiczny w Krakowie
e-mail: [email protected]; [email protected]
dr hab. prof. UP Grzegorz Formicki
Zakład Fizjologii Zwierząt i Toksykologii
lek. med. Bogdan Kosowski
Niepubliczny Zakład Opieki Zdrowotnej PROSMED w Krakowie
dr hab. prof. UP Robert Stawarz
Zakład Zoologii Kręgowców i Biologii Człowieka
Opiekun naukowy: dr hab. Robert Stawarz prof. UP
299
Beata Horecka
EPISTEME
14/2012
s.301-307
ISSN 1895-4421
STRUKTURA GENETYCZNA POPULACJI DZIKO ŻYJĄCEJ LISA
POSPOLITEGO (VULPES VULPES)
GENETIC STRUCTURE OF WILD RED FOX (VULPES VULPES)
POPULATION
Abstrakt. Celem pracy była charakterystyka struktury genetycznej lisów pospolitych z różnych regionów Polski, w oparciu o analizę sekwencji mikrosatelitarnych.
Materiał stanowiły próbki skór pozyskane od 27 lisów pospolitych z dwóch obszarów: woj. podkarpackie (n=20) i woj. lubelskie (n=7). Identyfikację alleli w obrębie
10 loci (Ren02K21, Ren01E05, INU013, INU014, INU019, Ren44K10, Ren13J22,
Ren39L15, Ren04M22, Ren02C20) przeprowadzono w oparciu o produkty PCR rozdzielone na drodze elektroforezy kapilarnej. Najbardziej polimorficzne okazało się
locus INU014, w którym odnotowano dla populacji podkarpackiej największą liczbę
alleli (12) oraz najwyższą wartość PIC (0,8553). Dla obu populacji indeks stopnia
polimorfizmu we wszystkich loci przekroczył 0,5. W 5 loci zaobserwowano znaczne
różnice pomiędzy heterozygotycznością obserwowaną a oczekiwaną. Dystans genetyczny (Nei, 1978) dzielący badane populacje wyniósł 0,1835.
Słowa kluczowe: lis pospolity dziki, sekwencje mikrosatelitarne
Summary. The aim of the study was to characterise the genetic structure of red
foxes from different regions in Poland, based on microsatellite sequence analysis.
Material were skin samples collected from 27 red foxes in two areas: Podkarpackie
voivodeship (n=20) and Lubelskie voivoideship (n=7). Allele identification in 10
loci (Ren02K21, Ren01E05, INU013, INU014, INU019, Ren44K10, Ren13J22,
Ren39L15, Ren04M22, Ren02C20) was conducted on the basis of PCR products
length separated by capillary electrophoresis. The most polymorphic was INU014
locus, at which the highest total number of alleles (12) and the highest PIC value
(0,8553) were found in population from Podkarpackie voivoideship. For both populations polymorphic information content in all loci was higher than 0,5. In 5 loci considerable differences between observed and expected heterozygosity were noted. Genetic
distance (Nei, 1978) among studied populations was 0,1835.
Key words: wild red fox, microsatellite sequences
301
Beata Horecka
WSTĘP
Lis pospolity (Vulpes vulpes) jest gatunkiem o najszerszym zasięgu geograficznym spośród wszystkich dzikich ssaków drapieżnych, który obejmuje Eurazję,
Amerykę Północną, północną Afrykę oraz Australię, gdzie został introdukowany
przez człowieka w XIX wieku. W Polsce lisa pospolitego spotyka się na terenie całego kraju a drapieżnik ten stale zwiększa swoją liczebność. Wiąże się to
w głównej mierze z wprowadzeniem szczepionek przeciw wściekliźnie, które
zapobiegając rozprzestrzenianiu choroby przez lisy, jednocześnie ograniczyły
naturalną selekcję osobników tego gatunku. Lisy pospolite zamieszkujące zarówno Polskę, jak i inne kraje czy kontynenty, charakteryzuje duża zmienność
umaszczenia. Ma to związek z modyfikującym działaniem środowiska, głównie
zaś z zamieszkiwanym obszarem geograficznym.
Plastyczność fenotypu może powodować problemy z określeniem różnorodności genetycznej, w przypadku dokonywania oceny jedynie na podstawie
zewnętrznych cech morfologicznych. Coraz większą popularnością cieszy
się więc obecnie ekologia molekularna, obejmująca badania genetyczne
zwierząt dziko żyjących., w tym genetykę populacji oraz identyfikację i ocenę różnorodności biologicznej gatunków. Skomplikowane zależności pomiędzy genotypem, fenotypem i środowiskiem utrudniają ocenę zmienności populacji na podstawie samych obserwacji. Wiarygodną metodą badawczą stają
się w takim przypadku markery molekularne. Jednymi z często wykorzystywanych narzędzi służących analizie zmienności gatunków wolno żyjących
są sekwencje mikrosatelitarne. Markery te mają kodominujący charakter,
ponadto cechuje je wysoki polimorfizm oraz powszechność występowania
w genomie i mendlowski model dziedziczenia. Sekwencje mikrosatelitarne
znalazły również zastosowanie w badaniach obejmujących dzikie populacje
należące do rodziny Canidae. Dotyczyły one między innymi lisów pospolitych [Oishi i in. 2011; Sacks i in. 2011; Swanson i in. 2005], lisów polarnych
[Norén i in. 2011; Dalén i in. 2006; Nyström i in. 2006], czy wilków [Verardi
i in. 2006; Vilà i in. 2002]. Celem pracy była zbadanie struktury genetycznej
polskiej populacji dziko żyjącej lisa pospolitego oraz ocena zróżnicowania
genetycznego w obrębie grup osobników pochodzących z dwóch regionów
kraju, w oparciu o analizę polimorfizmu dziesięciu sekwencji mikrosatelitarnych.
MATERIAŁ I METODY
Analizie poddano 27 osobników lisa pospolitego (Vulpes vulpes) z dwóch
rejonów Polski: województwo lubelskie (n=7) i województwo podkarpackie
(n=20). Materiał do badań zwierząt dzikich stanowiły próbki tkanek – fragmenty skór. Izolację DNA wykonano przy pomocy zestawu QIAamp DNA
Mini Kit firmy QIAGEN. Czystość i koncentrację wyizolowanego DNA
302
Struktura genetyczna poplacji dziko żyjącej lisa pospolitego...
oceniano spektrofotometrycznie w aparacie BioPhotometer, firmy Eppendorf. Ocenę jakościową przeprowadzono poprzez rozdział elektroforetyczny
w 1% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny, w buforze 1xTBE,
pod napięciem 70V w czasie 40 minut. Próby wizualizowano w świetle UV
i archiwizowano przy pomocy programu ScionImage. Na podstawie piśmiennictwa do analizy wybrano 10 markerów mikrosatelitarnych pochodzących
z genomu psa domowego: Ren02K21, Ren01E05, INU013, INU014, INU019,
Ren44K10, Ren13J22, Ren39L15, Ren04M22, Ren02C20 [Jouquand i in.
2000; Ichikawa i in. 2002]. Reakcję PCR wykonano z zastosowaniem zestawu AmpliTag Gold 360 DNA Polymerase w termocyklerze MJ Research
PTC 225 Tetrad. Charakterystykę starterów przedstawiono w tabeli 1.
Locus
INU013
INU014
INU19
Ren01E05
Ren02C20
Ren04M22
Ren02K21
Ren39L15
Ren13J22
Ren44K10
Sekwencja startera.
F – Forward; R – Rewerse
F:5’AGAGAAAAGCATCCAGTAAG3’
R:5’AAATGGTCTTCCTGTATCCT3’
F:5’ACATTTATCATAGTAAGTACCGAG3’
R:5’AAAACCACAAAACCTAACCT3’
F:5’TGACAAATAGGGTGGATGAT3’
R:5’GGTCTTTAGCAGGGACGAAT33
F:5’TCATCACTTCCTGCTCCATT3’
R:5’TCTCATGCCACACGGAACCT3’
F:5’AGAAATTGCATCACTCACAT3’
R:5’GCTGCTCCGAAAACTAACTT3’
F:5’AGAGAAAAGCATCCAGTAAG3’
R:5’AAATGGTCTTCCTGTATCCT3’
F:5’CTTAGTTTTCAGGCTTTCAG3’
R:5’TGATAGGAAGTAAAGATGTT3’
F:5’CTTGTTTTCTTTTGGATAGC3’
R:5’CTGCCTTGAAGAATGATAAA3’
F:5’TATTGCAACTGTCTTATGTA3’
R:5’TGTCTTAGTGATGGCTCCTG3’
F:5’CATATTGGACCTTCACAT3’
R:5’TTAACGCACAACTTCATC3’
Temperatura
przyłączania
starterów (°C)
Barwnik
6-FAM
60
NED
6-FAM
6-FAM
52
VIC
NED
NED
6-FAM
50
VIC
NED
Tab. 1. Charakterystyka starterów dla analizowanych sekwencji mikrosatelitarnych
Objętość jednej próby wynosiła 10 µl (9 µl mieszaniny reakcyjnej i 1 µl
wyizolowanego DNA). Mieszanina reakcyjna dla loci INU013, INU014,
INU019, Ren01E05, Ren02C20, Ren04M22 zawierała 1X bufor PCR, MgCl2
(2,7 mM), dNTP mix (0,2 mM), startery (0,3 pmol/µl - każdy) oraz 0,2 U polimerazy. Dla loci Ren02K21, Ren39L15 skład mieszaniny był następujący:
1X bufor PCR, MgCl2 (2,2 mM), dNTP mix (0,2 mM), startery (0,32 pmol/
303
Beata Horecka
µl - każdy) oraz 0,12 U polimerazy. W przypadku loci Ren13J22 i Ren44K10
mieszanina reakcyjna zawierała 1X bufor PCR, MgCl2 (2,2 mM), dNTP mix
(0,2 mM), startery (0,31 pmol/µl - każdy) oraz 0,15 U polimerazy. Produkty
PCR oceniono spektrofotometrycznie oraz w żelu agarozowym. Po reakcji
PCR przeprowadzono elektroforezę fragmentów DNA w analizatorze kapilarnym 3100 Avant Genetic Analyzer firmy Applied Biosystems. Wyniki
analizowano przy wykorzystaniu programu komputerowego: Gene Mapper
v 3.5. Długości otrzymanych alleli ustalono z zastosowaniem GeneScan
– 500 Rox Size Standard. Analizę statystyczną wyników przeprowadzono
z wykorzystaniem programu komputerowego Popgene v 1.31 oraz Cervus
v 3.0.3. Zmienność wewnątrz- i międzypopulacyjną oszacowano na podstawie następujących parametrów: indeks stopnia polimorfizmu (PIC), heterozygotyczność oczekiwana (He) i obserwowana (Ho), podobieństwo i dystans
genetyczny według Nei’a (1978), a także współczynnik Wright’a (FST) i liczba migrantów na pokolenie (Nm).
WYNIKI I DYSKUSJA
Analizowano 10 sekwencji mikrosatelitarnych, w dwóch populacjach lisów
pospolitych. We wszystkich loci większą liczbę alleli odnotowano dla lisów
z województwa podkarpackiego (Tab. 2). Najwięcej alleli (12) stwierdzono
dla tej grupy osobników w locus INU014. W trzech loci wystąpiło po 8 alleli.
Były to loci Ren02K21, INU013 i Ren02K21. W przypadku lisów z województwa lubelskiego najwięcej alleli – po 7, odnotowano w loci INU014
oraz INU019.
W obu analizowanych populacjach wartość indeksu stopnia polimorfizmu
(PIC) dla wszystkich loci wynosiła >0,5, co świadczy o ich wysokiej informatywności. Najwyższy PIC w populacji lubelskiej stwierdzono w locus
INU019 i wynosiła ona 0,8119. Dla populacji podkarpackiej najwyższą wartości PIC odnotowano w locus INU014 (0,8553).
Kolejnym parametrem opisującym zróżnicowanie genetyczne jest heterozygotyczność. Najwyższa heterozygotyczność obserwowana wystąpiła u lisów
z województwa podkarpackiego w locus Ren02K21 i wynosiła 1,0000. Wysoką wartość heterozygotyczności odnotowano także w loci INU014 (0,9000)
oraz Ren01E05 i INU013 (0,8000). Najmniejszą heterozygotyczność obserwowaną (0,2000) stwierdzono w tej grupie w locus Ren13J22. W populacji
lisów z terenu województwa lubelskiego najwyższa heterozygotyczność o
wartości 0,8571 została odnotowana w locus Ren39L15. Wysoką heterozygotycznością charakteryzowały się także loci INU013 i INU019 (0,8333).
Dla trzech loci: Ren01E05, Ren13J22, Ren04M22, heterozygotyczność obserwowana wynosiła 0,4286 i była to najniższa wartość odnotowana w tej
grupie osobników. W obu analizowanych populacjach heterozygotyczność
304
obserwowana odbiegała od oczekiwanej. Największe różnice zaobserwowano dla obu populacji w loci Ren13J22 i Ren04M22, jak również w loci Ren01E05 dla populacji lubelskiej oraz Ren44K10 i Ren02C20 dla osobników
z województwa podkarpackiego. W przypadku sześciu populacji lisa na wyspie Hokkaido (Japonia) wartości heterozygotyczności obserwowanej obliczone dla poszczególnych grup, łącznie dla 12 loci mikrosatelitarnych, zawierały się w przedziale 0,59 – 0,67 i jedynie dla populacji centralnej odbiegały
istotnie od heterozygotyczności oczekiwanej [Oishi i in. 2011]. Z kolei Sacks
i in. (2011) analizując polimorfizm 33 sekwencji mikrosatelitarnych w rodzimej
i introdukowanej populacji lisa, nie zaobserwowali odchylenia od równowagi
Hardy’ego-Weinberga w żadnym z loci. Odnotowane przez tych autorów średnie
wartości heterozygotyczności dla wspomnianych populacji wynosiły 0,65 i 0,69.
Lis dziki - lubelskie
Locus
La
Zd (pz)
Ren02K21
6
Ren01E05
PIC
Lis dziki - podkarpackie
Ho
He
La
Zd (pz)
PIC
Ho
He
288-302 0,6049
0,7143
0,6813
8
280-302
0,8117
1,0000
0,8538
5
402-410 0,6707
0,4286
0,7692
6
402-412
0,6892
0,8000
0,7462
INU013
6
169-185 0,7193
0,8333
0,8182
8
163-183
0,7930
0,8000
0,8372
INU014
7
158-184 0,7795
0,7143
0,8681
12
158-186
0,8553
0,9000
0,8910
INU019
7
266-278 0,8119
0,8333
0,9091
7
266-280
0,7705
0,7000
0,8192
Ren44K10
3
202-206 0,5674
0,7143
0,6923
7
198-210
0,7064
0,5500
0,7641
Ren13J22
4
408-418 0,6348
0,4286
0,7473
4
408-418
0,5293
0,2000
0,6244
Ren39L15
5
230-240 0,6707
0,8571
0,7692
6
220-236
0,6424
0,7000
0,7090
Ren04M22
6
179-191 0,7444
0,4286
0,8352
7
179-191
0,6933
0,6500
0,7385
Ren02C20
4
292-302 0,6499
0,7143
0,7582
8
292-308
0,7894
0,5000
0,8346
Tab. 2. Liczba (La) i zakres długości (Zd) alleli oraz indeks stopnia polimorfizmu
(PIC), heterozygotyczność obserwowana (Ho) i oczekiwana (He) dla badanych
populacji w poszczególnych loci
Dla analizowanych populacji lisa pospolitego z terenu Polski obliczono także współczynnik Wright’a (FST). Jego wartość wyniosła 0,038, co świadczy
o małym zróżnicowaniu genetycznym pomiędzy analizowanymi populacjami. Oishi i in. (2011) podali wartości współczynnika FST pomiędzy poszcze305
Beata Horecka
gólnymi populacjami lisów z Japonii zawierające się w zakresie od 0,02 do
0,17, co wskazuje na zróżnicowany stopień odrębności pomiędzy osobnikami
z różnych obszarów. Wartość współczynnika FST 0,08 oszacowana w badaniach
Sacks’a i in. (2011) świadczy o umiarkowanym zróżnicowaniu genetycznym
pomiędzy rodzimą i wprowadzoną populacją lisów kalifornijskich. Na podstawie współczynnika FST ustalono także w badaniach własnych liczbę migrantów na pokolenie (Nm), która kształtowała się na poziomie 6,34. Dodatkowo,
na podstawie frekwencji alleli w badanych loci, obliczono podobieństwo oraz
dystans genetyczny dzielący lisy pospolite z terenu województwa lubelskiego
i podkarpackiego. Podobieństwo genetyczne pomiędzy wspomnianymi populacjami wynosiło 0,8323, zaś dzielący je dystans przyjął wartość 0,1835.
WNIOSKI
Wszystkie analizowane loci okazały się dla obu populacji wysoce polimorficzne, co świadczy o ich przydatności w analizach zmienności genetycznej.
Zarówno niska wartość współczynnika Wright’a, jak również wynikająca
z tego znaczna liczba migrantów na pokolenie, mogą być spowodowane małym dystansem geograficznym dzielącym badane populacje, gdyż województwo lubelskie i podkarpackie położone są w bezpośrednim sąsiedztwie. Potwierdza to również wysoka wartość podobieństwa genetycznego pomiędzy
analizowanymi grupami, a co za tym idzie – niewielki dystans genetyczny.
Taka sytuacja może mieć także wpływ na zaburzenie równowagi genetycznej,
związane z efektem Wahlunda, gdyż próby gromadzone na granicy występowania dwóch populacji mogą być mylnie klasyfikowane i może to w efekcie
prowadzić do pozornego niedoboru heterozygot.
LITERATURA
Dalén L., Kvaløy K., Linnell J. D. C., Elmhagen B., Strand O., Tannerfeldt
M., Henttonen H., Fuglei E., Landa A., Angerbjörn A. 2006. Population structure
in a critically endangered arctic fox population: does genetics matter? Molecular
Ecology, 15 (10): 2809-2819.
Ichikawa Y., Takahashi Y., Tsumagari S., Takeishi M., Ishihama K., Morita
M., Kanemaki M., Minezawa M., Takahashi H. 2002. Identification and characterization of 40 dinucleotide microsatellites in the dog genome. Animal Genetics,
33: 377-405.
Jouquand S., Priat C., Hitte C., Lachaume P., André C., Galibert F. 2000. Identification and characterization of a set of 100 tri- and dinucleotide microsatellites in
the canine genome. Animal Genetics, 31: 266-272.
306
Nei M. 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from
a small numbers of individuals. Genetics, 89: 583-590.
Norén K., Carmichael L., Dalén L., Hersteinsson P., Samelius G., Fuglei E., Kapel
C. M. O., Menyushina I., Strobeck C., Angerbjörn A. 2011. Arctic fox Vulpes
lagopus population structure: circumpolar patterns and processes. Oikos, 120
(6): 873–885.
Nyström V., Angerbjörn A., Dalén L. 2006. Genetic consequences of a demographic
bottleneck in the Scandinavian arctic fox. Oikos, 114 (1): 84-94.
Oishi T., Uraguchi K., Takahashi K., Masuda R. 2011. Population Structures of the
Red Fox (Vulpes vulpes) on the Hokkaido Island, Japan, Revealed by Microsatellite Analysis. Journal of Heredity, 102 (1):38–46.
Sacks B. N., Moore M., Statham M. J., Wittmer H. U. 2011. A restricted hybrid zone
between native and introduced red fox (Vulpes vulpes) populations suggests reproductive barriers and competitive exclusion. Molecular Ecology, 20: 326–341.
Swanson B. J., Fuhrmann R. T., Crabtree R. L. 2005. Elevational isolation of red
fox populations in the Greater Yellowstone Ecosystem. Conservation Genetics,
6: 123-131.
Verardi A., Lucchini V. Randi E. 2006. Detecting introgressive hybridization between freeranging domestic dogs and wild wolves (Canis lupus) by admixture linkage disequilibrium analysis. Molecular Ecology, 15 (10): 2845-2855.
Vilà C., Sundqvist A. K., Flagstad Ø., Seddon J., Björnerfeldt S., Kojola I., Casulli A.,
Sand H., Wabakken P., Ellegren H. 2003. Rescue of a severely bottlenecked wolf
(Canis lupus) population by a single immigrant. Proceedings of the Royal Society
B (Biological Sciences), 270: 91-97.
mgr inż. Beata Horecka
Katedra Biologicznych Podstaw Produkcji Zwierzęcej
Opiekun naukowy: prof. dr hab. Grażyna Jeżewska-Witkowska
Praca naukowa finansowana ze środków NCBiR, projekt rozwojowy NR 12-0140-10
307
Andrzej Jurkowski
Andrzej Latusek
EPISTEME
14/2012
s.309-315
ISSN 1895-4421
ANALIZA OBECNOŚCI MARKERA XCFD81-5D U ŻYTA OZIMEGO
ANALYSIS OF A MARKER XCFD81-5D PRESENCE IN WINTER RYE
Abstrakt. Żyto ozime (Secale cereale L.) jest jednym z najważniejszych zbóż uprawianych w Polsce. Mączniak prawdziwy (Blumeria graminis) może powodować
w sprzyjających warunkach dla jego rozwoju straty w plonie żyta w wysokości nawet
do 20%. Regulacja odporności żyta na mączniaka nie jest tak dokładnie poznana jak
u pszenicy. Dotychczas nie wykonywano żadnych badań molekularnych w tym zakresie. Natomiast u pszenicy zidentyfikowano łącznie 53 różnych alleli odporności
na mączniaka prawdziwego (Pm) i dla większości z nich wykazano markery molekularne ściśle sprzężone z tymi genami. W pracy podjęto próbę identyfikacji genu
odporności na mączniaka prawdziwego u żyta ozimego za pomocą analizy stopnia
podatności na porażenie przez mączniaka prawdziwego oraz analizy występowania
markera Xcfd81-5D, sprzężonego z genem odporności na mączniaka prawdziwego
Pm2 u pszenicy. Analizom poddano łącznie 397 linii wsobnych żyta ozimego.
Słowa kluczowe: pszenica, żyto ozime, mączniak prawdziwy, geny odporności
Summary. Winter rye (Secale cereale L.) is one of the most important cereals in
Poland. Powdery mildew (Blumeria graminis) may causes losses of the rye yield up
to 20%. Adjusting the resistance of wheat to powdery mildew is not as well understood as in wheat. Not yet performed any molecular studies in this field. In contrast,
a total of 53 different alleles for resistance to powdery mildew (Pm) was identified in
wheat, and for most of them are molecular markers tightly linked to those genes. This
paper attempts to identify a gene for resistance to powdery mildew in winter rye by
analyzing the degree of susceptibility to infection by powdery mildew and analysis
of a marker Xcfd81-5D presence, linked with a Pm2, gene for resistance to powdery
mildew in wheat. Analyzes were a total of 397 inbred lines of winter rye.
Key words: wheat, winter rye, powdery mildew, resistance genes
309
WSTĘP
Żyto ozime (Secale cereale L.) jest jednym z najważniejszych zbóż uprawianych w Polsce. Pod względem powierzchni upraw zajmuje drugie miejsce. Do
najważniejszych chorób grzybowych liści należy mączniak prawdziwy (Blumeria graminis f. sp. secalis), który może powodować w sprzyjających warunkach dla jego rozwoju straty w plonie żyta w wysokości nawet do 20%.
Regulacja odporności żyta na mączniaka prawdziwego nie jest tak dokładnie
poznana jak u pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum L.). Jak dotąd u żyta
rozpoznano 9 genów warunkujących odporność na porażenie przez mączniaka prawdziwego. Są to geny Pm1a, Pm1b, Pm7 (1RS), Pm2 i Pm8 (2RL),
Pm3 (3RS), Pm6 (4R), Pm4 (5RL), Pm5 i Pm(?) (6RL) [Schlegel i in. 1998].
Natomiast u pszenicy zidentyfikowano łącznie 53 różne allele odporności na
mączniaka prawdziwego (Pm), i dla większości z nich wykazano markery
molekularne ściśle sprzężone z tymi genami [Ma i in. 2011; Huang i Röder
2004; Miranda i in. 2006; 2007; Blanco i in. 2008; Perugini i in. 2008; Luo
i in. 2009; Li i in. 2009; Hua i in. 2009; He i in. 2009].
Uprawa odmian odpornych oferuje skuteczne, ekonomiczne i ekologicznie bezpieczne podejście do wyeliminowania użycia fungicydów i do zmniejszenia strat
plonów spowodowanych przez mączniaka prawdziwego. Natomiast zidentyfikowanie markerów molekularnych ściśle sprzężonych z genami odporności na
mączniaka prawdziwego u żyta znajdzie praktyczne zastosowanie w procesie
hodowli nowych odmian. Identyfikacja genów odporności na tego patogena
umożliwi hodowcom szybsze wytwarzanie odmian odpornych na mączniaka
stosując selekcję przy użyciu markerów molekularnych (MAS- marker assisted
selection). Selekcja przy użyciu markerów molekularnych posiada wiele zalet:
jest niezależna od stadium rozwojowego rośliny i warunków środowiskowych
(można ją stosować już w bardzo wczesnym stadium rozwojowym), przy czym
nie niszczy badanego materiału.
Wyprowadzenie odmian tego zboża odpornych na mączniaka przyczyni się
z kolei do zmniejszenia strat w plonie. W zależności od stopnia odporności danej odmiany, możliwe będzie ograniczenie, lub całkowite zaniechanie
oprysków fungicydami. Zwiększy to opłacalność produkcji żyta. Przyczyni
się ponadto do zmniejszenia zanieczyszczania środowiska. Celem pracy była
analiza obecności markera Xcfd81-5D wśród badanych genotypów żyta.
Marker Xcfd81-5D jest sprzężony z genem Pm2 u pszenicy [Qiu i in. 2006].
MATERIAŁ I METODY
Materiał do badań stanowiło 397 linii wsobnych żyta przekazanych przez firmy hodowlane oraz wchodzących w skład kolekcji własnej Katedry Genetyki
Hodowli Roślin i Nasiennictwa Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu.
310
Analiza obecności markera XCFD81-5D...
Pierwszą fazą badań była ocena podatności genotypów żyta na porażenie
mączniakiem prawdziwym. Drugą fazę badań stanowiła analiza obecności
markera Xcfd81-5D wśród wybranych genotypów żyta. Analiza ta była przeprowadzona metodą PCR, z wykorzystaniem starterów właściwych dla markera Xcfd81-5D.
Ocenę podatności genotypów żyta na porażenie przez Blumeria graminis
przeprowadzono w doświadczeniu szklarniowym. Wykorzystano pięciostopniową skalę porażenia (0–4), gdzie 0 – oznacza brak widocznych objawów
infekcji; 1 - wysoka odporność - słabo rozwinięta grzybnia bez zarodnikowania - silne nekrozy i chlorozy; 2 - średnia odporność - widoczne słabe
zarodnikowanie - słabe nekrozy i chlorozy; 3 – średnia podatność - średnio
rozwinięta grzybnia i zarodnikowanie; 4 - dobrze rozwinięta grzybnia i obfite zarodnikowanie. Szklarniowe doświadczenie infekcyjne przeprowadzano
z wykorzystaniem własnej polowej populacji patogena utrzymywaną na siewkach wrażliwej odmiany żyta oraz inokulum otrzymanym z Hodowli Roślin
Smolice Sp. z o. o. Grupa IHAR. Inokulację przeprowadzano w fazie trzech
liści metodą „miotełkową”. Następnie rośliny umieszczono w kamerze o wysokiej wilgotności. Stopień porażenia roślin oceniany był po siedmiu dniach od
inokulacji, posługując się wspomnianą skalą.
Genomowy DNA z roślin wyizolowano metodą ekstrakcji fenolowej opracowaną przez Junghansa i Metzlaffa (1990). Materiał do izolacji stanowiły
liście 22 siewek genotypów żyta: 11 o największym i 11 najmniejszym stopniu porażenia przez Blumeria graminis. Ilość oraz czystość wyizolowanego
DNA oznaczano spektrofotometrycznie.
Źródłem matrycowego DNA do reakcji PCR były izolaty genomowego DNA
badanych genotypów żyta. Amplifikację przeprowadzono przy użyciu polimerazy DreamTaq Polymerase firmy Fermentas. Warunki termiczne reakcji PCR, sekwencje starterów, jak również skład mieszaniny reakcyjnej był
zgodny z danymi umieszczonymi w bazie danych na stronie internetowej
http://wheat.pw.usda.gov.
Analizom poddano genotypy żyta najmniej podatne na porażenie mączniakiem, następnie wykonano amplifikację dla genotypów wrażliwych w celu
analizy różnic uzyskiwanych produktów amplifikacji.
Produkty amplifikacji analizowano elektroforetycznie. W każdym rozdziale stosowano marker wielkości fragmentów DNA (MassRuler DNA Ladder
#SM0403, Fermentas) jako standard zewnętrzny i linię referencyjną pszenicy Ulka/8*CC jako próbę kontrolną swoistości reakcji PCR. Żele barwiono
wodnym roztworem bromku etydyny (5 μg/ml) przez 20 minut. Wybarwione
żele analizowano w świetle UV i archiwizowano w formie plików TIFF.
311
WYNIKI
W przeprowadzonym teście szklarniowym oceną podatności na porażenie
przez Blumeria graminis f. sp. secalis objęto ogółem 379 genotypów. Średni
stopień porażenia badanych materiałów żyta był istotnie różny i wynosił od
1 do 4 (dane nie pokazane).
Spośród badanych genotypów żyta wybrano 11 linii wsobnych żyta o najniższym stopniu porażenia i 11 linii wsobnych o najwyższym stopniu porażenia
mączniakiem prawdziwym. Analiza produktów amplifikacji wśród genotypów odpornych (o najmniejszym stopniu porażenia) wykazała obecność markera Xcfd81-5D (produkt wielkości 283 pz), wśród 10 genotypów (Rys. 1.).
Natomiast wśród produktów amplifikacji dla linii nieodpornych na porażenie
mączniakiem marker Xcfd81-5D występuje u dziewięciu genotypów (Rys. 2).
Rys. 1. Rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji dla linii wsobnych żyta
ozimego o najmniejszej podatności na porażenie mączniakiem prawdziwym.
M – marker, K – kontrola- Ulka/8*CC, 1 – UP77, 2 – UP78, 3 – UP259, 4 – UP269,
5 – UP366, 6 – UP382, 7 – UP2, 8 – UP76, 9 – UP90, 10 – UP260, 11 – UP287
Rys. 2. Rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji dla linii wsobnych żyta
ozimego o największej podatności na porażenie mączniakiem prawdziwym.
M – marker, K – kontrola - Ulka/8*CC, 1 – UP397, 2 – UP390, 3 – UP389,
4 – UP388, 5 – UP386, 6 – UP385, 7 – UP384, 8 – UP379, 9 – UP378, 10 – UP377,
11 – UP374
312
DYSKUSJA I WNIOSKI
Markery molekularne są obecnie szeroko wykorzystywane do mapowania
genów i innych badań genetycznych, ponieważ nie są zmienne pod wpływem
warunków środowiskowych i fazy wzrostu badanego organizmu. Wykorzystanie markerów molekularnych w technice PCR, do oznaczania regionów
genomowych są bardziej wydajne w selekcji przy użyciu markerów (MAS),
ze względu na małą ilość wymaganej matrycy DNA i łatwe w badaniu dużych populacji.
Zidentyfikowanie markerów molekularnych sprzężonych z genami odporności
na choroby, umożliwia uproszczenie działań hodowlanych takich jak: wyprowadzanie nowych odmian [Bonnett i in. 2005], wyprowadzanie linii ‘near isogenic
line’ [Zhou i in. 2005], a także piramidyzacja genów oporności w pojedynczych
genotypach. Ułatwienie działań hodowlanych możliwe jest dzięki użyciu selekcji
przy użyciu markerów (MAS). MAS zwiększa efektywność konwencjonalnej
hodowli roślin, poprzez selekcję roślin posiadających markery molekularne powiązane z korzystnymi cechami [Gupta i in. 1999].
Wśród 397 linii wsobnych żyta ozimego nie stwierdzono występowania genotypów całkowicie odpornych na porażenie mączniakiem prawdziwym.
Dla wszystkich badanych linii wsobnych średnia ocena stopnia porażenia
z trzech powtórzeń wynosiła od 1 do 4.
Analiza molekularna linii wsobnych żyta ozimego wybranych do dalszych
badań stwierdziła występowanie markera Xcfd81-5D zarówno wśród linii
odporniejszych na porażenie mączniakiem prawdziwym jak również wśród
linii podatnych na porażenie tym patogenem. Z otrzymanych wyników można wnioskować, że marker Xcfd81-5D nie jest markerem selekcyjnym odporności na mączniaka prawdziwego u żyta ozimego.
Możliwość skutecznej selekcji i hodowli odpornościowej żyta ozimego będzie możliwa dopiero w momencie zidentyfikowania u żyta ozimego markerów molekularnych sprzężonych z genami odporności na mączniaka prawdziwego. Dlatego konieczne jest nadal poszukiwanie markerów molekularnych sprzężonych z tą cechą u żyta ozimego.
313
LITERATURA
Blanco A., Gadaleta A., Cenci A., Carluccio A., Abdelbacki A., Simeone R. 2008. Molecular mapping of the novel powdery mildew resistance gene Pm36 introgressed
from Triticum turgidum var. dicoccoides in durum wheat. Theor. Appl. Genet.,
117: 135-142.
Bonnett D. G., Rebetzke G. J., Spielmeyer W. 2005. Strategies for efficient implantation
of molecular markers in wheat breeding. Mol. Breed., 15: 75-85.
Gupta P. K., Varshney R. K., Sharma P. C., Ramesh B. 1999. Molecular markers and
their applications in wheat breeding. Plant Breeding, 118: 369-390
He R., Chang Z., Yang Z., Yuan Z., Zhan H., Zhan X., Liu J. 2009. Inheritance and
mapping of powdery mildew resistance gene Pm43 introgressed from Thinopyrum
intermedium into wheat. Theor. Appl. Genet., 118: 1173-1180
Hua W., Liu Z., Zhu J., Xie Ch., Yang T., Zhou Y., Duan X., Sun Q., Liu Z. 2009. Identification and genetic mapping of pm42, a new recessive wheat powdery mildew
resistance gene derived from wild emmer (Triticum turgidum var. dicoccoides).
Theor. Appl. Genet., 119: 223–230
Huang X.Q., Röder M.S. 2004. Molecular mapping of powdery mildew resistance
genes in wheat: A review. Euphytica, 137: 203-223
Junghans H., Metzlaff M. 1990. A simple and rapid method for the preparation of
total DNA. Biotechniques, 8:176.
Li G., Fang T., Zhang H., Xie C., Li H., Yang T., Nevo E., Fahima T., Sun Q., Liu Z.
2009. Molecular identification of a new powdery mildew resistance gene Pm41 on
chromosome 3BL derived from wild emmer (Triticum turgidum var. dicoccoides).
Theor Appl Genet 119: 531-539
Luo P. G., Luo H. Y., Chang Z. J., Zhang H. Y., Zhang M., Ren Z. L. 2009. Characterization and chromosomal location of Pm40 in common wheat: a new gene for
resistance to powdery mildew derived from Elytrigia intermedium. Theor Appl
Genet, 118: 1059-1064
Ma H., Kong Z., Fu B., Li N., Zhang L., Jia H., Ma Z. 2011. Identification and mapping of a new powdery mildew resistance gene on chromosome 6D of common
wheat. Theor. Appl. Genet., 123: 1099-106
Miranda, L. M., Murphy J. P., Marshall D., Leath S., 2006. Pm34: a new powdery mildew resistance gene transferred from Aegilops tauschii Coss. to common wheat
(Triticum aestivum L.). Theor. Appl. Genet., 113: 1497—1504.
314
Miranda, L. M., Murphy J. P., Marshall D., Cowger C., Leath S., 2007. Chromosomal
location of Pm35, a novel Aegilops tauschii derived powdery mildew resistance
gene introgressed into common wheat (Triticum aestivum L.). Theor. Appl. Genet., 114: 1451-1456
Perugini, L., J. Murphy, D. Marshall, Brown-Guedira G., 2008. Pm37, a new broadly
effective powdery mildew resistance gene from Triticum timopheevii. Theor. Appl.
Genet., 116: 417-425.
Qiu Y. C., Sun X. L., Zhou R. H., Kong X. Y., Zhang S. S., Jia J. Z. 2006. Identification of microsatellite markers linked to powdery mildew resistance gene Pm2 in
wheat. Cereal Research Communications, 34: 1267-1273
Schlegel R., Melz G., Korzun V. 1998. Genes, marker and linkage data of rye (Secale
cereale L.): 5th updated inventory. Euphytica, 101: 23-67
Zhou R., Zhu Z., Kong X., Huo N. Tian Q., Li P., Jin C., Dong Y., Jia J. 2005. Development of wheat near-isogenic lines for powdery mildew resistance. Theor. Apel.
Genet., 110: 640-648
mgr Andrzej Jurkowski, mgr Andrzej Latusek
Katedra Genetyki, Hodowli Roślin i Nasiennictwa
Opiekun naukowy: dr hab. Henryk Bujak, prof. nadzw.
Linię pszenicy posiadającą gen Pm2, Ulka/8*CC, pozyskano dzięki uprzejmości
Dr. Susanne Brunner, Institute of Plant Biology, University of Zürich, Szwajcaria.
Projekt został sfinansowany ze środków Narodowego Centrum Nauki, numer
grantu 7773/B/P01/2011/40.
315
Agata Kapturowska
Wanda Zamojska
Izabela Stolarzewicz
Ewa Białecka-Florjańczyk
EPISTEME
14/2012
s.317-323
ISSN 1895-4421
SUBSTRATY HYDROFOBOWE W PODŁOŻACH STYMULUJĄCYCH
AKTYWNOŚĆ LIPOLITYCZNĄ DROŻDŻY YARROWIA LIPOLYTICA
HYDROPHOBIC SUBSTRATES IN MEDIA STIMULATING LIPOLYTIC
ACTIVITY OF YARROWIA LIPOLYTICA YEAST
Abstrakt. Oliwa z oliwek oraz kwasy tłuszczowe takie jak kwas oleinowy czy palmitynowy są powszechnie stosowanymi w badaniach induktorami produkcji lipaz
– ważnej grupy enzymów hydrolitycznych o szerokim zastosowaniu w przemyśle
spożywczym, paliwowym, chemicznym oraz farmaceutycznym. Źródła literaturowe wskazują na istotny wpływ obecności i zawartości kwasu oleinowego w olejach
stosowanych w podłożach na mikrobiologiczną produkcję lipaz. Celem pracy było
zbadanie związku pomiędzy rodzajem zastosowanego oleju a aktywnością enzymów
zewnątrzkomórkowych produkowanych przez komórki drożdży Yarrowia lipolytica
KKP 379. Wyniki badań potwierdzają, iż najwyższą aktywnością lipolityczną charakteryzowały się komórki drożdży hodowane na podłożu z oliwą z oliwek oraz olejem
słonecznikowym. Ponadto zauważono, że nie zawsze wysoka aktywność lipaz była
związana z wysoką zawartością kwasu oleinowego w olejach stosowanych jako jedyne źródło węgla w pożywkach.
Słowa kluczowe: Yarrowia lipolytica, podłoże stymulujące, olej, lipaza
Summary. Olive oil and free fatty acids such as oleic acid and palmitic acid are
inducers of lipase production commonly used in laboratories. Lipases are very important hydrolytic enzymes widely applicable in food, chemical, pharmaceutical and
fuel industry. There is pointed out an important impact of the oleic acid presence and
its content in oils for microbiological lipase production. The aim of this study was
to evaluate the connection between the oil used in culture medium and the extracellular activity of lipases synthesized by Yarrowia lipolytica KKP 379 cells. The results
confirmed that the highest lipolytic activity was measured for yeast cells cultured in
medium with olive oil and sunflower oil. There can be also concluded that the high
activity of lipases is not always correlated with the high content of oleic acids in oils
used as a sole carbon source in medium.
Key words: Yarrowia lipolytica, stimulating medium, oil, lipase
317
WSTĘP
Lipazy to jedna z najważniejszych grup enzymów stosowanych w przemyśle spożywczym, chemicznym, w tym w produkcji detergentów czy paliwa
typu biodiesel. Enzymy te cechuje ogromna różnorodność, a syntezują je zarówno komórki roślinne, zwierzęce jak i mikroorganizmy. Na ryku dostępnych jest kilkadziesiąt oczyszczonych preparatów enzymów lipolitycznych
pochodzenia mikrobiologicznego oferowanych przede wszystkim przez
koncerny Novo Nordisk, Amano, Bicatalysts, a głównymi producentami komercyjnie dostępnych lipaz są bakterie: Burkholderia cepacia, Pseudomonas
fluorescens, Penicillium spp., Bacillus lentus, Chromobacterium viscosum,
Alcaligenes sp., drożdże: Candida spp. i Yarrowia lipolytica oraz pleśnie:
Mucor miehei, Thermomyces lanuginosis i Th. lanuginous (Humicola), Rhizopus oryzae, Aspergillus sp. [Dominguez i in. 2003, Pancreac’h, Baratti,
2001]. W celu uzyskania pożądanych enzymów lipolitycznych należy brać
pod uwagę odpowiedni rodzaj, gatunek, a nawet szczep drobnoustroju, który
posiada zdolność do syntezy tych białek, jak również optymalne warunki
jego hodowli.
