określenie rodzaju interakcji pomiędzy oddziaływaniem związków

Ochrona Środowiska i Zasobów Naturalnych
nr
41, 2009 r.
Arkadiusz Telesiński*, Martyna Śnioszek*, Daniel Musik*,
Weronika Paszun*, Grzegorz Hury**
OKREŚLENIE RODZAJU INTERAKCJI POMIĘDZY ODDZIAŁYWANIEM
ZWIĄZKÓW SELENU I FLUORU NA AKTYWNOŚĆ KATALAZY
W ROŚLINACH SOI (GLYCINE MAX L. MERR.)
DETERMINATION OF INTERACTIONS BETWEEN INFLUENCE OF
SELENIUM AND FLUORINE ON CTALASE ACTIVITY IN SOYBEAN
PLANTS (GLYCINE MAX L. MERR.)
Słowa kluczowe: fluor, selen, katalaza, soja, interakcje.
Key words: fluorine, selenium, catalase, soybean, intractions.
The aim of this study was to detemine an fluorine and selenium effect on catalase activity
and, and evaluation of kind of interactions between influence these elements on catalase
activity in soybean cv. Mazowia, Aldana and Augusta.
The laboratory pot experiment was carried out on samples of light silty loam containing
1.2% of humus. Pots were filled with 1 kg soil samples each, to with NaF solution and selenium compounds: seleniumurea – CSe(NH2)2, selenic acid (IV) – H2SeO3, and selenic acid
(VI) – H2SeO4 alone and together. Selenium doses were calculated as well as Se+II, Se+IV
i Se+VI content introduced to soil was 0,05 mM · kg-1 soil. Fluorine content added to soil was
10 mM · kg-1 soil. Each pot was seeded with 10 seeds of cv. Mazowia, Aldana and Augusta.
The plants grown in soil without fluorine or selenium were control. On days 14, 21 and 28
green parts of plants were collected for determination of catalase by colorometry.
* Dr inż. Arkadiusz Telesiński, mgr inż. Martyna Śnioszek, mgr inż. Daniel Musik,
mgr inż. Weronika Paszun – Katedra Biochemii, Zachodniopomorski Uniwersytet
Technologiczny w Szczecinie, ul. Słowackiego 17, 71-434 Szczecin; tel.: 91 449 62 84;
e-mail: [email protected]
** Dr inż. Grzegorz Hury – Katedra Agronomii, Zachodniopomorski Uniwersytet
Technologiczny w Szczecinie, ul. Słowackiego 17, 71-434 Szczecin; tel.: 91 449 63 02;
e-mail: [email protected]
227
Arkadiusz Telesiński, Martyna Śnioszek, Daniel Musik...
Obtained results show that introduction of fluorine and selenium to soil significantly
changed catalase activity in soybean. Fluorine and selenium effects on catalase activity
was depended on soybean cultivars, the day of experiment and the selenium valency.
The addition of elenium anf fluornine into soil influence antaginically on catalase activity, wich was noticed specially in soyben grown in soil with Se+II and in plants cv. Aldana.
1. WPROWADZENIE
Wykształcenie w toku ewolucji metabolizmu tlenowego umożliwiło znacznie
efektywniejsze wykorzystanie energii wiązań chemicznych i spowodowało ogromny rozwój, w wyniku którego powstały nowe organizmy o skomplikowanej budowie.
Jednakże w trakcie oddychania tlenowego cząsteczka tlenu nie zawsze ulega pełnej redukcji do wody. Podczas niepełnej redukcji tlenu powstają tzw. reaktywne formy tlenu (RFT), które charakteryzuje większa od tlenu cząsteczkowego reaktywność
[Duda-Chodak i Tarko 2007]. Ochronną rolę przed toksycznym i mutagennym działaniem aktywnych form tlenu pełnią zarówno nieenzymatyczne antyutleniacze, czyli związki mające wysoki potencjał redukcyjny i łatwo reagujące z RFT, jak i antyutleniacze enzymatyczne, katalizujące reakcję rozkładu nadtlenków, a wśród nich katalaza [Łata 1998].
