v - BioInfo

Transkrypt

v - BioInfo

Modelowanie molekularne układów błonowych:
badania biofizyczne
(badania biochemiczne wymagają metod hybrydowych
łączących klasyczne modelowanie molekularne z
mechaniką kwantową)
1
M. Pasenkiewicz-Gierula, IVR Bt, 2007/08 WBBiB UJ
LIPIDOMIKA
Lipidomika (Lipidomic) jest nową gałęzią biologii molekularnej
Zajmuje się charakteryzacją lipidów występujących w
organizmach żywych, ich oddziaływaniami oraz funkcjami
biologicznymi
Następny związek struktura-funkcja
2
Rola lipidów w układach biologicznych
3
Schemat błony komórki zwierzęcej
4
Transport wewnątrzkomórkowy
Svetlana Lutsenko, Dept. Biochemistry and Mol. Biology MRB 624,
[email protected]
5
Transport wewnątrzkomórkowy (vesicular transport)
Tworzenie się pęcherzyków oraz ich fuzja z docelową błoną
6
W wodzie, lipidy spontanicznie agregują w różne
struktury przestrzenne (self-assembly)
(fazy lipotropowe)
7
Struktury przestrzenne agregatów lipidowych - środowisko
polarne (wodne) i niepolarne
http://www.tda.com/Library/docs/Butyl_Nano.pdf
8
Struktury przestrzenne agregatów lipidowych w środowisku
polarnym (wodzie)
Bicela zbudowana z DMPC (14C) i
DHPC (6C) w proporcji 3:1
Porządkowanie biceli w polu
magnetycznym – badania NMR białek
9
Dwuwarstwy lipidowe
cwx.prenhall.com/bookbind/pubbooks/mcmurrygob/medialib/
10
Zależnie od warunków zewnętrznych jedna struktura może
przejść w inną – polimorfizm lipidów (fazy lipotropowe)
DEPE, przejście z fazy lamelarnej do odwróconej heksagonalnej
di-elaidynowa-PE
web.mit.edu/pcvdwel/www
11
Lipidy dzielimy na :
• promujące tworzenie faz lamelarnych
• promujące tworzenie faz nie-lamelarnych
12
v
P=
al
13
Fazy lamelarne
14
Wspólną cechą strukturalną błon biologicznych jest matryca
lipidowa
Matryca lipidowa jest warstwą o grubości dwóch cząsteczek
lipidów (ok. 5 nm) i bardzo dużej powierzchni
(dwuwarstwa lipidowa)
15
Dla biologów – błona jest jeszcze jedną strukturą subkomórkową
Dla (bio)fizyków – pasjonujący obiekt badań: własności
mechaniczne, elastyczność, kontrolowana przepuszczalność
16
17
Badania błon metodą modelowania molekularnego
Błona komórkowa jest olbrzymią, ciągłą*, wieloskładnikową,
dynamiczną i bardzo złożoną strukturą
*kanały: „kontrolowane dziury”
*„lokalne” fazy nielamelarne
co więc stanowi komputerowy model błony?
18
Dygresja
19
Co jest komputerowym modelem błony?
Prowadząc badania metodami komputerowymi mamy ten
luksus, że możemy w (względnie) szerokim zakresie
kontrolować złożoność układu
Ponieważ nas interesuje wyjaśnienie podstawowych
mechanizmów odpowiedzialnych za biofizyczne aspekty
funkcjonowania błon, badania zaczęliśmy od najprostszego
układu,
tj. uwodnionej dwuwarstwy lipidowej,
która jest prostym modelem lamelarnych fragmentów
matrycy lipidowej błony
20
Modelem komputerowym jest więc mikroskopowy wycinek matrycy
lipidowej (membrane patch). Aby go „uciąglić” wprowadzamy do
opisu modelu periodyczne warunki brzegowe (PBC).