Na wydajność biosyntezy lipaz oraz ich właściwości wpływa wiele czynników. Za podstawowe kryterium uznaje się skład pożywki hodowlanej, w tym
źródło azotu, węgla oraz obecność substancji indukujących i stężenie soli
nieorganicznych. Istotną rolę odgrywają również warunki hodowli drobnoustrojów, w tym takie parametry jak: temperatura, pH podłoża oraz stężenie
rozpuszczonego tlenu [Corzo i Revah 1999; Sharma i in. 2001, Dominguez
i in. 2003]. Stosując różne modyfikacje warunków hodowli mikroorganizmów, można wpływać na osiągnięcie maksymalnej wydajności otrzymywania lipaz o wysokiej aktywności, czego rezultatem jest niższa cena uzyskanego preparatu enzymatycznego.
Większość doniesień literaturowych sugeruje, że wolne kwasy tłuszczowe,
a w szczególności kwas oleinowy obecny w oliwie z oliwek, są dobrymi
induktorami produkcji lipaz [Papanikolau i Aggelis 2003, Barth i Gaillardin 1997, Darvishi i in. 2009]. Tymczasem wyniki badań własnych wskazują
na inne czynniki decydujące o pozytywnym wpływie oleju jakim jest oliwa
z oliwek na aktywność lipolityczną drożdży Y. lipolytica.
Celem pracy było zbadanie związku pomiędzy rodzajem zastosowanego
oleju, a aktywnością lipaz zewnątrzkomórkowych produkowanych przez komórki drożdży Yarrowia lipolytica KKP 379.
318
Substraty hydrofobowe w podłożach stymulujących aktywność lipolityczną...
MATERIAŁY I METODY
Badania prowadzono z użyciem szczepu drożdży Yarrowia lipolytica KKP
379, należącego do Kolekcji Kultur Przemysłowych Instytutu Biotechnologii
Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie.
Podłoża stymulujące aktywność lipolityczą zawierały w 1000 cm3: 20g peptonu, 10g ekstraktu drożdżowego oraz 25 cm3 odpowiedniego oleju roślinnego (oliwę z oliwek, olej rzepakowy, olej słonecznikowy, olej ryżowy lub olej
z owoców czerwonej palmy i canoli). pH podłoża wynosiło 5,0 ± 0,1. 100
cm3 podłoża zaszczepiano 0,1 cm3 18-godzinnej hodowli inokulacyjnej prowadzonej w podłożu YPG. Hodowlę prowadzono na wytrząsarce posuwisto-zwrotnej w temperaturze 28oC przez 67 godzin. Plon biomasy oznaczono po
odwirowaniu płynu pohodowlanego. Aktywność lipolityczną płynu pohodowlanego zbadano metodą spektrofotometryczną wg Kapturowskiej i in. [2012],
opartą na reakcji hydrolizy laurynianu p-nitrofenylu.
WYNIKI I DYSKUSJA
Poziom aktywności enzymów lipolitycznych pochodzenia mikrobiologicznego jest uzależniony w znacznym stopniu od hydrofobowych źródeł węgla
w pożywce. W badaniach w skali laboratoryjnej najczęściej stosowanym substratem o charakterze hydrofobowym jest oliwa z oliwek [Gulati i in. 1999].
Z uwagi na wysoki koszt hodowli drożdży w podłożu z oliwą z oliwek w skali
przemysłowej podjęto próbę oceny wpływu innych lipidowych źródeł węgla na
aktywację produkcji lipaz przez drożdże Yarrowia lipolytica KKP 379.
Przeprowadzone doświadczenia wskazują, iż rodzaj oleju stosowanego
w podłożu jako jedyne źródło węgla nie wpływa na plon biomasy drożdży,
ale w znaczący sposób może zmienić jej zewnątrzkomórkową aktywność
lipolityczną. Wyniki naszych badań potwierdzają, że najlepszymi stymulatorami aktywności lipolitycznej są oliwa z oliwek (0,206 U/cm3) oraz olej
słonecznikowy (0,201 U/cm3), natomiast istotnie niższą aktywność zaobserwowano w przypadku hodowli drożdży w pożywkach z olejem rzepakowym,
olejem ryżowym oraz olejem z owoców czerwonej palmy i canoli (odpowiednio 0,133; 0,104; 0,120 U/cm3 , rys. 1).
Za zewnątrzkomórkową aktywność lipolityczną wykazywaną przez komórki drożdży z rodzaju Yarrowia odpowiada w większości gen LIP2 kodujący
zewnątrzkomórkową lipazę Lip2p [Turki i in. 2010]. Induktorem promotora
POX2, pod którego kontrolą znajduje się wspomniany gen, jest kwas oleinowy [Barth i Gaillardin 1997, Darvishi i in. 2009], którego zawartość w oliwie
z oliwek waha się od 55 do 85%. Dzięki temu, jak wynika z doniesień literaturowych, olej ten jest najlepszym aktywatorem syntezy lipaz.
319
Rys. 1. Aktywność płynu pohodowlanego oraz plon biomasy w hodowli drożdży
Yarrowia lipolityca KKP 379 po hodowli w podłożach zawierających źródła węgla
o charakterze hydrofobowym
W celu oceny faktycznego wpływu kwasu oleinowego na aktywność lipolityczną drożdży Y. lipolytica, zastosowano w pożywkach oleje o różnej
jego zawartości. Porównując skład użytych olejów (Tab. 1), stwierdzono, iż
wprawdzie największą ilość kwasu oleinowego zawiera oliwa z oliwek, to
jednak olej palmowy i ryżowy cechuje 10-cio krotnie wyższa jego zawartość w porównaniu z olejem słonecznikowym. Natomiast w oleju rzepakowym procentowy udział kwasu oleinowego jest najmniejszy. Przyjmując za
przyczynę wysokiej aktywności lipolitycznej zawartość kwasu oleinowego
w pożywce, powinniśmy zaobserwować najniższą aktywność w przypadku
oleju rzepakowego i słonecznikowego. Tymczasem wyniki uzyskane dla
podłoży zawierających olej palmowy i ryżowy były porównywalne z wynikami z podłoża z olejem rzepakowym, a ich wartość o połowę niższa niż
w przypadku zastosowania oleju słonecznikowego, który pozwolił na uzyskanie aktywności porównywalnej z rezultatami z hodowli z oliwą z oliwek.
Zatem można przypuszczać, iż sumaryczna zawartość kwasu oleinowego w
oleju stosowanym jako lipidowe źródło węgla nie jest jedynym czynnikiem
determinującym poziom aktywności lipolitycznej.
Z doniesień literaturowych wynika, że komórki drożdży są w stanie wybiórczo przyswajać z pożywki określone kwasy tłuszczowe - Papanikolau
i Aggelis zaobserwowali preferencyjne wykorzystanie kwasów C12:0,
C14:0, C18:1, C18:2 i C18:3 z mieszaniny różnych kwasów tłuszczowych
w wyjściowej pożywce [Papanikolau i Aggelis 2003].
320
Rodzaj oleju
Profil kwasów tłuszczowych [%]
Kwas oleinowy
Kwas linolowy
Kwas palmitynowy
oliwa z oliwek
71
10
13
olej słonecznikowy
19
68
7
olej rzepakowy
4
56
26
olej palmowy
44
40
10
olej ryżowy
42
37
16
Tab. 1. Profil kwasów tłuszczowych wybranych olejów roślinnych
[Gunstone i in. 1994, Wang i in. 2008]
Zatem należałoby wziąć pod uwagę nie tylko zawartość kwasu oleinowego
lecz także linolowego, a ich sumaryczna ilość dla wszystkich badanych przez
nas olejów z wyjątkiem rzepakowego była zbliżona lub przekraczała 80 %.
Jednak to spostrzeżenie wyjaśnia w sposób bezpośredni korzystny wpływ
jedynie oleju słonecznikowego, natomiast różnice w stosunku do olejów
palmowego i ryżowego mogą wynikać z budowy cząsteczek występujących
w nich triacylogliceroli. W szczególności dotyczy to pozycji zajmowanej
przez poszczególne kwasy tłuszczowe w cząsteczce, ponieważ jak wiadomo
determinuje ona szybkość hydrolizy wiązania estrowego. W związku z tym
efektywna zawartość wolnych kwasów tłuszczowych w pożywce może nie
być zgodna z sumarycznym profilem kwasów tłuszczowych w oleju. Lipazy
produkowane przez drożdże Yarrowia lipolytica hydrolizują preferencyjnie
wiązania estrowe w pozycjach 1,3 [Fickers i in. 2005], a zatem cząsteczki kwasów, które znajdują się w tych pozycjach są najłatwiej uwalniane do
podłoża, a następnie selektywnie wykorzystywane przez komórki drożdży
z rodzaju Yarrowia. Zasadne jest więc kontynuowanie badań nad wpływem
położenia kwasów tłuszczowych w cząsteczkach triacylogliceroli różnych
olejów na aktywność lipaz w celu zweryfikowania tej hipotezy.
WNIOSKI
• Najwyższą aktywnością lipolityczną charakteryzowały się komórki drożdży hodowane na podłożu z oliwą z oliwek oraz olejem słonecznikowym.
• Wysoka zawartość kwasu oleinowego w olejach stosowanych jako jedyne
źródło węgla w pożywkach nie jest jedynym czynnikiem wpływającym na
wysoką aktywność lipaz produkowanych przez drożdże Yarrowia lipolytica.
321
LITERATURA
Barth G., Gaillardin C. 1997. Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiol., 19 (4): 219-237.
Corzo G. i Revah S. 1999. Production and characteristics of the lipase from Yarrowia
lipolytica 681. Bioresour. Technol., 70: 173–180.
Darvishi F., Nahvi I., Zarkesh-Esfahani H., Momenbeik F. 2009. Effect of plant
oils upon lipase and citric acid production in Yarrowia lipolytica yeast.
J. Biomed. Biotechnol., 1-7.
Dominguez A., Deive F.J., Sanroman A., Longo M.A. 2003. Effect of lipids
and surfactants on extracellular lipase production by Yarrowia lipolytica.
J. Chem. Technol. Biotechnol., 78: 1166-1170.
Fickers P., Nicaud J.-M., Destain J., Thonart P. 2005. Involvement of Hexokinase
Hxk1 in glucose catabolite repression of LIP2 encoding extracellular lipase in the
yeast Yarrowia lipolytica. Curr. Microbiol., 50: 133-137.
Gulati R., Saxena R.K., Gupta R., Yadav R.P., Sheba Davidson W. 1999. Parametric
optimization of Aspergillus terreus lipase production and its potential in ester
synthesis. Process Biochem., 35: 459-464.
Gunstone F.D., Harwood J.L., Padley F.B. 1994. The Lipid Handbook. Second edition. Chapman & Hall, London.
Kapturowska A., Stolarzewicz I., Krzyczkowska J., Białecka-Florjańczyk E. 2012.
Studies on lipolytic activity of sonicated enzymes from Yarrowia lipolytica. Ultrason. Sonochem., 19: 186-191.
Pancreac’h G., Baratti J.C. 2001. Comparison of hydrolytic activity in water and heptane for Thiry-two commercial lipase preparations. Enz. Microb. Technol., 28:
473-479.
Papanikolaou S., Aggelis G. 2003. Selective uptake of fatty acids by the yeast Yarrowia lipolytica. Eur. J. Lipid Sci. Technol., 105: 651-655.
Sharma R., Chisti Y., Banerjee U. Ch. 2001. Production, purification, characterization and application of lipases. Biotechnol. Adv., 19: 627-666.
Turki S., Ayed A., Chalghoumi N., Weekers F., Thonart P., Kallel H. 2010. An enhanced process for the production of a highly purified extracellular lipase in the
non-conventional yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Biochem. Biotechnol., 160:
1371-1385.
Wang D., Xu Y., Shan T. 2008. Effects of oil and oil-related substrates on the synthetic
activity of membrane- bound lipase from Rhizopus chinensis and optimization of
the lipase fermentation media. Biochem. Eng. J., 41: 30-37.
322
mgr inż. Agata Kapturowska, mgr inż. Wanda Zamojska*,
dr inż. Izabela Stolarzewicz, dr hab. Ewa Białecka-Florjańczyk, prof. SGGW
Katedra Chemii, Wydział Nauk o Żywności
*Międzywydziałowe Studium Biotechnologii
Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego
ul. Nowoursynowska 159, 02-776 Warszawa
Opiekun naukowy: dr hab. Ewa Białecka-Florjańczyk, prof. SGGW
Praca naukowo-badawcza wykonana w ramach grantu Ministerstwa Nauki
i Szkolnictwa Wyższego nr N N209 107639.
323
Bartosz Kozak
EPISTEME
14/2012
s.325-332
ISSN 1895-4421
WYBÓR STARTERÓW Z NUKLEOTYDAMI SELEKCYJNYMI
DO ANALIZ AFLP U ŁUBINU WĄSKOLISTNEGO (LUPINUS
ANGUSTIFOLIUS L.)
PRIMERS SELECTION FOR AFLP ANALYSIS OF NARROW-LEAFED
LUPINE (LUPINUS ANGUSTIFOLIUS L.)
Abstrakt. W przeprowadzonych badaniach analizowano polimorfizm uzyskiwane
przy zastosowaniu 64 par starterów z trzema nukleotydami selekcyjnymi: EcoRI-ANN oraz MseI-CNN (gdzie N oznacza dowolny nukleotyd). Startery EcoRI-ANN
wybarwione zostały fluorescencyjnie. Badania przeprowadzono na dwóch genotypach łubinu wąskolistnego (Lupinus angustifolius L.), odmiana ‘Emir’ oraz ród hodowlany LAE-1, które są formami rodzicielskimi populacji mapującej na której tworzona będzie mapa genetyczna przy użyciu różnych markerów między innymi AFLP.
Trawienie restrykcyjne, preselektywny i selektywny PCR przeprowadzono według
Vos i in. 1995 (zmodyfikowany). Analizy AFLP prowadzono z wykorzystaniem urządzenia ABI 310 przeprowadzając elektroforezę kapilarną. Z przetestowanych 64 par
starterów wybrano 9 które zostaną wykorzystane do poszukiwania markerów AFLP
w posiadanej populacji mapującej.
Słowa kluczowe: Łubin wąskolistny, AFLP, DNA fingerprinting, selektywny AFLP - PCR
Summary. The present study analyzed the number of polymorphisms obtained by
using 64 combinations of primers pars with three selected nucleotides: EcoRIANN and MseI-CNN (where N is any nucleotides). EcoRI-ANN primers were labelled
with fluorescent dyes. The study was conducted on two genotypes of narrow-leafed
lupine (Lupinus angustifolius L.), cultivar “Emir” and breeding line LAE-1, which are
the parental forms of the mapping population on which will be created the genetic
map using several types of markers including AFLP markers. Restriction digestion,
preselective and selective PCR was performed according to Vos et al. 1995 (modified). AFLP analysis was performed using an ABI 310 Genetic Analyzer. Of those 64
tested combinations 9 pairs of primers were selected to be used to search for further
analysis on the mapping population.
Key words: Narrow-leafed lupine, AFLP, DNA fingerprinting, selective AFLP - PCR
325
Bartosz Kozak
WSTĘP
Z roślin motylkowatych łubin wąskolistny (Lupinus angustifolius L.) wzbudza coraz większe zainteresowanie hodowców i rolników ze względu na jego
wysoką zawartość białka w nasionach (31 – 34%) oraz zdolność adaptacji
na glebach lekkich i zakwaszonych [Galek i Sawicka-Sienkiewicz 2001;
Sujak i in. 2006]. W porównaniu do dwóch pozostałych gatunków łubinu
uprawianych w Polsce (łubinu żółtego i białego) łubin wąskolistny odznacza się podwyższoną odpornością na antraknozę, groźną chorobę grzybową
powodowaną przez Colletotrichum lupini [Nirenberg 2003; Thomas i Sweetingham 2004.]. Dzięki wyhodowaniu odmian o zdeterminowanym typie
wzrostu (tzw. samokończące) oraz tolerancji na opóźnienie siewu (odmiany
termoneutralne) łubin wąskolistny charakteryzuje się najkrótszym okresem
wegetacji. [Boersma 2005]. Dzięki tym właściwościom łubin wąskolistny
ma szansę stać się rośliną strączkową szerzej uprawianą w naszym kraju
i alternatywą w produkcji paszy treściwej dla importowanej z zagranicy soi.
Areał zasiewu łubinu wąskolistnego nadal jednak pozostaje nieduży (według
danych GUS ok. 36 tys. ha), a to ze względu na kilka niekorzystnych cech,
których jak dotąd nie wyeliminowano w procesie hodowlanym. Należy tu
wymienić: nierównomierne dojrzewanie strąków i nasion u form o niezdeterminowanym typie wzrostu, pękające strąki oraz osypywanie się nasion.
Odporność na choroby jest także cechą, na którą należy zwrócić uwagę w
dalszych pracach hodowlanych [Sawicka–Sienkiewicz i in. 2007].
Dla łubinu wąskolistnego opracowane zostały już mapy genetyczne [Boersma i in. 2005, Nelson i in. 2006, Nelson i in. 2010], jednak przy wykorzystaniu jako rodziców dzikiej formy z terenów Maroka i australijskiej linii
hodowlanej. Dla polskich materiałów dotychczas nie została opracowana
mapa genetyczna tego gatunku. Ponadto na opracowanych do tej pory mapach z ważnych dla hodowców cech zmapowano niemal wyłącznie cechy
dziedziczone jednogenowo. Brak natomiast cech poligenicznych takich jak:
plon (wierność plonowania), wczesność, wysokość roślin, zawartość białka,
tłuszczu oraz alkaloidów [Nelson i in. 2010].
Do tworzenia map genetycznych wykorzystuje się wiele systemów markerów, ale jednym z najczęściej stosowanych jest AFLP (ang. Amplified Fragment Length Polymorphism). Wykorzystując technikę AFLP można otrzymać
bardzo dużą liczbę polimorficznych markerów DNA, przy stosunkowo niskim
nakładzie pracy i środków finansowych. AFLP łączy w sobie zalety RFLP
(ang. Restriction Fragment Length Polymorphism) oraz technik wykorzystujących PCR [Vos i in 1995]. Technika AFLP wielokrotnie była już wykorzystywana do tworzenia map genetycznych u roślin [Marques i in. 1998, Lu i in.
1998, Vuylsteke i in. 1999, Nelson i in. 2006, Yamamoto i in. 2007].
326
Wybór starterów z nukleotydami selekcyjnymi...
Celem niniejszej pracy było przetestowanie 64 par starterów z trzema nukleotydami selekcyjnymi, dla wyboru tych które generują największy polimorfizm w badanym materiale. Badania prowadzono na dwóch genotypach
łubinu wąskolistnego (Lupinus angustifolius L.): odmianie ‘Emir’ i rodzie
LAE-1. Genotypy te zostały użyte jako formy rodzicielskie 148 linii typu
RIL’s (ang. Recombinant Inbred Lines), stanowiących populację mapującą
do opracowania mapy genetycznej z wykorzystaniem między innymi markerów AFLP.
MATERIAŁY I METODY
DNA wyizolowano według Doyl i Doyl 1987 (zmodyfikowany) z użyciem
CTAB. Liście ok. 100 mg św. m. rozcierano w ciekłym azocie, po czym inkubowano w buforze ekstrakcyjnym przez godzinę. Następnie dodawano
mieszaninę chloroform izoamyl (24:1), mieszano 10 min i wirowano 10 min.
Fazę wodną (górną) po wirowaniu przenoszono do nowej próbówki i dodawano równą objętość izopropanolu. DNA wytrącano w - 20°C przez 30
min. Próbki wirowano w 4°C przez 30 min, płukano etanolem i ponownie
wirowano przez 5 min. Po zlaniu etanolu próbki suszono próżniowo przez 10
min i zalewano buforem TE x 0,1. Po izolacji ilość i jakość DNA sprawdzano
elektroforetycznie i spektrofotometrycznie. Do dalszych analiz przygotowano roztwory DNA o stężeniu 100 ng *ml-1.
Trawienie restrykcyjne wykonywano przy użyciu enzymów restrykcyjnych
EcoRI i MseI (NewEngland BioLabs). Mieszanina reakcyjna składała się
z 5 ml roztworu DNA oraz 5 ml miksu o następującym składzie: H2O 3,7625
ml, bufor NE x 10 (NewEngland BioLabs) 1 ml, BSA x 100 (NewEngland
BioLabs) 0,1 ml, EcoRI (20 u * ml-1) 0,0625 ml, MseI (10 u *ml-1) 0,125 ml.
Tak przygotowaną mieszaninę inkubowano w 37°C przez 3h. Następnie dezaktywowano enzymy inkubując mieszaninę przez 1 min w 75°C. W celu ligacji adaptorów do tej mieszaniny dodawano 6 ml miksu o składzie: H2O 3,6 ml, Ligase
Buffer x 10 (Fermentas) 0,6 ml, MseI adaptor (50 pmol * ml-1) 0,6 ml, EcoRI
adaptor (5 pmol * ml-1) 0,6 ml, T4 DNA ligase (1 u * ml-1, Fermentas) 0,6 ml. Tak
przygotowaną mieszaninę inkubowano w 37°C przez 16 h.
Preselektywny i Selektywny PCR wykonywano na termocyklerze Biometria.
Preselektywny PCR wykonano przy użyciu mieszaniny reakcyjnej o następującym składzie: H2O 2,7 ml, Taq buffer x 10 (Fermentas) 2 ml, MgCl2
(25mM) 2 ml, dNTP mix (10 mM, Fermentas) 1ml 2,5 ml startera EcoRI-A
(1 pmol/ml), 2,5 ml startera MseI-C (5 pmol/ml), BSA (Fermentas) 0,2 ml,
polimeraza DNA (5u * ml-1 Fermentas) 0,1 ml oraz 4 ml mieszaniny po ligacji. Profil termiczny: wstępna denaturacja 94°C przez 2 min, 20 cykli denaturacja 94°C 20 sek, przyłączanie starterów 56°C 30 sek, amplifikacja 72°C
327
Bartosz Kozak
2 min, końcowa amplifikacja 72°C przez 15 min. Po zakończeniu reakcji do
mieszaniny reakcyjnej dodano 25 ml H2O.
Selektywny PCR prowadzono z wykorzystaniem kombinacji 64 par starterów (Tab. 1, Applied Biosystems), mieszanina reakcyjna miała skład: H2O
3,55 ml, Taq buffer x 10 (Fermentas) 1 ml, MgCl2 (25mM) 1 ml, dNTP mix
(10 mM, Fermentas) 0,25 ml 1 ml startera EcoRI-ANN (1 pmol/ml), 0,5 ml
startera MseI-CNN (3 pmol/ml), BSA (Fermentas) 0,8 ml, polimeraza DNA
(5u * ml-1 Fermentas) 0,4 ml oraz 1,5 ml mieszaniny po preselektywnym
PCR. Profil termiczny selektywnego PCR był następujący: wstępna denaturacja 94°C przez 2 min, 5 cykli denaturacja 94°C 20 sek, przyłączanie startera od 66°C do 58°C temperatura obniżana co 2 stopnie w każdym cyklu 30
sek, amplifikacja 72°C 2 min, 20 cykli denaturacja 94°C przez 20 sek, przyłączanie startera 56°C 30 sek, amplifikacja 72°C 2 min, końcowa amplifikacja
72°C przez 15 min.
Po selektywnym PCR 2 ml produktu dodawano do 25 ml mieszaniny składającej się z 24,5 ml formamidu oraz 0,5 ml ROX500 (Applied Biosystems).
Rozdział tak przygotowanych produktów po selektywnym PCR prowadzono
na urządzeniu ABI 310 w następujących warunkach: moduł GS POP4 (1 ml),
filtr F, czas iniekcji 12 sek, rozdział 30 min, temp. 60°C.
WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
Elektroforogramy uzyskane po rozdziale produktów selektywnego PCR na
urządzeniu ABI 310 analizowano według metody opisanej przez Rineharta
2004 (zmodyfikowany). Dla każdego genotypu całą analizę (trawienie restrykcyjne, ligację adaptorów, preselektywny i selektywny PCR) przeprowadzano w dwóch powtórzeniach dla obydwu genotypów. Do analiz brano
wyłącznie piki, które były obecne w obu powtórzeniach. Dla każdej z analizowanych par starterów policzono ogólną liczbę pików oraz pików polimorficznych. Obliczono procent pików polimorficznych dla każdej pary starterów. Wyniki zamieszczono w tabeli 1.
Badane startery wygenerowały łączną liczbę 3610 pików w tym 1004 polimorficzne (28%). Jedna kombinacja tworzyła średnio 56 pików w tym 16
polimorficznych. Uzyskane wyniki znajdują potwierdzenie w pracach innych
autorów [Marques i in. 1998, Lu i in. 1998, Vuylsteke i in. 1999, Nelson i in.
2006, Yamamoto i in. 2007].
Startery, które wygenerowały najwyższy polimorfizm w prezentowanych badaniach zestawiono w tabeli 2.
328
[FAM]
EcoRI_ACA
[JOY]
EcoRI_ACG
[JOY]
EcoRI_AGG
[JOY]
EcoRI_AAG
[NED]
EcoRI_AGC
[NED]
EcoRI_ACC
[NED]
EcoRI_AAC
M
P
%
M
P
%
M
P
%
15
43
56
10
18
57
4
7
48
14
29
28
28
100
38
8
21
35
16
46
43
9
21
8
20
50
15
30
45
8
18
41
9
22
63
14
22
54
20
37
44
15
34
69
29
42
14
26
70
12
17
40
10
25
69
13
19
83
24
29
16
11
69
38
11
29
58
8
14
15
27
79
19
24
65
4
6
76
17
22
83
24
29
42
12
29
66
22
33
52
9
17
9
18
30
30
100
75
4
5
75
27
36
83
28
34
39
7
18
42
13
31
66
20
30
13
26
58
12
21
70
1
1
89
46
52
79
28
35
78
37
47
53
24
45
65
24
37
22
34
44
7
16
52
4
8
76
16
21
43
12
28
62
23
37
62
21
34
66
11
17
16
28
49
11
22
68
2
3
79
31
39
44
15
34
35
7
20
58
21
36
56
15
27
CAG
%
MesI_
P
35
CAC
M
MesI_
%
41
CAA
P
MesI_
M
54
CAT
%
MesI_
P
55
CTA
M
MesI_
%
50
CTC
P
MesI_
M
49
CTG
%
MesI_
P
64
CTT
M
MesI_
[FAM]
EcoRI_ACT
58
Tab. 1. Zestawienie liczby otrzymanych pików przy zastosowaniu 64 par starterów.
Liczba otrzymanych pików (M), liczba pików polimorficznych (P), procent pików polimorficznych (%). Startery EcoRI-ANN – wybarwione fluorescencyjnie na końcu 5’)
Przy opracowywaniu istniejącej już mapy genetycznej łubinu wąskolistnego
[Nelson i in. 2006], badacze australijscy wykorzystali kombinacje starterów
zamieszczone w tabeli 2. Testując formy rodzicielskie (odmiana australijska
oraz dzika forma z terenów Maroka) swojej populacji mapującej przy użyciu
tych starterów uzyskali 276 polimorficznych produktów. Formy te są jednak
bardzo odległe genetycznie od genotypów użytych w prezentowanej pracy.
Dlatego przy zastosowaniu tych kombinacji starterów w prezentowanych
badaniach form rodzicielskich (Emir oraz LAE1) uzyskano znacznie niższą
ogólną liczbę polimorficznych produktów wynoszącą 143 (Tab. 2).
Łączna liczba polimorficznych pików wygenerowana przez 9 najlepszych kombinacji starterów wynosi 284. Z doniesień innych autorów wynika, że liczba uzyskanych w ten sposób polimorficznych markerów powinna być wystarczająca do
utworzenia szkieletu przygotowywanej mapy [Nelson i in. 2006]. Ostatecznym
potwierdzeniem będzie jednak zmapowanie tych markerów.
329
Wytypowane w prezentowanej pracy
Bartosz Kozak
Kombinacja
Liczba polimorficznych pików uzyskana
na genotypach: Emir oraz LAE 1
EcoRI-ACC/MesI-CTA
30
EcoRI-AGC/MesI-CTA
27
EcoRI-AGC/MesI-CTC
46
EcoRI-AGC/MesI-CTT
31
EcoRI-AAG/MesI-CAG
28
EcoRI-AAG/MesI-CTA
28
EcoRI-AAG/MesI-CTC
28
EcoRI-AGG/MesI_CTC EcoRI_ACA/
MesI_CAC
37
Suma
284
EcoRI-AAC/MseI-CAA
Użyte przez Nelsona i in. 2006
EcoRI-ACA/MseI-CAA
EcoRI-ACG/MseI-CAA
EcoRI-ACT/ MseI-CAA EcoRIAGG/
MseI-CAA
29
12
8
11
14
11
EcoRI-AAC/MseI-CAC
15
EcoRI-ACA/MseI-CAC
29
EcoRI-ACG/MseI-CAC
15
EcoRI-ACT/MseI-CAC, EcoRIAGG/
MseI-CAC
8
Suma
20
143
Tab. 2. Zestawienie kombinacji wytypowanych starterów i użytych do opracowania
istniejącej mapy genetycznej łubinu wąskolistnego (Nelson i in. 2006)
WNIOSKI
Po przetestowaniu 64 kombinacji starterów z trzema nukleotydami selekcyjnymi EcoRI-ANN/MseI-CNN (N – dowolny nukleotyd) stwierdzono że:
• Analizowane kombinacje starterów generowały zróżnicowany polimorfizm u badanych form rodzicielskich (Emir oraz LAE1)
330
• Dziewięć kombinacji starterów dających najwyższy polimorfizm to:
EcoRI-ACC/MesI-CTA (30), EcoRI-AGC/MesI-CTA (27), EcoRI-AGC/
MesI-CTC (46), EcoRI-AGC/MesI-CTT (31), EcoRI-AAG/MesI-CAG
(28), EcoRI-AAG/MesI-CTA (28), EcoRI-AAG/MesI-CTC (28), EcoRI-AGG/MesI_CTC (37), EcoRI_ACA/MesI_CAC (29), łącznie 284 polimorficzne produkty.
• Kombinacje tych starterów wykorzystane zostaną przy opracowywaniu mapy genetycznej łubinu wąskolistnego (Lupinus angustifolius L.)
- z wykorzystaniem 148 linii typu RIL’S pochodzących ze skrzyżowania
odmiany Emir z rodem LAE1
LITERATURA
Boersma J. G., Pallotta M., Li C., Buirchell B. J., Sivasithamparam K. i Yang H. 2005.
Construction of a genetic linkage map using MFLP and identification of molecular
markers linked to domestication genes in narrow-leafed lupin (Lupinus angustifolius
L.). Cellular and Molecular Biology Letters 10: 331 – 344
Doyle J. J., Doyle J. L. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of
fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19(1): 11 – 15
Galek R., Sawicka-Sienkiewicz E. 2001. Ocena form kolekcyjnych łubinów pochodzących z rożnych warunków geograficzno-klimatycznych, pod względem wybranych cech morfologicznych. Zeszyty Naukowe Akademii Rolniczej we Wrocławiu 427: 31-49
Lu Z., Sosinski B., Reighard G. L., Baird W. V., Abbott A. G. 1998. Construction of
a genetic linkage map and identification of AFLP markers for resistance to rootknot nematodes in peach rootstocks. Genome 41: 199-207
Marques C. M., Araujo J. A., Ferreira J. G., Whetten R., D. O`Malley D. M.,.
Liu B.-H., Sedero R. 1998. AFLP genetic maps of Eucalyptus globulus and
E. tereticornis. Theoretical and Applied Genetics 96: 727 – 737
Nelson M. N., Phan H. T. T., Ellwood S. R., Moolhuijzen P. M., Hane J., Williams
A., O‘Lone C. E., Fosu-Nyarko J., Scobie M., Cakir M., Jones M. G. H., Bellgard
M., Ksiarkiewicz M., Wolko B., Barker S. J., Oliver R. P., Cowling W. A. 2006.
The first gene-based map of Lupinus angustifolius L. - location of domestication
genes and conserved synteny with Medicago truncatula. Theoretical and Applied
Genetics 113: 225 – 238
Nelson M., Moolhuijzen P. M., Boersma J. G., Chudy M., Lesniewska K., Bellgard M.,
Oliver R. P., Święcicki W., Wolko B., Cowling W. A. i Ellwood S. R. 2010. Aligning
a new reference genetic map of Lupinus angustifolius with the genome sequence of
the model legume, Lotus japonicus. DNA Research 17: 73-83
331
Bartosz Kozak
Nirenberg H. I, Feiler U., Hagedorn G. 2002. Description of Colletotrichum lupine
comb. nov. in modern terms. Mycologia 94: 307–320
Rinehart T. 2004. AFLP analysis using GeneMapper software and an Excel macro
that aligns and converts output to binary. Biotechniques 37:186–188
Sawicka-Sienkiewicz E., Galek R., Zalewski D. 2007. Zmienność wybranych cech
u mutantów odmiany Emir łubinu wąskolistnego (Lupinus angustifolius L.). Zeszyty Problemowe Postępu Nauk Rolniczych 522: 39–54
Sujak A., Kotlarz A., Strobel W. 2006. Compositional and nutritional evaluation of
several lupin seeds. Food Chemistry 98: 711–719
Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot
J., Peleman J., Kuiper M. and Zabeau M. 1995 AFLP: a new technique for DNA
fingerprinting. Nucleic Acids Research 23(21): 4407-4414
Vuylsteke M., Mank R., Antonise R., Bastiaans E., Senior M. L., Stuber C. W., Melchinger A. E., Lübberstedt T., Xia X. C., Stam P., Zabeau M., M. Kuiper 1999. Two
high-density AFLP® linkage maps of Zea mays L.: analysis of distribution of AFLP
markers. Theoretical and Applied Genetics 99: 921 – 935
Yamamoto T., Kimura T., Terakami S., Nishitani C., Sawamura Y., Saito T., Kotobuki
K., Hayashi T. 2007. Integrated Reference Genetic Linkage Maps of Pear Based
on SSR and AFLP Markers. Breeding Science 57: 321 – 329
mgr inż. Bartosz Kozak
Opiekun naukowy: Prof. dr hab. Ewa Sawicka – Sienkiewicz
Zadanie współfinansowane ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
332
Iwona Kozikowska
Magdalena Chrobaczyńska – Dyląg
Katarzyna Suprewicz
Magdalena Czajkowska
EPISTEME
14/2012
s.333-340
ISSN 1895-4421
WPŁYW ILOŚCI PORODÓW NA KUMULACJĘ KADMU, MIEDZI
I CYNKU W ŁOŻYSKACH KOBIET ORAZ KRWI PĘPOWINOWEJ
NOWORODKÓW
IMPACT OF BIRTH NUMBER ON ACCUMULATION OF CADMIUM,
COPPER AND ZINC IN HUMAN PLACENTA AND UMBILICAL
CORD BLOOD
Abstrakt. Celem badań było określenie średniej zawartość kadmu, miedzi i cynku we
krwi pępowinowej noworodków oraz łożyskach kobiet w zależności od liczby przebytych ciąż. Materiał do badań pobrano od 100 kobiet, zamieszkujących obszar Górnego Śląska. Zawartość metali w tkankach została oznaczona metodą płomieniowej
absorpcyjnej spektrometrii atomowej (FAAS). Koncentrację Cd, Zn i Cu wyrażono
w miligramach na kilogram suchej masy. W wyniku przeprowadzonych pomiarów
wykryto obecność kadmu, cynku i miedzi we wszystkich badanych tkankach, zarówno u pierworódek jak i wieloródek. Spośród badanych metali, największą zawartość
kadmu odnotowano we krwi pępowinowej w grupie wieloródek (2,229 mg×kg-1 s.m.).
Największe zawartości Cu występowały w tkankach łożyska pierworódek. Analiza
statystyczna wykazała, iż kumulacja cynku w łożysku znacznie przewyższa średnią
zawartość Zn we krwi pępowinowej.
Słowa kluczowe: łożysko, krew pępowinowa, metale ciężkie, ciąża
Summary. The aim of this study was to determine the average content of cadmium,
copper and zinc in umbilical cord blood of newborns and women placenta depending
on the number of pregnancies. Biological material used in the research came from 100
women living in the Upper Silesian Region. Concentration of metals in each sample
was measured using flame atomic absorption spectrometry (FAAS). The concentration of Cd, Zn and Cu was shown in milligrams per kilogram of dry matter. The conducted study demonstrates that cadmium, zinc and copper were noted in all tissues,
both nulliparous women and multiparous mothers. The maximum concentration of
cadmium was observed in umbilical cord blood among multiparous mothers (2,229
mg×kg-1 d.m.). The maximum concentration of Cu was observed in the placenta of
nulliparous women. Statistical analysis showed that concentration of zinc in the placenta is much higher than in cord blood.
Key words: placenta, umbilical cord blood, heavy metals, pregnancy
333
WSTĘP
Łożysko to narząd, pośredniczący pomiędzy organizmem matki a organizmem płodu. Pełni funkcje analogiczne do płuc oraz układu żołądkowo-jelitowego i wydalniczego. Stanowi barierę dla niektórych substancji, innym
z kolei pozwala na swobodny przepływ. Oddziela krew matki od krwi dziecka cienką warstwą tkanek, zwaną barierą łożyskową. Pod względem czynnościowym stanowi skomplikowany narząd wzajemnej wymiany [Fernandez
i Kuczkowski 2009]. Przez barierę łożyskową przenikają tlen i substancje
pokarmowe oraz usuwane są szkodliwe produkty przemiany materii. Narząd
ten pełni także funkcję ochronną i wewnątrzwydzielniczą. Łożysko nie zapewnia jednak płodowi całkowitej ochrony przed różnymi szkodliwymi substancjami takimi jak: składniki dymu tytoniowego, leki, używki czy zawarte w pożywieniu mutageny. Głównie od środowiska oraz trybu życia matki
zależy zdrowie jej nienarodzonego dziecka [Falcon i in. 2002; Kantola i in.
2000; Piestrzyńska-Kajtoch 2005].
Celem badań było określenie średniej zawartości kadmu, cynku i miedzi
w tkankach łożyska ludzkiego oraz we krwi pępowinowej noworodków wśród
pierworódek oraz wieloródek. Istotne było także określenie wzajemnych korelacji pomiędzy zawartością badanych pierwiastków w tkankach łożyska
i ich zawartością we krwią pępowinowej.
MATERIAŁ I METODY
Materiał badawczy stanowiły tkanki łożyska ludzkiego oraz krew pępowinowa noworodków. Materiał został pozyskany z Kliniki Położnictwa i Ginekologii Onkologicznej w Bytomiu, bezpośrednio po porodzie. W badaniu wzięło
udział 100 kobiet, które wyraziły chęć uczestnictwa w badaniu, podpisując
pisemną zgodę. Ponadto została przeprowadzona ankieta wśród pacjentek dotycząca ich wieku, ilości porodów, stanu zdrowia oraz wagi noworodka. Na
badania uzyskano pisemną zgodę komisji bioetycznej (Nr 75/KBL/OIL/2010).
W celu dokonania analizy statystycznej, grupa kobiet została podzielona ze
względu na ilość przebytych ciąż na: pierworódki (1 dziecko) oraz wieloródki
(≥2 dzieci). Kobiety z grupy pierworódek były w przedziale wiekowym między 18 a 36 rokiem życia, natomiast wieloródki między 29 a 40 rokiem życia.
W celu oznaczenia zawartość kadmu, miedzi i cynku w łożyskach oraz krwi pępowinowej przeprowadzono mineralizację tkanek. W tym celu wysuszony uprzednio materiał (suchą masę) umieszczono w piecu muflowym i poddano procesowi spalania
w temperaturze 450°C. Spopielony materiał zalano 65% kwasem azotowym HNO3
w ilości 2 cm3. Roztwory mineralizatów przeniesiono do kolbek miarowych o pojemności 10 cm3 i dopełniono wodą redestylowaną. Zawartość badanych pierwiastków oznaczono metodą płomieniowej spektrometrii absorpcji atomowej (FAAS)
przy użyciu spektrometru Cole-Palmer model BUCK 200A.
334
Wpływ ilości porodów na kumulację kadmiu, miedzi i cynku...
Hipotezy weryfikowano za pomocą pakietu Statistica 9.0. Typ rozkładu
w próbie badawczej badano przy pomocy testu Shapiro–Wilka. Dalsze statystyki oparte były na testach U Manna-Whitneya oraz analizie korelacji Pearson’a. Wyniki wyrażono w miligramach na kilogram suchej masy (mg×kg-1
s.m) i zobrazowano na wykresach.