Katalaza (oksydoreduktaza nadtlenek wodoru: nadtlenek wodoru, EC 1.11.1.6) jest
białkiem enzymatycznym występującym zarówno w organizmach eukariotycznych, jak
i prokariotycznych, charakteryzujących się podwójną aktywnością: katalazową i peroksydazową [Ścibor i Czeczot 2006]. Podstawowa funkcja katalazy w komórkach to udział
w reakcji dysproporcjonowania nadtlenku wodoru. Wobec niektórych związków chemicznych katalaza wykazuje również aktywność peroksydazową. Katalizuje reakcje utleniania etanolu, metanolu, mrówczanu, azotanów (III), chinonów i innych [Bartosz 2006].
W reakcji tej nadtlenek wodoru jest substratem, który jest redukowany do wody, przez
związki będące donorami wodoru [Cadenas 1997].
Jednym z pierwiastków odgrywających stymulującą rolę w procesach wolnorodnikowych jest fluor [Chlubek i in. 2001]. Selen jest natomiast pierwiastkiem, występującym
w centrum aktywnym peroksydazy glutationowej, enzymu, który odgrywa znaczącą rolę
w ochronie przed reaktywnymi formami tlenu. Nadmiar selenu u roślin może jednak doprowadzić także do powstawania zwiększonych ilości reaktywnych form tlenu [Jendryczko
i Grzeszczak 1995].
Oddziaływanie związków selenu oraz fluoru na organizm może mieć różnoraki charakter. Oprócz określenia rodzaju oddziaływania – odrębnie selenu i fluoru – na różnego rodzaju procesy biochemiczne zachodzące w organizmach żywych, istotne jest również badanie
interakcji pomiędzy wpływem obu tych pierwiastków. Interakcje te mogą mieć zarówno charakter antagonistyczny, jak i synergistyczny.
228
Określenie rodzaju interakcji pomiędzy oddziaływaniem związków selenu i fluoru...
2. CEL I METODY BADAŃ
Celem badań prezentowanych w niniejszej pracy jest określenie, w jaki sposób wprowadzenie do gleby fluoru i selenu na różnym stopniu utlenienia oddziałuje na aktywność
katalazy w roślinach soi oraz jak kształtują się interakcje pomiędzy oddziaływaniem tych
pierwiastków.
Doświadczenie wazonowe w warunkach laboratoryjnych przeprowadzono na glinie
pylastej lekkiej, o zawartości próchnicy 1,2%. Pobraną z pola glebę przesiano przez sito
o średnicy oczek 2 mm i doprowadzono jej wilgotność do 60% maksymalnej pojemności
wodnej. Następnie glebę podzielono na jednokilogramowe naważki, którymi, po wcześniejszym dodaniu wodnych roztworów selenomocznika – CSe(NH2)2, kwasu selenowego (IV)
– H2SeO3, kwasu selenowego (VI) – H2SeO4 oraz fluorku sodu – NaF, w różnych kombi-
nacjach, napełniono wazony. Dawki związków selenu przeliczono tak, aby ilość Se+II, Se+IV
i Se+VI wprowadzona do gleby wraz z nimi wynosiła 0,05 mM · kg-1 gleby. Ilość wprowadzonego do gleby fluoru wynosiła natomiast 10 mM · kg-1 gleby. Przy doborze dawek kierowano się średnią zawartością selenu i fluoru w glebach Polski. Do kolejnych wazonów wysiano po 10 nasion trzech odmian soi: Mazowia, Augusta, Aldana. Próbę kontrolną stanowiły
rośliny każdej odmiany, rosnące na glebie baz dodatku soli.
W trakcie doświadczeń rośliny były oświetlane lampą sodową Son-T-Agro-400 W firmy
Philips, o natężeniu promieniowania na poziomie podłoża 90 µE∙m2∙s-1 PAR (radiacji aktywnej fotosyntetycznie). Fotoperiodyzm został ustalony na 12 godzin dnia i nocy.