Dwuwarstwa lipidowa DMPC
21
Ten model poddajemy symulacji dynamiki molekularnej,
a następnie
dokładnym analizom i weryfikacji względem dostępnych wyników
eksperymentalnych
Dwuwarstwa lipidowa DMPC
22
Symulacja dynamiki błony
23
Po wyjaśnieniu możliwych do zbadania mechanizmów decydujących o
własnościach dwuwarstwy, stopniowo zwiększaliśmy złożoność
modelu błony dodając kolejno do dwuwarstwy naturalne składniki
błony: sterole, peptydy i białka, a także inne aktywne biologicznie
związki
POPC
POPC+Chol
POPC+Chol+peptydy
24
W organizmach żywych zidentyfikowano ponad 200 typów lipidów
błonowych, które należą do kilku klas chemicznych. Skład lipidowy
błony jest swoisty dla danego typu komórki. Jednym z częściej
występujących lipidów błonowych jest fosfatydylocholina
Rozkład ładunku na cząsteczce PC
Całkowity ładunek 0e
25
Własności cząsteczek lipidów narzucają określone własności
dwuwarstwy lipidowej. Można wyróżnić w niej trzy główne obszary
Faza wodna
Interfaza błona/woda
Niepolarny obszar błony
Najtrudniejszy do badań eksperymentalnych jest obszar interfazy
26
Matryca lipidowa najczęściej występuje w fazie ciekłokrystalicznej
Wiele funkcji biologicznych błony wymaga tej fazy
Fazę ciekłokrystaliczną cechuje przede wszystkim „ruchliwość”
wewnętrzna łańcuchów węglowodorowych tj. izomeryzacja
tras ↔ gauche
W fazie
ciekłokrystalicznej lipidy
tworzące błonę przyjmują
bardzo różne chwilowe
konformacje – zarówno
łańcuchy acylowe jak i
głowy polarne
27
Fazę ciekłokrystaliczną cechuje przede wszystkim „ruchliwość”
wewnętrzna łańcuchów węglowodorowych , tj. izomeryzacja
tras ↔ gauche
Trzy stabilne konformacje kąta
torsyjnego wiązania pojedynczego
w łańcuchu acylowym
Profil energetyczny dla rotacji
wokół wiązania pojedynczego
28
izomeryzacja tras ↔ gauche zachodzi w krótkiej skali czasowej
Czasy życia
konformacji trans i
gauche dla kolejnych
kątów torsyjnych w
łańcuchach DMPC
Profil czasowy obsadzenia stanów
konformacyjnych przez wybrane kąty
torsyjne
29
Czas życia konformacji wiązania podwójnego jest bardzo długi w
porównaniu z czasem życia konformacji wiązania pojedynczego.
Możemy więc założyć, że izomeryzacja cis ↔ tras w łańcuchach
węglowodorowych w czasie nanosekundowej symulacji dynamiki
molekularnej praktycznie nie zachodzi
30
Czasy życia konformacji trans i gauche dla
kolejnych kątów torsyjnych w łańcuchach
POPC
Profil czasowy obsadzenia stanów
konformacyjnych przez wybrane
kąty torsyjne
31
Przyjęło się, określać błonę w fazie ciekłokrystalicznej jako
„płynną”
Płynność (pojęcie nieostre) błony jest różna od płynności cieczy –
ciecz jest układem izotropowym, gdzie wszystkie cząsteczki mają 3wymiarową swobodę dyfuzji translacyjnej i rotacyjnej
32
W odróżnieniu od cieczy, dwuwarstwa ma symetrię dwuwymiarową
Cząsteczki tworzące błonę mają swobodę dyfuzji lateralnej w obszarze
błony i rotacyjnej wokół długiej osi
Rotacja wokół osi prostopadłej jest ograniczona ⇒ rzadkie przeskoki
flip-flop (długi okres przejścia)
Dyfuzja translacyjna wzdłuż osi prostopadłej do powierzchni błony
(wertykalna) zachodzi jedynie w bardzo ograniczonym zakresie
33
Modelowanie molekularne układów błonowych:
badania biofizyczne
34
Trzy główne obszary błony
Faza wodna
Interfaza błona/woda
Niepolarny obszar błony
Najtrudniejszy do badań eksperymentalnych jest obszar interfazy
35
Pierwszy problem w zastosowaniu modelowania molekularnego do
badania błon !