WYNIKI
Zarówno we krwi pępowinowej noworodków jak i w łożyskach kobiet odnotowano obecność kadmu, cynku i miedzi. Wyniki analizy statystycznej
kumulacji Cd, Zn, Cu we krwi pępowinowej noworodków zilustrowano na
Rys. 1. Cynk jest metalem, który spośród badanych pierwiastków występuje w największych ilościach. Jego zawartość we krwi pępowinowej pobranej od płodów pierworódek oraz wieloródek była na zbliżonym poziomie
(17,737±2,266 mg×kg-1 s.m., 18,720±2,863 mg×kg-1 s.m.). We krwi pępowinowej płodów kobiet rodzących po raz pierwszy odnotowano wyższy poziom miedzi (3,440±0,369 mg×kg-1 s.m.) niż u kobiet rodzących dwa lub
więcej razy (3,165±0,269 mg×kg-1 s.m.).
Rys. 1. Średnia zawartość kadmu, cynku i miedzi we krwi pępowinowej noworodków
pobranej od płodów pierworódek i wieloródek (mg×kg-1 s.m.±błąd standardowy
– skala logarytmiczna)
Analiza wykazała występowanie statystycznie istotnych różnic pomiędzy średnią zawartością kadmu we krwi pępowinowej w grupie pierworódek a średnią
zawartością kadmu w grupie wieloródek (p=0,000). W grupie pierworódek
średnia zawartość Cd osiągnęła wartość 0,666±0,148 mg×kg-1 s.m podczas gdy
u wieloródek była to wartość znacznie wyższa (2,229±0,176 mg×kg-1 s.m.).
Średnią zawartość Cd, Zn oraz Cu w łożyskach kobiet z różną ilością przebytych porodów ilustruje Rys. 2. W przypadku zawartości cynku w łożysku,
335
odnotowano nieznacznie wyższy poziom tego metalu w grupie kobiet rodzących po raz pierwszy (48,412±2,944 mg×kg-1 s.m.) w stosunku do grupy wieloródek (45,448±2,388 mg×kg-1 s.m.). Średnie zawartości miedzi w łożysku
zarówno u pierworódek jak i wieloródek były zbliżone. Analiza statystyczna
wykazała brak istotnych statystycznie różnic pomiędzy średnią zawartością
miedzi w łożysku pierworódek a średnią zawartością tego pierwiastka w łożysku wieloródek. Również nie zanotowano statystycznie istotnych różnic
pomiędzy zawartościami cynku w łożysku pierworódek a zawartościami
cynku w łożysku wieloródek. Porównując średnią zawartość kadmu w badanych tkankach można zaobserwować, iż w grupie wieloródek jego zawartość
w łożysku (0,647±0,061 mg×kg-1 s.m.) jest ponad trzykrotnie mniejsza od
średniej zawartości tego metalu we krwi pępowinowej.
Rys. 2. Średnia zawartość kadmu, cynku i miedzi w łożyskach pierworódek oraz
wieloródek (mg×kg-1 s.m.±błąd standardowy – skala logarytmiczna)
Wykonując analizę Pearson’a zbadano korelacje jakie występują pomiędzy
zawartościami badanych pierwiastków (cynkiem, miedzią oraz kadmem) we
krwi pępowinowej a zawartościami tych pierwiastków w łożyskach kobiet
zarówno w grupie pierworódek jak i wieloródek. Wyniki testu opracowano
i zestawiono w tabeli (Tab. 1). Przeprowadzone analizy wykazały występowanie statystycznie istotnych zarówno dodatnich jak i ujemnych korelacji
pomiędzy badanymi pierwiastkami.
W grupie pierworódek ujawniono występowanie dodatniej umiarkowanej
korelacji pomiędzy zawartością cynku i miedzi w łożysku (Zn/Cu: r2=0,490;
p=0,000) oraz silnej korelacji we krwi pępowinowej noworodków pomiędzy
zawartością cynku i miedzi (Zn/Cu: r2=0,763; p=0,000). Ponadto w grupie kobiet rodzących pierwszy raz dziecko stwierdzono występowanie umiarkowanej korelacji pomiędzy średnią zawartością Cu w łożysku a zawartością Cu
we krwi pępowinowej (r2=0,604; p=0,000) oraz pomiędzy zawartością kadmu
w łożysku a zawartością Cd we krwi pępowinowej (r2=0,548; p=0,000).
336
Wieloródki
Pierworódki
Rodność
Porównywane tkanki
Metal
Współczynnik Perasona (r2)
Wartość p
Łożysko
i krew pępowinowa
Cd
0,548
p=0,000
Cu
0,604
p=0,000
Łożysko
Zn i Cu
0,490
p=0,000
Krew pępowinowa
Zn i Cu
0,763
p=0,000
Łożysko
Cd i Cu
0,772
p=0,000
Cd i Zn
-0,461
p=0,001
Cd i Cu
0,371
p=0,011
Zn i Cu
0,453
p=0,002
Krew pępowinowa
Tab. 1. Analiza korelacji pomiędzy kadmem, cynkiem i miedzią we krwi pępowinowej
i łożyskach pochodzących od pierworódek oraz wieloródek (wartości statystycznie istotne)
We krwi pępowinowej w grupie wieloródek wystąpiły umiarkowane dodatnie korelacje pomiędzy zawartością kadmu a zawartością miedzi (Cd/Cu:
r2=0,371; p=0,011 ), pomiędzy zawartością cynku a zawartością miedzi (Zn/
Cu: r2=0,453; p=0,002) oraz ujemna umiarkowana korelacja pomiędzy zawartością kadmu a zawartością cynku (Cd/Zn: r2=-0,461; p=0,001). W łożysku odnotowano silną dodatnią korelację pomiędzy zawartościami kadmu
i miedzi w grupie wieloródek (Cd/Cu: r2=0,772; p=0,000).
Wieloródki
Pierworódki
Rodność
Porównywane
tkanki
Cd
Zn
Łożysko
r2 = -0,0669 p = 0,631
r2 = 0,1355 p = 0,329
r2 = 0,0747 p = 0,591
Krew
pępowinowa
r2 = -0,1802 p = 0,192
r2 = 0,2035 p = 0,140
r2 = 0,3370 p = 0,013*
Łożysko
r2 = -0,2070 p = 0,167
r2 = 0,1007 p = 0,505
r2 = -0,1100 p = 0,467
Krew
pępowinowa
r2 = -0,0172 p = 0,909
r2 = -0,1631 p = 0,279
r2 = -0,2688 p = 0,071
Cu
Tab. 2. Analiza korelacji Pearsona pomiędzy wiekiem kobiet a zawartością kadmu,
cynku oraz miedzi we krwi pępowinowej i łożyskach pochodzących od pierworódek
oraz wieloródek. * - Różnice istotne statystycznie
Zbadano również zależności pomiędzy wiekiem kobiet a zawartością Zn, Cu
oraz Cd w badanych tkankach w grupie pierworódek oraz wieloródek (Tab.
2). W grupie kobiet rodzących pierwszy raz dziecko stwierdzono występowanie słabej korelacji pomiędzy wiekiem kobiet a średnią zawartością miedzi we krwi pępowinowej (r2=0,3370; p=0,013).
337
DYSKUSJA I WNIOSKI
Pewne substancje a także metale toksyczne mogą wpływać na funkcję łożyska na wielu poziomach takich jak: sygnalizacja, produkcja i uwalnianie hormonów i enzymów, transport substancji odżywczych i produktów zbędnych,
implantacja, wzrost komórek i dojrzewanie. Może to stanowić potencjalne
zagrożenie dla funkcjonowania łożyska, co może skutkować poronieniem,
przedwczesnym porodem czy deformacjami płodu [Singh 2010]. Liczne
badania wskazują jednak, że łożysko skutecznie chroni płód przed pewnymi substancjami np. związkami kadmu. Wykazano, że w organizmach noworodków zawartość kadmu jest niewielka i wynosi około 0,1 μg [Czeczot
i Skrzycki 2010]. Badania przeprowadzone w Szwecji wykazały, że we krwi
pępowinowej poziom kadmu był niższy w porównaniu z krwią matki, co potwierdza tezę, że łożysko jest skuteczną barierą dla tego pierwiastka [Osman
i in. 2000]. Podobne wnioski w swoich badaniach wysunęli Sakamoto i in.
[2010] oraz Baranowska [1995]. Jednak część badaczy donosi, że większość
metali ksenobiotycznych (m.in. Cd) oraz pierwiastków biogennych (np. Cu,
Zn) ma zdolność przenikania przez barierę łożyskową [Rudge i in. 2009].
W badaniach przeprowadzonych w Bytomiu można zaobserwować, iż w grupie wieloródek średnia zawartość kadmu w łożysku (0,647±0,061 mg×kg-1
s.m.) jest ponad trzykrotnie mniejsza od średniej zawartości tego metalu we
krwi pępowinowej. Badania wykazały, że ilość porodów istotnie wpływa
na zawartość kadmu we krwi pępowinowej noworodków. Może to być prawdopodobnie wynikiem zmniejszania się zdolności łożyska do ochrony płodu
lub spowodowane działaniem innych czynników, które nie zostały zbadane. (Świadczy to prawdopodobnie o tym, iż łożysko traci swoje właściwości
ochronne przed kadmem wraz ze wzrostem ilości przebytych ciąż). Ponadto
nie zaobserwowano korelacji pomiędzy wiekiem kobiet a zawartością Cd, Zn
oraz Cu w grupie wieloródek. Łożysko jako narząd przejściowy, powstaje de
novo w przypadku kolejnych ciąż, co czyni go doskonałym bioindykatorem
dla metali ciężkich.
Cynk i miedź łatwo przenikają przez barierę łożyskową i mogą odgrywać
znaczącą rolę w funkcjonowaniu łożyska, a nawet mieć wpływ na poprawę
jego kondycji [Singh 2010].
Warto zwrócić uwagę, że poziom niektórych pierwiastków takich jak Cu i Zn
w łożysku może być skorelowany z wiekiem matki, wagą noworodka, obwodem głowy noworodka czy wagą łożyska [Ozdemir i in. 2009; Osman i in.
2000]. Badania przeprowadzone w Bytomiu wykazały, że zarówno w przypadku cynku jak i miedzi, liczba urodzonych dzieci nie wpływa na zawartość tych
pierwiastków we krwi pępowinowej oraz w łożyskach kobiet (Rys. 1, Rys. 2).
Świadczy to o stabilnej funkcji jaką pełni łożysko dla przenikania metali biogennych do organizmu płodu. We krwi pępowinowej noworodków średnia zawartość tak cynku jak i miedzi w grupie pierworódek była zbliżona do średniej
338
zawartości Zn i Cu u wieloródek, co wskazuje, że łożysko jako sprawny narząd
płodowy, przepuszcza metale biogenne potrzebne do prawidłowego rozwoju płodu, niezależnie od ilości przebytych ciąż. Osman i in. [2000] wykazali
jednak, że łożysko wieloródek posiada niższy poziom Zn w porównaniu do
łożyska pierworódek, co również zostało zaobserwowane w badaniach z Bytomia. Pomiędzy poszczególnymi pierwiastkami mogą występować interakcje
[Ozdemir i in. 2009]. Wykazano istotną korelację pomiędzy poziomem kadmu
a poziomem cynku i miedzi w łożysku kobiet [Kuhnert i in. 1993]. Przeprowadzone przez nas badania dowodzą, że zarówno w łożysku jak i we krwi pępowinowej występują korelacje pomiędzy metalami, zwłaszcza pomiędzy Zn/Cu
u pierworódek oraz Cd/Cu w grupie wieloródek. Obecność ksenobiotyków we
krwi pępowinowej oraz w łożysku może wpłynąć na zawartość metali biogennych w organizmie człowieka.
Ludzkie łożysko jest narażone na różne szkodliwe substancje, pochodzące
z otaczającego środowiska. W przypadku metali toksycznych łożysko może
stanowić biomarker zarówno do oceny stanu zdrowia matki jak i płodu
[Singh, 2010; Iyengar i Rapp 2001]. Może to odgrywać szczególnie ważną
rolę w przypadku kobiet oraz ich dzieci pochodzących z terenów przemysłowych (Górny Śląsk), silnie zanieczyszczonych metalami ciężkimi. Iyengar
i Rapp [2001] zasugerowali, że jeśli toksyczne stężenia metali w tkankach łożyska są wysokie, informacje te mogą zostać wykorzystane do zmniejszenia
narażenia matki podczas kolejnych ciąż.
LITERATURA
Baranowska I. 1995. Lead and cadmium in human placentas and maternal and neonatal blood (in a heavily polluted area) measured by graphite furnace atomic
absorption spectrometry. Occup Environ Med (52) 229–232.
Czeczot H. Skrzycki M. 2010. Kadm – pierwiastek całkowicie zbędny dla organizmu.
Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 64: 38-49.
Falcon M. Vinas P. Osuna E. Luna A. 2002. Environmental exposures to lead and
cadmium measured in human placenta. Arch Environ Health; (57) 598–602.
Fernandez CL. Kuczkowski KM. 2009. Przepływ leków przez łożysko. Anestezjologia
i Ratownictwo, 3: 416-439.
Iyengar GV. Rapp A. 2001. Human placenta as a ‘dual’ biomarker for monitoring fetal
and maternal environment with special reference to potentially toxic trace elements.
Part 3: Toxic trace elements in placenta and placenta as a biomarker for these elements. The Science of the Total Environment, 280 :221-238
339
Kantola M. Purkunen R. Kroger P. Tooming A. Juravskaja J. Pasanen M. Saarikoski S.
Vartiainen T. 2000. Accumulation of cadmium, zinc, and copper in maternal blood
and developmental placental tissue: differences between Finland, Estonia, and St.
Petersburg. Environ Res; 83 (1) 54–66.
Kuhnert BR. Kuhnert PM. Lazebnik N. Erhard P. 1993. The relationship between
placental cadmium, zind, and copper. Journal of the American College of Nutrition, 12: 31-35.
Osman K. Åkesson A. Berglund M. Bremme K. Schütz A. Ask K. Vahter M. 2000. Toxic
and essential elements in placentas of Swedish women. Clinical Biochemistry, 33:
131-138.
Ozdemir Y. Börekci B. Levet A. Kurudirek M. 2009. Assessment of trace element
concentration distribution in human placenta by wavelength dispersive X-ray
fluorescence: effect of neonate weight and maternal age. Applied Radiation and
Isotopes, 67: 1790-1795.
Piestrzyńska-Kajtoch A. 2005. Łożysko - bariera chroniąca płód? Kosmos - Problemy Nauk Biologicznych, 54: 357-365.
Rudge CV. Röllin HB. Nogueira CM. Thomassen Y. Rudge MC. Odland JØ. 2009.
The placenta as a barrier for toxic and essential elements in paired maternal and
cord blood samples of South African delivering women. Journal of Environmental
Monitoring, 11: 1322-1330.
Singh J. Singh VK. Anand M. Kumar P. Siddiqui MKJ. 2010. Placental lead and its
interaction with some essential metals among women from Lucknow, India. Asian
Journal of Medical Sciences, 1: 32-36.
Sakamoto M. Murata K. Kubota M. Nakai K. Satoh H. 2010. Mercury and heavy
metal profiles of maternal and umbilical cord RBCs in Japanese population. Ecotoxicology and Environmental Safety 73; 1–6
mgr Iwona Kozikowska, mgr Magdalena Chrobaczyńska-Dyląg
mgr Katarzyna Suprewicz, mgr Magdalena Czajkowska
Instytut Biologii, Zakład Zoologii Kręgowców i Biologii Człowieka
ul. Podbrzezie 3, 31-054 Kraków
email: [email protected]
Opiekun naukowy: prof. nadzw. dr hab. Robert Stawarz
340
Anna Latacz, Paulina Szczurek
Marta Strzetelska
Krystyna Pierzchała-Koziec
EPISTEME
14/2012
s.341-348
ISSN 1895-4421
UDZIAŁ OPIOIDÓW W MODULOWANIU WPŁYWU RAPAMYCYNY
NA STĘŻENIE BIAŁKA S6K1 SZLAKU MTORC1 W PODWZGÓRZU
OPIOIDS PARTICIPATION IN MODULATING RAPAMYCIN IMPACT
IN THE S6K1 PROTEIN CONCENTRATION IN THE HYPOTHALAMUS MTORC1 TRACT
Abstrakt. Białko S6K1 jest jednym z substratów kompleksu mTORC1, odpowiedzialnego za regulowanie syntezy białek. Celem badań było określenie wpływu rapamycyny, inhibitora aktywności kompleksu mTORC1, na stężenie i stopień in vitro
wydzielania białka S6K1 z podwzgórza. Eksperyment przeprowadzono na myszach
kontrolnych lub poddanych iniekcji naltreksonu, będącego antagonistą receptorów
opioidowych. Stężenie białka S6K1 zmierzono przy pomocy testu ELISA (test immunoenzymatyczny), stężenie białka w tkance określono metodą BCA (metoda kolorymetryczna z użyciem kwasu bis-cynchoninowego). Naltrekson obniżył stopień
spontanicznego wydzielania białka S6K1 z podwzgórza. Rapamycyna znacząco zahamowała wydzielanie białka S6K1 z podwzgórza myszy kontrolnych, ale wywołała
wzrost sekrecji tego białka z tkanki zwierząt traktowanych naltreksonem. Otrzymane
wyniki wyraźnie wskazują na zaangażowanie układu opioidowego m.in. w regulację
wewnątrzkomórkowego mechanizmu syntezy białek i rzucają nowe światło na zagadnienia związane z rolą rapamycyny w modulowaniu szlaku kinazy mTORC1.
Słowa kluczowe: białko S6K1, rapamycyna, naltrekson, kinaza mTORC1
Summary. S6K1 protein is one of the mTORC1 complex substrate, responsible for
the regulation of protein synthesis. The aim of this study was to determine the effect
of rapamycin, an inhibitor of complex mTORC1 activity, concentration and degree
of in vitro secretion of hypothalamic S6K1 protein. The experiment was conducted
in control mice or in mice after injection of naltrexone, an opioid receptor antagonist.
S6K1 protein concentration was measured by ELISA (enzyme-linked immunosorbent
assay), protein concentration in tissue was determined by BCA (colorimetric method
with the use of bicinchoninic acid). Naltrexone reduced the level of spontaneous secretion of hypothalamic S6K1 protein. Rapamycin significantly inhibited the S6K1
protein secretion from the control mice hypothalamus, but caused increased secretion
of the protein from the tissue of animals treated with naltrexone. The results clearly
indicate the involvement of the opioid system e.g. in the regulation of intracellular
mechanisms of protein synthesis and shed new light on issues related to the role of
rapamycin in modulating mTORC1 kinase pathway.
Key words: S6K1 protein, rapamycin, naltrexone, mTORC1 kinase
341
WSTĘP
Kinaza mTOR, tzw. ssaczy cel rapamycyny (ang. mammalian target of rapamycin kinase) należy do dużej rodziny kinaz serynowo-treoninowych. Bierze ona udział w utrzymaniu homeostazy komórki poprzez koordynowanie
procesów katabolicznych, anabolicznych, a także poprzez informowanie o
poziomie substancji odżywczych, związków energetycznych oraz czynników
wzrostowych [Sengupta i in. 2010]. Kinaza funkcjonuje jako katalityczna
podjednostka w dwóch różnych kompleksach białkowych o odmiennych
funkcjach: mTORC1 i mTORC2 [Martin i Hall 2005; Kapahi i in. 2010].
Kompleks TORC1 stanowi kluczowy element szlaku sygnalizacyjnego TOR,
monitorując i integrując sygnały dotyczące czynników wzrostu, substancji
odżywczych, czynników energetycznych i stresowych [Shaw i Cantley 2006;
Kapahi i in. 2010]. Aktywność tego kompleksu wpływa na wiele procesów
komórkowych takich jak: translacja mRNA, transkrypcja, autofagia, metabolizm, proliferacja oraz wzrost [Kapahi i in. 2010]. Mało jednak wiadomo
o roli szlaku mTOR w centralnym układzie nerwowym (CNS). Jak do tej
pory wykazano, mTOR pełni funkcje w różnicowaniu neuronalnym, wzroście aksonalnym czy synaptogenzie. W dojrzałym CNS mTOR wpływa na
regenerację aksonów oraz na proces plastyczności synaptycznej w hipokampie [Costa-Mattioli i in. 2009; Cao i Obrietan 2010]. Coraz częściej postuluje
się udział ścieżki mTOR w patogenezie chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Huntingtona, Parkinsona czy Alzheimera [Webb i in. 2003;
Bandhyopadhyay i in. 2007; Perycz i in. 2007].
Spośród kompleksów kinazy mTOR tylko mTORC1 reaguje w krótkim
czasie na rapamycynę, która hamuje część jego funkcji [Hands i in. 2009].
Rapamycyna należy do grupy leków makrolidowych m.in. o działaniu antynowotworowym i immunosupresyjnym [Minor i in. 2010]. Mechanizm jej
działania opiera się na osłabieniu interakcji pomiędzy mTOR, a białkiem
raptor (ang. regulatory associated protein of mTOR), stanowiącym kluczowy
element kompleksu mTORC1, co skutkuje zmniejszeniem jego aktywności.
Innym czynnikiem wpływającym hamująco na aktywność mTORC1 może
być np. niski poziom związków energetycznych i czynników wzrostu w komórce czy niski potencjał redoks [Cota i in. 2006].
Dwoma najlepiej scharakteryzowanymi substratami kompleksu mTORC1 są
kinaza S6K1 (ang. ribosomal S6 protein kinase 1) i białko wiążące eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 4E-BP1 (ang. eukariotyc initiation factor
4E-binding protein 1) [Foster i Fingar 2010].
Aktywne formy zarówno kinazy mTOR jak i białka S6K1 występują w wysokich stężeniach w komórkach dwóch obszarów podwzgórza: jądrze przykomorowym (ang. paraventricular nucleus - PVN) oraz jądrze łukowatym
342
Udział opioidów w modulowaniu wpływu rapamycyny...
(ang. arcute nucleus - ARC) [Cota i in. 2006]. mTORC1 fosforyluje kinazę
S6K1, a reakcja ta stymuluje następnie fosforylację rybosomalnego białka
p70S6 (S6K1). Aktywowane białko S6K1 może stymulować syntezę innych
białek biorących udział w translacji mRNA [Kapahi i in. 2010].
Mimo to, że kinaza S6K1 nie jest niezbędnym czynnikiem do rozwoju organizmu, to jednak jej brak powoduje spowolnienie procesu wzrostu komórkowego oraz zmniejszenie rozmiarów ciała u wielu gatunków zwierząt [Kapahi
i in. 2010].
Szlak mTOR, jest jednym ze szlaków związanych z kinazą PI3K [Sengupta
i in. 2010]. Dowiedziono, że jednym z czynników prowadzących do aktywacji ścieżki sygnałowej PI3K/Akt-mTOR w polu CA3 hipokampa u szczura jest morfina. Zaobserwowano także, że rapamycyna hamuje fosforylację
kinazy S6K1 w komórkach hipokampalnych zarówno w warunkach in vivo
[Cui i in. 2010] jak i in vitro [Sato i in. 2008]. Można sugerować, że działanie
rapamycyny w mózgowiu uzależnione jest od aktywności układu opioidowego. Dlatego też, celem podjętych badań było określenie wpływu endogennych opioidów na stężenie białka S6K1 w podwzgórzu, w zależności od
obecności inhibitora kompleksu mTORC1 – rapamycyny.
MATERIAŁ I METODY
Eksperyment przeprowadzono na 12 myszach szczepu Swiss o średniej masie ciała 26g, trzymanych w standardowych warunkach, z wolnym dostępem
do wody i paszy. Zwierzęta podzielono na dwie grupy: kontrolną (n=6) i doświadczalną (n=6). Myszy z grupy kontrolnej otrzymały iniekcję z soli fizjologicznej (100µl), natomiast grupie doświadczalnej podano dootrzewnowo
naltrekson (3mg/kg m.c., Sigma – Aldrich, USA) 60 minut przed dekapitacją
i pobraniem podwzgórza.
Fragmenty podwzgórza umieszczono w dołkach, zawierających 1,5ml buforu Krebsa z dodatkiem BSA (0,3g glukozy/ 100ml, 0,1g BSA/ 100ml),
w temperaturze 37°C na okres 10 minut, pozwalając na stabilizację spontanicznego wydzielania (A). Po tym czasie przełożono tkanki do kolejnych dołków z buforem na 60 minut (B), następnie na kolejne 60 minut (C)
i końcowe 10 minut inkubacji (D). W celu określenia wpływu endogennych
opioidów na stężenie białka S6K1 w zależności od obecności inhibitora kompleksu mTORC1, do dołków na etapie B i C dodano roztwór rapamycyny
(50nM, Sigma – Aldrich, USA). Po każdym z etapów pobrano 0,5 ml medium hodowlanego i oznaczano w nim stężenie białka S6K1 za pomocą testu
ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit for Ribosomal Protein S6
Kinase Beta1, USCN Life Science Inc.). Tkanki po hodowli zhomogenizowano w buforze fosforanowym o pH=6,5, odwirowano 10minut/12000xg
343
i w nadsączach oznaczono stężenie białka całkowitego metodą BCA (QuantiPro BCA Assay Kit, Sigma – Aldrich, USA), a następnie testem ELISA
stężenie białka S6K1.
Wyniki zaprezentowano jako wartości średnie ±SEM (pg/mg białka). Analizę statystyczną wykonano stosując program Statistica (StatSoft Inc.,Tulsa,
OK, USA). Jednoczynnikowa analiza wariancji umożliwiła określenie różnic
statystycznych między grupami (p<0,01). W celu dokładniejszej ilustracji
wartości wyników poddano transformacji (pierwiastkowano).
WYNIKI
Wydzielanie spontaniczne białka S6K1 (Rys. 1A). Stopień wydzielania białka
S6K1 z podwzgórza myszy kontrolnych wzrósł z wartości 0,76±0,2 (Rys. 1A
0,87±0,44) obserwowanej w pierwszych 10 minutach inkubacji do 15,58±1,03
(Rys. 1A 3,95±1,01) po kolejnych 60 minutach (p<0,01). W kolejnych etapach inkubacji (C i D) wydzielanie spontaniczne wyniosło 0,25±0,01 (Rys. 1A
0,5±0,1) i 0,12±0,01 (Rys. 1A 0,35±0,1), odpowiednio (p<0,01).
Iniekcja naltreksonu wywołała istotne obniżenie wydzielania białka w każdym z badanych etapów w porównaniu do wydzielania z podwzgórza myszy
kontrolnych.
Wpływ rapamycyny na wydzielanie białka S6K1 (Rys. 1B). Rapamycyna zahamowała wydzielanie białka S6K1 z podwzgórza myszy kontrolnych zarówno w etapie B jak i D. Natomiast u myszy traktowanych naltreksonem
zaobserwowano stymulujący wpływ rapamycyny na wydzielanie białka
S6K1 – wzrost o 560 % po 60 minutach i o 117% po kolejnych 60 minutach
inkubacji (p<0,01).
5
kontrola
5
4
naltrekson
4
3
S6K1 [pg/mg]
S6K1 [pg/mg]
Stężenie białka S6K1 w tkankach przed i po wydzielaniu. W tkankach z grupy
doświadczalnej, na które działała rapamycyna zauważono spadek stężenia
białka S6K1 w porównaniu z kontrolą. Nie zauważono istotnych statystycznie różnic w stężeniu białka S6K1 po wydzielaniu spontanicznym pomiędzy
grupą kontrolna i doświadczalną (Rys. 2).
#
*
2
*
1
#
#
#
*
#
3
2
#
1
*
# #
#
*
0
0
A
344
#
B
C
D
A
B
C
D
Naltrekson obniżył stopień spontanicznego wydzielania białka S6K1 w porównaniu z grupą kontrolną (Rys. 3A). W przypadku wydzielania stymulowanego naltrekson obniżył stężenie białka w tkankach oraz zastymulował
jego wydzielanie w stosunku do grupy kontrolnej (Rys. 3B).
Rys. 1. Stężenie białka S6K1
wydzielonego z podwzgórza:
8
A – bez rapamycyny,
naltreks on
B – po dodaniu rapamycyny;
6
A – pierwsze 10 minut inkuba4
cji (stabilizacja), B – kolejne
2
60 minut inkubacji, C – kolejne
0
60 minut inkubacji, D – końcobez RA PA
z RA PA
we 10 minut inkubacji. Różnice statystycznie istotne: # – pomiędzy grupą kontrolną, a doświadczalną ( z naltreksonem); * – w stosunku do pierwszych
10 minut inkubacji. Wyniki zostały zaprezentowane jako wartości średnie ±SEM (n=6/
grupa). p<0,01
10
S6K1 [pg/mg]
S 6K 1 [pg/mg]
kontrola
w tkance
8
7
6
5
4
3
2
1
0
w ydzielone
kontrola
naltrekson
z RAPA
S6K1 [pg/mg]
Rys. 2. Stężenie białka S6K1 w tkankach po wydzielaniu spontanicznym
(bez rapamycyny) i po dodaniu rapamycyny. Wyniki zostały zaprezentowane jako
wartości średnie ±SEM (n=6/grupa)
8
7
6
5
4
3
2
1
0
kontrola
naltrekson
bez RAPA
Rys. 3. Stężenie białka S6K1 w tkankach przed wydzielaniem : A – spontanicznym
(bez rapamycyny), B – po dodaniu rapamycyny oraz stężenie białka wydzielone
z tkanki. Wyniki zostały zaprezentowane jako wartości średnie ±SEM (n=6/grupa)
345
DYSKUSJA
Układ opioidowy jest jednym z głównych układów zaangażowanych w silnie
konserwatywne ewolucyjnie mechanizmy, dotyczące percepcji bólowej, nagrody, uzależnienia i zachowań lękowych [Lesniak i Lipowski 2011]. Znane
są trzy typy receptorów opioidowych – mu, delta i kappa [Chang i Porecca
2003], rozpowszechnione w centralnym i obwodowym układzie nerwowym,
a także w tkankach pochodzenie nieneuronalnego [Sehgal i in. 2011].
Obszar podwzgórza, w którym znajdują się komórki wykazujące ekspresję aktywnych form mTOR i S6K1 [Cota i in. 2006], charakteryzuje się również występowaniem dużej liczby receptorów mu opioidowych [Lesniak i Lipowski 2011].
Potwierdzono, że zastosowanie antagonistów receptorów mu opioidowych
stymuluje ścieżkę sygnałową kinazy PI3K. Użycie DAMGO (selektywny
agonista receptorów opioidowych typu mu) w hodowli komórkowej zadziałało stymulująco na kinazę Akt, S6K1 oraz 4E-BP1. Przeciwstawne działanie
wywołało podanie selektywnych inhibitorów kinazy PI3K [Polakiewicz i in.
1998].
Uzyskane wyniki doświadczenia wykazały, że zastosowanie inhibitora receptorów opioidowych (naltreksonu) spowodowało znaczny spadek spontanicznego
wydzielanie białka S6K1 z podwzgórza w porównaniu do grupy kontrolnej.
Świadczy to o niewątpliwym udziale endogennych opioidów w modulacji szlaku
kinazy mTORC1, której jednym z substratów jest białko S6K1.
Wcześniejsze doniesienia podkreślają hamujący wpływ rapamycyny na fosforylację kinazy S6K1 [Sato i in. 2008]. Przeprowadzone badania wykazały,
że dodanie rapamycyny do hodowli spowodowało spadek wydzielania białka S6K1 z podwzgórza myszy kontrolnych. Niespodziewanie, rapamycyna
spowodowała wzrost wydzielania białka S6K1 z podwzgórza zwierząt traktowanych naltreksonem w stosunku do grupy kontrolnej (Rys. 3B) oraz grupy doświadczalnej nie poddanej działaniu rapamycyny (Rys. 3A). Wyniki
te sugerują, iż niskie stężenie endogennych opioidów wywołane działaniem
naltreksonu znosi inhibicyjny efekt rapamycyny, objawiający się spadkiem
wydzielania białka S6K1 z podwzgórza. Otrzymane wyniki rzucają nowe
światło na zagadnienia związane z rolą rapamycyny oraz układu opioidowego w modulowaniu aktywności szlaku kinazy mTORC1.
WNIOSKI
• Rapamycyna powoduje spadek stopnia wydzielania białka S6K1 z podwzgórza, co świadczy o jej hamujący wpływie na aktywność kinazy
mTORC1.
346
• Zmiany stężenia białka S6K1 w komórkach podwzgórza wywołane podaniem naltreksonu, wskazują na udział opioidów w regulacji aktywności
szlaku kinazy mTORC1.
• Przy jednoczesnej stymulacji komórek podwzgórza naltreksonem i rapamycyną, niskie stężenie endogennych opioidów znosi inhibicyjny efekt
działania rapamycyny.
LITERATURA
Bandhyopadhyay U. Cuervo AM. 2007. Chaperone-mediated autophagy in aging and
neurodegeneration: lessons from alpha-synuclein. Experimental Gerontology, 42:
120-128.
Cao R. Obrietan K. 2010. mTOR Signaling and entrainment of the mammalian circadian clock. Molecular and Cellular Pharmacology, 2(4):125-130.
Chang KJ. Porecca F. 2003. The delta receptor. CRC press.
Cota D. Proulx K. Blade Smith KA. Kozma SC. Thomas G. Woods SC. Seeley RJ.
2006. Hypothalamic mTOR signaling regulates food intake. Science, 312, 927.
Costa-Mattioli M. Sossin WS. Klann E. Sonenberg N. 2009. Translational control of
longlasting synaptic plasticity and memory. Neuron, 61: 10-26.
Cui Y. Zhang XQ. Cui Y. Xin WJ. Jing J. Liu G. 2010. Activation of phosphatidylinositol 3-kinase/Akt-mammalian target of rapamycin signaling pathway in the hippocampus is essential for the acquisition of morphine-induced place preference in
rats. Neuroscience, 171: 134-143.
Foster KG. Fingar D. 2010. Mammalian target of rapamycin (mTOR): conducting
the cellular signaling symphony. The Journal of Biological Chemistry, 285(19):
14071-14077.
Hands SL. Proud ChG. Wyttenbach A. 2009. mTOR’s role in ageing; protein synthesis
or autophagy? Aging, 1(7).
Kapahi P. Chen Di. Rogers AN. Katewa SD. Wai-Lun Li P. Thomas EL. Kockel L.
2010. With TOR less is more: a key role for the conserved nutrient sensing TOR
pathway in aging. Cell Metabolism, 11(6): 453-465.
Lesniak A. Lipkowski W. 2011. Opioid peptides in peripheral pain control. Acta Neurobiologiae Experimentalis, 71: 129-138.
Martin DE. Hall MN. 2005. The expanding TOR signaling network. Current Opinion
in Cell Biology, 17: 158-166.
347
Minor RK. Allard JS. Younts CM. Ward TM. de Cabo R. 2010. Dietary interventions
to extend life span and health span based on calorie restriction. Journal of Gerontology, 65(7): 695-793.
Perycz M. Wiech Ł. Malik A. Jaworski J. 2007. mTor physiology and pathology of the
nervous system. Postępy Biologii Komórki, 34(3): 511-525.
Polakiewicz RD. Schieferl SM. Gingras AC. Sonenberg N. Comb MJ. 1998. Mu-opioid receptor activates signaling pathways implicated in cell survival and translational control. The Journal of Biological Chemistry, 36: 23534-23541.
Sato T. Umetsu A. Tamanoi F. 2008. Characterization of the Rheb-mTOR signaling
pathway in mammalian cell: constitutive active mutant of Rheb and mTOR. Methods in Enzymology, 438: 307-320.
Sehgal N. Smith H. Manchikanti L. 2011. Peripherally acting opioids and clinical
implications for pain control. Pain Physician, 14: 249-258.
Shaw RJ. Cantley LC. 2006. Ras, PI(3)K and mTOR signaling controls tumor cell
growth. Nature, 441: 424-430.
Sengupta S. Peterson TR. Sabatini DM. 2010. Regulation of the mTOR complex
1 pathway by nutrients, growth factors, and stress. Molecular Cell, 40(2): 310322.
Webb JL. Ravikumar B. Atkins J. Skepper JN. Rubinsztein DC. 2003. Alpha-synuclein is degraded by both autophagy and the proteasome. Journal of Biological
Chemistry, 278: 25009-25013.
mgr Anna Latacz, Paulina Szczurek, mgr inż. Marta Strzetelska
Katedra Fizjologii i Endokrynologii Zwierząt
Wydział hodowli i biologii zwierząt
Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Krystyna Pierzchała-Koziec
Praca finansowana z DS.3243/KFEZ/2011
348
Małgorzata Łukasz
Aleksandra Cetera
Barbara Rusztowicz
Jerzy Świtalski
EPISTEME
14/2012
s.349-355
ISSN 1895-4421
ODDZIAŁYWANIE WODY ANIONOWEJ NA TEMPO WZROSTU
DROBNOUSTROJÓW
INFLUENCE OF ANIONIC WATER ON THE GROWTH RATE OF
MICROBES
Abstrakt. W doświadczeniu zbadano wpływ wody anionowej na wzrost wybranych
drobnoustrojów. Woda alkaliczna wzbogacona jest w aktywny wodór (OH-) oraz elektrolity o ładunku ujemnym. Efekt oddziaływania czynnika doświadczalnego na tempo
namnażania mikroorganizmów oceniono sporządzając krzywe kinetyki wzrostu wybranych drobnoustrojówów. Analiza wyników doprowadziła do wniosku, że woda
anionowa może stymulować niektóre bakterie w logarytmicznej fazie wzrostu. Nie
wykazano natomiast wpływu alkalizowanej wody na tempo przyrostu drożdży.
Słowa kluczowe: woda anionowa, kinetyka wzrostu drobnoustrojów, Escherichia
coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae
Summary. Influence of alcaline water on the growth of selected microbes was the
object of this experiment. Anionic water contains active hydrogen (OH-) and negative
electrolites. Effect of the tested factor on the growth rate of microbes was estimated
by compiling growth curves for chosen microorganisms. Results of this study suggest
that alkaline water may stimulate some bacteria in their exponential growth phase. Yet
no influence of anionic water on the growth rate of yeast occurred.
Key words: anionic water, growth kinetics of microbes, Escherichia coli, Bacillus
subtilis, Saccharomyces cerevisiae
349
WSTĘP
Japońscy naukowy uważają spożywanie wody anionowej (zwanej też wodą
alkaliczną lub „wodą żywą”) za bezcenne dla zdrowia. Woda ta o alkalicznym pH i ujemnym potencjale redoks powstaje wskutek elektrolizy wody
wodociągowej. Pod wpływem przyłożonego napięcia elektrycznego na katodzie wydzielany jest wodór (H2) oraz powstają aniony wodorotlenkowe (OH), co skutkuje alkalizacją środowiska głównie z powodu tworzenia wodorotlenku sodu (NaOH). Korzyści zdrowotne wynikające ze spożywania wody
alkalicznej przypisuje się głównie neutralizacji nierównowagi kwasowej
w organizmie. Badania kliniczne w japońskich szpitalach dowodzą znamienitego wpływu spożywania wody anionowej na poprawę ogólnego stanu zdrowia w tym: stymulację fizjologicznej mikroflory jelitowej oraz przeciwdziałanie fermentacji kątniczej [Hayakawa i Tsuge a) b) 1999], przeciwdziałanie
osteoporozie, obniżenie poziomu cholesterolu, regulację wydzielania soku
żołądkowego, przeciwdziałanie alergiom, wspomaganie rekonwalescencji,
neutralizację toksyn, regulację poziomu cukru we krwi, wspomaganie funkcji wątroby, pomoc w leczeniu chronicznych biegunek [Hayashi i Kawamura
1990; Hayakawa i Tsuge b) 1999]. W testach in vitro wykazano, że poprzez
zmiatanie rodników tlenowych aktywnym wodorem (OH-) woda anionowa
chroni DNA przed uszkodzeniami [Shirahata i in. 1997] jak również wzmacnia działanie innych przeciwutleniaczy takich jak kwas askorbinowy [Hanaoka i in. 2004]. Południowokoreańscy badacze dowiedli działania przeciwnowotworowego u myszy pojonych woda anionową – opóźnienie wzrostu guzów
oraz wydłużenie czasu przeżycia zwierząt [Lee i in. 2004]. Dla wielu wyniki
te pozostają jednak wątpliwe. Powyższe doniesienia zainspirowały autorów niniejszej pracy do zbadania oddziaływania wody alkalicznej na tempo wzrostu
drobnoustrojów: Escherichia coli, Bacillus subtilis oraz Saccharomyces cerevisiae. Korzystne efekty działania wody anionowej na tak nieskomplikowane
organizmy, w porównaniu do organizmu człowieka, przemawiałyby za dodatnimi efektami spożywania tej wody również przez ludzi. Korzyści ze stymulacji tempa namnażania, a pośrednio metabolizmu mikroorganizmów mogłyby
zostać wykorzystane w biotechnologii i mikrobiologii przemysłowej w celu
eskalacji produkcji biomasy, zwiększenia efektywności syntezy metabolitów
przez drobnoustroje czy wreszcie przyspieszenia procesów biochemicznych
z ich udziałem.