W czternastym, dwudziestym pierwszym i dwudziestym ósmym dniu doświadczenia
pobrano zielone części roślin i oznaczono w nich kolorymetrycznie aktywność katalazy metodą Lücka [1963] za pomocą spektrofotometru UV/VIS Lambda Bio firmy Perkin Elmer.
Otrzymane wyniki opracowano statystycznie przy użyciu dwuczynnikowej analizy wariancji. Czynnikiem pierwszym była odmiana soi, a drugim – substancje wprowadzone do
gleby. Najmniejsze istotne różnice (NIR) obliczono według procedury Tukey’a, przy poziomie istotności α = 0,05. Analizy wykonano niezależnie w każdym terminie pomiaru.
3. WYNIKI I DYSKUSJA
Aktywność katalazy w roślinach soi wszystkich trzech odmian w większości przypadków zmieniała się istotnie po wprowadzeniu do gleby osobno oraz łącznie fluoru i selenu. Odnotowano również istotne różnice w aktywności enzymu pomiędzy odmianami
(tab. 1).
Rzeczywistą aktywność katalazy przeliczono w stosunku do aktywności w roślinach kontrolnych, przyjmując tę aktywność za 100%, a następnie obliczono średnią procentową aktywność ze wszystkich terminów pomiarów. Otrzymane wyniki przedstawiono w postaci wykresów słupkowych na rysunku 1.
229
230
NIR0,05
K
F
Se+II
Se+IV
Se+VI
F/Se+II
F/Se+IV
F/Se+VI
Średnia
(B)
14. dzień doświadczenia
Mazowia
Aldana
Augusta
Średnia
1,127
1,737
1,488
1,451
0,969
1,654
0,937
1,187
0,960
1,199
1,382
1,180
1,067
1,399
1,002
1,156
1,028
1,270
1,417
1,238
1,504
2,167
2,260
1,977
1,463
0,964
1,485
1,304
0,972
1,505
1,120
1,199
1,136
1,487
1,386
1,337
A = 0,020
B = 0,054
A x B = 0,083
B x A = 0,070
Odmiana soi (A)
21. dzień doświadczenia
Mazowia
Aldana
Augusta
Średnia
0,702
0,843
0,925
0,823
1,001
0,706
1,067
0,925
0,801
0,798
0,755
0,785
0,684
0,714
0,886
0,761
0,725
0,663
1,113
0,834
0,814
1,104
1,086
1,001
0,879
0,785
0,958
0,874
0,769
0,819
0,847
0,812
0,955
0,852
0,797
0,804
A = 0,063
B = 0,034
A x B = 0,078
B x A = 0,093
28. dzień doświadczenia
Aldana
Augusta
Średnia
1,421
1,246
1,190
0,879
0,678
0,860
0,698
0,926
0,868
0,671
1,344
1,014
0,829
1,016
1,045
0,955
0,933
1,034
0,643
0,810
0,711
0,793
0,735
0,765
0,861
0,961
0,936
A = 0,033
B = 0,070
A x B = 0,092
B x A = 0,102
Mazowia
0,903
1,023
0,981
1,027
1,291
1,214
0,681
0,767
0,986
Tabela 1.Zmiany aktywności katalazy [µM H2O2 · (g ś.m. roślin · min)-1] w roślinach soi po wprowadzeniu do gleby różnych kombinacji fluoru z selenem
Table 1. Changes of catalase activity [µM H2O2 · (g f.w. plants · min)-1] in soybean after introduction of different combinations deleneium and fluoride to soil
Arkadiusz Telesiński, Martyna Śnioszek, Daniel Musik...
oxidative stress and apoptosis induced by fluoride in rats. Biomed. Environ. Stud.
19(6): 439–444.
Określenie
rodzaju interakcji pomiędzy oddziaływaniem związków selenu i fluoru...