Jak zbudować układ symulacyjny, jeśli matryca lipidowa błony jest w
stanie ciekłokrystalicznym (skąd wziąć startową strukturę
przestrzenną lipidów)?
w przypadku białek strukturą startową jest struktura krystaliczna lub
rozwiązana metodą NMR (zbiór PDB),
w przypadku dwuwarstwy lipidowej sprawa jest problematyczna
36
Jak zbudować startowy model błony?
Ponieważ układy lipidowe są trudnym obiektem badań strukturalnych
tylko dla niewielu fosfolipidów rozwiązano struktury przestrzenne
Znana jest na przykład struktura DMPC (wzorzec, template)
Struktura krystaliczna
DMPC i zbudowana z
niej dwuwarstwa
Ten model błony nie jest jednak przydatny do
badań bioukładów błonowych
37
„Aktywna biologicznie” jest faza ciekłokrystaliczna błony, aby ją
otrzymać musimy „przeprowadzić” dwuwarstwę przez przejście
fazowe (temperatura przejścia fazowego, Tm)
Pole powierzchni/lipid
38
Zmiana wartości parametrów błony przy przejściu fazowym ze struktury
krystalicznej do ciekłokrystalicznej, na przykładzie błony DMPC
1. liczba cząsteczek wody/lipid wzrasta z 2 do ok. 25 **
2. średnia wartość pola powierzchni/lipid wzrasta z ~40 do ~60 Å2
3. średnia liczba konformacji gauche/łańcuch wzrasta z 0 do ~3
4. wzrasta ruchliwość grup i całych cząsteczek (w stanie
krystalicznym brakuje miejsca na ruch)
5. entropia układu rośnie, w efekcie układ jest w równowadze
termodynamicznej
39
Różnice w strukturze błony w fazie krystalicznej i ciekłokrystalicznej
Obecnie w Internecie dostępne są struktury „ciekłokrystalicznych”
lipidów, z których można zbudować dwuwarstwę w fazie zbliżonej
do ciekłokrystalicznej (oferta ograniczona do kilku typów PC, ale
można wymieniać głowy polarne)
40
W organizmach żywych zidentyfikowano ponad 200 typów lipidów
błonowych, które należą do kilku klas chemicznych
Skład lipidowy błony jest swoisty dla danego typu komórki
41
Temperatury głównego przejścia fazowego (Tm) błon DMPC, DPPC,
POPC, POPE, PEPC (palmitynowo-elaidynowaPC), SM
Lipid
DMPC (14/14)
DPPC (16/16)
POPC (16/18, cis)
POPE (16/18, cis)
PEPC (16/18, trans)
SSM (18)
Temperatura [°C]
23
41
-5
26
26
45
DMPC i DPPC – oba łańcuchy nasycone
POPC/PE – łańcuch β nono-cis nienasycony, łańcuch γ nasycony
PEPC – łańcuch β nono-trans nienasycony, łańcuch γ nasycony
SSM – wiązanie C4=C5 w łańcuchu γ trans-nienasycone, łańcuch β
nasycony
42
O temperaturze przejścia fazowego błony decydują między
innymi oddziaływania między głowami polarnymi lipidów
w obszarze interfazy
43
Dlaczego badamy błony metodami modelowania molekularnego??
Błony są bardzo trudnym obiektem do badań eksperymentalnych
ponieważ są:
wieloskładnikowym,
wielofazowym,
układem dynamicznym, gdzie ruchy zachodzące w różnej
skali czasowej są bardzo istotną cechą układu
Błonę cechuje struktura dynamiczna innej jakości niż w przypadku
białek
Slogan: „w białkach najważniejsza jest struktura, w błonach
dynamika”
44
Dlaczego badamy błony metodami modelowania molekularnego??