MATERIAŁ I METODY
Materiał biologiczny. Materiałem biologicznym były trzy gatunki drobnoustrojów: Escherichia coli ATCC 25922, dziki szczep Bacillus subtilis oraz
szczep przemysłowy Saccharomyces cerevisiae - pozyskany z kostki “Drożdże domowe” wyprodukowanej przez firmę “Lallemad” S.p. z o. o. Wybrane
350
Oddziaływanie wody anionowej na tempo wzrostu drobnoustrojów...
bakterie stanowiły przykład modelowych organizmów gramoujemnych i gramododatnich, natomiast wykorzystane drożdże organizmu eukariotycznego.
Podłoża mikrobiologiczne. Wodę anionową pozyskano z wody wodociągowej z wykorzystaniem urządzenia „Jonizator wody PTV-KL, PTV-AL.” firmy „BURBULIKAS”. Wodę wodociągową poddawano 30-minutowemu procesowi jonizacji. W wyniku powyższej procedury otrzymano wodę anionową
o wartości pH ok. 11 i potencjale utleniania-redukcji równym -949 mV.
W celu oszacowania oddziaływania badanego czynnika w doświadczeniu
używano podłoży o optymalnie dobranych komponentach dla danego mikroorganizmu. Kontrolę stanowiła pożywka wykonana na bazie wody wodociągowej, natomiast podłoże właściwe zawierało wodę anionową. Wartości pH
medium z „wodą żywą” minimalnie skorygowano dodatkiem 0,1M roztworu
HCl do wartości pH charakteryzujących próby kontrolne tj. 6,50 - 7,00. Skład
pożywki dla E. coli w przeliczeniu na 1000 cm3 wody: bulion odżywczy 8g,
ekstrakt drożdżowy 2g, NaCl 5g, laktoza 5g, K2HPO4 5g, KH2PO4 1,5g. Skład
pożywki dla B. subtilis w przeliczeniu na 1000 cm3 wody: pepton 5g, ekstrakt
drożdżowy 5g, glukoza 5g, NaCl 1g, K2HPO4 0,5g, MgSO4 0,5g, NaHCO3
1g. Skład pożywki dla S. cerevisiae w przeliczeniu na 1000 cm3 wody: pepton 2g, ekstrakt drożdżowy 2g, glukoza 20g, (NH4)2SO4 3g, MgSO4 x 7H2O
0,3g, KH2PO4 1g, CaCl2 x 5 H2O 0,2g.
Metody. W celu zbadania wpływu wody anionowej na wzrost mikroorganizmów mierzono gęstość optyczną płynnej hodowli co godzinę od momentu
inokulacji. Pomiar gęstości optycznej (OD - Optical Dentisity) przeprowadzono w spektrofotometrze Shimadzu UV-1201V przy długości fali λ=550
nm w kuwecie szklanej zawierającej 2 cm3 wody dejonizowanej i 0,2 cm3
płynnej hodowli drobnoustrojów. Dla każdego pomiaru wykonano trzy powtórzenia, których uśrednione wartości poddano analizie statystycznej.
Badane mikroorganizmy, w celu otrzymania czystej kultury, hodowano na
pożywkach stałych: bakterie na bulionie z glukozą, S. cerevisiae na pożywce
Sabouruaud (Biomerieux) z chloramfenikolem. W celu otrzymania inokulum, podłoże płynne szczepiono ezą z pojedynczej koloni. Po 24 godzinach
hodowli przygotowanym inokulum zaszczepiano 20 cm3 płynnej pożywki
tak, by mierzona gęstość optyczna w czasie inokulacji wynosiła od 0,015
do 0,025. Hodowle prowadzono na wytrząsarce Heidolph Unimax 1010
z inkubatorem Heidolph Inkubator 1000 w temperaturze 37ºC dla bakterii
oraz 28ºC dla drożdży. Kontrolę oraz próbę właściwą wykonano w trzech
replikach. Eksperyment powtórzono dla B. subtilis i E. coli trzykrotnie, natomiast dla S. cerevisiae - pięciokrotnie. Do oszacowania istotności statystycznej posłużono się testem t dla par skorelowanych.
351
WYNIKI
Bacillus subtilis. Zaobserwowano zwiększoną gęstość optyczną podczas fazy
wzrostu wykładniczego w hodowlach prowadzonych na wodzie alkalicznej
w stosunku do kontroli. Największe różnice w OD wynosiły dla kolejnych
powtórzeń: 1,93 w 5 i 6 godzinie hodowli; 2,56 w 6 i 7 godzinie oraz 2,61
w 8 godzinie hodowli;1,47 w 5 godzinie hodowli. Rozbieżności te stanowiły
dla kolejnych powtórzeń odpowiednio 71%, 175% i 64 % przyrostu gęstości optycznej w odniesieniu do kontroli. Nie zaobserwowano skrócenia fazy
lag ani wydłużenia fazy logarytmicznego wzrostu podczas hodowli B. subtilis
w pożywce na bazie wody anionowej. Uzyskane wyniki są wysoce istotne statystycznie (p < 0,01).
Escherichia coli. W pierwszym eksperymencie zanotowano wyraźnie zwiększony przyrost gęstości optycznej w czasie logarytmicznej fazy wzrostu bakterii E. coli hodowanych na wodzie alkalicznej w odniesieniu do hodowli
kontrolnej. Różnica w OD wyniosła 1,91, 1,90, 1,62 oraz 1,84 w kolejno 5,
6, 7, i 8 godzinie hodowli, co stanowiło maksymalnie 67% przyrostu gęstości
optycznej w porównaniu do kontroli. Otrzymane wyniki są wysoce istotne
statystycznie (p < 0,01). Analogicznych rezultatów nie odnotowano w kolejnych powtórzeniach doświadczenia, w których największe różnice gęstości
optycznej pomiędzy próbą właściwą a kontrolą wynosiły od 0,32 do 0,38
będąc na granicy błędu statystycznego.
Saccharomyces cerevisiae. Nie zaobserwowano istotnych różnic w gęstości
optycznej prób właściwych S. cerevisiae w stosunku do kontroli w żadnej
fazie wzrostu podczas 10-godzinnych eksperymentów. Odnotowane rozbieżności w wartościach OD mieszczą się w zakresie wyliczonych odchyleń
standardowych lub są na ich granicy. Na Rycinie 1 przedstawiono wykresy
obrazujące wzrost B. subtilis, E. coli oraz S. cereviasiae w dwóch powtórzeniach doświadczenia dla każdego z badanych mikroorganizmów.
WYNIKI I DYSKUSJA
Celem doświadczenia było zbadanie oddziaływania wody anionowej na
tempo przyrostu wybranych drobnoustrojów. Wyniki przeprowadzonych
eksperymentów wskazują na stymulację bakterii z gatunku Bacillus subtilis
w logarytmicznej fazie wzrostu pod wpływem wody alkalicznej w medium,
o czym świadczy przyrost OD w zakresie 64 - 175% w porównaniu do kontroli. Dla modelowego gatunku gramoujemnych bakterii Escherichia coli jedynie w pierwszym z trzech przeprowadzonych eksperymentów odnotowano
przyrost gęstości optycznej rzędu 67% pod wpływem czynnika doświadczalnego w fazie wzrostu wykładniczego. Z kolei dla drożdży Saccharomyces
cerevisiae woda alkaliczna w podłożu w żaden sposób nie ingeruje w tempo
352
wzrostu. W żadnym z badanych przypadków nie zaobserwowano negatywnego odziaływania „wody żywej” na przyrost drobnoustrojów. Woda anionowa w medium mikrobiologicznym nie wpłynęła również na długość fazy lag
ani przebieg fazy akcelerecji.
Rys. 1. Obserwacje wzrostu B. subtilis, E. coli oraz S. cerevisiae w podłożach na
bazie wody anionowej (linie przerywane) oraz podłożach kontrolnych (linie ciągłe)
353
Uzyskane wyniki w przypadku B. subtilis mogą być spowodowane zawartością soli mineralnych jako czynnika limitującego wzrost w tradycyjnych
podłożach mikrobiologicznych. Uzupełnienie poziomu składników mineralnych przez wodę alkaliczną w medium mogło przyczynić się do stymulacji
wzrostu B. subtilis. Spotęgowanie proliferacji bakterii B. subtilis oraz E. coli
mogło być ponadto następstwem doznanego przez bakterie szoku osmotycznego po zainokulowaniu podłoża na bazie wody alkalicznej. Warunki stresu
mogły spowodować obumarcie lub sprzetrwalnikowanie części komórek,
po czym pozostałe zdołały zaadoptować się do napotkanych warunków
i w szybkim tempie zająć dostępną niszę [Ding i in. 2009]. Ponadto aniony
zawarte w „wodzie żywej” mogą neutralizować kwaśne produkty metabolizmu bakterii, przez co nie dochodziło do silnego zakwaszenia środowiska,
które ostatecznie hamuje proliferację komórek [Salmond i in. 1984; Shelef
1994]. Możliwe, że ze względu na złożony metabolizm S. cerevisiae nieistotne okazało się zwiększenie ilości dostępnych związków mineralnych jak
to mogło mieć miejsce w przypadku bakterii. Warunki przeprowadzanych
eksperymentów oraz podłoża mikrobiologiczne były odpowiednio dobrane
o czym świadczy szybkie wejście drobnoustrojów w fazę wzrostu wykładniczego. Gęstość optyczna inokulum była wystandaryzowana, a warunki pH,
temperatury i wytrząsania ustabilizowane. Nie można zlekceważyć faktu
odmiennego przebiegu krzywych wzrostu dla prób B. subtilis, który może
wskazywać na pominięcie dodatkowego czynnika wpływającego na wzrost
drobnoustrojów. Z uwagi na rozbieżne wyniki w przypadku E. coli oraz
niespójności w obrazie krzywych wzrostu B. subtilis należy przeprowadzić
powtórzenie doświadczenia przy odmiennych wartościach temperatury oraz
z wykorzystaniem różnych szczepów tych gatunków bakterii. Nie można
wykluczyć interakcji składników medium z jonami zawartymi w „wodzie
żywej”, dlatego wyniki eksperymentu należy zweryfikować przeprowadzając
doświadczenia z użyciem maksymalnie zubożonych podłóż. Reasumując powyższe, należy być ostrożnym w jednoznacznym stwierdzeniu korzystnego
efektu oddziaływania wody alkalicznej na wzrost bakterii.
Możliwe pozytywne rezultaty oddziaływania wody anionowej w medium na
wzrost B. subtilis mogą znaleźć zastosowanie w mikrobiologicznej syntezie
α-amylaz (również α-amylazy), proteaz, ksylanazy, amidazy penicylanowej
[Libudzisz i in. 2008], kwasu hialuronowego, polihydroksyalkalonów (PHA)
[Chen i in. 2000] oraz antybakteryjnej subtyliny [Błaszczyk 2008].
354
LITERATURA
Błaszczyk U. 2008. Bakteriocyny – właściwości i zastosowanie. Laboratorium Przemysłowe, 10:28-32.
Chen GQ. Wu Q. Xi JZ. Yu HP. Chan A. 2000. Microbial production of biopolyesters
polyhydroxyalkanoates. Prog Nat Sci, 10:843–50.
Ding T. Jin YG. Rahman, SME. Kim JM. Choi KH. Choi GS. Oh DH. 2009. Prediction of
Growth of Escherichia coli O157 : H7 in Lettuce Treated with Alkaline Electrolyzed
Water at Different Temperatures. J. Fd Hyg. Safety, 24(3):232-237.
Hanaoka K. Sun D. Lawrence R. Kamitani Y. Fernandes G. 2004. The mechanism of
the enhanced antioxidant effects against superoxide anion radicals of reduced
water produced by electrolysis. Biophys Chem, 107(1):71-82.
Hayakawa T. Tsuge H. 1999: Science and Technology of Functional Water. Water
Scienll cc Institute, 109-116.
Hayakawa T. Tsuge H. 1999: Basics and Effective Use of Alkaline Ionized Water.
25th General Assembly of Japan Medical Congress Functional Water in Medical
Treatment, Administration Offices, 10-11.
Hayashi H. Kawamura M. 1990. The concept of prehepatic medicines. Presentation
At The Eight Annual International Symposium On man And His Environment in
Health And Disease at The Grand Kempinski Hotel, Dalls, USA.
Lee KJ. Park SK. Kim JW. Kim GY. Ryang YS. Kim GH. Cho HC. Kim SK. Kim
HW. 2004. Anticancer Effect of Alkaline Reduced Water. Journal of International
Society of Life Information Science. 22(2):302-305.
Libudzisz Z. Kowal K. Żakowska Z.2008. Mikrobiologia techniczna. Tom 2. PWN
Warszawa, 128-143
Salmond CV. Kroll RG. Booth IR. 1984. The effect of food preservatives on pH homeostasis in Escherichia coli. J. Gen. Microbiol,130:2845–2850.
Shelef LA. 1994. Antimicrobial effects of lactates: a review. J. Food Prot,57:445–450.
Shirahata S. Kabayama S. Nakano M. Miura T. Kusumoto K. Gotoh M. Hayashi H.
Otsubo K. Morisawa S. Katakura Y. 1997. Electrolyzed-reduced water scavenges
active oxygen species and protects DNA from oxidative damage. Biochem Biophys
Res Commun. 234(1):269-74.
355
mgr inż. Małgorzata Łukasz, mgr Jerzy Świtalski
Katedra Mikrobiologii
mgr inż. Alaksandra Cetera mgr inż. Barbara Rusztowicz
Katedra Chemii i Fizyki
e-mail: [email protected], [email protected],
Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Wiesław Barabasz
Autorzy pragną podziękować prof. dr hab. inż. Wiesławowi Barabaszowi za
umożliwienie prowadzenia doświadczeń w Katedrze Mikrobiologii, dr inż. Markowi Ostafinowi – pomysłodawcy badań oraz mgr inż. Marcinowi Sinderze za
wkład włożony w przygotowanie i udostępnienie szczepu S. cerevisiae oraz opracowanie metodyki pomiarów spektrofotometrycznych.
356
Katarzyna Małek
Ilona Czyczyło-Mysza
Izabela Marcińska
Michał Dziurka
EPISTEME
14/2012
s.357-364
ISSN 1895-4421
MAPOWANIE QTL PLONU I ZAWARTOŚCI SACHAROZY W STRESIE
SUSZY U PSZENICY
QTL MAPPING OF THE YIELD AND SUCROSE CONTENT UNDER
DROUGHT STRESS IN WHEAT
Abstrakt. Współcześnie kwestią priorytetową dla rolnictwa jest pozyskiwanie nowych, bardziej wydajnych odmian, o dobrym plonowaniu nawet w warunkach suszy.
Powszechnie wiadomo, iż stres deficytu wody wpływa ujemnie na plon większości
gatunków roślin uprawnych,w tym pszenicy. W obecności czynnika stresowego,
w tym niedoboru wody, zarówno w liściach jak i w organach niefotosyntetyzujących,
może nastąpić gromadzenie się sacharozy i produktów jej rozkładu. Celem badań była
lokalizacja QTL plonu (ang. Quantitative Trait Loci) i zawartości sacharozy u pszenicy w warunkach niedoboru wody. Analizę QTL wykonano w populacji podwojonych
haploidów CSDH pszenicy. Zmapowano 9 QTL dla obu cech. Zlokalizowano 4 QTL
dla plonu na chromosomach: 7A (kontrola) i 4A, 7A, 2B (susza). Dla zawartości sacharozy w liściu flagowym zidentyfikowano 5 QTL na chromosomach: 5A, 7A, 2B
(kontrola) i 4A (susza).
Słowa kluczowe: plon, pszenica, QTL, sacharoza, susza
Summary. Nowadays, the priority for agriculture is to obtain new, more efficient
varieties with good yield even in the drought conditions. It is well known that water
deficit stress affects negatively on majority crop species’ yield, including wheat. In
the presence of stress factor, including water deficiency, in the leaves as well as in
the non-photosynthetic organs, may taking place the accumulation of sucrose and
its degradation products. The aim of this study was to localize the QTL (Quantitaive
Trait Loci) for yield and sucrose content in wheat under water deficit conditions. QTL
analysis was performed in CSDH doubled haploid lines population of wheat. Nine
QTL were mapped for both traits. Four of the yield QTLs were located on chromosomes 7A (control) and 4A 7A, 2B (drought). Five QTL for sucrose content in the flag
leaf were identified on chromosomes: 5A, 7A (control) and 4A (drought).
Key words: sucrose, yield, QTL, wheat, drought
357
WSTĘP
Pszenica zwyczajna jest jednym z najważniejszych gatunków zbóż uprawnych w gospodarce człowieka, a efektywność jej produkcji jest ściśle uzależniona od dostępności wody w glebie. Komórkowy deficyt H2O u roślin wywołany stresem suszy prowadzi do redukcji przyswajania węgla, związanej
w sposób fizjologiczny z zamykaniem się szparek liściowych, a biochemicznie przypisanej obniżeniu aktywności fotosyntetycznej, co nie pozostawia
bez zmian również gospodarki węglowodanowej [Chaves i in. 2002]. Pomimo redukcji asymilacji dwutlenku węgla w liściach traktowanych stresem
suszy, rośliny akumulują duże ilości węglowodanów rozpuszczalnych w wodzie, w tym sacharozę [Bartelsi Salamini 2001]. Cukry rozpuszczalne pełnią
funkcje osmolityczne utrzymując turgor komórek liści, zabezpieczając integralność błon oraz zapobiegając denaturacji białek [Bartels i Sunkar 2005].
Sacharoza uczestniczy nie tylko w odpowiedzi na stresy abiotyczne, ale służy
także jako składnik odżywczy i cząsteczka sygnałowa, modulująca aktywność szerokiego zakresu genów [Ciereszko 2002; Koch 2004]. Ze względu
na wysoki potencjał antyoksydacyjny sacharoza jest rozważana jako czynnik
wspomagający organizm roślinnyw przeciwdziałaniu szkodliwemu wpływowi wolnych rodników [Van den Ende i Valluru 2009]. Zmiany w środowisku
znajdują odzwierciedlenie we wzmożonej produkcji nie tylko sacharozy, ale
również produktów jej metabolizmu [Hare i in. 1998]. Przemiany metaboliczne sacharozy są ściśle związane z intensywnością przebiegu fotosyntezy
i oddychania oraz różnorodnych szlaków – metabolicznych i transportowych.
Susza wpływa negatywnie na procesy związane z asymilacją [Sharkey i Seeman 1989], co może prowadzić do braków w zaspokojeniu potrzeb rozwijających się ziaren [Schnyder 1993] i dużych strat w plonie. Wraz ze wzrostem
dehydratacji tkanek czynnych fotosyntetycznie rośnie również możliwość
trwałych uszkodzeń, a co za tym idzie znacznego obniżenia asymilacji węgla
[Kaiser 1984]. Skrobia stanowi na ogół >65% suchej masy ziarna pszenicy
[Duffus 1992], a stres suszy może znacznie obniżyć jej zawartość w plonie
[Ahmadi i Baker 2001]. Wypełnienie ziarna u pszenicy zależy od bieżącej
asymilacji oraz remobilizacji rezerw węglowodanowych, zarówno przed jak
i po kwitnieniu, pomiędzy pędem, liśćmi,a ziarnami w kłosie [Wardlaw i Willenbrink 1994].
W poszukiwaniu odpowiedzi na genetyczne uwarunkowanie zmian ilościowych,
zachodzących w niekorzystnych warunkach środowiska, w tym suszy, użytecznym narzędziem jest mapowanie loci cech ilościowych (ang. Quantitative Trait
Loci, QTL). Zostało ono wykorzystane do lokalizacji QTL plonu i zawartości
sacharozy na genomie pszenicy w warunkach niedoboru wody w glebie.
358
Mapowanie QTL plonu i zawartości sacharozy w stresie suszy u pszenicy...
MATERIAŁ I METODY
Materiał roślinny. Populacja CSDH, złożona z 94 linii podwojonych haploidów (ang. Doubled Haploid, DH), została wyprowadzona przez prof. Quarrie z mieszańca F1 krzyżówki Chinese Spring, formy modelowej pszenicy
jarej, często wykorzystywanej w badaniach polowychi laboratoryjnych, wykazującej tolerancję na suszę oraz SQ1 (o podwyższonej zawartości ABA)
[Quarrie i in. 2005].
Wielkość doświadczenia: (94 DH + 2 formy rodzicielskie) × 3 rośliny (roślina/wazon) × 2 traktowania (susza + kontrola) = 576 roślin
Metody. Zwernalizowane siewki 94 linii CSDH oraz 2 form rodzicielskich
umieszczonow wazonach (Ø15 cm, wys. 20 cm, siewka/wazon) wypełnionych mieszanką glebowąo składzie: ziemia ogrodnicza z substratem torfowym:piasek (v:v, 1:1). Wegetacja roślin przebiegała w otwartej hali wegetacyjnej, zabezpieczonej przed opadami, w warunkach zbliżonych do naturalnych,
przy długości dnia i temperaturze powietrza przypadających na okres wiosenno-jesienny (V-IX). W stadium krzewienia u roślin przeznaczonych do
traktowania suszą, zastosowano ostre ograniczenie nawadniania w celu uzyskania zawartości wody na poziomie 40% ppw (pojemność polowa wody),
i utrzymywano je przez okres4 tygodni. W dniu zakończenia suszy pobrano
liście flagowe pędów głównych do pomiaru zawartości sacharozy. Oceny
wielkości plonu dokonano po zakończeniu wegetacjii uzyskaniu pełnej dojrzałości roślin: określono suchą masę ziaren/roślinę (plon [g]). Zamrożony
materiał roślinny liści flagowych poddano liofilizacji przez 72h, a następnie
rozdrobniono w młynku kulowym (Retsch, Kroll, Niemcy). Pomiar zawartości sacharozy wykonano przy użyciu zmodyfikowanej metody Janeczko i in.
[2010], z wykorzystaniem chromatografu cieczowego (HPLC). Ekstrakcję
sacharozy prowadzono w 1 ml dejonizowanej wody destylowanej przez 1h
przy prędkości 50 obr·min.-1. Rozdział sacharozy prowadzono na kolumnie
Hamilton RCX-10 250×4.1 mm. Poszukiwanie QTL wykonano w oparciu
o mapę, o łącznej długości 3521,7 cM, opublikowaną przez Quarrie i in.
[2005] zawierającą 567 markerów: SSR, RFLP, AFLP, obejmujących genom
T. aestivum L.
Analizy statystyczne i QTL. Podstawowe statystyki obliczono przy użyciu
programu Excel 2007. Rozkład cechw populacji oraz korelacje pomiędzy
nimi sprawdzono za pomocą programu Statistica. Analizy QTL prowadzono
przy pomocy programu Windows QTLCartographer v. 2.5 software (Wang
i in. 2004) metodami: analizy regresji liniowej (Single Marker Analysis, SMA)
oraz złożonego mapowania interwałowego (Composite Interval Mapping,
CIM). Wartość krytyczną LOD wyznaczono na podstawie testu permutacji dla
1000 powtórzeń.
359
WYNIKI I DYSKUSJA
Populacja CSDH, jest bardzo dobrze scharakteryzowana genotypowo (około
450 zlokalizowanych markerów), a w wyniku wcześniejszych badań także
fenotypowo, ponadto dobrze poznane są obie formy rodzicielskie: Chinese
Spring i SQ1. Różnią się one znacznie wydajnością plonu w odpowiedzi na
suszę w warunkach polowych [Quarrie i in. 2005 i 2006; Habash i in. 2007],
co potwierdzają nasze badania (Tab. 1). Uzyskane wartości średnich dla plonu
i zawartości sacharozy w liściu flagowym dla roślin poddanych suszy i kontroli
są wartościami pośrednimi wobec wartości minimalnych i maksymalnych dla
populacji CSDH,a wartości odchyleń standardowych w populacji są wysokie,
co razem wskazuje na duże zróżnicowanie fenotypowe oraz genetyczne populacji i bogaty zestaw alleli form rodzicielskich (Tab. 1). Maksima i minima dla
plonu i zawartości sacharozy w liściu,w odniesieniu do wartości średnich dla
form rodzicielskich, wskazują na istnienie linii potomstwa zarówno ze zmniejszoną, jak i zwiększoną ekspresją fenotypową badanych cech.
Cecha
Plon [g]
Yld
Sacharoza
[µg·mg-1]
LfSucC
Populacja CSDH
Obiekt
Rodzice
Symbol
locus
CS
SQ1
Średnia
SD
Min.
Max.
Skośność
Kurtoza
K
3,38
2,80
3,05
0,79
0,40
4,82
-0,31
-0,02
S
1,63
1,66
1,43
0,47
0,24
2,77
0,19
0,15
K
112,3
91,5
73,9
15,5
20,8
123,5
0,42
0,51
S
106,6
77,2
78,2
27,2
17,6
174,7
0,68
0,86
Tab. 1. Średnie wartości badanych cech linii rodzicielskich i podwojonych haploidów (CSDH) oraz odchylenie standardowe (SD), minimum (min.), maksimum
(max.), skośność i kurtoza dla linii CSDH w warunkach stresu suszy (S) i kontrolnych
(K) oraz symbole ich loci. SD – odchylenie standardowe, K – kontrola, S – susza
Dane umieszczone w Tab. 1, a przede wszystkim wartości skośności i kurtozy mieszczące się w granicy od -1 do 1 wskazują, że rozkład badanych cech
był zbliżony do rozkładu normalnego, co dało podstawę do dalszej analizy
QTL. Wykazano dodatnią korelację (dane nie przedstawione) dla zawartości
sacharozy, co świadczy o tym, że susza wpływa na wzrost zawartości sacharozy, co jest zgodne z badaniami Ciereszko [1999].
Za pomocą złożonego mapowania interwałowego otrzymano łącznie 9 QTL
dla badanych zmiennych: 4 QTL dla plonu i 5 QTL dla zawartości sacharozy
(Tab. 2). Otrzymane QTL były zlokalizowane na chromosomach: 4A, 5A,
7A i 2B, na których zmapowano już wcześniej QTL dla plonu [Quarrie i in.
2005]. Uzyskane QTL charakteryzują się wysokimi wartościami współczyn360
nika R2 – od 9.2% do 21,2%, co świadczy o tym, że każdy z nich w istotny
sposób reguluje omawiane cechy. QTL zmapowane dla plonu tłumaczą odpowiednio 14,1% i 34,5% zmienności fenotypowej występującej w populacji
CSDH w warunkach kontrolnych i ostrego deficytu wody w glebie. Natomiast dla zawartości sacharozy zdefiniowane QTL wpływają odpowiednio
na 60,9% (K) i 13,2% (S) zróżnicowania populacji. Na poziom plonowania,
zarówno przy optymalnym poziomie nawodnienia jak i w warunkach stresu suszy, przeważający wpływ mają allele pochodzące od formy ojcowskiej
SQ1. W badaniach Quarrie i in. [2005] wykazano, że na chromosomie 7Au
pszenicy zlokalizowane są QTL istotne dla szeregu cech agronomicznych,
w tym plonowania. Jest to potwierdzeniem dla naszych badań, w wyniku
których otrzymano dla plonu QTL na chromosomie 7A – zarówno w kontroli
jak i w suszy. Na szczególną uwagę zasługuje fakt, że w warunkach kontrolnych to allel SQ1 podwyższa plon, natomiast dla suszy allelem podnoszącym
wartość tej cechy był allel pochodzący od rodzica tolerancyjnego, czyli CS.
Opisany powyżej wpływ alleli SQ1 i CS jest zbieżny z charakterystyką form
rodzicielskich: Chinese Spring wykazuje tolerancję na suszę, natomiast SQ1
odznacza się niższym plonowaniem w warunkach niedoboru wody w glebie
w porównaniu z CS [Quarriei in. 2005 i 2006; Habash i in. 2007], co byłoby
dodatkowym potwierdzeniem dla ważnej roli chromosomu 7A w plonowaniu
u pszenicy [Quarrie i in. 2005, 2006]. Obecność loci QTL plonu na chromosomie 7A stwierdzili w swoich badaniach także: Kumar i in. [2006] i Habash
i in. [2007].
Z użyciem SMA dodatkowo uzyskano 2 QTL na chromosomie 4A w pobliżu
markerów: gwm30.2-4 i gwm165.3 dla warunków kontrolnych plonu i zawartości sacharozy. Allel podwyższający poszczególne cechy jest tu odmienny
– dla plonu jest to allel SQ1, natomiast dla sacharozy – allel Chinese Spring, co
wskazuje na zróżnicowany wpływ tych alleli na badane cechy.
Ponadto, dla plonu i zawartości sacharozy w warunkach niedoboru wody zlokalizowano QTL na chromosomie 4A otrzymane metodą CIM, dla których podwyższającym wartość cechy jest allel CS, a jego wpływ na zawartość sacharozy w liściu
flagowym jest znaczny. Wspomniane QTL wpływają na warunkowane przez nich
cechy odpowiednio w 10,3%i 13,2%. QTL znaleziony w pobliżu markera m92p78.8
dla sacharozy w suszy jest istotny dla plonowania [Quarrie i in. 2005].
QTL związany z markerem wmc257, na chromosomie 2B, został wyznaczony dla wysokiej wartości ilorazu logarytmu wiarygodności (LOD=6,4)
i w dużym stopniu wpływa na zawartość sacharozy w warunkach dobrego
nawodnienia gleby (R2=21,2%). Wysoce pozytywny wpływ na zawartość sacharozy posiada tu allel Chinese Spring (a=8,035). Habash i in. [2007] przy użyciu metody analizy regresji liniowej na chromosomie 2B uzyskali aż 10 klastrów
(w tym 4 QTL potwierdzono metodą CIM) odpowiadających m.in. za: wysokość
361
Obiekt
Sacharoza
Plon
Cecha
rośliny, czas kwitnienia, zawartość białek rozpuszczalnych oraz barwę liścia,
dla których wspólnym mianownikiem jest wyżej wspomniany marker. Salem
i in. [2007] zmapowali3 QTL związane z remobilizacją rezerw cukrowych oraz
utrzymaniem rozmiaru ziarnaw warunkach działania na liść substancji chemicznej o właściwościach osuszających na chromosomach 2D, 5D i 7D.
QTL
Chromosom
Marker
Pozycja
LOD
R2
a
K
QYld.csdh*
7A
m51p65.7
132.8
3.8
14.1%
- 0.235
QYld.csdh*
2B
wmc360
141.9
4.5
15.0%
- 0.132
QYld.csdh*
4A
dupw004a
111.2
3.1
10.3%
- 0.110
QYld.csdh
7A
gwm635b
24.9
3.4
9.2%
0.179
QLfSucC.csdh
2B
m59p78.1
12
3.1
10.0%
- 5.476
QLfSucC.csdh
2B
wmc257
34
6.4
21.2%
8.035
QLfSucC.csdh
5A
vrn-A1
111
3.1
10.7%
- 4.443
QLfSucC.csdh
7A
wmc479
33
5.6
19.0%
5.963
QLfSucC.csdh
4A
m92p78.8
34
3.9
13.2%
8.755
S
K
S
Tab. 2. QTL zmapowane dla plonu i zawartości sacharozy z użyciem metody Composite Interval Mapping (CIM). LOD – iloraz logarytmu wiarygodności, R2 – współczynnik determinacji, a– efekt addytywny allela A (allela pochodzącego od rodzica
Chinese Spring, CS), * – QTL potwierdzone metodą Single Marker Analysis (SMA)
WNIOSKI
Populacja CSDH jest zróżnicowana pod względem plonowania i zawartości sacharozy w liściu flagowym, mierzonych po zastosowaniu suszy glebowej, co pozwala na mapowanie tych cech. Selekcja wybranych linii
o zwiększonych wartościach plonu czy zawartości sacharozy w stosunku
do form rodzicielskich jest więc możliwa. Zawartość sacharozy w liściach
pszenicy wzrasta w wyniku deficytu wody w glebie, a poziom jej akumulacji jest prawdopodobnie warunkowany genetycznie w sposób odmienny niż
dla plonowania. Ważnym obszarem na genomie pszenicy jest chromosom 7A
zawierający region, dla którego pozytywny wpływ na wartość plonu posiada
allel Chinese Spring, odmiany znanej z tolerancji na suszę. Prezentowane
wyniki stanowią efekt jednorocznego doświadczenia, dlatego też wymagają
poparcia w postaci kolejnych lat badań.
362
LITERATURA
Ahmadi A. Baker D.A. 2001. The effect of water stress on the activities of key regulatory enzymes of the sucrose to starch pathway in wheat. Plant Growth Regulation,
35: 81–91.
Bartels D. Salamini F. 2001. Desiccation tolerance in the resurrection plant Craterostigma plantagineum: A contribution to the study of drought tolerance at the
molecular level. Plant Physiol, 127(4): 1346-1353.
Bartels, D. Sunkar R. 2005. Drought and salt tolerance in plants. Crit. Rev. in Plant
Sci. 24(1): 241-36.
Chaves M. M. Pereira J.S. Maroco J. Rodrigues M.L. Ricardo C.P.P. Osório M.L.
Carvalho I. Faria T. Pinheiro C. 2002. How plants cope with water stress in the
field. Photosynthesis and growth. Annals of Botany, 89: 907–916.
Ciereszko I. 2002. Regulacyjna rola cukrów. Percepcja cukrów i przekazywanie sygnału w komórkach roślinnych. Post. Biol. Kom. 29: 269–289.
Ciereszko I. Farrar J.F. Rychter A.M. 1999. Compartmentation and fluxes of sugars in
roots of Phaseolus vulgaris under phosphate deficiency. Biol. Plant. 42: 223–231.
Duffus C. M. 1992. Control of starch biosynthesis in developing cereal grains. Bioch.
Soc. Tran. 20: 13–18.
Habash D. Z. Stephanie Bernard S. Schondelmaier J. Weyen J. Quarrie S.A. (2007):
The genetics of nitrogen use in hexaploid wheat: N utilisation, development and
yield. Theor Appl Genet. 114(3): 403-19.
Hare P. D. Cress A.W. van Staden J. 1998. Dissecting the roles of osmolyte accumulation during stress. Plant Cell Environ. 21: 535–553.
Janeczko A., Biesaga–Kościelniak J., Oklestkova J., Filek M., Dziurka M., Szarek-Łukaszewska G., Kościelniak J. 2010. 24-Epibrassinolide in wheat production:
physiological activity and uptake. Journal of Agronomy and Crop Science 196:
311-321.
Kaiser W. M.1984. Response of photosynthesis and dark-CO2-fixation to light, CO2
and temperature in leaf slices under osmotic stress. Journal of Experimental Botany, 35: 1145-1155.
Koch K. 2004. Sucrose metabolism: regulatory mechanisms and pivotal roles in sugar sensing and plant developmnent. Curr. Opin. Plant Biol. 7: 235–246.
Kumar N. Kulwal P.L. Balyan H. S. Gupta P.K. 2007. QTL mapping for yield contributing traits in two mapping populations of bread wheat. Molecular Breeding,
19(2): 163-177.
363
Quarrie S. A. Steed A. Calestani C. Semikhodskii A. Lebreton C. Chinoy C. Steele
N. Pljevljakusić D. Waterman E. Weyen J. et al. 2005. A high-density genetic map
of hexaploid wheat (Triticum aestivum L.) from the cross Chinese Spring × SQ1
and its use to compare QTLs for grain yield across a range of environments.
Theor Appl Genet. 110: 865-880.
Quarrie S. A. Pekic Quarrie S. Radosevic R. Rancic D. Kaminska A. Barnes J.D.
Leverington M. Ceoloni C. Dodig D. 2006. Dissecting a wheat QTL for yield
present in a range of environments: from the QTL to candidate genes. Journal of
Experimental Botany, 57: 2627-2637.
Salem K. F. M. Röder M.S. Börner A. 2007. Identification and mapping quantitative
trait loci for stem reserve mobilisation in wheat (Triticum aestivum L.). Cereal
Research Communications, 35: 1367–1374.
Schnyder H. 1993. The role of carbohydrate storage and redistribution in the sourcesink relations of wheat and barley during grain filling — a review. New Phytologist, 123: 233–245.
Sharkey T. D. Seeman 1.R. 1989. Mild water stress effects on carbon-reduction-cycle
intermediates, ribulose bis-phosphate carbohylase activity, and spatial homogenity in intact leaves. Plant Physiology, 89: 1060-1065.
Van den Ende W. Valluru R. 2009. Sucrose, sucrosyl oligosaccharides, and oxidative
stress: scavenging and salvaging? Journal of Experimental Botany, 60(1): 9-18.
Wang S. Basten C.J. and Zeng Z.B. 2007. Windows QTL Cartographer, new version,
Statistical Genetics. North Carolina State University.
Wardlaw I. F. Willenbrink J. 1994. Carbohydrate storage and mobilization by the
culm of wheat between heading and grain maturity: the relation to sucrose synthase and sucrose-phosphate synthase. Aust J Plant Physiol, 21:255–271
mgr Katarzyna Małek1, dr inż. Ilona Czyczyło-Mysza1,
dr hab. Izabela Marcińska1, dr. Michał Dziurka2
1
Zakład Biotechnologii, 2Zakład Biologii Rozwoju
Instytut Fizjologii Roślin im. F. Górskiego Polskiej Akademii Nauk
ul. Niezapominajek 21, 30-239 Kraków
Opiekun naukowy: dr. hab. Izabela Marcińska, prof. PAN
364
Rafał Ogórek
Katarzyna Kalinowska
Bartosz Kozak
EPISTEME
14/2012
s.365-372
ISSN 1895-4421
ZRÓŻNICOWANIE GENETYCZNE IZOLATÓW CANDIDA ALBICANS
ZA POMOCĄ MARKERÓW ITS
GENETIC DIVERSITY OF CANDIDA ALBICANS ISOLATES USING
ITS MARKERS
Abstrakt. Candida albicans jest wszechobecnym komensalem, jak również bardzo
ważnym, oportunistycznym patogenem ludzkim, powodującym infekcje skóry, błon
śluzowych czy paznokci. Mikroorganizm ten może wywołać ostre i przewlekłe grzybice inwazyjne. Są one bardzo groźne dla pacjentów z grup ryzyka np. osób z chorobami nowotworowymi lub osób po zabiegach chirurgicznych z cukrzycą bądź gruźlicą. Grupą pacjentów szczególnie predysponowaną do rozwinięcia zakażenia grzybiczego są chorzy na AIDS. W przypadku nie leczonych kandydoz głębokich może
dojść do zgonu chorego. Przeprowadzone badania miały na celu określenie genetycznego zróżnicowania izolatów C. albicans. Do analiz wybrano 22 izolaty uzyskane
od pacjentów z różnych miejsc chorobowo zmienionych. Do określenia zmienności
wykorzystano markery ITS. Produkty uzyskane po reakcji PCR, trawiono enzymem
restrykcyjnym Hinf I i rozdzielano je elektroforetycznie. Z przeprowadzonych badań
wynika, że analizowane izolaty wykazały zróżnicowanie profilu genetycznego.
Słowa kluczowe: zróżnicowanie genetyczne, Candida albicans, markery ITS
Summary. Candida albicans is both an ubiquitous commensal, as well as very important opportunistic human pathogen causing skin infections, mucous membrane infections or nail infections. This microorganism may cause acute and chronic invasive
fungal infections. It is very dangerous for patients from risk gropus, e.g. people with
cancer, people after surgeries, who suffer from diabetes or tuberculosis. Group of
patients particularly predisposed to the development of fungal infection are patients
with AIDS. The prognosis is poor and untreated, deep candidiasis may cause death.
The research was aimed to determine the genetic diversity of C. albicans isolates. 22
isolates selected for analysis, which were obtained from patients with different pathological changes. To determine the diversity used ITS markers. The product obtained
after PCR, digested with the restriction enzyme Hinf I and them were separated by
electrophoresis. The research showed that the analyzed isolates showed high genetic
diversity.
Key words: genetic diversity, Candida albicans, ITS markers
365
WSTĘP
Grzyby drożdżakowe z rodzaju Candida należą do typu workowców (Ascomycota). Są pospolitymi saprotrofami, które zasiedlają organizm człowieka
[Kasperska-Zając i Rogala 2002]. Szacuje się, że grzyby drożdakowe w tym
Candida albicans (C.P. Robin) Berkhout, występują u 10 do 40 % ludzi zdrowych. Zasiedlają one cały ich przewód pokarmowy, począwszy od jamy ustnej, aż do odbytnicy [Szczepaniak i in. 2004].
Obecnie znanych jest około 196 gatunków Candida spp., z tego 15 ma właściwości chorobotwórcze [Kostecka 2011]. Są one główną przyczyną kandydoz błon śluzowych, układu moczowego, płciowego i dróg oddechowych
u pacjentów z naturalnym lub wywołanym farmakologiczne niedoborem odporności [Krzyściak i in. 2011]. Spośród gatunków drożdżaków z tego rodzaju, najczęściej izolowanym i najbardziej patogenicznym dla człowieka jest
C. albicans, który może być przyczyną infekcji i alergii u ludzi oraz zwierząt
[Kasperska-Zając i Rogala 2002, Karkowska-Kuleta i in. 2009]. Szacuje się,
że jest on przyczyną 80% kandydoz przewodu pokarmowego [Szczepaniak
i in. 2004]. Natomiast pod względem uczuleniowym ustępuje grzybom
strzępkowym z rodzaju Cladosporium, Alternaria i Aspergillus [Kasperska-Zając i Rogala 2002, Karkowska-Kuleta i in. 2009].