Rys. 1.Średnia procentowa aktywność katalazy w roślinach soi odmiany Mazowia (A), Aldana
(B) i Augusta (C) rosnących w glebie z dodatkiem fluoru i selenu
Fig. 1. Mean percentage catalase activity in plants of soybean cv. Mazowia (A), Aldana (B) and
Augusta (C), growing in soil with fluorine and selenium
Dodatek do gleby fluoru spowodował zwiększenie o ok. 15% aktywności katalazy w roślinach odmiany Mazowia oraz zmniejszenie aktywności enzymu w roślinach odmiany Aldana i Augusta ok. 20%. Zmiany w aktywności katalazy, a także innych enzymów stresu oksydacyjnego, mogą być wywołane reakcją obronną rośliny, ponieważ fluor negatywnie oddziałuje na aktywność wielu enzymów kluczowych przemian metabolicznych czy na funkcjonowanie aparatów szparkowych, a tym samym na gospodarkę wodną [Miller 1993], przez co
może dochodzić do generowania zwiększonej ilości RFT.
Oddziaływanie dodatku selenu do gleby na aktywność katalazy w dużym stopniu zależało od jego stopnia utlenienia. Jedynie w roślinach odmiany Aldana wprowadzenie do
podłoża selenu na wszystkich stopniach utlenienia wywołało inhibicję aktywności enzymu
ok. 30%. W roślinach odmiany Mazowia natomiast dodatek selenu na stopniach utlenienia
+II i +IV w niewielkim stopniu zmienił aktywność katalazy, a dodatek selenu na stopniu utlenienia +VI zwiększył o ok. 12% średnią aktywność katalazy. W roślinach odmiany Augusta
zaś odnotowano zmniejszenie aktywności enzymu wraz ze wzrostem stopnia utlenienia
o ok. 17% dla Se+II oraz 10% dla Se+IV i zaledwie 1% dla Se+VI. Trudno zatem jednoznacznie
stwierdzić, w jaki sposób selen oddziałuje na aktywność katalazy w roślinach soi, bo zmiany aktywności tego enzymu zależne były zarówno od odmiany soi, jak i stopnia utlenienia
selenu.
231
Arkadiusz Telesiński, Martyna Śnioszek, Daniel Musik...
Telesiński i in. [2008] wykazali istotne zmiany zawartości nieenzymatycznych antyutleniaczy: glutationu i askorbinianu w roślinach pszenicy i grochu spowodowane dodatkiem
do gleby selenu. Zaobserwowany efekt zależał od stopnia utlenienia selenu i był zdecydowanie większy dla Se+IV niż dla Se+VI. Kąklewski i in. [2008] wykazali natomiast, że wprowadzenie do gleby Se+IV może powodować zmniejszenie aktywności peroksydazy askorbinianowej oraz zwiększenie aktywności reduktazy glutationowej w tkankach roślin pszenicy.
Po wprowadzeniu do gleby fluoru wraz z selenem kierunek zmian aktywności katalazy
w roślinach soi również w dużej mierze zależał od stopnia utlenienia selenu. Dodatek do gleby
fluoru z selenem na stopniu utlenienia +II zwiększał średnią aktywność enzymu w roślinach
wszystkich odmian i był najwyższy w odmianie Mazowia. Jeżeli natomiast chodzi o aktywność
katalazy w roślinach rosnących w glebie z fluorem i selenem na stopniu utlenienia +IV, że jedynie w roślinach odmiany Mazowia odnotowano ok. 10-procentowe zwiększenie aktywności katalazy, rośliny zaś odmian Aldana i Augusta charakteryzowało zmniejszenie aktywności
enzymu odpowiednio o 35% i 20% w odniesieniu do kontroli. Wprowadzenie do gleby fluoru
z selenem na stopniu utlenienia +VI wywołało natomiast inhibicję aktywności katalazy, która
wynosiła ok. 7% w odmianie Mazowia, 20% w Aldanie i 25% w odmianie Augusta.
W celu określenia zmian charakteru sumarycznego oddziaływania selenu z fluorem na
aktywność katalazy w roślinach soi obliczono w kolejnych terminach pomiarów różnice pomiędzy procentowymi zmianami aktywności enzymu wywołane dodatkiem do gleby fluoru
wraz z selenem oraz samego fluoru i przedstawiono je w postaci wykresów powierzchniowych na rysunku 2.