Modelowanie molekularne, ze względu na swoją rozdzielczość
czasową i przestrzenną jest bardzo pomocne w poznawaniu struktury i
dynamiki dwuwarstwy lipidowej i prostszych modeli błon
biologicznych
Rozdzielczość czasowa Δt rzędu 1ps, czas symulacji rzędu 50-100 ns
Rozdzielczość przestrzenna Δx, Δy, Δz : atomowa
45
Jakich informacji o błonach dostarczyły badania metodami
modelowania molekularnego?
••• Nic nowego, ale ciekawe:
Symulacja spontanicznej agregacji fosfolipidów w dwuwarstwę
S. J. Marrink, E. Lindahl, O. Edholm, A. E. Mark, J. Am. Chem Soc. 2001, 123, 8638-8639
University of Groningen, Holandia
Układ molekularny:
64 cząsteczki dipalmitylofosfatydylcholiny (DPPC)
3000 cząsteczek wody
Początkowa konfiguracja: przypadkowa mieszanina DPPC i wody
Metoda: symulacja dynamiki molekularnej
46
t = 0 ps, przypadkowa mieszanina DPPC i
wody.
Głowy polarne DPPC są w kolorze
pomarańczowym, łańcuchy węglowodorowe we
fioletowym, a cząsteczki wody w niebieskim.
Ramka wskazuje podstawowe pudełko
symulacyjne (periodyczne warunki brzegowe)
t=0 ps
t = 200 ps, cząsteczki DPPC agregują w
nieregularne klastry – „separacja” wody
i łańcuchów węglowodorowych
t=200 ps
47
t = 3 ns, tworzy się już struktura będąca
zaczątkiem dwuwarstwy
t = 3 ns
t = 10 ns, w ciągu następnych 7 ns
struktura „relaksuje” do metastabilnej
struktury z transbłonowym porem
t = 10 ns
48
t = 20 ns, utworzony por jest względnie
stabilny, jednakże po zgromadzeniu się
wystarczającej na pokonanie bariery
energii, struktura pora szybko zanika
t = 20 ns
t = 25 ns, osiągnięcie przez układ
stabilnego (zrównoważonego) stanu,
odpowiadającego „idealnej”
dwuwarstwie
t = 25 ns
49
normalna do błony
To samo, ale w inny sposób. Profil liczby atomów danej grupy w funkcji głębokości
błony (wzdłuż normalnej) w procesie samo-organizacji dwuwarstwy (kolory jak
poprzednio). (a) t = 0 ps, przypadkowa mieszanina DPPC i wody; (b) t = 100-500
ps, powstawanie nieregularnych klastrów; (b-c) t = 1-1.5 ns klastry
stają się coraz regularniejsze; (c) t = 3-4 ns, początki struktury
dwuwarstwy; (ceq) t = 10-20 ns, struktura z metastabilnym porem;
50
(deq) t = 25-50 ns, pozbawiona defektów, zrównoważona, stabilna
Ostatnie nanosekundy pora
51
Przeprowadzono również symulacje dla innych typów fosfolipidów
(POPC, DOPC, DOPE)
oraz większych błon DPPC (128 i 256 cząsteczek lipidów)
Proces tworzenia dwuwarstwy oraz powstawania i rozpadu stanu
pośredniego przebiegał we wszystkich układach podobnie
występowały różnice w czasach „życia” poszczególnych etapów
procesu
Analiza szczegółowa: praktycznie żadna – po prostu obserwacja
zjawiska
52
Jakich informacji o błonach dostarczyły badania metodami
modelowania molekularnego?
••• Coś nowego, ale spodziewanego:
Jakie oddziaływania gwarantują integralność błony?
Hydrofobowe – fakt znany i zilustrowany powyższym przykładem
Czy oddziaływania w obszarze interfazy zwiększają integralność
błony?
Panował pogląd, że oddziaływania między głowami polarnymi lipidów
są odpychające, tj. destabilizujące strukturę błony
Co wykazały symulacje dynamiki molekularnej?
