Zakładanie hodowli komórek nowotworowych in vitro

Zakładanie hodowli komórek nowotworowych in vitro

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej
Katedra Technologii Leków i Biochemii
Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt
Zakładanie hodowli komórek nowotworowych in vitro
1. Wstęp
Linią komórkową nazywamy kulturę dzielących się komórek, które otrzymano
w wyniku podziałów jednej lub kilku komórek wyselekcjonowanych z organizmu
wielokomórkowego. Poszczególne linie komórkowe róŜnych typów nowotworów ludzkich
(i nie tylko) moŜna zakupić w tzw. bankach linii komórkowych, do których naleŜy między
innymi Europejska Kolekcja Hodowli Komórkowych (ECACC, ang. The European
Collection of Cell Cultures). Powstała ona w 1984 roku i stanowi obecnie jedną
z największych kolekcji zwierzęcych linii komórkowych na świecie. Pod względem
dostępnych linii komórkowych ECACC ustępuje jednak Amerykańskiej Kolekcji Hodowli
Komórkowych (ATCC, ang. American Type Culture Collection).
Zasadniczo rozróŜnia się trzy podstawowe typy wzrostu komórek nowotworowych
in vitro:
a) wzrost w zawiesinie pojedynczych komórek np. komórki HL-60 (i inne białaczki)
(Rys. 1),
b) wzrost w postaci monowarstwy - większość nowotworów litych np. komórki HCT8
(Rys. 2),
c) wzrost w postaci sferycznych tworów tzw. sferoidów.
Rys. 1.
HL-60
Rys. 2.
HCT8
2. Warunki prowadzenia hodowli komórek in vitro
Komórce wyizolowanej z jej tkankowego otoczenia i umieszczonej w hodowli naleŜy
zapewnić środowisko, które będzie zastępowało warunki panujące in vivo. Hodowla komórek
in vitro wymaga przede wszystkim zachowania sterylnych warunków, środowiska wzrostu
o optymalnej temperaturze i wilgotności, jak równieŜ dostarczenia komórkom niezbędnych do
Ŝycia oraz proliferacji składników odŜywczych.
Zastosowanie komory z laminarnym przepływem powietrza zapewnia zachowanie
sterylnych warunków podczas pracy z komórkami. Powietrze, które wchodzi do komory,
przechodzi przez specjalne filtry i w ten sposób zostaje oczyszczone z bakterii oraz
zarodników grzybów, co zapobiega większości infekcji. Obecnie mamy trzy typy komór
laminarnych: a) z horyzontalnym przepływem powietrza; b) z wertykalnym przepływem
powietrza i c) tzw. biohazard, do pracy z materiałem zakaźnym [1].
Środowisko wzrostu o optymalnej temperaturze i wilgotności, jak równieŜ odpowiednie
stęŜenie CO2 zapewniają inkubatory przeznaczone do hodowli komórek.
Optymalna temperatura wzrostu zaleŜy od rodzaju linii komórkowej. Większość linii
komórkowych wyselekcjonowanych z organizmów stałocieplnych, w tym komórki
pochodzenia ludzkiego, wymaga do wzrostu temperatury 37°C. Przekroczenie tej wartości
zarówno w kierunku niŜszych, jak i wyŜszych temperatur moŜe mieć mniej lub bardziej
niekorzystny wpływ na komórki utrzymywane w hodowli. I tak, o ile komórki ssacze są
w stanie przeŜyć kilka dni w temperaturze 4°C, to w temperaturze 39,5°C przeŜyją zaledwie
kilka godzin.
Optymalna wilgotność środowiska wzrostu w przypadku komórek ludzkich nowotworów
powinna być utrzymywana na poziomie 95%, natomiast zachowanie właściwego stęŜenia
CO2 (5 – 10%) w inkubatorze przeznaczonym do hodowli komórek jest niezwykle istotne dla
zapewnienia odpowiedniego pH poŜywki hodowlanej. Większość komórek wymaga pH
poŜywki w granicach 7.2 – 7.4, co pociąga za sobą konieczność zastosowania systemu
buforującego. Obecnie najczęściej stosowany jest tzw. system „naturalny”, gdzie pH
utrzymywane jest dzięki równowadze pomiędzy gazowym CO2 dostarczanym do inkubatora
z zewnątrz, a jonami CO32- i HCO3- pochodzącymi z soli wodorowęglanowej dodawanej do
poŜywki. System ten, w przeciwieństwie do systemów chemicznej regulacji pH, nie wymaga
wysokich nakładów finansowych i jest nietoksyczny w stosunku do komórek. Ze względu na
fakt, iŜ pH poŜywki jest jednym z krytycznych parametrów, komercyjnie dostępne media
hodowlane zawierają w swym składzie równieŜ wskaźniki pH. Jednym z najczęściej
stosowanych wskaźników jest czerwień fenolowa, która nadaje poŜywce określoną barwę
w zaleŜności od jej pH (barwa: purpurowa – pH 7.8; czerwona – pH 7.4; pomarańczowa –
pH 7.0; Ŝółta – pH ≤ 6.5).