Otrzymaną powierzchnię trójwymiarową dopasowano zgodnie z procedurą wygładzania
najmniejszych kwadratów ważonych odległością. Kolor ciemnoszary na wykresach (różnice większe od 0) obrazuje antagonizm, barwa jasnoszara na wykresach (różnice poniżej 0)
przedstawia synergizm oddziaływania selenu i fluoru na aktywność katalazy w roślinach soi.
W roślinach odmiany Mazowia w początkowej fazie doświadczenia odnotowano antagonistyczne interakcje pomiędzy oddziaływaniem fluoru i selenu na wszystkich stopniach
utlenienia na aktywność katalazy. W kolejnych terminach stwierdzone oddziaływanie tych
pierwiastków prawie zawsze miało charakter synergistyczny (rys. 2A). W roślinach odmiany Aldana natomiast w trakcie trwania całego doświadczenia wykazano antagonizm w oddziaływaniu fluoru i Se+II, a także Se+VI na aktywność enzymu. W przypadku dodatku do gleby fluoru z Se+IV taki charakter interakcji stwierdzono jedynie w dwudziestym pierwszym
dniu doświadczenia. Na początku i na końcu doświadczenia wykazano natomiast synergizm w oddziaływaniu fluoru i Se+IV (rys. 2B). W roślinach odmiany Augusta jedynie w przypadku selenu na stopniu utlenienia +II zaobserwowano w trakcie trwania całego doświadczenia antagonistyczny wpływ selenu i fluoru na aktywność katalazy. Selen na pozostałych
stopniach utlenienia jedynie na początku i końcu doświadczenia działał antagonistycznie na
zmiany aktywności katalazy wywołane fluorem, podczas gdy pomiędzy tymi terminami interakcje miały charakter synergistyczny (rys. 2C).
232
z dodatkiem fluoru i selenu
Fig. 1. Mean percentage catalase activity in plants of soybean cv. Mazowia (A), Aldana (B) and Augusta (C), growing in soil with fluorine
and
selenium
Określenie
rodzaju interakcji pomiędzy oddziaływaniem związków selenu i fluoru...
różnice aktywności
katalazy
w roślinach
odmiany
Mazowia
(A), Aldana
Rys.Rys. 2.Procentowe
2. Procentowe różnice w aktywności
katalazy roślinach
soi odmiany
Mazowia (A),soi
Aldana
(B) i Augusta
(C) rosnących
w glebie
z dodatkiem
fluoru z selenem
i samego fluoru
(B) i Augusta
(C) rosnących
w glebie
z dodatkiem fluoru z selenem i samego fluoru
Fig. 2. Percentage changes of catalase activity in plants of soybean cv. Mazowia (A), Aldana (B)
and Augusta (C), growing in soil treated fluorine with selenium and fluorine alone
233
Arkadiusz Telesiński, Martyna Śnioszek, Daniel Musik...
Można zatem stwierdzić, że w większości przypadków, zwłaszcza w roślinach odmiany
Augusta i Aldana, występował antagonizm pomiędzy oddziaływaniem selenu i fluoru na aktywność katalazy w roślinach soi. W literaturze można znaleźć szereg doniesień o antagonizmie selenu i fluoru, ale głównie w organizmach kręgowców. Taki charakter interakcji pomiędzy tymi pierwiastkami stwierdzono, badając ich wpływ na aktywność peroksydazy glutationowej w surowicy krwi [Gao i in. 2005] oraz dysmutazy ponadtlenkowej w nerkach szczurów
[Yu i in. 2006], a także na aktywność aminotransferazy asparaginowej i dehydrogenazy mleczanowej w hepatocytach [Wang i in. 2004], czy dehydrogenazy bursztynianowej i oksydazy cytochromowej w mitochondriach komórek mięśni szkieletowych u ludzi [Pang i in. 1996].