53
Oddziaływania w obszarze interfazy
M. Pasenkiewicz-Gierula, Y. Takaoka, H. Miyagawa, K. Kitamura, A. Kusumi. Hydrogen
bonding of water to phosphatidylcholine in the membrane as studied by a molecular dynamics
simulation. J. Phys. Chem. A. 1997, 101, 3677-3691
(79 cytowań)
M. Pasenkiewicz-Gierula, Y. Takaoka, H. Miyagawa, K. Kitamura, A. Kusumi. Chargepairing of headgroups in phosphatidylcholine membranes. A molecular dynamics simulation
study. Biophys. J. 1999, 76, 1228-1240
(65 cytowań)
Układ molekularny:
72 cząsteczki DMPC
1800 cząsteczek wody
Metoda: symulacja dynamiki
molekularnej
Analizy: RDF, definiowanie
kryteriów, wyznaczania odległości i
kątów, czasów życia dla WW i PŁ
(żadnych wyszukanych analiz)
54
Iloczyn skalarny – rzut wektora 2 na wektor 1 – przypomnienie
v 1⋅v 2 =∣v 1∣×∣v 2∣×cosθ =x 1 x 2 y1 y2 z1 z2
v  t 
θ
∣v ∣= x  y z 
2
v  0 
rzut v(t) na v(0)
2
2
v 1⋅v 2 x 1 x 2 y 1 y 2z 1 z 2
cos q =
=
∣v 1∣∣v 2∣
∣v 1∣∣v 2∣
Kryterium wiązania wodorowego:
r(O···O) ≤ 3.25 Å
Kąt (O···O,OH) ≤ 35°
55
Przeprowadzono analizę oddziaływań poszczególnych grup DMPC z
wodą poprzez obliczenie funkcji rozkładu radialnego, RDF, wody
względem tych grup
56
Następnie sprawdzono, czy spełnione jest kryterium wiązania
wodorowego
Te analizy wykazały, że woda tworzy
wiązania wodorowe przede wszystkim
z atomami tlenu grupy fosforanowej
O14 i O13 oraz z atomami tlenu grup
karbonylowych O22 i O32. Pozostałe
atomy tlenu „słabo” wiążą wodę
57
Oddziaływania między atomami tlenu DMPC a wodą
Liczba wiązań wodorowych/DMPC
5.3 ± 0.14
Liczba związanych wodorowo
cząsteczek wody/DMPC
4.5 ± 0.2
Liczba cząsteczek wody
w najbliższym sąsiedztwie/DMPC
4.8 ± 0.2
Wyznaczona eksperymentalnie (NMR) liczba
mocno związanych cząsteczek wody
5.0
58
błony?
Liczba wiązań wodorowych/DMPC (5.3) > od liczby związanych
cząsteczek wody/DMPC (4.5)
Wynika stąd, że jedna cząsteczka wody jest związana równocześnie
przez dwie cząsteczki DMPC lub dwie grupy w tej samej cząsteczce
Cząsteczka wody równocześnie związana przez dwie grupy tworzy
pomost wodny, między- lub wewnątrzcząsteczkowy
59
Pomosty wodne między cząsteczkami lipidów występują równie
często jak pomosty wodne w białku
60
Podobne analizy wykazały, że grupa cholinowa DMPC oddziałuje
elektrostatycznie z grupą fosforanową lub karbonylową tej samej lub
sąsiedniej cząsteczki (pary ładunkowe), analogicznie do mostków
solnych w białku. Pary ładunkowe były obserwowane metodą 31PNMR
[Wiązania wodorowe N(CH3)3···Op]
61
błony?
Liczba wiązań wodorowych/DMPC
zaangażowanych w „pomosty wodne”
1.7 ± 0.2
Liczba wiązań wodorowych/DMPC zaangażowanych
w międzycząsteczkowe „pomosty wodne”
1.4 ± 0.2
62
błony?
Coś nowego, ale spodziewanego – dlaczego spodziewanego?