W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat obserwuje się stały wzrost zakażeń grzybiczych powierzchownych i głębokich, które prowadzą często do zgonu [Gustem 1994, Pfaller 1996, Batura-Gabryel i Młynarczyk 1998]. Najczęstszym
czynnikiem etiologicznym w grzybicach są drożdżaki z rodzaju Candida,
a w szczególności gatunek C. albicans. Ryzyko rozwoju zakażeń grzybiczych
jest powiązane z kondycją fizjologiczną organizmu gospodarza, czyli jego
stanem zdrowia, wiekiem i sposobem odżywiania. Do innych czynników
zwiększających ryzyko kandydoz należą zabiegi inwazyjne, antybiotykoterapie oraz pierwotne i wtórne niedobory immunologiczne (AIDS, cukrzyca) [Nawrot i Karpiewska 2002]. W ostatnich latach, istotny jest szczególnie
problem zwiększenia ilości spożywanych antybiotyków. ESAC (European Surveillance of Antibiotic Consumption) donosi, że Polska znajduje się
w pierwszej dziesiątce krajów europejskich pod względem ilości spożywanych antybiotyków na jednego mieszkańca. W Polsce na 1000 osób, 25
zażywa antybiotyki codziennie, a w okresie jesienno-zimowym nawet 100
[Kostecka 2011]. Powszechne stosowanie antybiotykoterapii zabija bakterie
pasożytnicze oraz masowo niszczy pożyteczną florę bakteryjną przewodu
pokarmowego. Zmiany te prowadzą także do wtórnych niedoborów witaminowych, które mają również wpływ na odporność przed zakażeniami grzybiczymi [Isenberg i in. 1960, Pappas i in. 2003]. Potwierdzają to doniesienia
Campbell i Saslaw [1949], których wyniki badań klinicznych wykazały rozwój grzybic pod wpływem stosowanej streptomycyny.
366
Zróżnicowanie genetyczne izolatów Candida Albicans...
Trudności związane z patogenicznością C. albicans mogą być spowodowane
zmiennością fenotypową i genotypową tego patogena, która objawiają się
m.in. różną zdolnością adhezji komórek drożdżaka do komórek nabłonka
i śródbłonka gospodarza oraz różną produkcją pozakomórkowych enzymów
[Odds i in. 1983, Nawrot i Karpiewska 2002].
Do oceny zróżnicowania genetycznego grzybów można wykorzystać technikę
PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction -Restriction Fragment Length Polymorphism) [Godoy i in. 2004]. Jest to metoda w której produkty uzyskane
w reakcji amplifikacji (PCR) poddaje się trawieniu enzymami restrykcyjnymi.
Celem badań było określenie zróżnicowania genetycznego izolatów C. albicans, wyizolowanych z chorobowo zmienionych miejsc u pacjentów z wykorzystaniem techniki PCR-RFLP.
MATERIAŁ I METODY
Do badań użyto 22 izolaty Candida albicans, które pochodziły z chorobowo zmienionych miejsc u pacjentów – Tab. 1. Pochodziły one z kolekcji Katedry i Kliniki
Dermatologii, Wenerologii i Alergologii, Akademii Medycznej we Wrocławiu.
DNA do analiz molekularnych wyizolowano z koloni wyrosłych na podłożu
Sabourauda. Kolonie zbierano ezą do 1,5 ml probówek Eppendorf i izolowano według metody Doyle i Doyle [1987], zmodyfikowanej przez Kozaka i in.
. Ilość i jakość wyizolowanego materiału sprawdzano spektrofotometrycznie
(długości fali: 260, 280, 230 nm). Do dalszych analiz przygotowano roztwory robocze o stężeniu DNA 30 ngx ml-1. Reakcje PCR przeprowadzano
w termocyklerze firmy Biometria. Mieszanina reakcyjna miała skład: 5,9 ml
H2O, 1,5 ml buforu x 10 (Fermentas), 2,5 ml MgCl2 (25 mM, Fermentas),
1 ml dNTP (10 mM każdy, mix, Fermentas), 1,1 ml startera Forward (F)
i Reverse (R), 0,2 ml polimerazy (5ux ml-1, Fermentas), genomowe DNA (30
ngx ml-1). Do analiz użyto dwóch kombinacji starterów ITS1: F 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’, R 5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’
oraz ITS2: F 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’, R 5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’. Reakcję PCR przeprowadzono w 40 cyklach i składała się
z następujących etapów: wstępna denaturacja 95°C przez 5 min, denaturacja
95°C przez 1 min, przyłączanie starterów 55°C przez 30 sek., amplifikacja
72°C przez 30 sek., końcowa amplifikacja 72°C przez 10 min. Produkty po
PCR trawione były przy użyciu enzymu Hinf I w roztworze o składzie: 9 ml
H2O, 1 ml bufor R (Fermentas), 1 ml Hinf I (Fermentas), 5 ml produkt po
amplifikacji. Trawienie prowadzone było przez 16 godzin w 37 °C, po tym
czasie enzym był dezaktywowany przez 5 min inkubację w 75 °C.
367
Po trawieniu otrzymane produkty rozdzielono z użyciem elektroforezy kapilarnej na urządzeniu Qiaxel (Qiagen). Po analizie elektroforogramów
utworzona została binarna macierz przy użyciu oprogramowania urządzenia
Qiaxel, którą analizowano w programie NTSYSpc [Rohlf 1990]. Do stworzenia macierzy dystansu genetycznego wykorzystano algorytm Nei [1972].
Dendrogram utworzono przy wykorzystaniu metody UPGMA.
WYNIKI
Analiza matrycy binarnej, utworzonej na podstawie elektoforogramów uzyskanych w rozdziale produktów trawienia enzymem Hinf I, pozwoliła na
wykrycie 6 polimorficznych prążków. Na tej podstawie utworzono macierz
dystansu genetycznego oraz dendrogram zróżnicowania genetycznego w badanym materiale (Rys. 1).
Rys. 1. Dendrogram UPGMA obrazujący dystans genetyczne pomiędzy badanymi
izolatami C. albicans
Utworzona macierz dystansu genetycznego i dendrogram zróżnicowania genetycznego, podzieliły badane izolaty na dwie grupy (I i II) i w każdej z nich
wyróżniona trzy podgrupy (A, B i C) – obrazują to Tab. 1 i Rys. 1.
Izolaty C. albicans z grupy I można uznać za plejotropowe, pojawiają się
one na tkankach zewnętrznych i wewnętrznych, natomiast izolaty z grupy
II występują tylko w tkankach wewnętrznych. Jednakże izolaty należące do
obu grup, występowały na narządach rozrodczych – Tab. 1.
368
L.p.
Nazwa szczepu
Symbol
1
AM 1418 / 2011
A–1
2
AM 1481 / 2011
A–2
3
AM 1285 / 2011
A–3
4
AM 1235 / 2011
A–4
5
AM 1548 / 2011
A–5
6
AM 1185 / 2011
A–6
7
AM 900 / 2011
A –7
8
AM 90028 / 2011
A–8
9
AM 09 / 2011
A–9
10
AM 96 / 2011
A – 10
11
AM 10231 / 2011
A – 11
12
AM 08 / 2011
B–1
Miejsce izolacji
paznokcie rąk
przestrzeń międzypalcowa stóp
paznokcie rąk
jama ustna
paznokcie rąk
żołądź
jama ustna
Grupa
IA
IA
IA
IA
IA
IB
II A
IA
IA
IA
II A
II A
13
AM 53 / 2011
B–2
pachwiny
IC
14
AM 73 / 2011
B–3
paznokcie stóp
IA
15
AM 70 / 2011
B–4
pochwa
II B
16
AM 1066 / 2011
B–5
jama ustna
IA
17
AM 103 / 2011
B–6
paznokcie stóp
IA
18
AM 325 / 2011
B–7
jama ustna
II C
19
AM 1444 / 2011
B–8
20
AM 1768 / 2011
B–9
21
AM 06 / 2011
B – 10
22
AM 02 / 2011
B – 11
pochwa
jama ustna
IC
IC
IC
IC
Tab. 3. Zestawienie badanych izolatów C. albicans z podziałem na grupy uzyskane
po analizie zmienności genetycznej
DYSKUSJA
We współczesnej medycynie metody identyfikacji grzybów izolowanych
z chorobowo zmienionych miejsc do gatunku oraz ocena ich zmienności genetycznej, stały się bardzo ważnym elementem prowadzącym do skutecznej
terapii. Za jedną z najlepszych metod uważana jest analiza sekwencji reprezentatywnych fragmentów genomu drobnoustroju, ale stosowanie tej metody ogranicza się głównie do laboratoriów referencyjnych. Znacznie tańszą
i prostszą metodą jest analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) produktów reakcji PCR [Chen i in. 2001, Iwen i in. 2002,
Mecler i Nawrot 2008].
369
Wyniki uzyskane za pomocą technika PCR-RFLP są specyficzne gatunkowo
dla grzybów oraz pozwala jednocześnie na ocenę ich zmienności genetycznej [Nawrot i in. 2011]. Przydatność tej metody do oceny zmienności genetycznej grzybów, potwierdziły wyniki przeprowadzonych badań z izolatami
C. albicans. Metoda ta pozwoliła na ocenę zmienności genetycznej w obrębie badanych izolatów, poprzez utworzenie macierzy dystansu genetycznego
oraz dendrogramu zróżnicowania genetycznego w badanym materiale.
Polimorfizm uzyskany przy wykorzystaniu metody RFLP-PCR nie odbiegał
od tego uzyskanego przez innych autorów za pomocą technik RAPD oraz
RFLP [Boerlin i in. 1996, Espinel-Ingroff i in. 1999].
WNIOSKI
• Technika RFLP-PCR jest skuteczną metodą oceny zróżnicowania genetycznego grzybów w obrębie gatunku C. albicans.
• Wyniki badań genetycznych wykazały zróżnicowanie izalotów C. albicans w zależności od miejsca ich izolacji.
• Najsłabiej zróżnicowane pod względem genetycznym są izolaty uzyskane z powierzchniowo zmienionych części ciała.
LITERATURA
Batura-Gabryel H., Młynarczyk W. 1998. Uwaga grzybice narządowe atakują. Mikologia Lekarska, 5(1): 21–24.
Boerlin P., Boerlin-Petzold F., Goudet J., Durussel C., Pagani J.L., Chave J.P., Bille
J. 1996. Typing Candida albicans oral isolates from human immunodeficiency
virusinfected patients by multilocus enzyme electrophoresis and DNA fingerprinting. Journal of Clinical Microbiology, 34:1 235 – 1248.
Campbell C.C., Saslaw S. 1949. Enhancement of growth of certain fungi by streptomycin. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 70:
562 – 563.
Chen Y., Eisner J.D., Kattar M.M., Rassoulian-Barrett S.L., Lafe K., Bui U., Limaye
A.P., Cookson B.T. 2001. Polymorphic internal transcribed spacer region 1 DNA
sequences identify medically important yeasts. Journal of Clinical Microbiology,
39: 4042 – 4051.
Doyle J.J., Doyle J.L. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of
fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, 19(1): 11 – 15.
370
Espinel-Ingroff A., Vazquez J.A., Boikov D., Pfaller M. A. 1999. Evaluation of DNAbased typing procedures for strain categorization of Candida spp. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 33: 231 – 239.
Godoy P., Cano J., Gené J., Guarro J., Höfling-Lima A.L.,Colombo A.L. 2004. Genotyping of 44 Isolates of Fusarium solani, the Main Agent of Fungal Keratitis in
Brazil. Journal of Clinical Microbiology, 42(10): 4494 – 4497.
Gustem J.V. 1994. Prophylaxis of Candida and Aspergillus infection with oral administration of itraconazole. Mycoses, 37: 243 – 248.
Isenberg H.D., Pisano M.A., Carito S. 1960. Factors leading to overt monilial disease. Preliminary studies of the ecological relationship between Candida albicans and intestinal bacterial. Antibiotics&Chemotherapy, 10: 353 –356.
Iwen P.C., Hinrichs S.H., Rupp M.E. 2002. Utilization of the internal transcribed
spacer regions as molecular targets to detect and identify human fungal pathogens. Medical Mycology, 40: 87 – 109.
Karkowska-Kuleta J., Rapala-Kozik M., Kozik A. 2009. Fungi pathogenic to humans: molecular bases of virulence of Candida albicans, Cryptococcus neoformans and Aspergillus fumigatus. Acta Biochimica Polonica, 56 (2): 211 – 224.
Kasperska-Zając A., Rogala E. 2002. Candida albicans – czynnik przyczynowy chorób allergicznych. Alergia Astma Immunologia, 7(4): 170 – 173.
Kostecka M. 2011. Kandydoza przewodu pokarmowego u osób leczonych antybiotykami – profilaktyczne stosowanie suplementów diety. Mikologia Lekarska, 18(1):
11 – 14.
Krzyściak P., Skóra M., Macura A.B.: Atlas grzybów chorobotwórczych człowieka.
MedPharm Polska, 148–153.
Mecler I., Nawrot U. 2008. Metody molekularne stosowane w identyfikacji grzybów z
rodzaju Candida. Mikologia Lekarska, 15: 99 – 103.
Nawrot U., Czmajduch N., Gościniak G. 2011. Identyfikacja grzybów z rodzaju Candida na podstawie analizy polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych rybosomalnego DNA. Mikologia Lekarska, 18(4): 192 – 196.
Nawrot U., Karpiewska A. 2002. Patogeneza zakażeń wywołanych przez Candida
albicans. Mikologia Lekarska, 9(3): 137 – 143.
Nei M. 1972. Genetic distance between populations. The American Naturalist,
106(28): 3 – 29.
Odds F.C., Abbot A.B., Stiller R.L., Scholer H.J., Polak A., Stevens D.A. 1983. Analysis of Candida albicans phenotypes from different geographical and anatomical
sources. Journal of Clinical Microbiology, 18: 554–557.
371
Pappas P.G., Rex J.H., Lee J. 2003. Mycoses Study Group. A prospective observational study of candidemia: epidemiology, therapy and influences on mortality in hospitalized adult and pediatric patients. Clinical Infectious Diseases, 37: 634 – 643.
Pfaller M. 1996. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservois and modes
transmission. Clinical Infectious Diseases, 22(2): 89 – 94.
Rohlf F. J. 1990. NTSYS-pc. Numerical taxonomy and multivariate analysis system.
ver. 2.02. Exeter software, Setauket, New York.
Szczepaniak W., Zawirska A., Adamski Z., 2004. Rola grzybów drożdżopodobnych
rodzaju Candida w etiopatogenezie wybranych schorzeń przewodu pokarmowego. Nowiny Lekarskie, 73(6): 475 – 478.
mgr inż. Bartosz Kozak
Zakład Genetyki i Biotechnologii Roślin
mgr inż. Rafał Ogórek
Zakład Fitopatologii i Mikologii
Katedra Ochrony Roślin
mgr inż. Katarzyna Kalinowska
Katedra i Klinika Dermatologii, Wenerologii i Alergologii
Akademia Medyczna we Wrocławiu
Wybrzeże L. Pasteura 1, 50-367 Wrocław
Opiekun naukowy: prof. dr hab. Ewa Sawicka - Sienkiewicz, dr hab. Elżbieta
Pląskowska, prof. dr hab. Eugeniusz Baran
372
Hubert Okła
Jan Słodki
Krzysztof P. Jasik
EPISTEME
14/2012
s.373-379
ISSN 1895-4421
ZAKAŻENIE KLESZCZY IXODES RICINUS TYPOWYMI
PATOGENAMI NA TERENIE WYBRANYCH SIEDLISK
WOJEWÓDZTWA ŚLĄSKIEGO
INFECTION OF IXODES RICINUS TICKS WITH TYPICAL
PATHOGENS FROM SELECTED REGIONS OF THE
SILESIAN VOIVODSHIP
Abstrakt. Kleszcze są wektorami wielu drobnoustrojów chorobotwórczych, które
przekazywane są żywicielom podczas żerowania. Celem pracy było określenie stopnia zakażenia kleszczy z terenów województwa śląskiego czynnikami etiologicznymi
boreliozy, anaplazmozy i babeszjozy. Na 78 przebadanych kleszczy 84,9% było zainfekowanych Borrelia burgdorferi s.l., 24,4% Anaplasma phagocytophilum a 1,3%
Babesia spp. Ponadto 23,1% kleszczy wykazywało koinfekcję B. burgdorferi s.l.
i A. phagocytophilum a 1,3% koinfekcję B. burgdorferi s.l. i Babesia spp. Kleszcze
I. ricinus na terenie województwa śląskiego są zakażone drobnoustrojami chorobotwórczymi.
Słowa kluczowe: Ixodes ricinus, choroby odkleszczowe, PCR
Summary: Ticks are vectors of various pathogens which are transmitted to hosts
during feeding. The aim of this study was to verify the frequency of ticks infections
with Borrelia burgdorferi s.l., Anaplasma phagocytophilum and Babesia spp. from
selected regions of the Silesian voivodship. Among the 78 analysed ticks, 84,9% were
infected with B. burgdorferi s.l., 24,4% -A. phagocytophilum and 1,3% - Babesia
spp. Furthermore, in 23,1% of all cases the coinfection of B. burgdorferi s.l. with
A. phagocytophilum and in 1,3% - B. burgdorferi s.l. with Babesia spp. was found.
Ixodes ricinus ticks from selected regions of Silesia are infected with pathogenic microorganisms.
Key words: Ixodes ricinus, tick-borne diseases, PCR
373
WSTĘP
Kleszcze Ixodes ricinus są najbardziej rozpowszechnionym gatunkiem kleszczy twardych (Ixodidae) w Polsce [Stańczak 2006]. Bytują głównie w lasach liściastych i mieszanych, łąkach śródleśnych oraz pastwiskach. Podczas
szczytów swojej aktywności głodne osobniki skupiają się w wilgotnych trawiastych miejscach, gdzie atakują niemal wszystkie kręgowce, w tym człowieka. Ich ukąszenia są źródłem zakażeń drobnoustrojami wywołującymi
infekcje czasem o niespecyficznym, często ciężkim przebiegu. Tym samym,
kleszcze należą do jednych z najważniejszych stawonogów z punktu widzenia medyczno-weterynaryjnego [Skotarczak 2006]. Do typowych patogenów
wywołujących choroby odkleszczowe należą: Borrelia burgdorferi sensu
lato, Anaplasma phagocytophilum, Babesia spp. i wirus kleszczowego zapalenia mózgu [Stańczak 2006].
Celem pracy była ocena stopnia zakażenia kleszczy I. ricinus w wybranych
siedliskach województwa śląskiego typowymi patogenami: B. burgdorferi
s.l., A. phagocytophilum i Babesia spp.
MATERIAŁY I METODY
Materiał badany stanowiło 78 kleszczy I. ricinus zebranych metodą flagową
w okresie wiosennego szczytu aktywności tego gatunku (od marca do czerwca 2010 roku) w Raciborzu w województwie śląskim.
Ekstrakcję DNA z zebranych kleszczy przeprowadzono przy użyciu zestawu
odczynników DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie
z protokołem dostarczonym przez producenta.
Kolejny etap stanowiła analiza molekularna polegająca na wykryciu w otrzymanych ekstraktach materiału genetycznego B. burgdorferi s.l., A. phagocytophilum, Babesia spp. Do tego celu wykorzystano komercyjne zestawy diagnostyczne: PCR Borrelia – PK17, PCR Anaplasma – PK24 i PCR Babesia
– PK25 (DNA Gdańsk, Polska). Wykrycie badanych mikroorganizmów opierało się na amplifikacji odpowiednich fragmentów genów: fla dla krętków
Borrelia, 16S rDNA dla A. phagocytophilum i 18S rDNA dla Babesia spp.
W skład mieszanin reakcyjnych PCR wchodziły: Master Mix, mieszanina nukleotydów dNTPs (8 mM), termostabilna polimeraza DNA Hypernova oraz
matryca DNA. W przypadku PCR Anaplasma wykorzystano termostabilną
polimerazę Delta 3. Reakcje amplifikacji przeprowadzono w termocyklerze
Personal Cycler (Biometra, Goettingen, Niemcy) w warunkach termicznych
przedstawionych w Tab. 1.
374
Zakażenie kleszczy Ixodes Ricinus typowymi patogenami...
Temperatura
Czas
Temperatura
Czas
PCR Babesia
Czas
PCR Anaplasma
Temperatura
PCR Borrelia
Denaturacja początkowa
93oC
2 min.
94oC
5 min.
94oC
2 min.
Denaturacja*
o
93 C
30 sek.
o
94 C
30 sek.
o
94 C
45 sek.
Przyłączanie starterów*
o
52 C
1 min.
o
56 C
30 sek.
o
48 C
45 sek.
Wydłużanie łańcucha DNA*
72oC
1 min.
72oC
30 sek.
72oC
45 sek.
Końcowe wydłużanie
72oC
1 min.
72oC
5 min.
72oC
5 min.
Etap
Tab. 1. Warunki termiczne PCR Borrelia, PCR Anaplasma i PCR Babesia. * Etapy:
denaturacja, przyłączanie starterów i wydłużanie łańcucha DNA powtórzone 35 razy
(Anaplasma) lub 40 razy (Borrelia, Babesia)
Produkty reakcji PCR w kolejnym etapie zostały rozdzielone za pomocą
elektroforezy w 1,5% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) przy napięciu ok. 120 V. Elektroforegramy
przeanalizowano w transluminatorze UV (Biometra, Goettingen, Niemcy)
i zarchiwizowano przy użyciu oprogramowania UVI-Doc (UVItec, Cambridge, Wielka Brytania). Oczekiwany rozmiar produktów amplifikacji dla krętków B. burgdorferi s.l. wynosił 442 pary zasad (pz), dla A. phagocytophilum
– 227 pz a dla Babesia spp. – 560 pz.
Rys. 1a. Elektroforegram przedstawiający wynik reakcji PCR Borrelia
(ścieżka 1 – kontrola negatywna, ścieżka 2 – marker wielkości M100-500,
ścieżka 3 – kontrola pozytywna, ścieżki 4, 5, 6, 7, 8, 9 – próbki badane - pozytywne)
375
WYNIKI
Badania przeprowadzono na populacji liczącej 78 kleszczy I. ricinus. Wśród
nich było 61 samic (78,2%) i 17 larw (21,8%). Analiza molekularna wykazała infekcje wielu kleszczy czynnikami etiologicznymi boreliozy, anaplazmozy i babeszjozy. W próbkach pozytywnych obserwowano występowanie
odpowiedniej długości amplimerów (Rys. 1a, 1b, 1c ).
Rys. 1b. Elektroforegram przedstawiający wynik reakcji PCR Anaplasma (ścieżka
1 –kontrola negatywna, ścieżka 2 – marker wielkości M100-500, ścieżka 4 – kontrola pozytywna, ścieżki 3, 5, 6, 8 – próbki badane – pozytywne, ścieżki 7, 9 – próbki
badane - negatywne)
Rys. 1c. Elektroforegram przedstawiający wynik reakcji PCR Babesia (ścieżka
1 – kontrola negatywna, ścieżka 2 - marker wielkości M100-1000, ścieżka 3 – kontrola pozytywna, ścieżki 4, 5, 6, 7, 8, 10 – próbki badane - negatywne, ścieżka
9 – próbka badana - pozytywna)
Najwięcej kleszczy było zainfekowanych krętkami z kompleksu B. burgdorferi
s.l. – 66 osobników (84,6%), w tym 53 samice (86,9%) i 13 larw (76,5%). Druga
pod względem częstości występowania była A. phagocytophilum. Tą bakterią
było zakażonych 19 kleszczy (24,4%), w tym 10 samic (16,4%) i 9 larw (52,9%).
Badania w kierunku Babesia spp. wykazały obecność tego pierwotniaka u jednej samicy (1,3%). Ponadto zaobserwowano zjawisko koinfekcji. 18 kleszczy
(23,1%), w tym 9 samic (14,8%) i 9 larw (52,9%) było jednocześnie zainfekowanych B. burgdorferi s.l. i A. phagocytophilum. U jednej samicy (1,3%) stwierdzono współistnienie zakażenia B. burgdorferi s.l. i Babesia spp..
376
DYSKUSJA I WNIOSKI
Choroby odkleszczowe stały się w ostatnich latach dużym problemem epidemiologicznym [Skotarczak 2006]. Kleszcze stanowią zagrożenie nie tylko na
terenach leśnych, ale także w parkach i na terenach rekreacyjnych w miastach
[Słodki i in. 2011].
Czynnikiem etiologicznym boreliozy (choroby z Lyme) są Gram-ujemne bakterie z rodziny Spirochaetaceae [Skotarczak 2006, Strzelczyk i in.
2006]. W 1996 roku w Polsce wprowadzono obowiązek zgłaszania zachorowań na boreliozę. Od tego czasu zaobserwowano 13-krotny wzrost liczby
zachorowań [Meldunki o zachorowaniach na choroby zakaźne, zakażeniach
i zatruciach w Polsce 1996-2011, Paulo 2010]. Stopień zakażenia kleszczy
jest zróżnicowany w różnych regionach Polski. Z analizy mapek terenów
endemicznych występowania boreliozy tworzonych przez Zakład Epidemiologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego – Państwowego Zakładu
Higieny w Warszawie wynika, że na przestrzeni lat obszar występowania
tej choroby przesuwa się z północno-wschodniej części Polski w głąb kraju
[Paulo 2010].
W latach 2001–2003 Strzelczyk i in. [2006] przeprowadzili badania kleszczy
na terenach rekreacyjnych w okolicach Zabrza i Tarnowskich Gór. Wykazali
oni, że 14,2% osobników I. ricinus jest zainfekowanych krętkami z kompleksu B. burgdorferi s.l. Porównując odsetki zakażeń na przestrzeni lat zaobserwowali oni spadek infekcji kleszczy. We wcześniejszych badaniach Petko
[2002] wykazał, że stopień zakażenia kleszczy krętkami Borrelia waha się
w przedziale 4% - 15%.
Anaplasma phagocytophilum jest czynnikiem etiologicznym anaplazmozy
zwierząt (AGA - animal granulocytic anaplasmosis) i ludzi (HGA - human
granulocytic anaplasmosis) [Rymaszewska i Grenda 2008]. Wyniki badań
przeprowadzonych w okolicach Białegostoku pokazują, że 14,5% zebranych kleszczy było nosicielami A. phagocytophilum [Grzeszczuk 2006]. Dla
porównania, w Wielkopolsce odsetek zakażeń wynosił 22,7% wśród samic
i 9,1% wśród samców kleszczy [Michalik i in. 2009].
Kleszcze są nosicielami nie tylko bakterii, ale także pierwotniaków z rodzaju Babesia. Skotarczak i Sawczuk [2003] analizowali obecność B. microti
w różnych stadiach rozwojowych I. ricinus. Na Pomorzu 10,9% samic
i 9,9% samców kleszczy było nosicielami tego patogenu. Podobne badania
przeprowadzone rok później wykazały wzrost odsetku zakażonych osobników (11,9% samic i 13,4% samców). Dodatkowo zostało udowodnione, że
kleszcze mogą być nosicielami więcej niż jednego patogenu. Wójcik-Fatla
i in. [2009] przedstawili dane, z których wynika, że u 2,16% przebadanych
kleszczy występują koinfekcje. Najczęściej wykrywali współzakażenie
377
A. phagocytophilum i B. microti (1,05%) a najrzadziej B. burgdorferi s.l. i B.
microti (0,12%). Koinfekcja B. burgdorferi s.l. i A. phagocytophilum występowała w 0,93% przypadków. Ponadto w jednym przypadku wykazali infekcję kleszcza trzema patogenami.
Na terenie Polski obserwuje się zróżnicowany stopień zakażeń B. burgdorferi
s.l., A. phagocytophilum i Babesia spp. wśród kleszczy. W regionach endemicznych o wysokiej ekstensywności zakażeń odsetki osobników będących
nosicielami patogenów sięgają nawet kilkudziesięciu procent [Stańczak 2006].
Podsumowując, kleszcze I. ricinus na terenie województwa śląskiego są zakażone drobnoustrojami chorobotwórczymi: B. burgdorferi s.l., A. phagocytophilum i Babesia spp.. Ponadto część z nich jest nosicielami więcej niż
jednego patogenu.
LITERATURA
Grzeszczuk A. 2006. Anaplasma phagocytophilum in Ixodes ricinus ticks and human
granulocytic anaplasmosis seroprevalence among forestry rangers in Białystok
region. Advances in Medical Science, 51: 283-286.
Meldunki o zachorowaniach na choroby zakaźne, zakażeniach i zatruciach w Polsce 19962011. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny w Warszawie. http://www.pzh.gov.pl/oldpage/epimeld/2011/index_mp.html.
Michalik J. Stańczak J. Racewicz M. Cieniuch S. Sikora B. Szubert-Kruszyńska A.
Grochowalska R. 2009. Molecular evidence of Anaplasma phagocytophilum infection in wild cervids and feeding Ixodes ricinus ticks from west-central Poland.
Clinical Microbiology and Infection, 15(2): 81-83.
Paulo M. 2010. Kleszcze: oferta na lato 2010. Medycyna Praktyczna. http://infekcje.
mp.pl/ publicystyka/show.html?id=53240.
Petko B. 2002. Lyme borreliosis in carpathian region of central Europe – ecological
aspect of diagnostics. W: Buczek A. Błaszak C. red. Stawonogi w medycynie.
Liber. Lublin.
Rymaszewska A. Grenda S. 2008. Bacteria of the genus Anaplasma – characteristics of
Anaplasma and their vectors: a review. Veterinarni Medicina, 53(11): 573–584.
Skotarczak B. 2006. Biologia molekularna patogenów przenoszonych przez kleszcze.
PZWL. Szczecin.
Skotarczak B. Sawczuk M. 2003. Occurrence of Babesia microti in ticks Ixodes
ricinus on selected areas of western Pomerania. Wiadomości Parazytologiczne,
49(3): 273-280.
378
Słodki J. Jasik KP. Kępa M. Idzik D. Wojtyczka RD. 2011. Tick-transmitted diseases
caused by Apicomplexa. Acta Protozoologica, 50: 155–161.
Stańczak J. 2006. Kleszcze (Acari, Ixodidae) jako przenosiciele patogenów rozwijajacych się chorób infekcyjnych i inwazyjnych („emerging infectious diseases”) na terenie Polski. Rozprawa habilitacyjna. Akademia Medyczna
w Gdańsku
Strzelczyk JK. Wilczkowski A. Spausta G. Ciarkowska J. Zalewska-Ziob M. Izdebska-Straszak G. Strzelczyk J. Kasperczyk J. 2006. Obecność krętków Borrelia
burgdorferi sensu lato u kleszczy Ixodes ricinus na terenach rekreacyjnych okolic
Tarnowskich Gór i Zabrza w latach 2001-2003. Przegląd Epidemiologiczny, 60:
589-595.
Wójcik-Fatla A. Szymańska J. Wdowiak L. Buczek A. Dutkiewicz J. 2009. Coincidence of
three pathogens (Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma phagocytophilum and Babesia microti) in Ixodes ricinus ticks in the Lublin macroregion. Annals of Agricultural
and Environmental Medicine, 16(1): 151-158.
mgr Hubert Okła, mgr Jan Słodki, dr hab. Krzysztof P. Jasik
Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
ul. Jagiellońska 4, 41-200 Sosnowiec
e-mail: [email protected].
Opiekun naukowy: dr hab. n. biol. Krzysztof Jasik
379
Katarzyna Pisarska
Mariusz Adamski
EPISTEME
14/2012
s.381-388
ISSN 1895-4421
OCENA WPŁYWU ENDOFITYCZNEGO METHYLOBACTERIUM
EXTORQUENS NA WYBRANE CECHY KUKURYDZY (ZEA MAYS L.)
INFLUENCE OF ENDOPHYTIC METHYLOBACTERIUM EXTORQUENS ON SOME MAIZE FEATURES (ZEA MAYS L.)
Abstrakt. W pracy badano wpływ dwóch endofitycznych izolatów Methylobacterium
extorquens wyizolowanych z tkanek liści kukurydzy odmiany Król na wybrane cechy.
Określono zdolność szczepów do wzrostu w obecności wybranych związków fenolowych, obecność genu nifH oraz zdolność do ograniczania wzrostu fitopatogenów
in vitro. Badane izolaty nie miały zdolności do wykorzystywania związków fenolowych jako jedynego źródła węgla i energii. Oba izolaty posiadały gen nifH. Jedynie
izolat A5 ograniczał wzrost Fusarium graminearum IOR 1970 in vitro. Inokulacja
nasion izolatem A5 wpłynęła istotnie hamująco na długość korzenia oraz zawartość
suchej masy korzenia i epikotylu odmiany KB1902, na zawartość suchej masy korzenia odmian KB1903, Król i Cyrkon oraz zawartość suchej masy epikotylu odmiany
KB1903.
Słowa kluczowe: Methylobacterium, endofity, kukurydza, kwasy fenolowe, nifH, Fusarium
Summary. Influence of two endophytic Methylobacterium extorquens strains, isolated from leaf tissue of Król variety, on selected features were tested. The ability to use
selected phenolic compounds as a sole source of carbon and energy, the presence of
nifH gene and the ability to inhibit the growth of phytopathogens in vitro were tested.
Isolates had no ability to use phenolic compounds as sole source of carbon and energy.
Both isolates had nifH gene. Only A5 inhibited growth of Fusarium graminearum
IOR 1970 in vitro. Seeds inoculation with A5 showed negative significant effect on
root length, dry matter yield of roots and epicotyl of KB1902 variety, dry matter yield
of roots of KB1903, Król, Cyrkon varirties and on dry matter yield of epicotyl of
KB1903 variety.
Key words: Methylobacterium, endophytes, maize, phenolic acids, nifH, Fusarium
381
WSTĘP
Wśród bakterii endofitycznych stwierdza się stymulatory wzrostu roślin zwane PGP (ang. Plant Growth Promoting). Zdolność do stymulowania wzrostu
i rozwoju jest efektem m.in. produkcji fitostymulatorów [Long i in. 2008,
Martinez-Morales i in. 2003]. Niektóre endofity wykazują również zdolność
do wiązania wolnego azotu [Elbeltagy i in. 2001] a wiarygodnym markerem tego procesu jest gen hifH, kodujący reduktazę nitrogenazy [Poly i in.
2001]. Ponieważ wiele bakterii endofitycznych ma zdolność do produkcji
substancji antybiotycznych w stosunku do fitopatogenów [Cho i in. 2002]
z powodzeniem mogą być one wykorzystywane jako biologiczne środki
ochrony. Wykorzystanie endofitów może przyczynić się do ograniczenia zużycia syntetycznych pestycydów a jednocześnie mogą ograniczyć pojawianie
się odpornych form patogenów.
Związki fenolowe, obecne w tkankach roślin, stanowią naturalny mechanizm
ochrony przed patogenami. Mają one charakter bakterio oraz grzybobójczy. Zdolność drobnoustrojów do tolerowania lub/i wykorzystywania takich substancji
umożliwia im efektywne zasiedlanie tkanek roślinnych [Oksińska i in. 2011].
Bakterie z rodzaju Methylobacterium występują w fyllosferze, gdzie wykorzystują jednowęglowe związki wydzielane przez rośliny. Stwierdzane są również
w rizosferze ze względu na zdolność wykorzystywania wielowęglowych substratów [Green 1991]. Bakterie z rodzaju Methylobacterium zasiedlają również
zdrowe tkanki. Jako endofity zostały wyizolowane m.in. z ryżu [Madhaiyan
i in. 2007], kukurydzy słodkiej oraz bawełny [McInroy i Kloepper, 1995]
i zaliczane są do PGP [Jeounghyun i in. 2006]
Celem niniejszej pracy była ocena zdolności endofitycznych bakterii Methylobacterium extorquens do wzrostu w obecności wybranych związków fenolowych, ich zdolność do wydzielania substancji przeciwgrzybowych oraz
obecność genu nifH. Oceniono również wpływ izolatu A5 na wybrane cechy
różnych odmian kukurydzy w warunkach in vitro.
MATERIAŁY I METODY
Bakterie z rodzaju Methylobacterium wyizolowano z odmiany kukurydzy
KRÓL uprawianej na polu doświadczalnym firmy „Nasiona Kobierzyce”
w Kobierzycach w 2009 roku. Izolacji bakterii endofitycznych dokonano
z liści powierzchniowo zdezynfekowanych 70% etanolem, zmacerowanych
w 0,1 M MgSO4. Macerat tkankowy posiano na podłoże 1/3 TSA (Difko,
USA) i inkubowano w 28oC, 72h. Wybrano kolonie o charakterystycznym
czerwonym kolorze.
382
Ocena wpływu endofitycznego Methylobacterium Extorquens...
Przynależność gatunkowa została określona na podstawie sekwencjonowania fragmentu 16S rDNA z wykorzystaniem dwóch par uniwersalnych primerów: FAM27f [5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’] i 1942R [5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’] hybrydyzujące do końcowych odcinków oraz
704F [5’-TGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA-3’] i 765R [5’-CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC-3’] hybrydyzujące do odcinków środkowych.
Zdolność do wykorzystywania kwasów fenolowych (p-kumarowy, o-kumarowy, ferulowy, chlorogenowy) jako źródło węgla i energii określono
w pożywce mineralnej SWK (Syntetyczne Wydzieliny Korzeniowe) [Oksińska
i wsp. 2011]. Podłoża inokulowano 10 μl zawiesiny bakterii (108 jednostek
tworzących kolonie ml-1) i po 72 h oceniano wzrost na podstawie pomiaru
OD540 w porównaniu do wzrostu w SWK z 0,1% dodatkiem ekstraktu drożdżowego oraz SWK bez źródła węgla. Dla izolatów, niezdolnych do wykorzystywania określonego związku, wyznaczono MIC (ang. Minimal Inhibitory Concentration) na podłożu King B. Zdolność do produkcji związków
przeciwgrzybowych określono na podstawie stref zahamowania wzrostu
w stosunku do Fusarium moniliforme IOR 728 oraz Fusarium graminearum
IOR 1970 na podłożu PDA. Na szalce w odległości 50 mm umieszczano krążek z 8-dniowej hodowli grzyba o średnicy 10 mm i wykonano rysę bakterii
z 48-godzinnej hodowli. Całość inkubowano do momentu, aż grzybnia na
płytce kontrolnej przekroczyła promień 50mm. Doświadczenia prowadzono
w trzech powtórzeniach.
Identyfikację genu nifH przeprowadzono z wykorzystaniem primerów PolF
& PolR [Poly i wsp. 2001] oraz 5xHot FIREPol Blend Master Mix (Solid
Biodyne). Produkt reakcji poddano elektroforezie w 2% agarze, 60 min,
100V. Masy prążków zanalizowano przy użyciu programu GelixOne 1D Software (biostep GmbH, Niemcy). Szczep referencyjny stanowił Azospirillum
barsieliense 35Bb [Król i Perzyński 2005].
Wpływ szczepu A5 na wzrost 6-ciu badanych odmian kukurydzy określono w teście probówkowym w 0,9% agarze wodnym z dodatkiem zawiesiny bakterii (6,6 x 107 j.t.k. ml-1 w 0,1 M MgSO4) w proporcji 1:9 (v/v)
w porównaniu do jałowego agaru wodnego. Nasiona powierzchniowo zdezynfekowano 1% NaClO- (30 min) i płukano w sterylnej wodzie (2 x 5 min.,
1 x 90 min.). Ziarniaki wyłożone na słupki inkubowano 7 dni w 20oC i następnie określono wybrane cechy biometryczne (długość korzeni, epikotylu, liczbę korzeni) oraz oznaczono suchą masę. Doświadczenie prowadzono
w 10 powtórzeniach. Analizę statystyczną przeprowadzono z wykorzystaniem Statistica 9.1 PL (StatSoft Inc.).
383
WYNIKI I DYSKUSJA
Zdolność do wzrostu w obecności wybranych związków fenolowych, zdolność do pozakomórkowego wydzielania substancji przeciwgrzybowych oraz
obecność genu nifH endofitycznych bakterii Methylobacterium extorquens
przedstawia Tab. 1. Testowane izolaty nie wykorzystywały wybranych
związków fenolowych jako jedynego źródła węgla i energii. Były jednak
zdolne do wzrostu w ich obecności w stężeniach wyższych niż naturalnie
występujące w tkankach roślinnych [��
Maksimovic i wsp. 2008].��
Kwasy ferulowy, o-kumarowy i p-kumarowy nie hamowały wzrostu izolatów nawet
w stężeniach czterokrotnie większych niż stwierdzane w sokach roślinnych.