4. WNIOSKI
1. Wprowadzenie do gleby fluoru oraz selenu istotnie zmieniało aktywność katalazy w roślinach soi, co może świadczyć o znaczącym wpływie tych pierwiastków na procesy
wolnorodnikowe.
2. Oddziaływanie fluoru i selenu na aktywność katalazy w roślinach soi wyraźnie zależne
było od stopnia utlenienia selenu, odmiany soi, a także od terminu pomiaru.
3. W roślinach soi rosnących w glebie z dodatkiem zarówno selenu, jak i fluoru, najczęściej występowało antagonistyczne oddziaływanie tych pierwiastków na aktywność katalazy, co uwidoczniło się w największym stopniu przy utlenieniu selenu w stopniu +II,
a także w roślinach odmiany Aldana.
PIŚMIENNICTWO
BARTOSZ G. 2006. Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie. Wydaw. Nauk. PWN,
Warszawa.
CADENAS E. 1997. Basic mechanisms of antioxidant activity. Biofactors 6: 391–397.
CHLUBEK D., STACHOWSKA E., BOBER J. 2001. Udział fluorków w reakcjach wolnorodnikowych i ich wpływ na aktywność enzymów antyoksydacyjnych. Bromat. Chem. Toksykol. 34(3): 263–266.
DUDA-CHODAK A., TARKO T. 2007. Wolne rodniki – za i przeciw. Laboratorium 11: 48–50.
GAO Y.-H., FU S.-B., XU C.-B., WAN G.-M., WU Y., SUN D.-J. 2005. Action and antagonistic
effects of selenium on fluorosis associated with brick tea. Chin. J. Endemiol. 24(1): 11–13.
JENDRYCZKO A., GRZESZCZAK W. 1995. Glutathione peroxidase activities in erythrocytes and their relationship to cholesterol in lipoproteins of medical school students. Appl.
Biol. Comm. 5(1–2): 37–43.
KĄKLEWSKI K., NOWAK J., LIGOCKI M. 2008. Effects of selenium content in green parts
of plants on the amount of ATP and ascorbate-glutathione cycle enzyme activity at various growth stages of wheat and oilseed rape. J. Plant Physiol. 165: 1011–1022.
234
Określenie rodzaju interakcji pomiędzy oddziaływaniem związków selenu i fluoru...
LÜCK H. 1963. Catalase. w: Methods of enzymatic analysis (red. Bergmeyer H.-U.). Wyd.
Verlag Chemie, Nowy Jork i Londyn: 885–888.
ŁATA B. 1998. Mechanizmy chroniące roślinę przed stresem oksydacyjnym, wywołanym
niekorzystnymi warunkami środowiska. Post. Nauk Rol. 6: 115–130.
MILLER G.W. 1993. The effect of fluoride on higher plants. Fluoride 26(1): 3–22.
PANG Y.X., GUO Y.Q., ZHU P., FU K.W., SUN Y.F., TANG R.Q. 1996. The effects of fluoride, alone and in combination with selenium, on the morphology and histochemistry of
skeletal muscle. Fluoride 29(2): 59–62.
ŚCIBOR D., CZECZOT H. 2006. Katalaza – budowa, właściwości, funkcje. Post. Hig. Med.
Dośw. 60: 170–180.
TELESIŃSKI A., KOMSTA A., MUSIK D., ŚNIOSZEK M., ZAKRZEWSKA H. 2008. Determination of relationships between ascorbic acid and reduced glutathione contents in Triticum aestivum L. and Pisum sativum L. plants after addition to soil selenium on different
oxidation state. Acta Biochim. Pol. 55, Suppl. 3: 266.
WANG A., XIA T., RU R., YUAN J., CHEN X., YANG K. 2004. Antagonistic effects of selenium on oxidative stress, DNA damage, and apoptosis induced by fluoride in human hepatocytes. Fluoride 37(2): 107–116.
YU R.-A., XIA T., WANG A.-G., CHEN X.-M. 2006. Effect of selenium and zinc on renal oxidative stress and apoptosis induced by fluoride in rats. Biomed. Environ. Stud. 19(6):
439–444.
235