Obliczenia kwantowo-mechaniczne wykazały, że tworzenie pomostów
wodnych jest korzystne energetycznie, ale nikt nie zwrócił na to uwagi
H. Frischleder et al., Chemistry and Physics of Lipids. 19, 144-149, 1977
63
błony?
Coś nowego, ale spodziewanego – dlaczego spodziewanego?
W strukturze krystalicznej
DMPC, cząsteczki wody tworzą
pomosty wodne między
grupami fosforanowymi, ale
uważano, że w strukturze
ciekłokrystalicznej takie
pomosty nie powstają
64
błony?
Dynamiczna sieć powiązań między głowami polarnymi DMPC w
błonie poprzez pomosty wodne i pary ładunkowe (mostki solne)
65
błony?
Badania metodami modelowania molekularnego wykazały:
Oprócz oddziaływań hydrofobowych, za integralność dwuwarstwy
lipidowej odpowiedzialne są oddziaływania przyciągające w
obszarze interfazy: poprzez pomosty wodne i pary ładunkowe
Postuluje się, że pomosty wodne uczestniczą w szybkiej lateralnej
dyfuzji „protonów” na powierzchni błony
66
Akawporyny
67
Błona biologiczna stanowi barierę dla niekontrolowanego
przepływu wody, jonów i większości innych cząsteczek do i z
komórki
68
Kanały wodne (akwaporyny)
Nagroda Nobla z chemii (Peter Agre) w 2003
Akwaporyny są transbłonowymi kanałami wodnymi o znanej
strukturze przestrzennej
W błonie, akwaporyna tworzy homotetramer; każdy z monomerów
funkcjonuje jako kanał. Monomer zbudowany jest z 6 transbłonowych
i 2 krótkich helis
F. Zhu et al./FEBS Letters 504 (2001)
212-218
69
Kanały wodne (akwaporyny)
Akwaporyna jest niezwykle selektywnym białkiem, przepuszcza
cząsteczki wody (H2O), a nie przepuszcza protonów (H3O+) czy
innych jonów (2 cząsteczki wody/monomer/ns)
F. Zhu et al./FEBS Letters 504 (2001) 212-218
70
Moment dipolowy α-helisy
71
Moment dipolowy cząsteczki wody
72
Dwie krótkie helisy (M3 i M7) odgrywają znaczną rolę w
selektywności kanału
Ich N-końce (+) znajdują się wewnątrz kanału, a C-końce (–) na
zewnątrz. Wygenerowane przez nie wypadkowe pole elektrostatyczne
zmienia kierunek wewnątrz kanału
73
Na N-końcu każdej z krótkich helis, prawie w środku błony,
znajdują się 3 reszty aminokwasowe: asparagina (Asn),
prolina (Pro) i alanina (Ala) – tzw. Motyw NPA
74
Asparaginy
Asn192 i Asn76
W środku kanału, lokalne pole elektryczne zmienia kierunek,
co powoduje rotacje cząsteczek wody
To, oraz dwa wiązania wodorowe tworzone przez centralną
cząsteczkę wody i 2 reszty asparaginy (Asn192 i 76), przerywa
liniową sieć wiązań wodorowych między cząsteczkami wody i
uniemożliwia przepływ protonów w procesie proton hopping
75
„proton hopping”
76
Reszty asparaginy na końcach helis M3 i M7 przerywają „ciąg”
wiązań wodorowych między cząsteczkami wody
asparaginy
Asn192
i Asn76
(Tajkhorshid, E., Nollert, P., Jensen, M.O., Miercke, L.J., O'Connell, J., Stroud, R.M., and Schulten, K.
Science 296, 525-530, 2002).
(106245 atomów, 5 ns)
77
Grupy prof. Schultena i Groota zbudowały modele błony z
kanałem wodnym i przeprowadziły symulacje dynamiki
molekularnej
(B.L. de Groot and H. Grubmüller. 2001. Science 294, 2353-2357)
78

v - BioInfo

Transkrypt

Podobne dokumenty

UCM6510