Jedynie kwas chlorogenowy (lub produkty jego rozpadu) hamował ich wzrost
w stężeniu dwukrotnie większym niż stwierdzane w tkankach kukurydzy.
W literaturze opisano nieliczne szczepy Methylobacterium, które są endofitami roślin [m.in. McInroy i Kloepper, 1995] lub żyją w symbiotycznych
układach z porostami [Żarnowski i in. 2002]. Tolerowanie kwasów fenolowych przez wybrane izolaty świadczy o ich zdolności do kolonizacji tkanek
roślinnych i tworzenia asocjacji z roślinami.
cecha
Izolat A4
Izolat A5
Wykorzystanie kwasów fenolowych jako
jedyne źródło węgla i energii
brak
brak
Kwas o-kumarowy
>1,44
>1,44
Kwas p-kumarowy
>1,44
>1,44
Kwas ferulowy
>1,80
>1,80
Kwas chlorogenowy
0,6
0,6
obecny
obecny
F. moniliforme 728
brak
brak
F. graminearum 1970
brak
2 mm
MIC* (mg ml-1)
Gen nifH
Strefa zahamowania wzrostu
Tab. 1. Zestawienie cech ��
Methylobacterium extorquens A4 oraz A5. ��
*MIC dla kwasów fenolowych: kwas ferulowy 0,180%, kwas o-kumarowy i p-kumarowy 0,144%
stężenie czterokrotnie większe niż w tkankach; kwas chlorogenowy 0,040% stężenie
naturalnie występujące w tkankach
Zdolność do asymilacji wolnego azotu przez endofity może stymulować
wzrost i rozwój rośliny. Klaster genów odpowiedzialnych za wiązanie wolnego azotu bakterie mogą nabyć poprzez poziomy transfer genów [Yan i in.
2008]. Testowane izolaty posiadały gen nifH co umożliwia im wiązanie wolnego azotu. Końcowe produkty asymilacji N2, m.in. aminokwasy, stanowią
łatwo dostępne dla gospodarza formy azotu.
384
Zdolność endofitów do wydzielania substancji przeciwgrzybowych jest czynnikiem, który umożliwia im łatwiejsze zasiedlanie tkanek. W przypadku pozyskanych izolatów tylko A5 hamował wzrost grzybni F. graminearum 1970.
Bakterie endofityczne zdolne do produkcji takich substancji są potencjalnymi
kandydatami biologicznej ochrony roślin.
Wpływ badanego szczepu na wybrane cechy różnych odmian kukurydzy
przedstawia Tab. 2. Inokulacja nasion badanym izolatem nie wpłynęła istotnie na liczbę korzeni roślin oraz długość epikotylu, miała natomiast istotnie
negatywny wpływ na długość korzeni oraz suchą masę korzeni i epikotylu.
Po inokulacji badanym izolatem, w przypadku odmiany KB1902, zaobserwowano istotne zmniejszenie długości korzenia, zmniejszenie suchej masy
korzenia i epikotylu. Istotne zmniejszenie suchej masy korzenia i epikotylu
zaobserwowano także dla odmian KB1903. Spadek suchej masy korzenia odnotowano również u odmian Król i Cyrkon. Obserwowany spadek zawartości
suchej masy kukurydzy, a także zmniejszenie długości korzenia można powiązać z wydzielaniem przez A5 niezbadanych w tej pracy inhibitorów wzrostu.
A5
woda
A5
woda
A5
2a
Długość
korzenia [mm]
39,4 26,3
a*
b
a
a
s.m. korzenia
[mg]
4,9
a
4,1 b
4,0
a
Długość
epikotylu [mm]
18,4 14,3
a
s.m. epikotylu
[mg]
5,3
a
KOSMO230
woda
1a
CYRKON
A5
2a
KRÓL
woda
woda
Liczba korzeni
KB2704
A5
A5
KB1903
woda
KB1902
1a
1a
1a
3a
3a
3a
3a
3a
2a
21,3 21,6 28,4
27,5
32,3
27,6
28,4
21,0
24,6
21,2
a
a
a
a
a
a
a
a
3,1
b
3,8
a
3,9 a
8,8 a
8,0 b
6,8 a
5,4 b
5,8 a
5,6 a
13,6
9,0
11,1
12,0
22,7
21,3
22,2
19,1
16,7
15,0
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
4,1 b
4,4
a
2,9
b
4,4
a
5,3 a
6,9 a
7,3 a
6,8 a
6,8 a
5,5 a
5,3 a
Tab. 2. Wpływ inokulacji izolatem A5 na wybrane parametry różnych odmian kukurydzy. * wartości w wierszach dla poszczególnych odmian oznaczone tymi samymi
literami nie różnią się istotnie wg testu Duncana (p=0,05)
Jeounghyun i in. [2006] opisali pozytywny wpływ Methylobacterium spp.
pozyskanych z tkanek ryżu, na siewki pomidora oraz pieprzu. Zasiedlanie
tkanek roślinnych przez endofity cechuje selektywność. Przykładem hamującego wpływu endofitów są niektóre szczepy z rodzaju Pseudomonas, izolowane ze zdrowych tkanek roślin pomidora, które w momencie reinokulacji
siewek pomidora hamowały ich wzrost [Van Peer i in. 1990]. Nasze badania
385
pokazują wybiórczość na poziomie odmiany. Obserwowane efekty oddziaływania na wybrane odmiany sugeruje istotną rolę, metabolizowanych przez
bakterie, wydzielin korzeniowych. Rizodepozyty zawierają szereg związków
[Dakora i Phillips 2002], jednak ich skład zależy od wielu czynników, m.in.
odmiany rośliny [Carvalhais i wsp. 2011, Nardi i in. 1997]. Relacje pomiędzy
M. extorquens a różnymi odmianami kukurydzy nadal pozostają niewyjaśnione.
WNIOSKI
• Stwierdzono istotnie zróżnicowany wpływ izolatu M. extorquens A5 na
rozwój siewek 6-ciu odmian kukurydzy (KB1902, KB1903, KB2704,
Król, Cyrkon, Kosmo230).
• Izolaty M. extorquens A4 i A5 posiadały gen nifH oraz tolerowały kwasy
fenolowe: ferulowy, chlorogenowy, p-kumarowy, o-kumarowy.
• Izolat M. extorquens A5 hamował wydłużanie korzeni oraz ograniczył
przyrost suchej masy korzenia i epikotylu odmiany KB1902.
• Izolat M. extorquens A5 ograniczył przyrost suchej masy korzenia odmian KB1903, Król, Cyrkon.
• Izolat M. extorquens A5 ograniczył przyrost suchej masy epikotylu odmiany KB1903.
LITERATURA
Carvalhais L.C., Dennis P.G., Fedoseyenko D., Hajirezaei M.R., Borriss R., Von
Wiren N. 2011. Root exudation of sugar, amino acids, and organic acids by
maize as affected by nitrogen, phosphorus, potassium, and iron deficiency.
J. Plant Nutr. Soil Sci. 174: 3-11.
Cho S.J., Park S.R., Kim M.K., Lim W.J., Ryu S.K., An C.L., Hong S.Y., Lee Y.H.,
Jeong S.G., Cho Y.U., Yun H.D. 2002. Endophytic Bacillus sp. isolated from the
interior of ballon flower root. Biosci Biotechnol Biochem, 66: 1270-1275.
Dakota F.D., Phillips D.A. 2002. Root exudates as mediators of mineral acquisition in
low-nutrient environments. Plan Soil 245: 35-47.
Elbeltagy A., Nishioka K., Sato T., Suzuki H., Ye B., Harnada T., Isawa T., Mitsiu H.,
Minarnisawa K. 2001. Endophytic colonization and in planta nitrogen fixation by
a Herbaspirillum sp. isolated from wild rice species. Applied Environ Microbiol,
67(11): 5285-5293.
386
Green P.N. 1991. The Prokaryotes, chapter 117 “The Genus Methylobacterium”, Second Edition, Edited by Balows A., Truper H.G., Dworkin M., Harder W., Schliefer
K.H., 2342-2349.
Jeounghyun R., Madhaiyan M., Poonguzhali P., Yim W., Indiragandhi P., Kim K.,
Anangham R., Yun J., Kim K.H., Sa T. 2006. Plant growth substances produced
by Methylobacterium spp. and their effect on tomato (Lycopersicon esculentum
L.) and red pepper (Capsicum ennuum L.) growth. J.Microbiol. Biotechnol.,
16(10):1622-1628.
Król M.J., Perzyński A. 2005. Wykorzystanie benzenu jako jedynego źródła węgla
w wiązaniu wolnego azotu przez bakterie z rodzaju Azospirillum i Pseudomonas
stutzeri. Pamiętnik Puławski, 140:103-116.
Long H.H., Schmidt D.D., Baldwin I.T. 2008. Native bacterial endophytes promote
host growth in a specoes-specyfic manner, phytohormone manipulations do not
result in common growth responses. PLoS ONE 3: e2702.
Madhaiyan M., Poonguzhali S. 2007. Metal tolerating methylotrophic bacteria reduces nickel and cadmium toxicity and promotes plant growth of tomato (Lycopersicon esculentum L.). Chemosphere 69: 220-228.
Maksimovic, J.D., Maksimovic, V., Zivanovic, B., Sukalovic, V.H.T., Vuletic, M. 2008.
Peroxidase activity and phenolic compounds content in maize root and leaf apoplast, and their association with growth. Plant Science, 175: 656–662.
Martinez-Morales L.J., Soto-Urzua L., Baca B.E., Schanchez-Ahedo A. 2003. Indole3-butyric acid (IBA) production in culture medium by wild stain Azospirillum
brasilenese. FEMS Micriobiol. Lett., 228: 167-173.
McInroy J.A., Kloepper J.W. 1995. Survey of indigenous bacterial endophytes from
cotton and sweet corn. Plant Soil. 173: 337-342
Nardi S., Reneiro F., Concheri G. 1997. Soil organic matter mobilization by root exudates of three maize hybrids. Chemosphere 35: 2237-2244.
Oksińska M.P., Wright S.A.I., Pietr S.J. 2011. Colonization of wheat seedlings (Triticum aestivum L.) by strains of Pseudomonas spp. with respect to their nutrient
utilization profiles. Eur. J. Soil Biol., 47: 356-373.
Poly F., Monrozier L.J., Bally R. 2001. Improvement in the RLPH procedure for
studying the diversity of nifH genes in communities of nitrogen fixers in soil. Res.
Microbiol., 152:95-103
Yan Y., Yang J., Dou Y., Chen M., Ping S., Peng J., Lu W., Zhang W., Yao Z., Li H.,
Liu W., He S., Geng L., Zhang X., Yang F., Yu H., Zhan Y., Li D., Lin Z., Wang
Y., Elmerich C., Lin M., Jin Q. 2008. Nitrogen fixation island and rhizosphere
competence traits in the genome of root-associated Pseudomonas stutzeri A1501.
PNAS, 105(21): 7564-7569.
387
Van Peer R., Punte H.L.M., De Weger L.A., Schippers B. 1990. Characterization of
root surface and endorhizosphere Pseudomonas in relation to their colonization
of roots. Appl. Environ. Microbiol. 56: 2462-2470.
Żarnowski R., Felske A., Ellis R.J., Geuns J.M.C., Pietr S.J. 2002 A Methylobacterium – like organism from algal crustes covering silicone rubber electric insulators
in Africa. J. Applied. Microbiol. 93: 1012-1219.
mgr Katarzyna Pisarska1,2, mgr Mariusz Adamski2
Zakład Mikrobiologii Rolniczej
Katedra Ochrony Roślin
Opiekun naukowy: prof. dr hab. Stanisław J. Pietr
Badania realizowane z grantu1 nr NCN 2011/01/N/NZ9/02332 oraz w ramach
programu2 współfinansowanego przez Unię Europejską w ramach Europejskiego
Funduszu Społecznego „Przedsiębiorczy doktorant – inwestycja w innowacyjny
rozwój regionu”
388
Jan Słodki
Hubert Okła
Krzysztof P. Jasik
EPISTEME
14/2012
s.389-393
ISSN 1895-4421
TRANSMISJA WERTYKALNA PIERWOTNIAKA BABESIA
MICROTI U SZCZURÓW
VERTICAL TRANSMISSION OF PROTOZOAN BABESIA
MICROTI IN RATS
Abstrakt. Kleszcze są wektorami wielu drobnoustrojów zagrażających zdrowiu
człowieka i zwierząt.��
Prezentowane
��
badania oceniają możliwości transmisji protistów Babesia microti z zarażonych ciężarnych samic szczurów szczepu Wistar do
tkanek płodu.��
Aby
��
wykluczyć��
��
ryzyko zarażenia okołoporodowego wykonano sekcje przed rozwiązaniem ciąży. Trzytygodniowe samice szczurów zakażono szczepem
wzorcowym Babesia microti. W 21 dniu dokonano sekcji pobierając wybrane narządy
samicy i płodu. Obecność protistów w wybranych narządach potwierdzono metodą
PCR. Monitorowanie parazytemii samic dokonano poprzez obserwację rozmazów
krwi, którą pobierano w tygodniowych odstępach czasu. Rozmazy krwi barwiono
metodą May-Grunwalda-Giemsy i obserwowano w mikroskopie świetlnym. Zarówno
metody molekularne jak i analiza rozmazów potwierdziły możliwość przenikania
B. microti poprzez łożysko do potomstwa.
Słowa kluczowe: Babesia microti, babeszjoza wrodzona, transmisja wertykalna
Summary. Ticks are vectors of many microbes that threaten human and animal health. The present study evaluates the possibility of transmission of protozoan from
infected pregnant rats belonging to Wistar stock to fetal tissue. To avoid the risk of
perinatal infection, postmortem examinations were performed prior to the termination
of pregnancy. Three-week female rats were infected with Babesia microti reference
strain. On the 21st day postmortem examinations were performed in order to collect
selected female and fetal organs. Protozoan presence in selected organs was confirmed by PCR. The monitoring of female parasitaemia was made by observation of
blood smears which was collected every week. Blood smears were stained by May-Grunwald-Giemsa and observed by means of light microscopy. Both molecular methods and analysis of the smears confirmed the possibility of penetration of B. microti
through the placenta to the offspring.
Key words: Babesia microti, congenital babesiosis, vertical transmission
389
WSTĘP
Babesia microti to przedstawiciel Protista z rodziny Babesidae, którego
wektorem w Polsce jest kleszcz pospolity – Ixodes ricinus [Wójcik-Fatla
i in. 2006]. Babesia spp. są czynnikami etiologicznymi babeszjozy, choroby zwierząt [Sawczuk 2007], a sporadycznie także człowieka [Wójcik-Fatla
i in. 2006]. Ma to znaczenie weterynaryjno-medyczne, gospodarcze oraz epidemiologiczne. Najczęstszym czynnikiem etiologicznym babeszjozy u ludzi
jest Babesia microti [Teal i in. 2011].
Choroba ta jest rzadko rozpoznawana, z powodu nieznanego patomechanizmu, trudnej diagnostyki oraz podobieństwa do pasożytów Plasmodium [Teal
i in. 2011].��
Ze
��
względu na nieliczne doniesienia literaturowe opisujące kazuistyczne przypadki babeszjozy wrodzonej, bardzo istotna jest analiza możliwości przenikania Babesia spp. przez łożysko i następstwa tego zjawiska
dla potomstwa.
MATERIAŁY I METODY
Materiałem badanym były tkanki pochodzące od siedmiu samic szczurów
szczepu Wistar inokulowanych szczepem wzorcowym Babesia microti oraz
płodów, pochodzących od zarażonych samic. Wykonano dootrzewnową inokulację 0,5 ml hodowli szczepu wzorcowego (ATCC® 30221™). Zarażenie
samic badano poprzez analizę w mikroskopie świetlnym rozmazu krwi, pobieranej z żyły ogonowej wybarwianego metodą May-Grunwald-Giemsa.
Dodatkowo w odstępach tygodniowych z żyły grzbietowej ogona była pobierana krew do analizy molekularnej w celu wykrycia materiału genetycznego
B. microti metodą PCR.
Zarażone samice zostały pokryte i w 21 dniu ciąży poddane eutanazji ��
poprzez iniekcję dootrzewnową (i.p.) tiopentalu z ketaminą w dawce 20 mg/
kg m.c. W trakcie sekcji pobrano śledzionę i wątrobę samicy, łożysko, oraz
mózgowie, serce i wątrobę płodu.
Tkanki przeznaczone do badań molekularnych zostały umieszczone w proZ
��
tkanek tych zostało wyibówkach typu Eppendorf w temperaturze -20oC.��
zolowane DNA przy użyciu zestawu odczynników High Pure PCR Template
Preparation Kit (Roche Applied Science, Mannheim, Niemcy) zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Wyizolowany DNA była przechowany w -20oC do dalszej diagnostyki.
Obecność patogenu w tkankach potwierdzano za pomocą PCR, przy użyciu
komercyjnego zestawu diagnostycznego PCR Babesia (DNA Gdańsk, Polska). W zestawie tym wykorzystano startery komplementarne do fragmentu
genu 18S rDNA.
390
Transmisja wertykalna pierwotniaka...
W skład mieszaniny reakcyjnej PCR wchodziły: Master Mix, dNTPs (8
mM), termostabilna polimeraza DNA Hypernova oraz matryca DNA. Reakcje amplifikacji przeprowadzono w termocyklerze Personal Cycler (Biometra,
Goettingen, Niemcy) w warunkach termicznych przedstawionych w tabeli 1.
Etap
PCR Babesia
Temperatura
Czas
Denaturacja początkowa
o
94 C
2 min.
Denaturacja*
94oC
45 sek.
Przyłączanie starterów*
o
48 C
45 sek.
Wydłużanie łańcucha DNA*
o
72 C
45 sek.
Końcowe wydłużanie
72oC
5 min.
* Etapy: denaturacja, przyłączanie starterów
i wydłużanie łańcucha DNA powtórzone 40 razy
Tab. 1. Warunki reakcji PCR dla Babesia microti
WYNIKI
Rozmazy krwi samic szczurów wykonane metodą May-Grunwald-Giemsa
wykazały obecność B.microti w erytrocytach potwierdzając zarażenie (Rys.
1). Zarażenie zostało również potwierdzone za pomocą PCR wykonanych
z krwi samic - widoczny produkt amplifikacji na wysokości 560pz. (Rys.
2). Za pomocą PCR udało się potwierdzić obecność B.microti w tkankach
płodów uzyskanych z zarażonych samic – widoczny produkt amplifikacji
DNA B.microti w łożyskach, wątrobie płodowej, płodzie, wątrobie oraz
w sercu płodowym (Rys. 3).
Rys. 1. Babesia microti w erytrocytach
(preparat barwiony metodą May-GiemsaGrunwald)
391
Rys. 2. Wyniki PCR z próbek krwi
samic szczurów ,potwierdzające
zarażenie (ścieżka 1 – kontrola
negatywna, ścieżka 2 – marker
wielkości M100-1000, ścieżka 3 –
kontrola pozytywna, ścieżki 4,
5 – próbki badane pozytywne)
Rys. 3. Wyniki PCR z tkanek samic
i płodów (ścieżka 1 – marker
wielkości M100-1000, ścieżka
2 – kontrola pozytywna, ścieżka
3 – kontrola negatywna, ścieżka
4 - łożysko ścieżka 5 - wątroba
płodowa, ścieżka 6 - płód, ścieżka
8 - wątroba i serce płodowe, ścieżka
9 – łożysko)
DYSKUSJA
Problem związany z ryzykiem infekcji płodu babeszjozą jest sporadycznie
wspominany w literaturze. Temat ten został po raz pierwszy zasygnalizowany ok 30 lat temu. Opisano wówczas efekty zarażenia Babesia spp. w postaci
poronień lub śmierci noworodków. Esernio-Jenssen i in. [1987] przedstawili
przypadek okołoporodowego zarażenia dziecka. Podobny przypadek został
zasygnalizowany przez New��
i in. w 1997��
. W 2009 r. udokumentowano wrodzone zarażenie babeszjozą [Sethi i in. 2009].
Do tej pory nie udowodniono mechanizmu przenikania Babesia microti poprzez łożysko do płodu. W Japonii, w 2005 wykonano eksperyment, polegający na analizie potomstwa zdrowego psa z suką zarażoną B. gibsonii. Efektem tego jedno ze szczeniąt urodziło się martwe a pozostałe cztery zdechły
w okresie od 14 do 39 dnia po urodzeniu [Fukumoto i in. 2005]. Doświadczenie to nie dowodzi jednak czy do zakażenia doszło poprzez łożysko, czy
okołoporodowo. Jest to istotny problem, zwłaszcza, że z roku na rok notuje
się coraz większą ilość zachorowań na babeszjozę. Znając dokładnie mechanizm zarażenia będzie można skupić się na problemach diagnostyki czy leczenia i profilaktyki. Przedstawione wyniki stanowią etap wstępny obszerniejszych badań, obejmujacych problematykę skutków babeszjozy wrodzonej,
jej objawów i wpływu B. microti na proces embriogenezy.
392
Transmisja wertykalna pierwotniaka...
WNIOSKI
We krwi i w wybranych narządach pobranych podczas sekcji potwierdzono,
że zarażona matka przekazuje potomstwu przez łożysko badane patogeny.
Wyniki te stanowią dowód, że pierwotniak Babesia microti jest przekazywany wertykalnie z zarażonej samicy poprzez łożysko do płodu.
LITERATURA
Fukumoto S. Suzuki H. Igarashi I. Xuan X. 2005. Fatal experimental transplacental
Babesia gibsoni infections in dogs. International Journal for Parasitology, 35(9):
1031-1035.
New DL. Quinn JB. Qureshi MZ. Sigler SJ. 1997. Vertically transmitted babesiosis.
The Journal of Pediatrics, 131(1 Pt 1): 163-164.
Sawczuk M. 2007. Cattle babesiosis. Wiadomości parazytologiczne, 53(2): 73-79.
Sethi S. Alcid D. Kesarwala H. Tolan RW Jr. 2009 Probable Congenital Babesiosis in
Infant, New Jersey, USA. Emerging Infectious Disease Journal, 15(5): 788-791.
Teal AE. Habura A. Ennis J. Keithly JS. Madison-Antenucci S. 2011. A New Real-Time PCR Assay for Improved Detection of the Parasite Babesia microti. Journal
of Clinical Microbiology.
Wójcik-Fatla A. Cisak E. Chmielewska-Badora J. Zwoliński J. Buczek A. Dutkiewicz J.
2006. Prevalence of Babesia microti in Ixodes ricinus ticks from Lublin region (eastern Poland). Annals of Agricultural and Environmental Medicine, 13(2): 319-322.
mgr Jan Słodki, mgr Hubert Okła, dr hab. Krzysztof P. Jasik
Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
ul. Jagiellońska 4, 41-200 Sosnowiec
Opiekun naukowy: dr hab. n. biol. Krzysztof Jasik
393
Katarzyna Stalmach
Małgorzata Borek
Katarzyna Śniegowska
EPISTEME
14/2012
s.395-408
ISSN 1895-4421
FIZJOLOGICZNE ASPEKTY ODPOWIEDZI ROŚLIN JĘCZMIENIA
JAREGO (HORDEUM VULGARE L.) NA STRES SUSZY
PHYSIOLOGICAL ASPECTS OF RESPONSES SPRING BARLEY
(HORDEUM VULGARE L.) TO DROUGHT STRESS
Abstrakt. Niedobór wody jest głównym czynnikiem środowiskowym ograniczającym
produktywność roślin, a jego wpływ manifestuje się zmianami niemalże w każdym
procesie fizjologicznym. Celem badań było poznanie różnych aspektów reakcji odmian
jęczmienia na stres suszy tj. linie jęczmienia jarego o zróżnicowanej reakcji na deficyt
wody. Pomiary parametrów fluorescencji chlorofilu wykonano na roślinach optymalnie
nawadnianych i poddanych działaniu suszy glebowej a ich celem było ustalenie optymalnego czasu działania suszy dla zróżnicowania odmian jęczmienia pod względem
wydajności reakcji fotochemicznych. Pomiary wykonano w fazie siewki po ukazaniu się
4 liścia. Pomiary szybkiej kinetyki fluorescencji chlorofilu a przeprowadzono przy
użyciu fluorymetru Handy PEA. Stwierdzono, że największe zróżnicowanie aktywności fotochemicznej odmian siewek jęczmienia, pod względem wrażliwości na deficyt wody, wystąpiło po 10 dniach suszy.
Słowa kluczowe: stres suszy, jęczmień jary, parametry fizjologiczne
Summary. Water shortage is a major environmental factor limiting plant productivity, and it influences almost every physiological process. Thus, we undertook
a research aimed at understanding aspects of the plants response to drought stress.
Material consisted of spring barley lines with different susceptibility to water deficit.
Measurements of different parameters o chlorophyll fluorescence were carried out
on plants well watered and exposed to soil drought. The aim was to determine the
optimal length of drought that enables a differentiation of barley varieties in terms of
photochemical reactions efficiency. Measurements were taken at the seedling stage
after the appearance of the fourth leaf. Measurements of fast kinetics of chlorophyll
fluorescence were performed using a fluorometer Handy PEA. It was found that the
greatest variation of photochemical activity of barley varieties as a response to water
deficit, occurs after 10 days of drought.
Key words: drought stress, spring barley, physiological parameters
395
WSTĘP
Rolnictwo jak żadna inna gałąź gospodarki czułe jest na oddziaływanie
zmian klimatu i związanych z nim zjawisk atmosferycznych takich jak zmiany nasłonecznienia, temperatury i opadów. W miarę intensyfikowania produkcji roślinnej, znaczenie czynników pogodowych wzrasta [Bac i in.1998].
Warunki pogodowe w Polsce są czynnikiem najmniej stabilnym w uprawie
zbóż. Wszelkie anomalia pogodowe mogą w znaczący sposób wpłynąć na
wielkość i jakość plonu ziarna. Odporność na suszę i efektywna gospodarka
wodna roślin jest ważnym elementem dostosowania się systemu produkcji
rolnej do zmian klimatu. Hodowcy poszukują genotypów, które charakteryzują się wysokim potencjałem plonowania i cechami fizjologicznymi sprzyjającymi odporności na suszę [Gonzalez i in. 1999]. Fotosynteza jest procesem, którego intensywność zależy od ilości wody w środowisku, jak również
od jej dostępności dla roślin. U roślin wyższych jest ona wysoce wrażliwa
na działanie suszy. Proces fotosyntezy jest ściśle związany z zawartością
chlorofilu jako jednego z głównych składników chloroplastów [Li Rong-hua
i in. 2006]. Fluorescencja chlorofilu jest parametrem fotosyntezy odzwierciedlającym wrażliwość roślin na stres suszy [Flexas i in. 2002]. Niestety jak
dotąd niewiele wiadomo na temat zmian zawartości chlorofilu i parametrów
jego fluorescencji jakie zachodzą u roślin jęczmienia pod wpływem deficytu
wody [Li Rong-hua i in. 2006]. Prowadzone badania miały na celu określenie
poziomu suszy najbardziej różnicującego badane odmiany jęczmienia pod
względem reakcji fotosyntetycznych.
MATERIAŁ I METODY
Badania przeprowadzono na 8 odmianach jęczmienia (Cam/B1, Georgia,
Harmal, Lubuski, M.Dingo, Maresi, Morex, Stratus). Po zaprawieniu ziarno
wysiano do doniczek o pojemności 9 L, napełnionych glebą (piasek gliniasty
mocny) z domieszanym do niej piaskiem (7 gleba : 2 piasek, w/w). W wazonach rosło początkowo po 15 siewek, a później ich liczbę obniżono do 10.
Po wschodach rośliny umieszczono na 14 dni w komorze wegetacyjnej przy
temperaturze 10/5 oC (dzień noc). Następnie przeniesiono rośliny do klimatyzowanej szklarni, gdzie utrzymywano temperaturę 20/17 oC (dzień noc),
aż do fazy strzelania w źdźbło, a potem temperaturę (23/14 oC). Wilgotność
względna powietrza wynosiła od 25% do 60%. Wilgotność podłoża w wazonach była kontrolowana wagowo (na podstawie krzywej retencji wodnej)
i wynosiła początkowo 11% (masa wody w s. masie gleby). Suszę glebową
(4.0%) zastosowano w fazie wegetacji: po ukazaniu się 4. liścia przez 10 dni.
Rośliny dokarmiono pożywką zaleconą przez IUNG w Puławach. Pomiary
wykonano u roślin dobrze podlewanych i poddanych działaniu suszy glebowej po ukazaniu się 4. liścia w 1, 5 i 10 dniu suszy.
396
Fizjologiczne aspekty odpowiedzi roślin jęczmienia jarego...
Pomiar szybkiej kinetyki fluorescencji. Pomiary szybkiej kinetyki fluorescencji chlorofilu a przeprowadzono przy użyciu fluorymetru Handy PEA
(Hansatech Ltd., Kings Lynn, UK) na liściu 1 (dolny liść), 2 i 3 w fazie 4.
liścia. Intensywność promieniowania wzbudzającego fluorescencję wynosiła
3 mmol m-2 s-1 (maksimum 650 nm). Pomiary przeprowadzono po 30 minutowej adaptacji liści do ciemności. Intensywność fluorescencji zmierzono fotodiodą-PIN po przepuszczeniu promieniowania przez filtr przepuszczający
promieniowanie długofalowe. Dane te zostały wykorzystane do obliczenia
wskaźników testu JIP na podstawie teorii przepływu strumienia energii przez
PSII [Srivastava i Strasser 1977; Strasser i Strasser 1995; Lazár 1999; Lazár
i Pospíšil 1999; Strasser i in. 2000]: ABS/CS, TRo/CS, ETo/CS, DIo/CS, RC/
CSm i PICS. Pomiary przeprowadzono w 15 powtórzeniach. Wyniki pomiarów fotosyntezy dla każdego okresu suszy (1, 5 i 10 dni) przedstawiono jako
wskaźnik SI (Stres index). Wskaźnik ten opisuje zmianę badanego parametru
w suszy względem dobrze podlewanych roślin określając stopień odporności
na suszę. Był on obliczany na podstawie wzoru: SI(%) = (X1/X2) x 100, gdzie
X1 oznacza wartość pomiarową uzyskaną dla roślin suszy, a X2 dla roślin
dobrze podlewanych.
Obliczenia statystyczne. Dla wszystkich danych pomiarowych przeprowadzono wieloczynnikową analizę wariancji. Dla oceny istotności zróżnicowania średnich dla odmian obliczono wartości NRI, przy P<0.05. Istotność
zróżnicowania par X1 i X2 zbadano na podstawie testu „t” Studenta gdzie X1
oznacza wartość pomiarową uzyskaną dla roślin suszy, a X2 dla roślin dobrze
podlewanych.
WYNIKI I DYSKUSJA
Celem pomiarów fizjologicznych było ustalenie długości suszy optymalnej
dla zróżnicowania odmian jęczmienia pod względem wydajności reakcji
fotochemicznych. Analiza wariancji wykazała, że wszystkie uwzględnione
w doświadczeniu czynniki (odmiana, wiek liści, wilgotność podłoża i długość suszy) miały istotny wpływ na aktywność fotochemiczną PSII roślin
adaptowanych do ciemności. Funkcjonowanie fotosystemu PS II jest bardzo
czułym wskaźnikiem działania różnorodnych czynników stresowych na rośliny [Jansen i in.1995, Smille i in.1987]. Stwierdzono, że statystycznie istotne były także efekty współdziałania wymienionych czynników, świadczące
między innymi o tym, że fotoukład II (PSII) odmian w zróżnicowany sposób
odpowiadał na suszę. Przedłużanie okresu niedoboru wody w podłożu hamowało przechwytywanie energii promienistej przez anteny PSII (ABS/CS),
zmniejszało wielkość strumieni energii przepływających do centrów reakcji CR (TRo/CS) i poza te centra (ETo/CS), a ponadto obniżyło ilość energii wypromieniowywanej poza PSII (DIo/CS) i zmniejszyło zagęszczenie aktywnych centrów reakcji (RC/CS) jak i ogólną sprawność PSII (PICS) (Tab. 1).
397
398
3
(górny)
1629.7
1259.4
746.0
370.3
732.5
38373.4
18.6
18.6
12.5
4.0
10.0
943.3
0.05
LSD
45556.1
836.1
382.3
831.9
1408.6
1790.9
2
(środek)
45287.3
807.0
406.5
889.5
1486.0
1892.5
1
(dolny)
1434.4
854.5
393.3
822.3
45319.8
27.6
26.3
9.7
24.2
2413.8
PICS
RC/CS
DIo/CS
ETo/CS
TRo/CS
ABS/CS
985.7
9.9
4.0
12.3
15.2
21.0
LSD 0.05
1827.6
45.0
Liść
Stratus
LSD 0.05
38373.4
732.5
370.3
746.0
1259.4
1629.7
10
45322.0
825.0
390.2
836.3
1407.3
1797.5
Morex
45556.1
836.1
382.3
831.9
1408.6
1790.9
5
45022.1
812.3
394.0
855.4
1426.2
1820.2
Maresi
1372.3
817.8
384.5
794.5
43510.3
1356.3
784.3
381.1
756.9
38982.9
45287.3
807.0
406.5
889.5
1486.0
1892.5
PICS
RC/CS
DIo/CS
ETo/CS
TRo/CS
ABS/CS
Dzień
suszy
1756.8
1737.4
1
Lubuski
M.Dingo
763.9
7.7
3.1
8.3
11.8
14.2
LSD 0.05
43955.2
801.4
399.2
855.9
1430.3
1829.5
Harmal
38477.5
742.1
378.3
771.6
1314.0
1692.3
susza
38955.4
731.7
368.5
761.0
1288.0
1656.5
Georgia
47667.0
841.7
394.5
873.3
1455.3
1849.8
kontrola
43510.1
790.9
380.2
814.3
1362.4
1742.6
Cam/B1
PICS
RC/CS
DIo/CS
ETo/CS
TRo/CS
ABS/CS
Uwodnienie
PICS
RC/CS
DIo/CS
ETo/CS
TRo/CS
ABS/CS
Genotyp
Tab. 1. Średnia wartość przepływu strumieni energii przez PSII w 1, 2 i 3 liściu siewek
w zależności od genotypu, uwodnienia podłoża i długości suszy (1, 5 i 10 dni suszy)
Rapacz i in. 2010 zaobserwowali wysoką korelację między liczbą aktywnych centrów reakcji (RC/CS) oraz parametrami charakteryzującymi przepływ energii w PSII u roślin jęczmienia browarnego i pastewnego traktowanych suszą. Wpływ czynnika odmianowego
i przedłużającej się suszy glebowej oraz wieku liści (Rys. 1) na przebieg reakcji fotochemicznych był bardzo wyraźny. Z przedstawionych danych wynika, że zróżnicowanie odpowiedzi odmian na suszę nie wynikło z różnic
pod względem wydajności przepływu energii, ale bardziej z różnych ilości
transportowanej energii.
GEORGIA - 10 DZIEŃ SUSZY
MOREX
3 LIŚĆ
3 LIŚĆ
1 dzień
1786
1850
5 dzień
1417
1470
1638
890
1 LIŚĆ
1 LIŚĆ
1268
10 dzień
718
369
901
1 LIŚĆ
148
1271
379
966
41
369
legenda:
497
ET/CS
ABS/CS
11
legenda:
ABS/CS
ET/CS
TR/CS
DI/CS
304
DI/CS
TR/CS
GEORGIA
1 dzień
1896
5 dzień
1495
1511
1 LIŚĆ
1151
873
10 dzień
148
575
401
41
354
legenda:
ABS/CS
TR/CS
107
Rys. 1. Strumienie przepływu energii
w dolnym liściu siewek odmiany Morex
i Georgia w 1, 5 i 10 dniu suszy glebowej
oraz strumienie przepływu energii
w górnym i dolnym liściu siewek odmiany
Georgia w 10 dniu suszy glebowej (na
podstawie testu JIP)
11
ET/CS
DI/CS
107
399
400
97.3 n.s.
819.0
94.1 n.s.
53682.2
98.7 n.s.
100.4 n.s.
833.5
95.4 n.s.
50206.9
90.5 n.s.
5.9
69.0
5.9
7524.6
9.9
101.1
n.s.
769.9
97.8 n.s.
37785.3
90.2 n.s.
91.2
n.s.
670.4
79.8 *
22564.0
58.1 *
102.8 n.s.
799.6
90.6 n.s.
38604.2
79.1 n.s.
683.2
76.4 *
24487.2
48.2 *
95.3
n.s.
369.4
406.8
27.1
375.9
354.1
405.1
372.3
98.3 n.s.
96.5 n.s.
6.8
94.4 n.s.
72.5 *
91.7 n.s.
70.2 *
928.6
90.7
749.5
574.9
815.7
622.4
98.4 n.s.
5.2
95.1 n.s.
80.7 *
94.0 n.s.
80.4 *
1515.1
118.4
1296.1
1157.0
1413.6
1189.4
98.8 n.s.
5.2
96.4 n.s.
83.0 *
95.8 n.s.
83.5 *
890.4
96.4 n.s.
1417.1
96.6 n.s.
1786.5
1921.9
1818.7
1561.6
144.9
Morex
1672.0
Stratus
1511.1
Harmal
Lubuski
Cam/B1
SD
Georgia
5
99.2 n.s.
55437.0
97.8 n.s.
876.7
100.8
n.s.
69.1 *
36555.2
81.8 *
707.5
91.8 n.s.
348.6
82.2 *
100.3
n.s.
401.3
740.4
85.9 *
1267.4
87.1 *
1616.0
98.4 n.s.
92.1 n.s.
50309.3
94.5 n.s.
100.3
n.s.
52204.2
789.0
92.3 n.s.
892.0
105.4
n.s.
383.4
92.0 n.s.
103.2
n.s.
401.3
914.0
93.3 n.s.
102.7
n.s.
927.1
1461.8
93.1 n.s.
103.3
n.s.
1534.3
1845.2
Harmal
1935.5
M.Dingo Lubuski
966.5
99.1 n.s.
1561.3
99.4 n.s.
1962.5
Maresi
1
94.0 n.s.
87.2 n.s.
36155.5
93.5 n.s.
100.0
n.s.
44431.3
709.2
89.1 n.s.
103.2
n.s.
832.6
335.5
88.7 n.s.
720.4
93.1 n.s.
1253.0
92.2 n.s.
1588.5
Cam/B1
401.0
97.5 n.s.
873.6
98.9 n.s.
1495.8
99.8 n.s.
1896.8
Georgia
(%%)
PIcs
(%%)
RC/CS
(%%)
DIo/CS
(%%)
ETo/CS
(%%)
TRo/CS
(%%)
ABS/CS
SI
Susza
SI
Susza
SI
Susza
SI
Susza
SI
Susza
SI
Susza
Genotyp
Dzień suszy
27193.9
497.0
65.8 *
304.0
74.8 *
533.1
71.2 *
18993.5
653.2
75.4 *
343.7
89.2
n.s.
671.9
79.1 *
28343.2
237.0
28.6
90.5
22.7
228.4
27.3
10954.6
56.7 *
74.9 *
72.2 *
83.6 *
28.4
58.9 *
616.9
966.8
1205.2
401.6
27.7
95.5 n.s.
72.8 *
84.8 *
27.1
60.1 *
376.1
79.3 *
675.3
82.8 *
1169.0
85.5 *
1545.1
1270.8
1548.9
490.5
Maresi
Morex
Stratus
SD
49.7 *
23120.6
6494.4
20.4 *
75.1 *
626.6
96.6 n.s.
363.6
75.2 *
612.7
84.8 *
1137.6
87.4 *
1501.1
Lubuski
48.9 *
377.6
79.8 *
324.9
42.5 *
326.0
59.4 *
841.7
63.9 *
1166.7
M.Dingo
10
62.8 *
30771.0
82.8 *
730.6
97.4 n.s.
390.2
81.9 *
725.1
89.1 *
1317.7
90.9 n.s.
1707.9
Harmal
0.1 *
26.8
2.1 *
17.3
28.6 *
106.8
1.4 *
11.3
3.0 *
41.3
8.5 *
148.1
8.3
68.4
4.4
17.9
9.4
83.7
6.0
97.5
5.5
113.8
SD
24523.3
35538.8
90.3 *
16.0
68.7 *
49.1 *
75.6 *
88.8 n.s.
87.5
n.s.
82.2 n.s.
631.7
769.0
810.9
55.5 *
26925.7
75.9 *
675.8
92.1 n.s.
98.2
n.s.
92.7 n.s.
93.6
n.s.
358.1
369.2
370.0
346.0
85.5 n.s.
80.5 *
73.1 *
717.9
736.5
1212.9
73.2 *
85.7 n.s.
86.6
n.s.
1118.6
83.0 *
641.2
1268.5
1329.6
85.0
n.s.
1571.0
606.9
87.2 n.s.
88.0
n.s.
1464.6
M.Dingo
80.7 *
1637.7
1699.6
Maresi
81.7 *
Morex
Stratus
23308.9 6835.9 36536.0
81.0 *
581.0
86.5 *
353.6
86.9 *
587.0
81.0 *
1050.6
82.3 *
1404.3
Georgia Cam/B1
Tab. 2. Aktywność fotochemiczna PSII pierwszego (dolnego) liścia siewek jęczmienia na podstawie testu JIP i wartość wskaźnika SI w różnych okresach wegetacji w warunkach suszy. Gwiazdka
przy SI oznacza, że różnice pomiędzy kontrolą i roślinami poddanymi działaniu suszy były istotnie
(P<0.05) na podstawie testu “t” Studenta; n.s. różnice nieistotne statystycznie (P<0.05)
401
402
98.6 n.s.
397.2
98.7 n.s.
837.3
93.6 n.s.
55715.5
94.6 n.s.
99.3 n.s.
1465.7
99.2 n.s.
919.8
99.7 n.s.
397.1
99.3 n.s.
774.2
98.3 n.s.
48288.8
99.4 n.s.
1.1
31.6
1.2
29.0
0.6
6.0
1.5
39.8
2.6
4518.4
2.4
94.3 n.s.
1325.8
93.5 *
827.2
98.3 n.s.
367.0
97.3 n.s.
819.6
97.2 n.s.
47035.2
98.5 n.s.
86.2 *
1159.8
84.7 *
676.1
84.7 *
354.7
91.7 *
675.4
84.5 *
31280.1
78.4 *
97.5 n.s.
1350.8
98.1 n.s.
823.0
100.8 n.s.
367.8
95.2 *
803.1
98.9 n.s.
44461.1
101.9 n.s.
88.7 *
1244.6
86.1 *
728.1
81.9 *
373.2
98.6 n.s.
736.0
84.8 *
35346.8
66.7 *
952.2
98.2 n.s.
1496.0
98.3 n.s.
1893.2
1862.9
34.8
1692.8
1514.5
1718.6
Morex
1617.8
Stratus
Cam/B1
Georgia
Harmal
SD
Lubuski
5
96.7 n.s.
51589.7
97.9 n.s.
96.4 n.s.
48115.9
98.3 n.s.
762.3
93.4 n.s.
49940.5
99.4 n.s.
810.9
810.3
99.2 n.s.
392.3
98.1 n.s.
937.8
811.6
100.4 n.s.
382.2
99.8 n.s.
874.7
100.7 n.s.
1423.1
100.6 n.s.
1805.3
Cam/B1
94.9 n.s.
40326.6
98.7 n.s.
52212.8
100.1 n.s.
47104.2
98.7 n.s. 102.1 n.s. 101.7 n.s.
718.0
99.6 n.s.
103.6
n.s.
100.3
n.s.
100.2
n.s.
828.2
399.5
99.1 n.s.
390.3
99.7 n.s.
869.8
386.0
99.6 n.s.
907.4
99.1 n.s.
101.1
n.s.
101.1
n.s.
100.5
n.s.
896.0
1493.7
1423.4
1457.6
99.1 n.s.
100.8
n.s.
101.6
n.s.
100.4
n.s.
1419.6
1885.9
Georgia
1822.8
Harmal
1847.9
Lubuski
1805.6
M.Dingo
395.5
98.8 n.s.
922.8
98.5 n.s.
1476.0
98.9 n.s.
1871.5
Maresi
1
(%%)
PIcs
(%%)
RC/CS
(%%)
DIo/CS
(%%)
ETo/CS
(%%)
TRo/CS
(%%)
ABS/CS
SI
Susza
SI
Susza
SI
Susza
SI
Susza
SI
Susza
SI
Susza
Genotyp
Dzień suszy
1584.2
90.8 *
1215.8
88.9 *
727.1
87.4 *
368.5
97.6 n.s.
680.5
84.7 *
33837.2
74.5 *
7.8
130.0
9.4
95.8
10.8
19.6
6.2
87.0
10.4
8033.4
16.5
Stratus
136.5
SD
89.8 n.s.
60.9 *
77.6 *
49.8 *
21057.8
71.2 *
580.9
90.5 *
102.0
n.s.
731.3
350.0
70.2 *
575.1
77.8 *
1094.1
80.6 *
1444.1
M.Dingo
391.3
91.3 n.s.
769.8
93.6 n.s.
1277.3
95.5 n.s.
1668.5
Maresi
27982.7 36658.9
76.7 *
649.2
97.5 n.s.
380.2
78.1 *
654.9
79.2 *
1106.0
83.2 *
1486.2
Morex
10
60.5 *
25511.9
80.3 *
584.3
100.9
n.s.
362.7
83.1 *
629.3
87.3 *
1053.0
90.4 *
1415.7
Lubuski
83.1 *
35169.2
92.5 n.s.
724.5
97.3 n.s.
376.6
91.1 n.s.
742.6
93.4 n.s.
1264.4
94.3 n.s.
1641.0
Harmal
37.3 *
14744.9
61.7 *
470.1
97.4 n.s.
374.2
59.9 *
480.2
65.4 *
878.7
72.5 *
1252.9
Georgia
7.3
60.8
2.6
8.8
7.6
61.6
5.9
74.7
4.7
78.0
SD
82.2 *
13.7
36226.6 6627.6
87.*
663.4
82.9 *
328.5
82.5 *
678.7
84.1 *
1105.8
83.8 *
1434.4
Cam/
B1
96.8 n.s.
43520.3
98.4 n.s.
818.5
91.9 *
359.9
94.7 n.s.
794.7
94.1 n.s.
1334.8
93.6 n.s.
1694.7
Stratus
90.0 n.s.
46441.5
86.6 *
808.6
94.1 *
373.8
90.6 *
815.3
86.1 *
1318.4
87.8 *
1692.2
Morex
82.1 *
40357.1
90.1 *
777.1
97.4 n.s.
383.3
89.6 *
782.4
90.4 n.s.
1298.4
91.9 n.s.
1681.8
Maresi
67.6 *
30701.3
80.0 *
677.2
94.5 *
367.5
80.1 *
685.2
80.4 *
1172.4
83.3 *
1539.8
M.Dingo
Tab. 3. Aktywność fotochemiczna PSII drugiego (środkowego) liścia siewek jęczmienia na podstawie testu JIP i wartość wskaźnika SI w różnych okresach wegetacji w warunkach suszy. Gwiazdka
403
404
97.1 n.s.
1540.6
99.5 n.s.
955.4
103.1
n.s.
392.1
1430.2
97.7 n.s.
841.8
90.1 n.s.
388.5
890.2
96.8 n.s.
53363.3
95.8 n.s.
834.6
96.7 n.s.
45958.4
75.9 *
104.6 n.s. 98.1 n.s.
901.8
99.2 n.s.
99.1 n.s.
89.7 n.s.
53532.6
99.0 n.s.
922.2
97.5 n.s.
379.7
95.8 n.s.
1470.3
96.2 n.s.
1850.0
1932.7
1818.7
Georgia
Harmal
Lubuski
5
2.1
51.5
2.6
12.9
3.5
48.3
1.6
60.2
1.6
58.3
98.4 n.s.
5.8
55421.7 5974.4
96.0 n.s.
883.9
92.1 n.s.
378.6
102.4
n.s.
924.4
93.4 n.s.
1463.4
93.1 n.s.
1841.9
Cam/B1
SD
93.2 n.s.
28780.3
103.0 n.s.
743.1
101.0 n.s.
458.8
106.7 n.s.
819.1
104.6 n.s.
1500.3
103.7 n.s.
1959.1
Stratus
93.1 n.s.
98.4 n.s.
39672.1
98.8 n.s.
101.3
n.s.
32614.8
828.4
100.9 n.s.
442.7
100.2 n.s.
917.8
100.3 n.s.
1628.3
100.4 n.s.
2070.9
Maresi
824.9
95.6 n.s.
443.2
105.7
n.s.
879.2
99.5 n.s.
1545.8
98.6 n.s.
1988.9
Morex
92.0 n.s.
35300.7
102.0 n.s.
777.4
97.4 n.s.
433.4
104.7 n.s.
878.0
100.2 n.s.
1514.8
99.5 n.s.
1948.3
M.Dingo
1
99.8 n.s.
35014.7
87.7 n.s.
27342.7
84.6 n.s.
101.3 n.s.
46165.2
101.9 n.s.
105.3
n.s.
35538.9
866.8
777.8
103.0 n.s.
101.2
n.s.
102.7
n.s.
712.3
427.9
102.2 n.s.
424.1
103.9
n.s.
931.5
458.8
96.1 n.s.
872.8
101.8 n.s.
102.1
n.s.
100.5
n.s.
784.9
1587.5
1481.3
102.1 n.s.
101.9
n.s.
101.0
n.s.
1449.7
2015.4
Cam/B1
1905.4
Georgia
1908.5
Harmal
101.4 n.s. 99.0 n.s.
830.7
101.0 n.s.
445.7
99.9 n.s.
851.3
100.6 n.s.
1580.2
100.7 n.s.
2025.8
Lubuski
(%%)
PIcs
(%%)
RC/CS
(%%)
DIo/CS
(%%)
ETo/CS
SI
Susza
SI
Susza
SI
Susza
SI
Susza
SI
Susza
TRo/
CS
(%%)
SI
Susza
(%%)
ABS/
CS
Genotyp
Dzień suszy
1426.6
96.7 n.s.
869.9
94.7 n.s.
389.0
99.4 n.s.
875.8
95.8 n.s.
50534.7
105.0
6.0
73.5
7.2
21.0
4.9
80.2
8.3
6743.5
88.3 n.s.
97.3 n.s.
5.5
12.4
1815.6
Stratus
123.8
SD
88.8 n.s.
49535.6
91.9 *
823.2
94.9 n.s.
370.8
98.1 n.s.
851.0
92.3 n.s.
1348.5
92.9 n.s.
1719.3
Morex
95.5 n.s.
46932.9
93.8 n.s.
786.8
97.6 n.s.
392.3
97.6 n.s.
864.2
96.0 n.s.
1377.9
96.3 n.s.
1770.2
Maresi
77.5 *
36862.8
83.7 *
712.2
86.3 *
336.0
83.7 *
715.2
85.3 *
1221.4
85.6 *
1557.4
M.Dingo
10
51713.3
684.3
79.4 *
344.3
91.5 n.s.
640.2
75.7 *
33429.4
839.0
90.7 *
390.1
100.4
n.s.
835.1
94.8 n.s.
45427.9
778.8
88.6 *
374.7
100.0
n.s.
71.4 *
40373.8
88.6 *
64.2 *
103.0 n.s.
80.8 *
95.5 n.s.
94.2 n.s.
78.7 *
856.8
1112.9
1395.0
1277.2
747.2
94.8 n.s.
83.1 *
96.5 n.s.
95.4 n.s.
100.7 n.s.
373.2
98.7 n.s.
865.2
97.3 n.s.
1361.5
96.8 n.s.
1734.8
1457.2
1785.1
1651.9
Cam/B1
Georgia
Harmal
Lubuski
9.9
5163.5
3.8
40.7
3.9
8.4
6.3
44.2
2.9
41.9
2.5
44.4
SD
1912.7
Maresi
1510.0
94.3 n.s.
54298.2
94.3 n.s.
910.4
95.9 n.s.
865.4
46285.5
91.8 n.s. 90.0 n.s.
55946.5
398.3
87.8 n.s.
847.8
91.4 n.s.
1447.4
93.6 n.s.
1845.7
M.Dingo
70.3 *
42505.8
86.9 *
821.4
99.8 n.s. 102.6 n.s.
402.7
97.9 n.s. 93.8 n.s.
936.0
100.6
n.s.
391.8
97.2 n.s.
104.0
n.s.
103.4
n.s.
386.4
885.3
949.5
97.9 n.s. 98.1 n.s.
1521.9
98.5 n.s. 98.4 n.s.
1913.7
Morex
938.8
98.9 n.s.
1532.9
98.3 n.s.
1919.3
Stratus
Tab. 4. Aktywność fotochemiczna PSII trzeciego (górnego) liścia siewek jęczmienia na podstawie
testu JIP i wartość wskaźnika SI w różnych okresach wegetacji w warunkach suszy. Gwiazdka
405
Celem porównania wrażliwości procesów fotochemicznych poszczególnych odmian na suszę, wyliczone zostały wskaźniki SI (Tab. 2-4). Hamowanie aktywności tych procesów u zdecydowanej większości odmian
nie ujawniło się w pierwszym dniu suszy, ale stało się dobrze widoczne
w 5 dniu, a jeszcze silniej w dniu 10. Wyjątkową wrażliwość na suszę wykazała odmiana M.Dingo, której najstarszy liść (dolny) silnie obniżył niemal
wszystkie wartości SI już w 1 dniu. Wśród trzech badanych liści siewek,
starsze pośród nich (1 i 2 liść) charakteryzowały się większą wrażliwością
procesów fotochemicznych na suszę niż liść młodszy (3 liść). Świadczą
o tym wyraźnie obniżone wartości wskaźnika SI wszystkich parametrów
fluorescencji 1 i 2 liścia zarówno w 5 jak i 10 dniu suszy. Silny spadek wartości SI w reakcji na stres suszy wykazał wskaźnik efektywności funkcjonowania PSII (PICS). Największą tolerancyjność obu starszych liści - według PIcs - stwierdzono w 10 dniu suszy u odmian Cam/B1 oraz Harmal,
najmniejszą zaś u odmiany Georgia. Fotochemiczny wskaźnik PICS silniej
niż inne wskaźniki aktywności fotochemicznej zróżnicował badane odmiany pod względem reakcji na suszę. Zróżnicowanie odmian pod względem PICS powiększało się wraz z czasem działania suszy i było największe
u liścia najstarszego. W 5 i 10 dniu rozstęp wartości wskaźnika wrażliwości
(SI) dla PICS odmian wynosił dla tego właśnie liścia odpowiednio ok. 63%
i 181%. Podobną prawidłowość zaobserwowano dla innych wskaźników
testu JIP. Rezultat ten sugeruje, że największego zróżnicowania odmian
pod względem wrażliwości na suszę należy oczekiwać po 10 dniach suszy. Kinetyka indukcji fluorescencji chlorofilu jest przydatna w określaniu
tolerancji roślin na stres temperaturowy, herbicydowy, w ocenie przeżywalności siewek, a także w hodowli do selekcjonowania roślin o pożądanym genotypie [Jansen i in.1995, Smille i in.1987]. Ponieważ na aktywność
fotochemiczną w suszy najstarszego liścia mogły nałożyć się specyficzne
efekty współdziałania ze starzeniem się, bezpiecznie będzie można przyjąć,
że zróżnicowanie aktywności fotochemicznej należy badać po 10 dniach
suszy na 2 liściu. Pomiary takie okazały się - jak wynika z przytoczonych
danych - reprezentatywne dla pozostałych liści, a zarazem są wykonywane
w okresie największego zróżnicowania reakcji odmian na suszę.
406
WNIOSKI
• Przedłużanie czasu działania stresu powiększa wyraźnie z hamowanie
procesów fotochemicznych u siewek jęczmienia.
• Przedłużanie suszy bardziej wpływa na ilość energii transportowanej niż
na wydajność jej przepływu przez PSII.
• Wrażliwość (SI) na suszę liści młodszych jest mniejsza u niż starszych.
• Zróżnicowanie odmian pod względem wrażliwości na suszę jest większe
po dłuższej (10 dni) suszy.
LITERATURA
Bac S., Koźmiński C., Rojek M., 1998 r. Agrometeorologia. Wydawnictwo Naukowe
PWN, s.130-133,172-173, 261-270.
Flexas J., Escalona J. M., Evain S., Gulías J., Moya I., Barry Osmond C., Medrano
H., 2002 r. Steady-state chlorophyll fluorescence (Fs) measurements as a tool to
follow variations of net CO2 assimilation and stomatal conductance during waterstress in C3 plants. Physiologia plantarum 114, s. 231–240.
Gonzàlez A., Martín I., Luis Ayerbe L., 1999r. Barley yield in water-stress conditions.
The influence of precocity, osmotic adjustment and stomatal conductance. Field
Crops Research 62. s. 23-34.
Jansen L. H. J., van Oevaren J. C., van Hasselt P. R., Kuiper P. J. C.: Genotypic
variation in chlorophyll fluorescence parameters, photosynthesis and growth of
tomato grown at low temperature and low irradiance. Photosynthetica, 31, 301314, 1995.
Lazár, D., Pospíšil, P.: Mathematical simulation of chlorophyll a fluorescence rise
measured with3-(3’,4’-dichlorophenyl)-1,1dimetylurea-treated barley leaves at
room and high temperatures. Eur. biophys. J.28: 468-477, 1999.
Lazár, D.: Chlorophyll a fluorescence induction. – Biochim. biophys. Acta 1412: 1-28,
1999.
LI Rong-hua, GUO Pei-guo, Baum M., Grando S., Ceccarelli S.,2006 r. Evaluation
of Chlorophyll Content and Fluorescence Parameters as Indicators of Drought
Tolerance in Barley. Agricultural Sciences in China5 (10), s. 751-757.
Michałek W., Sawicka B., 2005 r Zawartość chlorofilu i aktywność fotosyntetyczna średnio późnych odmian ziemniaka w warunkach pola uprawnego
w środkowo-wschodniej Polsce; Acta Agrophysica, 2005, 6 (1), 183-195
407
M. Rapacz, J. Kościelniak, B. Jurczyk, A. Adamska, M. Wójcik J. 2010, Different patterns of physiological and molecular response to drought in seedlings of malt- and
feed-type barleys (Hordeum vulgare). Agronomy & Crop Science (2010) ISSN
0931-2250
Smillie C. R., Nott R., Hetherington S. E., Oquist G.: Chilling injury and recovery
in detached and attached leaves measured by chlorophyll fluorescence. Physiol.
Plant., 69, 419-427, 1987.
Srivastava, A., Strasser R. J. Constructive and destructive actions of light on the photosynthetic apparatus. Journal of Scientific and Industrial Research 56, 133-148,
1977.
Strasser B. J., Strasser R. J. Measuring fast fluorescence transients to adress environmental questions: the JIP test. In: Mathis P (eds). Photosynthesis: from light to
biosphere. Kluwer Academic, Dordrecht, pp. 977–980, 1995.
Strasser R. J., Srivatava A., Tsimilli-Michael M. The fluorescence transient as tool
to characterize and screen photosynthetics samples. In: Yunus M, Pathre U, Mohanty P (eds). Probing photosynthesis: mechanism, regulation and adaptation.
Taylor and Francis, Bristol, pp. 45–483, 2000.
mgr inż. Katarzyna Stalmach, mgr inż. Małgorzata Borek
mgr inż. Katarzyna Śniegowska
Katedra Fizjologii Roślin
[email protected]
Opiekun naukowy: prof. dr hab. Janusz Kościelniak
Finansowanie projektu POLAPGEN-BD i zgodność z Programem Operacyjnym
Innowacyjna Gospodarka 2007-2013
408
Marta Strzetelska, Anna Latacz
Ewa Stypka, Krystyna Pierzchała-Koziec
EPISTEME
14/2012
s.409-416
ISSN 1895-4421
PROTEKCYJNA ROLA MET-ENKEFALINY W CENTRALNYM UKŁADZIE NERWOWYM W WARUNKACH HIPOGLIKEMII
PROTECTION ROLE OF MET-ENKEPHALIN IN CENTRAL NERVOUS SYSTEM IN HYPOGLYCEMIC CONDITIONS
Abstrakt. Met-enkefalina jest endogennym peptydem opioidowym występującym
w ośrodkowym układzie nerwowym i tkankach obwodowych pełniącym rolę ochronną podczas stresu lub przy braku składników energetycznych. Szczególnie wrażliwą
strukturą na niedobór glukozy jest podwzgórze. Celem badania było określenie wpływu hipoglikemii na stopień in vitro wydzielania Met-enkefaliny z podwzgórza myszy kontrolnych i traktowanych naltreksonem, antagonistą receptorów opioidowych.
W mediach hodowlanych oznaczono stężenie wolnej Met-enkefaliny metodą radioimmunologiczną, a białka metodą BCA (metoda z kwasem bis-cynchoninowym).
Naltrekson wywołał istotny spadek spontanicznego wydzielania Met-enkefaliny
z podwzgórza, który został pogłębiony przez warunki hipoglikemiczne hodowli (obniżenie stężenia glukozy o 50%). Natomiast zmniejszające się w czasie spontaniczne wydzielanie opioidu z podwzgórza myszy kontrolnych było istotnie spowolnione
w warunkach niedostatku glukozy. Otrzymane wyniki wyraźnie wskazują na protekcyjną rolę endogennych peptydów opioidowych w centralnym układzie nerwowym
w warunkach niedoboru glukozy.
Słowa kluczowe: Met-enkefalina, podwzgórze, hipoglikemia
Summary. Met-enkephalin is an endogenous opioid peptide found in the central
nervous system and peripheral tissues acting as a protector during stress or in the
absence of energy. Particularly sensitive brain structure for glucose deficiency is hypothalamus. The aim of this study was to determine the effect of hypoglycemia on
the degree of in vitro release of Met-enkephalin in the hypothalamus of the control
mice and treated with naltrexone. In the media free Met-enkephalin was indicated by
radioimmunoassay and the protein by BCA. Naltrexone caused significant decrease
of spontaneous secretion of Met-enkephalin from the hypothalamus, which was exacerbated by the hypoglycemic conditions (reduced glucose levels by 50%). While
decreasing in time the spontaneous secretion of hypothalamic opioid of control mice
was significantly slowed down in hypoglycemic conditions. The results clearly indicate the protective role of endogenous opioid peptides in the central nervous system
in conditions of glucose deficiency.
Key words: Met-enkephalin, hypothalamus, hypoglycemia
409
WSTĘP
Wyróżniamy trzy podstawowe grupy peptydów opioidowych: endorfiny,
enkefaliny i dynorfiny. Endorfiny syntezowane są z propiomelanokortyny,
enkefaliny z preproenkefaliny natomiast dynorfiny z preprodynorfiny [Rao
i in.1986]. Receptory opioidowe należą do rodziny receptorów błonowych
metabotropowych sprzężonych z białkiem G tzw. GPCR i po aktywacji działają w sposób zależny od stężenia liganda [Holzer 2009]. Receptory opioidowe dzielą się na klasy mu-(μ) (MOP-R), kappa-(κ) (KOP-R), delta-(δ)
(DOP-R) i NOP-R (ORL-1) [Henriksen i Willoch 2008], a ich ilość jest różna
w zależności od struktury mózgu [Simon 1986]. Największa jest w okolicy
jądra półleżącego, jądra migdałowatego, prążkowia oraz warstwy I i III kory
mózgowej [Templer i in. 1990]. Endogenni agoniści receptorów opioidowych to między innymi pentapeptydy takie jak Met-enkefalina i Leu-enkefalina z grupy enkefalin. Są one neurotransmiterami występującymi naturalnie
w mózgu wielu gatunków zwierząt [Koneru i in. 2009]. Endogenne opioidy
są odpowiedzialne między innymi za analgezję, zmiany ciśnienia krwi umożliwiające np. przystosowanie do wysiłku fizycznego, reakcję organizmu na
stres [Pierzchała i Loon 1990], zmiany w zachowaniu dotyczące pobierania
pokarmu czy polepszenia nastroju oraz posiadają szeroki wpływ na układ pokarmowy, co związane jest z regulacją motoryki, odczuwaniem łaknienia czy
wydzielaniem różnorodnych hormonów [Członkowski i in. 1989, Vuong i in.
2010]. Opioidy stymulują wydzielanie soku żołądkowego, natomiast podawanie naltreksonu powoduje spadek jego wydzielania [Olsen i in. 1982, Minowa i in. 2003]. Małe ilości morfiny powodują wzrost łaknienia i pragnienia, natomiast przy dużych dawkach pobranie płynów spada [Reid 1985].
Aktywacja receptorów μ-opioidowych w komórkach mięśniówki przewodu
pokarmowego powoduje hamowanie perystaltyki jelit, opróżnienia żołądka, wzrost skurczów mięśnia zwieracza oraz zahamowanie sekrecji jonów
i płynów co prowadzi do zaparć, jednego z najczęstszych i najbardziej uciążliwych niepożądanych efektów terapii przeciwbólowej [Holzer 2009]. Ze
zmniejszeniem pobierania pokarmu spada ilość glukozy we krwi. Niedobór
tlenu i składników odżywczych wpływa negatywnie na komórki mózgowe.
W warunkach niedokrwienia, podczas nagłego zatrzymania przepływu krwi,
jako jedne z pierwszych ulegają trwałemu uszkodzeniu i obumierają. Celem
badania było określenie stopnia wydzielania Met-enkefaliny z podwzgórza w
warunkach hipoglikemii.
MATERIAŁY I METODY
Badania wykonano na 12 myszach (n = 6 + 6) szczepu Swiss o średniej masie ciała 26 g. Zwierzęta utrzymywane były w standardowych warunkach,
w klatkach ze stałym dostępem do wody i paszy. Doświadczenie prowadzo410
Protekcyjna rola met-enkefaliny w centralnym ukadzie nerwowym...
no na dwóch grupach myszy. Grupa kontrolna otrzymywała dootrzewnowe
iniekcje soli fizjologicznej (100 µl), natomiast doświadczalna dootrzewnowe
iniekcje naltreksonu (3 mg/kg m.c) godzinę przed pobraniem tkanek. Próbki
podwzgórza skierowano do wydzielania w buforze Krebsa z dodatkiem albuminy bydlęcej BSA (0,3 g glukozy/100 ml, 0,1 g BSA/100 ml ) lub hipoglikemicznym buforze Krebsa (0,15 g glukozy/100 ml). Po okresie stabilizacji (10
minut, 37oC) przystąpiono do właściwej inkubacji przekładając próbki do
kolejnych dołków z buforem wg schematu: A – 10 min w roztworze Krebsa
(stabilizacja), B – 60 min w warunkach hipoglikemii, C – 60 min w warunkach hipoglikemii, D – 10 min w roztworze Krebsa (stabilizacja).
Po zakończeniu inkubacji w mediach oznaczono stężenie wolnej Met-enkefaliny metodą radioimmunologiczną. Wykonano kolumny z Porapakiem
Q, przygotowanym dzień wcześniej przez dodanie 25 g substancji do 350
ml absolutnego etanolu. Na krótko przed podaniem próbek kolumny zostały trzykrotnie przemyte 1 ml wody destylowanej i odsączone. Następnie
dodawano po 300 µl medium hodowlanego. Wolna Met-enkefalina została
w całości związana na kolumnach z Porapakiem. Met-enkefalina została
eluowana dwukrotnym przelaniem kolumn 1 ml stężonego 96 % etanolu.
Próbki zostały zliofolizowane i poddane oznaczeniu radioimmunologicznemu [Pierzchała i in.1987].
Pozostałe tkanki zhomogenizowano w 0,5 ml buforze fosforanowego o pH = 6.5,
a następnie zwirowano w czasie 10 minut w 12 000 x g. Ilość białka całkowitego
w homogenacie oznaczono metodą BCA (QuantiPro BCA Assay Kit).
Rys. 1. Schemat protokołu użytego do zbadania wpływu jednorazowej iniekcji
naltreksonu na poziom wydzielania Met-enkefaliny z podwzgórza
w warunkach hipoglikemii
Otrzymane wyniki zostały poddane analizie statystycznej przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji. Prawdopodobieństwo na poziomie 0,05 było
uznawane za wskaźnik różnic między średnimi. Wyniki zostały przedstawione jako średnie ± SEM.
411
Rys. 2, Stopień wydzielania Met-enkefaliny z podwzgórza w określonych przedziałach
czasowych inkubacji w grupie kontrolnej i traktowanej naltreksonem w warunkach
hipoglikemii. Wyniki podano jako średnie ± SEM, różnice statystyczne między grupami
(*) określono z prawdopodobieństwem p<0,05. Użyte skróty: K – kontrola, Nal
-naltrekson, Hip- hipoglikemia
WYNIKI
Warunki hipoglikemii spowodowały wzrost całkowitego wydzielenia Met-enkefaliny o około 13,8 % w stosunku do wydzielania spontanicznego
w grupie kontrolnej. Natomiast w grupie doświadczalnej naltrekson wywołał istotny spadek spontanicznego wydzielania Met-enkefaliny z podwzgórza
(1,396±0,05 pg/mg białka) o około 38 % w stosunku do grupy kontrolnej
(2,257±.0,1 pg/mg białka), który został pogłębiony przez warunki hipoglikemiczne inkubacji (obniżenie stężenia glukozy o 50%), powodujące obniżenie
wydzielania Met-enkefaliny o 47,1% (1,194±0,05 pg/mg białka) w stosunku
do wydzielania spontanicznego w kontroli. Zarówno w grupie kontrolnej jak
i doświadczalnej największe wydzielanie spontaniczne zaobserwowano podczas okresu stabilizacji oraz w ostatnich 10 min inkubacji (94 % całkowitego
wydzielania). Różnice w stężeniu Met-enkefaliny w kolejnych przedziałach
czasowych inkubacji w stosunku do okresu stabilizacji były statystycznie
istotne. Spontaniczne wydzielanie opioidu z podwzgórza myszy kontrolnych
było istotnie spowolnione w warunkach niedostatku glukozy w grupie doświadczalnej.
412
DYSKUSJA
Wzmożone wydzielanie Met-enkefaliny z komórek podwzgórza w warunkach hipoglikemii sugeruje rolę ochronną jaką może ten opioid spełniać
w stosunku do komórek nerwowych. Inne badania potwierdzają neuroprotekcyjne działanie agonistów receptorów opioidowych, których podanie
w warunkach hipoglikemii zmniejsza uszkodzenia neuronów kory mózgowej
[Monyer i Choi 1988], hipokampa i prążkowia [Yang i in. 2011]. O neuroprotekcyjnej roli opioidów świadczą również inne badania [Zhao i in. 2006,
Pateliya i in. 2008, Borlongan i in. 2009, Kawalec i in. 2011, Yang i in. 2011].
Rola ta może wynikać z faktu ich oddziaływania na spadek stężenia cytotoksycznych lipopolisacharydów i interferonu gamma w komórkach glejowych biorących udział w ochronie komórek nerwowych przed degeneracją [Gwak i Zuo
2010], aktywność kinazy białkowej C (nPKC) [Liu i in. 2008] lub na spadek stężenia pro-apoptotyczych białek Bax czy Hsp 70 [Chen i in. 2008]. Inne badania
nie potwierdziły neuroprotekcyjnej funkcji agonistów receptorów opioidowych
(np.DADLE- syntetycznego peptydu opioidowego) na komórki nerwowe w warunkach niedokrwienia [Iwata i in. 2007]. Badania Ammon-Treiber i in.[2005]
prowadzone na komórkach nerwowych hipokampa w hodowli in vitro wykazały
szkodliwe działanie endogennych opioidów na te komórki w warunkach hipoglikemii poprzez znaczne opóźnianie proliferacji. Podawanie antagonistów receptorów opioidowych zmniejszało ten negatywny efekt, a morfina kumulowała
negatywne działanie endogennych opioidów. Natomiast podawanie morfiny na
kilka-kilkanaście godzin przed pobraniem tkanek do doświadczenia wpływało
neuroprotekcyjnie na komórki i przyspieszyło ich odnowę. Stężenie wydzielanej w doświadczeniach in vivo i in vitro Met-enkefaliny w mózgu zależy od
warunków hodowli i podawanych zwierzęciu substancji. W prezentowanym
doświadczeniu krótkotrwałej inkubacji zaobserwowano znaczny spadek wydzielania Met-enkefaliny z podwzgórza po podaniu naltreksonu. Natomiast
inne badania, gdzie długotrwale blokowano receptory opioidowe, donoszą
o istotnym wzroście stężenia Met-enkefaliny [Osborne i Herz 1980, Templer
i in.1984, 1990, Voung i in. 2010].
WNIOSKI
• Blokowanie receptorów opioidowych powoduje spadek wydzielania endogennych opioidów z podwzgórza.
• Warunki hipoglikemii pogłębiają hamujące działanie naltreksonu na wydzielanie Met-enkefaliny z podwzgórza.
• Warunki hipoglikemii powodują przyspieszenie oraz wzrost całkowitego
wydzielenia Met-enkefaliny.
• Endogenne peptydy opioidowe pełnią protekcyjną rolę w centralnym
układzie nerwowym w warunkach niedoboru glukozy.
413
LITERATURA
Ammon-Treiber S. Stolze D. Schröder H. Loh H. Höllt V. 2005. Effects of opioid
antagonists and morphine in a hippocampal hypoxia/hypoglycemia model. Neuropharmacology, 49(8):1160-90.
Borlongan C. Hayashi T. Oeltgen P. Tsung-Ping S. Wang Y. 2009. Hibernation-like
state induced by an opioid peptide protects against experimental stroke. BMC
Biology, 7:31.
Chen Q. Cui J. Zhang Y. Yu L. 2008. Prolonged morphine application modulates Bax
and Hsp70 levels in primary rat neurons. Neuroscience Letters, 441(3):311-314.
Członkowski A. Makulska-Nowak H.E. 1989. Opioidy endogenne. PZWL. W-wa.
Gwak M. Li L. Zuo Z. 2010. Morphine preconditioning reduces lipopolysaccharide and interferon-gamma-induced mouse microglial cell injury via delta
1 opioid receptor activation. Neuroscience, 167(2):256-60.
Henriksen G. Willoch F. 2008. Imaging of opioid receptors in the central nervous system.
Brain,131(5): 1171-96.
Holzer P. 2009. Opioid receptors in the gastrointestinal tract. Regulatory Peptides,
155(1-3): 11–17.
Iwata M. Inoue S. Kawaguchi M. Kurita N. Horiuchi T. Nakamura M. Konishi N.
Furuya H. 2007. Delta opioid receptors stimulation with [D-Ala2, D-Leu5] enkephalin does not provide neuroprotection in the hippocampus in rats subjected to
forebrain ischemia. Neuroscientific Letters, 414(3):242-6.
Kawalec M. Kowalczyk J. Beresewicz M. Lipkowski A. Zablocka B. 2011. Neuroprotective potential of biphalin, multireceptor opioid peptide, against excitotoxic
injury in hippocampal organotypic culture. Neurochemical Resources, 36(11):
2091-2095.
Koneru A. Satyanarayana S. Rizwan S. 2009. Endogenous opioids: their physiological
role and receptors. Global Journal of Pharmacology, 3(3): 149-153.
Liu Y. Li J. Yang J. Ji F. Bu X. Zhang N. Zhang B. 2008. Inhibition of PKCgamma
membrane translocation mediated morphine preconditioning-induced neuroprotection against oxygen-glucose deprivation in the hippocampus slices of mice.
Neuroscience Letters, 444(1):87-91.
Minowa S. Ishihara S. Tsuchiya S. Horie S. Watanabe K. Murayama T. 2003. Involvement of glutamate and γ-amino-butyric acid receptor systems on gastric acid
secretion induced by activation of κ-opioid receptors in the central nervous system
in rats. British Jurnal of Pharmacology, 138(6): 1049–1058.
414
Monyer H. Choi D. 1988. Morphinans attenuate cortical neuronal injury induced by
glucose deprivation in vitro. Brain Resources, 12;446(1):144-8.
Olsen P. Kirkegaard P. Petersen B. Christiansen J. 1982. Effect of naloxone on met-enkephalin-induced gastric acid secretion and serum gastrin in man. Gut, 23(1):
63-65.
Osborne H. Herz A.1980. K+-evoked release of Met-Enkephalin from rat striatum in
vitro: effect of putative neurotransmitters and morphine. Archives of Pharmacology, 310(3):203-209.
Pateliya B. Singh N. Jaggi A. 2008. Possible role of opioids and KATP channels in
neuroprotective effect of postconditioning in mice. Biological and Pharmaceutical
Bulletin, 31(9):1755-60.
Pierzchała K. Houdi A. Van Loon GR. 1987. Nicotine-induced alterations in brain
regional concentrations of native and cryptic Met- and Leu-enkephalin. Peptides,
8(6):1035-43
Pierzchała K. Glen R. Van Loon GR. 1990. Plasma native and peptidase-derivable responses to restraint stress in rats Met-Enkephalin. Jurnal of Clinical Investment,
85: 861-73.
Rao S. Rapaka R. Hawks R. 1986. Opioid peptides: molecular pharmacology, biosynthesis, and analysis, NIDA Research Monograph 70.
Reid L. 1985. Endogenous opioid peptides and regulation of drinking and feeding.
The american Jurnal of Clinical Nutrition, 42(5):1099-1132
Rónai A. 2004. Natural opioid peptides, synthetic analogs, peptidases: pharmacological analysis and drug design, Ph.D. Dissertation, Department of Pharmacology
and Pharmacotherapy Semmelweis University, Budapest.
Simon E. 1986. Progress in the characterization of the opioid receptor subtypes: peptides as probes. Future directions, NIDA Research Monograph 70.
Tempel A. Gardner E. Zukin R. 1984. Visualization of opiate receptor upregulation by light
microscopy autoradiography. Proc Natl Acad Sci U S A., 81(12): 3893-3897.
Tempel A. Kessler J. Zukin S. 1990. Chronic naltrexone treatment increases expression of preproenkephalin and preprotachykinin mRNA in discrete brain regions.
Neuroscience, 10(3): 741-747.
Vuong C. Stan H. M. Van Uum, O’Dell L. Lutfy K. Friedman T. 2010. The effects of
opioids and opioid analogs on animal and human endocrine systems. Endocrine
Reviews, 31(1): 98 –132.
415
Yang L. Shah K. Wang H. Karamyan V. Abbruscato T. 2011. Charakteryzation of
neuroprotective effects of biphalin, an opioid receptor agonist, in a model of focal brain ischemia. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,
339(2):499-508.
Yang L. Wang H. Shah K. Karamyan V. Abbruscato T. 2011. Opioid receptor agonists
reduce brain edema in stroke. Brain Research, 1383:307-16.
Zhao P. Huang Y. Zuo Z. 2006. Opioid preconditioning induces opioid receptor-dependent delayed neuroprotection against ischemia in rats. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology, 65(10): 945-52.
mgr inż. Marta Strzetelska, mgr Anna Latacz, Ewa Stypka
prof. dr hab.inż. Krystyna Pierzchała-Koziec
Katedra Fizjologii i Endokrynologii Zwierząt
Wydział Hodowli i Biologii Zwierząt
Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Krystyna Pierzchała-Koziec
Praca finansowana z DS.3243/KFEZ/2011
416
Katarzyna Śniegowska
Katarzyna Stalmach
EPISTEME
14/2012
s.417-421
ISSN 1895-4421
THE COMPARISON OF HVA1 AND SRG6 GENES EXPRESSION
PROFILES IN SEEDLING AND FLOWERING STAGE IN A SPRING
BARLEY (HORDEUM VULGARE L.) CULTIVARS DURING
DROUGHT TREATMENT
PORÓWNANIE PROFILU EKSPRESJI GENÓW HVA1 ORAZ SRG6
W STADIUM SIEWKI I KWITNIENIA U ROŚLIN JĘCZMIENIA JAREGO
(HORDEUM VULGARE L.) W ODPOWIEDZI NA STRES SUSZY
Summary. Drought is considered to be the main environmental factor causing lower
crop productivity, including that of barley. Drought tolerance in this crop is highly
correlated with the expression of two genes: HVA1 (Hordeum vulgare aleurone 1)
encodes a LEA (Late Embryogenesis Abundant) protein and SRG6 (stress-responsive
gene 6) encodes a hydrophobic regulatory protein. A research was conducted in seven cultivars of spring barley drought-treated in seedling and heading stage. Level of
HVA1 and SRG6 gene expression during drought stress were carried out by real time
PCR method after 10 days drought treatment. In the present study an increase in SRG6
gene expression in seedlings compared to the later stage was showed. Differentiation
of HVA1 gene expression between growing stages in drought was noticed.
Key words: drought stress, the gene expression profile, HVA1, SRG6, spring barley
Abstrakt. Susza jest jednym z czynników środowiskowych obniżających plon zbóż,
w tym także jęczmienia. Jego odporność na stres suszy jest ściśle związana z ekspresją dwóch genów: HVA1 (Hordeum vulgare aleurone 1) gen kodujący białko z grupy
LEA (Late Embryogenesis Abundant) oraz Srg6 (stress-responsive gene 6) kodujący
hipotetyczny czynnik transkrypcyjny. Badania przeprowadzono na siedmiu odmianach jęczmienia jarego w stadium siewki i kwitnienia. Poziom ekspresji badanych
genów określono za pomocą metody Real-Time PCR po 10-dniowym stresie suszy.
Wykazano wzrost poziomu ekspresji genu SRG6 w stadium kwitnienia w porównaniu ze stadium przed kwitnieniem. Zauważono także zróżnicowanie profilu ekspresji
genu HVA1 pomiędzy roślinami w badanych stadiach rozwojowych.
Słowa kluczowe: stres suszy, profil ekspresji genów, HVA1, SRG6, jęczmień jary
417
INTRODUCTION
Drought is considered to be the main environmental factor causing lower
crop productivity. In Poland, barley yield can be reduced by 20% because of
water deficit, hence the need for a simple tool for drought tolerant varieties
selection. There are two genes that are probably connected with the drought
tolerance of barley: HVA1 (Hordeum vulgare aleurone 1) and SRG6 (stressresponsive gene 6). Transgenic plants modified with these genes seemed to
be more resistant to water deficit [Xu et al. 1996, Tong et al. 2007]. Also the
association between HVA1 and SRG6 transcript accumulation and drought
tolerance of barley was observed [Rapacz 2010].
The reliability of physiological and biochemical drought tolerance markers
depends on species, genotypes [Kumar 2005, Praba et al. 2009] and developmental stage [Szira et al. 2008]. The aim of this study was to observe if the
same dependence exists in case of molecular traits, studying differences in
the HVA1 and SRG6 transcript accumulation in seedling and flowering stage
of different spring barley varieties under drought conditions.
MATERIAL AND METHODS
The experiments were performed on seven barley varieties with different
drought resistance (Georgia, Harmal, Lubuski, M.Dingo, Maresi, Morex,
Stratus). Plants were grown in a growth room in pots filled with a mixture
of clay and sand (7:2, v/v) in 25%-60% air humidity, for a 16-h photoperiod.
The temperature varied according to the developmental stage; namely: during germination (4 days), a constant temperature of 29°C was maintained,
whereas after emergence (also during the drought treatment), the temperature
was 25/17°C (day/night).
All genotypes were treated with water deficit in soil (4% - mass of water
in the dry mass of soil) for 10 days. Plants of each genotype grown under
normal watering conditions were a control. Drought stress was started after
reaching a certain stage: seedling in first experiment and flowering in the
second one. Accumulation of SRG6 and HVA1 transcript were studied in
the second leaves harvested last day of the stress treatment. There were five
biological samples collected from each genotype studied, in each of the two
experimental series. The further analysis were performed on three samples,
each PCR reaction was performed in three replicates. The quality and concentration of cDNA were determined spectrophotometrically. Real time PCR
with TaqMan-MGB probes was used as the relative quantification method
detection of the amplification products, with ubiquitin gene as the internal
standard. The mRNA copy number for each cultivar was calculated as a relative value to control.
418
The commparison of HVA1 and SRG6 genes expression profiles...
RESULTS
Induction of SRG6 gene expression was observed in all tested varietes (Fig.
1) before and after flowering. In case of six varieties (Georgia, Harmal, Lubuski, M. Dingo, Morex and Stratus) increase of analyzed gene transcript
accumulation was noticed. In five cases, with exception of the Harmal variety, the difference was statistically significant. The greatest increase was
observed in the M.Dingo variety, where the relative SRG6 gene expression in
flowering stage was three times higher than the expression observed before
flowering. Just in the case of Maresi cultivar SRG6 gene transcript accumulation was slightly higher in seedling stage, but the difference is statistically
insignificant. Therefore it can be assumed, that the expressions in both stages
were comparable.
The expression of HVA1 in most cases was slightly noticed (Fig. 2). Very
high accumulation of analyzed transcript was noticed in Georgia variety in
flowering stage and in Maresi in seedling stage. Level of HVA1 transcript
accumulation in both stages was comparable in M.Dingo variety. However,
these results seemed to be imprecise and will be repeated.
8
relative SRG6 mRNA copy number
7
6
5
seedling stage
4
flowering stage
3
2
1
0
Georgia
Harmal
Lubuski
M.Dingo
Maresi
Morex
Stratus
cultivar
Fig. 1. Relative (to the well-watered plants) change in SRG6 gene expression observed after 10 days of drought treatment in barley cultivars(mean ± standard error)
419
relative HVA1 mRNA copy number
250
200
seedling stage
150
flowering stage
100
50
0
Georgia
Harmal
Lubuski
M.Dingo
Maresi
Morex
Stratus
cultivar
Fig. 2. Relative (to the well-watered plants) change in HVA1 gene expression
observed after 10 days of drought treatment in barley cultivars (means)
DISCUSSION
A wide range of variation in drought response was observed among studied
genotypes. Drought-induced relative transcript accumulation of SRG6 was
higher in seedling stage than in flowering stage. These results correspond
with previous results [Szira et al. 2008], which indicate that expression of
genes correlated with water deficit depends on development stage. The expression of these genes is lower in plants in seedling stage, because plants
before flowering are generally less susceptible to drought stress. The higher
expression of SRG6 gene in the flowering stage may results from greater water demand during this period. The increased expression of genes responsible
for plant tolerance to water deficit at flowering stage may be related to the
adaptation of selected spring barley cultivars to environmental conditions in
which they were bred.
The expression profile of HVA1 (encoding LEA protein) gene obtained in this
study was incomplete. These results suggest, that this experiment should be
repeated under modified conditions.
420
The commparison of HVA1 and SRG6 genes expression profiles...
REFERENCES
Kumar, D., 2005: Breeding for drought resistance. In: M. Ashraf, and P. J. C. Harris, eds. Abiotic Stresses. Plant Resistance Through Breeding and Molecular Approaches: 145–176.
Praba, M. L., J. E. Cairns, R. C. Babu, and H. R. Lafitte, 2009: Identification of physiological traits underlying cultivar differences in drought tolerance in rice and
wheat. J. Agron. Crop Sci. 195, 30–46.
Rapacz M, Kościelniak J, Jurczyk B, Adamska A, Wójcik M. 2010. Different Patterns
of Physiological and Molecular Response to Drought in Seedlings of Malt- and
Feed type Barleys (Hordeum vulgare). Journal of Agronomy and Crop Science
196: 9-19.
Szira, F., A. F. Ba´lint, A. Bo¨rner, and G. Galiba, 2008: Evaluation of drought-related
traits and screening methods at different developmental stages in spring barley.
J. Agron. Crop Sci. 194, 334–342.
Tong S, Ni Z, Peng H, Dong G, Sun Q. 2007. Ectopic overexpression of wheat TaSRG6 gene confers water stress tolerance in Arabidopsis. Plant Science 172: 10791086.
Xu D, Duan X, Wang B, Hong B, Ho T-HD, Wu R. 1996. Expression of late embryogenesis abundant protein gene, HVA1, from barley confers tolerance to water deficits and
salt stress in transgenic rice. Plant Physiology 110: 249-257.
Postal address:
Faculty of Agriculture and Economics
Agricultural University of Cracow
Supervisor: prof. dr hab. Marcin Rapacz
This work was supported by the European Regional Development Fund
through the Polish Innovative Economy Program 2007 – 2013, project WNDPOIG.01.03.01-00-101/08 POLAPGEN-BD „Biotechnological tools for breeding
cereals with increased resistance to drought”.
421
Katarzyna Wolny-Koładka
Anna Lenart
EPISTEME
14/2012
s.423-430
ISSN 1895-4421
AEROZOL MIKROBIOLOGICZNY W WYBRANYCH POMIESZCZENIACH UNIWERSYTETU ROLNICZEGO W KRAKOWIE
MICROBIAL AEROSOL IN SELECTED PREMISES AT THE UNIVERSITY OF AGRICULTURE IN CRACOW
Abstrakt. Przeprowadzone eksperymenty miały na celu ocenę zagrożenia mikrobiologicznego w wybranych salach Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie. Ocenianymi
pomieszczeniami były: laboratoria, pokoje pracowników i sale wykładowe. Próbki
pobrano w następujących godzinach: 8 rano i 18 popołudniu za pomocą impaktora MAS-100 (Merck). Uzyskane wyniki wskazują, że pomimo obecności bakterii
(z uwzględnieniem gronkowców), promieniowców i grzybów w badanych pomieszczeniach, nie zostały przekroczone wytyczne zawarte w Polskich Normach dotyczących czystości powietrza. Ponadto zaobserwowano wzrost stężenia bioaerozolu
w ciągu dnia. Biorąc pod uwagę fakt, że ludzie znajdujący się wewnątrz budynków
działają jako wektory dla mikroorganizmów i mogą być głównym źródłem zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza, ważne jest, aby monitorować skład i koncentrację aerozolu mikrobiologicznego w pomieszczeniach zamkniętych.
Słowa kluczowe: bioaerozol, powietrze, bakterie, grzyby, promieniowce, gronkowce
Summary. The aim of this study was to evaluate the microbiological hazards in selected premises of the University of Agriculture in Cracow. The examined rooms were:
laboratories, employers’ rooms and lecture halls. The samples were taken in the following hours: 8 A.M and 6 P.M. with a MAS-100 (Merck) impactor. The results indicate that, despite the presence of bacteria (including staphylococci), actinomycetes
and fungi in the studied areas, the guidelines contained in the Polish Standards for air
quality were not exceeded. In addition, bioaerosol concentration increased during the
day. Considering the fact, that people located in the investigated rooms act as vectors
for microorganisms and can be major sources of microbial contamination of air, it is
important to monitor the composition and concentration of indoor microbial aerosols.
Key words: bioaerozol, air, bacteria, fungi, actinomycetes, staphylococci
423
WSTĘP
Poznanie i charakterystyka aerozolu biologicznego w pomieszczeniach zasługuje na szczególną uwagę. Ekspozycja na bioaerozol zawierający zarodniki
grzybów, komórki bakterii i promieniowców może stać się przyczyną brzemiennych w skutki zakażeń górnych i dolnych dróg oddechowych a także alergii oraz astmy [Grinshpun i in. 1997]. Mając na uwadze charakter edukacyjny
uczelni wyższych oraz bezpieczeństwo studentów i pracowników przeprowadzono badania monitoringowe w celu oceny składu bioaerozolu w wybranych
salach Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie.
MATERIAŁ I METODY
Badania przeprowadzono w 6 pomieszczeniach na terenie budynku Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie:
• sala ćwiczeń Katedry Mikrobiologii,
• sala ćwiczeń Katedry Fizjologii i Endokrynologii Zwierząt,
• pokój pracowników I,
• pokój pracowników II,
• sala wykładowa I,
• sala wykładowa II,
• kontrola – przed budynkiem UR.
Badania wykonywano dwukrotnie w ciągu dnia: w godzinach porannych
(przed zajęciami) od 7:00 do 9:00 oraz w godzinach popołudniowych (po zajęciach) od 17:00 do 19:00, przy użyciu impaktora typu MAS-100 (Merck).
Próbki powietrza o objętości 0,1m3 pobierano z wysokości 1,5 m nad podłożem (w strefie respiracyjnej człowieka). Badanie wykonano w trzech powtórzeniach.
Zgodnie z zaleceniami Polskich Norm [PN-89/Z-04111/02, PN-89/Z-04111/03] oznaczano: ogólną liczbę bakterii, grzybów i promieniowców, liczebność gronkowców hemolizujących oraz Pseudomonas fluorescens. Wyniki wyrażono w postaci jtk (jednostki tworzące kolonie) w m3
pobranego powietrza (jtk·m-3).
W oparciu o informacje zawarte w kluczach diagnostycznych dokonano
identyfikacji dominujących rodzajów bakterii, grzybów i promieniowców.
Oznaczono przynależność gatunkową najczęściej izolowanych grup drobnoustrojów [Barnett i Hunter 1972, Fassatiova 1983, Holt 1989].
424
Aerozol mikrobiologiczny w wybranych pomieszczeniach...
Przy pomocy programu Statistica v. 10 (StatSoft, Polska) wyznaczono średnie liczebności poszczególnych grup mikroorganizmów oraz odchylenia
standardowe z uwzględnieniem czasów poboru próbek.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Punkt
poboru
Uzyskane wyniki dotyczące występowania aerozolu mikrobiologicznego
przedstawiono w tabeli 1.
1
2
3
4
5
6
7
Liczebność drobnoustrojów (jtk·m-3)
Czas
poboru
Grzyby
Bakterie
Promieniowce
Gronkowce
Pseudomonas
fluorescens
rano
13
190
3
0
0
popołudniu
220
220
3
7
0
rano
177
450
0
7
0
popołudniu
187
940
13
0
0
rano
47
110
6,7
3
0
popołudniu
130
213
0
17
0
rano
27
290
13
10
0
popołudniu
173
123
17
0
0
rano
213
423
0
0
0
popołudniu
430
180
3
0
0
rano
43
93,3
0
0
0
popołudniu
247
627
3
0
0
rano
120
113
20
3
0
popołudniu
135
130
25
6
0
Tab. 1. Liczebność drobnoustrojów w powietrzu (jtk·m-3)
Na podstawie przeprowadzonych analiz stwierdzono, iż liczba grzybów
mikroskopowych we wszystkich badanych pomieszczeniach oraz przed budynkiem UR (kontrola) nie przekroczyła wartości zalecanych przez Polską
Normę [PN-89/Z-04111/03]. Można w związku z tym uznać, że przebywanie we wszystkich testowanych pomieszczeniach nie stanowi zagrożenia
dla zdrowia studentów i pracowników. Podobne obserwacje poczyniono
425
w przypadku aerozolu bakteryjnego. W żadnym z badanych pomieszczeń
nie doszło do przekroczenia dopuszczalnych stężeń ogólnej liczby bakterii
[PN-89/Z-04111/02], natomiast liczebność promieniowców przekroczyła dopuszczalne normy w następujących pomieszczeniach: sala ćwiczeń KFiEZ
(popołudniu), pokój pracowników II (cały dzień) oraz na zewnątrz budynku
UR. We wszystkich trzech punktach powietrze zaklasyfikowano jako średnio-zanieczyszczone [PN-89/Z-04111/02]. Obecność gronkowców stwierdzono w sali ćwiczeń KM (popołudniu), sali ćwiczeń KFiEZ (rano), pokoju
pracowników I (cały dzień) oraz w pokoju pracowników II (rano). Powyższe
rezultaty świadczą, iż powietrze w wymienionych miejscach było średnio-zanieczyszczone [PN-89/Z-04111/02].
Przeprowadzona statystyczna analiza wyników wykazała, że ilość mikroorganizmów w powietrzu badanych pomieszczeń była wyższa w godzinach popołudniowych (Tab. 2). Zwiększona liczba mikroorganizmów w powietrzu
w tym czasie jest konsekwencją faktu, iż człowiek jest jednym z głównych
źródeł drobnoustrojów [Wanner i in. 1993]. Należy zaznaczyć, że badane
pomieszczenia są intensywnie użytkowane w ciągu dnia – wykłady jak i ćwiczenia odbywają się od rana do późnego popołudnia.
Czas poboru
Statystyka
Grzyby
Bakterie
Promieniowce
Gronkowce
Pseudomonas
aeruginosa
Na podstawie analizy statystycznej wyników stwierdzono także dużą zmienność liczebności badanych mikroorganizmów zarówno rano jak i po południu. Jest to zrozumiałe, z uwagi na to, że badane pomieszczenia różniły
się między sobą pod względem sposobu użytkowania i liczby osób w nich
przebywających. Wyniki analizy jakościowej powietrza przedstawiono
w Tab. 3.
Rano
Odchylenie
standardowe
79,09879
151,1746
7,771958
3,9036
0
Średnia
91,42857
238,4714
6,1
3,285714
0
Odchylenie
standardowe
102,7989
313,3916
9,352871
6,395683
0
Średnia
217,4286
347,5714
9,142857
4,285714
0
Popołudniu
Tab. 2. Analiza statystyczna otrzymanych wyników
426
Punkt
poboru
Czas
poboru
Liczebność drobnoustrojów (jtk·m-3).
Grzyby
Bakterie
Promieniowce
Gronkowce
rano
Aspergillus flavus,
Aspergillus niger,
Fusarium spp.,
Penicillium spp.,
Cladosporium spp.,
Rhizopus nigricans
Bacillus mycoides,
G (+) laseczki, G
(+) ziarniaki
Streptomyces
albus
brak
popołudniu
Aspergillus flavus,
Aspergillus niger,
Fusarium spp.,
Penicillium spp.,
Cladosporium spp.,
Rhizopus nigricans
Bacillus mycoides,
G (+)laseczki
Streptomyces
albus
Staphylococcus
spp.
rano
Aspergillus flavus,
Penicillium spp.,
Cladosporium spp.
G (+) ziarniaki
brak
Staphylococcus
spp.
popołudniu
Aspergillus flavus,
Penicillium spp.,
Cladosporium spp.,
Rhizopus nigricans
Bacillus mycoides,
G (+) ziarniaki
Streptomyces
albus
brak
rano
Fusarium spp.,
Penicillium spp.,
Cladosporium spp.,
Rhizopus nigricans
Bacillus mycoides,
G (+)laseczki
Streptomyces
albus
Staphylococcus
spp.
popołudniu
Fusarium spp.,
Penicillium spp.,
Cladosporium spp.,
Rhizopus nigricans
G (-) pałeczki
brak
Staphylococcus
spp.
rano
Aspergillus niger,
Penicillium spp.
G (-) pałeczki
Streptomyces
albus
Staphylococcus
spp.
popołudniu
Aspergillus niger,
Penicillium spp.,
Cladosporium spp.
Bacillus mycoides,
G (+) ziarniaki
Streptomyces
albus
brak
rano
Penicillium spp.,
Cladosporium spp.,
Rhizopus nigricans
G (-) pałeczki
brak
brak
popołudniu
Aspergillus flavus,
Penicillium spp.,
Cladosporium spp.,
Rhizopus nigricans
Bacillus mycoides,
G (+) ziarniaki
Streptomyces
albus
brak
1
2
3
4
5
427
6
rano
Cladosporium spp.,
Rhizopus nigricans
G (-) pałeczki
brak
brak
popołudniu
Fusarium spp.,
Cladosporium spp.,
Rhizopus nigricans
Bacillus mycoides,
G (+)laseczki
Streptomyces
albus
brak
rano
Aspergillus niger,
Fusarium spp.,
Penicillium spp.,
Cladosporium spp.,
Rhizopus nigricans
G (+) ziarniaki
Streptomyces
albus
Staphylococcus
spp.
popołudniu
Aspergillus flavus,
Aspergillus niger,
Fusarium spp.,
Penicillium spp.,
Cladosporium spp.
G (+) ziarniaki
brak
brak
7
Tab. 3. Skład jakościowy aerozolu mikrobiologicznego w badanych pomieszczeniach
Zidentyfikowane rodzaje oraz gatunki mikroorganizmów stanowią typowy
skład mikroflory powietrza pomieszczeń zamkniętych [Araujo i in. 2008, Lee
i Jo 2006, Prasad i in. 2004, Wanner i in. 1993]. Na szczególną uwagę zasługuje stwierdzenie gronkowców w badanym powietrzu. Niemniej jednak sam
fakt ich obecności nie świadczy o istnieniu zagrożenia epidemiologicznego.
Należałoby przeprowadzić szczegółową diagnostykę i ocenić przynależność
gatunkową wyizolowanych szczepów. Dodatkowo wśród grzybów pleśniowych zidentyfikowano gatunki potencjalnie toksynotwórcze, jak A. flavus lub
A. niger, a także grzyby z rodzaju Cladosporium, których zarodniki w wyższych stężeniach mogą przyczyniać się do powstawania reakcji alergicznych
u ludzi. Dlatego tak ważna jest kontrola stopnia zanieczyszczenia mikrobiologicznego pomieszczeń, a także ich odpowiednia wentylacja oraz dbałość
o stan i regularne zabiegi konserwacji urządzeń klimatyzacyjnych.
WNIOSKI
• Biorąc pod uwagę koncentrację aerozolu mikrobiologicznego we wszystkich badanych pomieszczeniach, nie stwierdzono przekroczenia wytycznych zawartych w Polskich Normach dotyczących czystości powietrza.
• W badanym bioaerozolu dominowały następujące mikroorganizmy:
Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium spp., Penicillium spp.,
Cladosporium spp., Rhizopus nigricans, Bacillus mycoides, Streptomyces albus oraz bakterie z rodzaju Staphylococcus spp.
428
• Zwiększenie zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza w godzinach popołudniowych wskazuje, iż człowiek jest jednym z głównych
źródeł mikroorganizmów we wnętrzach budynków.
LITERATURA
Araujo R., Cabral J.P., Rodrigues A.G. 2008. Air filtration systems and restrictive
access conditions improve indoor air quality in clinical units: Penicillium as a
general indicator of hospital indoor fungal levels, Am. J. Infect. Control 36, 2,
129-134
Barnett H.L., Hunter B.B. 1972. Illustrated genera of Imperfect Fungi, Burgess Publishing Company
Fassatiova O. 1983. Grzyby mikroskopowe w mikrobiologii technicznej, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa, Polska
Grinshpun S.A., Reponen T., Willeke K. 1997. Aerosol characteristics of airborne
actinomycetes and fungi, J. Aerosol Sci. 28, suppl. 1, 667-668
Holt J.G. (ed) 1989. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 1 Williams &
Wilkins, Baltimore
Lee J-H., Jo W-K. 2006. Characteristics of indoor and outdoor bioaerosols at Korean
apartment buildings, Environmental Research 101, 11-17
PN-89/Z-04111/02. Ochrona czystości powietrza. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie liczby bakterii w powietrzu atmosferycznym (imisja) przy pobieraniu próbek metodą aspiracyjną i sedymentacyjną
PN-89/Z-04111/03. Ochrona czystości powietrza. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie liczby grzybów mikroskopowych w powietrzu atmosferycznym (imisja)
przy pobieraniu próbek metodą aspiracyjną i sedymentacyjną
Prasad M., Van Der Wefr P., Brinkmann A. 2004. Bioaerosols and Composting,
A Literature Evaluation, CRE Composting Association of Ireland TEO
Wanner H., Verhoeff A., Colombi A., Flannigan B., Gravesen S., Mouilleseaux A.,
Nevalainen A., Papadakis J., Seidel K. 1993. European Collaborative Action Indoor air quality and its impact on man, Environment and Quality of Life, Report
No. 12 Biological Particles in Indoor Environments.
429
mgr inż. Katarzyna Wolny-Koładka, dr inż. Anna Lenart
Katedra Mikrobiologii
Wydział Rolniczo – Ekonomiczny
Opiekun naukowy: prof. dr hab. Wiesław Barabasz
430
Isaura Zaleska
Marta Wawrzyszyn
EPISTEME
14/2012
s.431-438
ISSN 1895-4421
DYNAMIKA EKSPRESJI GENÓW FOXP3, JAK1, STAT1 W TRAKCIE
ROZWOJU CIA U SZCZURÓW
DYNAMICS OF FOXP3, JAK1 AND STAT1 GENES EXPRESSION
DURING THE DEVELOPMENT OF CIA IN RATS
Abstrakt. Model CIA (z ang. Collagen Induced Arthritis) pozwala poznać u zwierząt
molekularne mechanizmy zachodzace w trakcie rozwoju chorób autoagresywnych.
Ostatnie lata badań udowadniają że istotną rolę w procesach autoagresji odgrywają komórki T regulatorowe CD4+ CD25+ FOXP3+, które dzięki swojej supresyjnej
funkcji mogą skutecznie chronić przez rozwojem chorób autoagresywnych. W niniejszej pracy przedstawiono dynamikę ekspresji genów foxp3, jak1 i stat1 oraz kinetykę
zmian liczby komórek T regulatorowych CD4+CD25+FOXP3+ (Treg) w trakcie rozwoju modelowego CIA u szczurów Wistar.
Słowa kluczowe: modelowe reumatoidalne zapalenie stawów, foxp3, jak1, stat1, Treg
Summary. CIA animal model (Collagen Induced Arthritis) allows exploring the
molecular mechanisms that occur during the development of self-aggressive diseases. Recent years of studies have proven that regulatory T cells CD4+ CD25+FOXP3+
play a pivotal role in autoimmune processes, which due to their suppressive function can effectively protect the development of self-aggressive diseases. This paper
presents the dynamics of foxp3 gene expression, jak1 and stat1, and the kinetics of
change in the number of regulatory T cells, CD4 +CD25 + FOXP3 + during the development of the CIA model in Wistar rats. Key words: collagen induced arthritis, foxp3, jak1, stat1, Treg
431
WSTĘP
Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest schorzeniem przewlekłym
i układową, zapalną i autoimmunologiczną chorobą tkanki łącznej o charakterze postępującym [Balcer i Bednarek, 2009]. U podstaw patogenezy
reumatoidalnego zapalenia stawów leży aktywacja limfocytów Th1 błędnie
identyfikujących autoantygeny obecne w chrząstkach stawowych, co powoduje zapalenie w błonie maziowej stawów i naciek makrofagów, fibroblastów
i komórek dendrytycznych [Marcińska i Szczepanik 2010].
Za regulację odpowiedzi odpornościowej odpowiadają limfocyty T regulatorowe o fenotypie CD4+CD25+Foxp3+ [Sakaguchi i in.2008; Maślanka,2010]. W powstawaniu i regulowaniu funkcji Treg główną rolę pełni
czynnik transkrypcyjny Foxp3 [Myśliwska i Ryba, 2010].
U szczurów i myszy modelem doświadczalnym RZS jest indukowane kolageneem typu II CIA, które podobnie jak RZS wywołuje obrzęk kończyn,
napływ komórek odpornościowych i niszczenie chrząstki i kości [Marcińska
i Szczepanik 2010]. Kodowane przez ten gen stat1 białko-STAT1, należy do
rodziny czynników transkrypcyjnych STATs (signal transducers and activators of transcription), biorących udział w regulacji odpowiedzi odpornościowej. Białka te mogą wpływać m.in. na różnicowanie i proliferację komórek,
czy wydzielanie cytokin i czynników wzrostu [Łukomski i Starska, 2008].
STAT1 jest aktywowane w komórkach płynu stawowego [Wincewicz i in.
2005]. Aktywność białek STAT regulowana jest przez rodzinę wewnątrzkomórkowych kinaz tyrozynowych JAK (z ang. Janus kinases) [Świst i Pajtasz-Piasecka, 2011].
Celem niniejszej pracy jest zbadanie dynamiki ekspresji genów foxp3, jak1
i stat1 w trakcie rozwoju CIA.
MATERIAŁY I METODY
Zwierzęta doświadczalne. W pracy wykorzystano materiał biologiczny pochodzący od 12-tu samic 6-cio tygodniowych szczurów Wistar o wadze 150200 g (Akademia Medyczna im.Piastów Śląskich we Wrocławiu, Katedra i
Zakład Anatomii Patologicznej, Polska). Zwierzęta otrzymywały wodę i karmę bytową at libitum i utrzymywane były w pomieszczeniu dla zwierząt, które było codziennie oświetlone przez 12 godzin (7:00-19:00), w temperaturze
pokojowej 24°C. Szczury podzielono na 3 grupy doświadczelne L1, L2 i L3
zgodnie z nastepującymi po sobie terminami eutanazji: grupę L1 poddawano
eutanazji po 1 tyg., L2 po dwóch i L3 po 3 tygodnich od drugiej immunizacji
po 4 zwierzęta w każdej, a w obrębie każdej z grup podzielono zwierzęta na
podrupy kontrolną i właściwą. Doświadczenie z wykorzystaniem zwierząt
432
Dynamika ekspresji genów FOXP3, JAK1, STAT1...
doswiadczalnych było wykonywane w oparciu o zgodę nr 08/2009 II Lokalnej Komisju Etycznej we Wrocławiu.
Wywołanie modelowego CIA. Zwierzęta z podgrup właściwych były, w odstępie 7 dni, dwukrotnie immunizowane u nasady ogona mieszaniną 1:1
kolagenu bydlęcego typu II i IFA (Incomplete Freund’s Adjuvant). Podgrupy kontrolnych były immunizowane roztworem IAF z dodatkiem 0,01M
CH3COOH, w stosunki 1:1. Po 7 dniach od drugiej immunizacji zaobserwowano okołostawową opuchnilznę tylnych łap, a po kolejnych 2 tygodniach
opuchlizna się zmiejszyła natomiast zaobserwowano zmiany zwyrodnieniowe paliczków. Zwierzęta poddano eutanazji poprzez narkozę wziewną izofluranu i dyslokację kręgów szyjnych, grupę L1 poddano eutanazji w 7. dniu po
2-giej immunizacji, grupę L2 w 14 dniu, a grupę L3 w 28 dniu.
Badany materiał biologiczny. Po eutanazji pobierano od szczurów śledziony,
z których izolowano leukocyty oraz krew obwodową, z której uzyskiwano
surowicę.
Test ELISA. W surowicach szczurów określono poziom przeciwciał anty-CII
w klasie IgG z użyciem testu ELISA. Płytki Nunc Maxisorp opłaszczano
2µg/mL kolagenem bydlęcym (BD Bioscience, nr kat.354257) w 0,1 M buforze węglanowym o pH=9,6 poprzez całonocną inkubację w 4oC. Analizowane surowice rozcieńczono 500-krotnie w roztworze PBS+0,05% Tween20
i inkubowano 1,5 h w 37oC. Do identyfikacji poziomu anty-CII użyto anty-IgG szczura (BIOKOM, nr kat. 212-035-082), skoniugowanych z peroksydazą chrzanową. Do wywołania reakcji zastosowano substrat TMB-supersensitive (100µl/dołek), reakcję przerwano po 15 minutach z udziałem 2M
H2SO4 (50 µl/dołek). Gęstość optyczną określano przy λ=450nm z użyciem
czytnika BioTek µQuantum.
Cytometria Przypływowa. Limfocyty w liczbie 1x106 kom poddano barwieniu
przy użyciu koniugatów mysich przeciwciał monoklonalnych: anti-rat CD4
FITC (E-bioscience, nr kat. 11-0040-85), anti-rat CD25 PE (E-bioscience, nr
kat. 12-0390-82), i Anti-Mouse/Rat Foxp3 Alexa Fluor 647 (E-bioscience, nr
kat. 51-5773-82). Komórki analizowano przy użyciu cytometru przepływowego FACScan i oprogramowania CELLQUEST (Becton Dickinson).
Izolacja RNA i RT-PCR. Z limfocytów śledzionowych izolowano całkowite
mRNA na kolumnach Qiagen Rneasy Mini Kit (Qiagen, nr kat. 74104). RNA
przepisano na cDNA na drodze reakcji RT-PCR z wykorzystaniem High Capacity cDNA RT Kit (Applied Biosystems, nr kat. 4368814).
Real-time PCR. Ilościowy real-time PCR wykonano z użyciem SYBR Green I (Applied Biosystems, nr kat. 4385616) i genu referencyjnego gapdh.
Zestawy starterów dla genów foxp3, jak1, stat1 i gapdh przedstawiono
w tabeli nr.1. Reakcja była prowadzona według programu: A) początkowa
433
denaturacja 95 °C/1:30 min, B) denaturacja 95 °C/3 sekundy, C) Przyłączanie 60 °C/:30 min. Etapy B i C przeprowadzono w 40 cyklach. Po etapie detekcji przyrostu produktu przeprowadzono etap sprawdzajacy przyrost specyficznego produktu na krzywej topnienia. Reakcję prowadzono w aparacie
Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR System. Analizę wyników
według metodyki Livaka wykonano w Applied Biosystems 7300 Real Time
PCR System SDS Version 1.4 Patch 2.
WYNIKI I DYSKUSJA
U zwierząt immunizowanych kolegenem bydlęcym typu II (CII) rozwinęło się modelowe CIA, natomiast szczury immunizowane IFA z dodatkiem
0,01M CH3COOH nie wykazywały objawów choroby. Detekcja przeciwciał
anty-CII w surowicy testem ELISA (Rys. 1) wykazała obecność tych przeciwciał tylko u szczurów, którym podawano IFA+CII a różnice pomiędzy
poszczególnymi grupami L1, L2 i L3 są nieistotne statystycznie.
Lp
Gen
Primer forward
Primer reverse
1
foxp3
ATGGGAGTTGCTGTTGAAGTCA
CCGAGGGCCCACTAAAGG
2
jak1
GAGCCAGCTCTACTCTGCAC
CCTCGAAGACCTTCTCACAA
3
stat1
CATCCCAGTCTCTGTGCTGA
AGCAGCCACACTCAGGTTCT
4
gapdh
TCACCATTGTTGCAGAGAGC
CGATCGGATAACACCTGCTT
Tab. 1. Primery zastosowane w metodzie real-time PCR
Z wyizolowanych śledzion od wszystkich zwierząt wyizolowano limfocyty,
które poddano barwieniu zewnątrzkomórkowych markerów CD4+CD25+
i wewnątrzkomórkowego czynnika transkrypcyjnego Foxp3. Komórki T regulatorowe były obecne u wszytskich badanych zwierząt i nieznacznie różniły się liczbą (Rys. 3) pomiędzy badanymi podgrupami właściwą i kontrolną w każdej z grup badawczych (L1,L2 i L3). U zwierząt immunizowanych
IFA+CII liczba komórek T regulatorowych była zawsze wyraźnie wyższa niż
u zwierząt kontrolnych.
Dynamika liczby komórek T regulatorowych w trakcie rozwoju CIA wykazuje
wyraźną tendencję wzrostową co pomimo niestotnej statystycznie korelacji wydaje
się być spowodowane niską liczbą osobników uczestniczących w doświadczeniu.
Ekspresję genów foxp3, jak1 i stat1 badano metodą real-time PCR wobec
genu referencyjnego gapdh. Przedstawione na Rys. 4 wyniki ekspresji genów
pokazują, że ekspresja badanych genów w każdym przypadku jest wyższa
u zwierząt immunizowanych IFA+CII niż u zwierząt kontrolnych.
434
Uzyskane wyniki pomimo braku istotnych statystycznie różnic w korelacji
czasu i ekspresji genów (przyczyną nieodrzucenia hipotezy o braku korelacji
w populacjach nawet w przypadku wysokich wartości współczynników korelacji w próbach wydają się być małe liczebności prób) pokazują zróżnicowaną
dynamikę ekspresji genów foxp3, jak1, stat1 w trakcie rozwoju CIA u szczurów.
Rys. 1. Dynamika przeciwciał anty-CII u szczurów z CIA. Przeciwciała anty-CII nie
były obecne u zwierząt immunizowanych IAF+0,01M CH3COOH, natomiast zwierzęta, które były immunizowane IFA+CII w każdej grupie czasowej zidentyfikowano
podobną ilość przeciwciał anty-CII
W przypadku RZS obserwowana zarówno zwiększoną jak i zmniejszoną
frekwencję Treg [Miyara i wsp., 2011]. Nasze obserwacje wskazują, że indukowana odpowiedź wobec antygenów tkankowo swoistych może polaryzować obwodową odpowiedź odpornościową w kierunku Treg, na co wskazuje wzrost liczby Treg u badanych zwierząt. Chociaż, jak wskazuje przyrost
liczby komórek Treg w grupie kontrolnej w przebiegu immunizacji samym
adiuwantem, charakter czynnika indukującego ekspansję komórek Treg jest
niejasny. Wzrost ekspresji foxp3 w trakcie rozwoju CIA może być skorelowany ze wzrostem liczby komórek Treg.
Rola białek STAT w początkowym okresie patogenezy reumatoidalnego zapalenia stawów nadal jest niejasna. Zarówno w danych literaturowych jak i w przeprowadzonych badaniach dowiedziono, że ekspresja genu stat1 ulega skokowemu wzrostowi przy pełnoobjawowym CIA. Analogicznie jak badaniach Sokalskej−Jurkiewicz, uzyskane wyniki pokazują, że ekspresja tego genu jest wyższa
w grupie doświadczalnej niż w kontrolnej, co może świadczyć o istotnej roli tego
białka w patogenezie CIA [Sokalska−Jurkiewicz i wsp. 2008].
Aktywacja szlaku białek JAK / STAT jest ściśle uzależniona od obecności cytokin, które wiążąc się z odpowiadającymi im receptorami wywołują kaskadę reakcji zmieniającą potencjał transkrypcyjny komórki [Kisseleva i wsp.,
435
2002]. Na obecnym etapie prowadzonych badań nie jest możliwe bezpośrednie zweryfikowanie tych danych, niemniej jednak, bazując na uzyskanych
wynikach udało się wykazać tendencję wzrostową w dynamice ekspresji
genu jak1, co pośrednio wskazuje na zwiększoną aktywność cytokin w śledzionie u zwierząt w trakcie rozwoju CIA.
Rys. 2. Przyrost liczby komórek T regulatorowych w trakcie rozwoju CIA u szczurów.
Liczba komórek wzrasta w kolejnych tygodniach od immunizacji IFA+CII lub IFA+0,01M CH3COOH
Analiza statystyczna wyników polegała na wyznaczeniu parametrów linii regresji oraz obliczenia współczynnika korelacji Persona dla prób, w których
zmiennymi były czas i ekspresja genów. Następnie przeprowadzono test istotności statystycznej współczynnika korelacji na poziomie istotności 5% [Aczel,
2006]. We wszystkich przypadkach nie zdołano odrzucić hipotezy zerowej
o braku korelacji między zmiennymi w populacjach, z których pochodzą próby.
Rys. 3. Dynamika ekspresji genów foxp3,jak1 i stat1 w trakcie rozwoju CIA u szczurów Wistar. Analiza wyników metoda Livaka wykazała wyższą ekspresję badanych
genów u zwierząt immunizowanych IFA+CII niż u zwierząt kontrolnych
436
Nawet w przypadku, gdy współczynnik korelacji w próbie wyniósł R=0,99464
(typowo, przekroczenie progu 0,9 przez wartość bezwzględną z R uznawane
jest za przejaw silnej korelacji między zmiennymi), test nie pozwolił na przyjęcie hipotezy alternatywnej o istotnej statystycznie korelacji w populacji na
poziomie istotności 5%. Powodem tego stanu rzeczy jest mała liczebność prób,
co skutkuje niewielką liczbą stopni swobody układu (w krańcowym przypadku
otrzymywano układ o jednym stopniu swobody), a w konsekwencji wysokimi
wartościami krytycznymi testu t-Studenta.
WNIOSKI
• Ekspresja foxp3 wyraźnie wzrasta u szczurów, które były immunizowane IAF+CII. Liczba komórek CD4+CD25+FOXP3+ zmienia się wraz
z rozwojem modelowego schorzenia z autoagresji - CIA. Jednakże podaż
samego niekompletnego adiuwantu Freunda zwiększa liczbę śledzionowych limfocytów Treg.
• Liniowa dynamika ekspresji jak i gwałtowny wzrost liczby transkryptomów stat1 wydaje sie być skorelowana z rozwojem stanu zapalnego.
LITERATURA
Aczel A. 2006. Statystyka w zarządzaniu. Pełny wykład. Wydawnictwo Naukowe PWN
Balcer N. Bednarek A. 2009. Leki biologiczne stosowane w reumatologii– część 1.
Farmacja Współczesna. 2: 156-164
Kisseleva T., Bhattacharya S., Braunstein J., Schindler C.W. 2002. Signaling through the
JAK/STAT pathway, recent advances and future challenges. Gene 285; 1-24.
Łukomski M. Starska K. 2008. Regulacja różnicowania i proliferacji komórek immunokompetentnych, wydzielania cytokin i czynników wzrostu w przebiegu choroby
nowotworowej oraz hamowania karcynogenezy i wzrostu guza w mechanizmie
aktywacji rodziny cząsteczek SOCS/CIS. Postępy Biologii Komórki, 35: 485-498
Marcińska K. Szczepanik M. 2010. Mechanizmy regulacji odpowiedzi immunologicznej w modelu zwierzęcym reumatoidalnego zapalenia stawów u myszy (CIA). Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 64: 372-385
Maslanka T. 2010. Komórki regulatorowe z populacji limfocytów CD4+. Medycyna
wet., 66(12); 827-832
437
Miyara M., Gorochov G., Ehrenstein M., Musset L., Sacaguchi S., Amoura Z.2011
Human FoxP3+ regulatory T cells in systemie autoimmune diseases. ��
Autoimmunity Revews, 10, 744-755
Myśliwska J. Ryba M. 2010. Limfocyty T CD4+CD25+Foxp3+: naturalnie występujące limfocyty T regulatorowe. Pediatric Endocrinology, Diabetes and Metabolism, 16: 289-294
Sakaguchi S., Tomoyuki Yamaguchi T., Takashi Nomura T., and Masahiro Ono www.
cell.com/abstract/S0092-8674(08)00624 -7 - aff1 M. 2008. Regulatory T Cells
and Immune Tolerance. Cell, Volume 133, Issue 5, 775-787
Sokalska−Jurkiewicz M., Madej M., Nowak B., Czarny A., Zaczyńska E., Wiland P.
2008. Activation of STAT−1, −3, and − 6 Proteins in Early ArthritisAdv Clin Exp
Med 17, 4, 399–404
Świst K., Elżbieta Pajtasz-Piasecka E. 2011. Wpływ czynników transkrypcyjnych na
różnicowanie limfocytów T CD4+. Postepy Hig Med Dosw (online), 2011; 65:
414-426
Wincewicz A. i in. 2005. Udział białek STAT w patogenezie chorób autoimmunologicznych. Advances in Clinical and Experimental Medicine, 14: 785-790
mgr inż. Isaura Zaleska, inż. Marta Wawrzyszyn
Katedra Immunologii, Patofizjologii i Prewencji Weterynaryjnej
Wydział Medycyny Weterynaryjnej
Opiekun naukowy: dr hab. Anna Chełmońska-Soyta, prof. nadzw. UP
438

Pobierz wersję PDF

Transkrypt

Podobne dokumenty

DPD Dodatkowe zalecenia - elektronika i sprzęt RTV AGD

Rysunek architektoniczno