PoŜywki hodowlane stosowane dla określonych linii komórkowych róŜnią się miedzy
sobą proporcjami poszczególnych komponentów i często wymagają dodatkowego
uzupełnienia o specyficzne składniki (np. witaminy lub aminokwasy). Mimo to, ogólny skład
poŜywek hodowlanych jest następujący: węglowodany, aminokwasy, peptydy, proteiny,
kwasy tłuszczowe, lipidy, sole nieorganiczne, witaminy oraz surowica.
Węglowodany – stanowią główne źródło energii w mediach hodowlanych. Najczęściej
stosowane są glukoza i galaktoza, jednak niektóre rodzaje komórek wykazują lepszy wzrost
na poŜywkach zawierających maltozę lub fruktozę. W przypadku standardowych poŜywek
uŜywanych do hodowli komórek nowotworowych in vitro, stęŜenie cukru mieści się
w granicach od 1 do 4.5 g/l.
Aminokwasy, peptydy i białka – są wykorzystywane przez komórki jako podstawowy
materiał budulcowy. Białka spełniają np. funkcje transportowe lub teŜ słuŜą komórkom jako
czynniki wzrostu.
Kwasy tłuszczowe i lipidy – dostarczane są do poŜywki głównie z surowicą.
Cholesterol i steroidy są niekiedy niezbędne do utrzymania wzrostu oraz proliferacji
określonych typów komórek hodowanych na podłoŜach bez dodatku surowicy.
Sole nieorganiczne – jony tych soli pomagają utrzymać odpowiednie ciśnienie
osmotyczne, a takŜe biorą udział w regulacji potencjału błonowego komórek dzięki
dostarczaniu kationów potasowych, sodowych i wapniowych oraz stanowią kofaktory
enzymów. Sole nieorganiczne są równieŜ niezbędne dla prawidłowego oddziaływania
komórek z matrix zewnątrzkomórkową. Do poŜywek hodowlanych dodawane są równieŜ sole
tzw. pierwiastków śladowych, takich jak cynk, miedź czy selen, który odgrywa istotna rolę
w procesie usuwania wolnych rodników tlenowych.
Witaminy – są prekursorami bądź kofaktorami enzymów komórkowych. Wiele
witamin, szczególnie z grupy B, ma istotne znaczenie dla wzrostu i proliferacji komórek
utrzymywanych w hodowli in vitro. Najczęściej dodawane do poŜywek witaminy to:
ryboflawina, tiamina i biotyna.
Surowica – większość poŜywek stosowanych do hodowli komórek nowotworowych
wzbogacana jest 5 – 10% (v/v) dodatkiem bydlęcej surowicy płodowej (FBS), która stanowi
złoŜoną mieszaninę wielu mikro- i makrobiocząsteczek. Surowica zawiera czynniki
i hormony stymulujące wzrost komórek, czynniki adhezyjne, białka nośnikowe wielu
hormonów, sole mineralne, lipidy, białka oraz węglowodany. Neutralizuje ona efekty
toksyczne np. metali cięŜkich, a takŜe zapobiega zmianom środowiska, takim jak
np. zmiana pH.
3. Liczenie komórek
Określanie gęstości komórek utrzymywanych w hodowli in vitro jest niezwykle przydatne
podczas pasaŜowania i planowania poszczególnych doświadczeń. Gęstość zawiesiny komórek
moŜna ustalić poprzez policzenie pod mikroskopem komórek znajdujących się na siatce w
komorze hemocytometru. Hemocytometr ma postać grubego, oszlifowanego szkiełka
podstawowego, na którym znajduje się otoczony wyŜłobieniem prostokątny obszar
pomiarowy, gdzie naniesiona jest siatka prostopadłych linii (Rys. 3). W hemocytometrach
uŜywanych podczas ćwiczenia znajduje się siatka Thoma (Rys. 4), której całkowita
powierzchnia wynosi 1 mm2. Składa się ona z 16 duŜych kwadratów, które rozdzielają linie
potrójne. KaŜdy taki kwadrat podzielony jest z kolei na 16 małych kwadratów o boku
1/20 mm. Przecinające się linie potrójne tworzą równieŜ kwadraty o boku 1/20 mm. Po
umieszczeniu szkiełka nakrywkowego na hemocytometrze uzyskuje się zamkniętą komorę,
której wysokość mierzona od powierzchni siatki do szkiełka nakrywkowego wynosi
dokładnie 0.1 mm. Niewielka odległość pomiędzy szkiełkiem podstawowym a nakrywkowym
powoduje, Ŝe zawiesina komórek wypełnia przestrzeń komory, a jej nadmiar spływa do
wyŜłobienia. Licząc komórki podczas obserwacji mikroskopowej moŜna określić ich
koncentrację, czyli liczbę komórek na jednostkę objętości. Znacznie szybszy i wygodniejszy
sposób określania gęstości zawiesiny komórek polega na ich liczeniu za pomocą licznika
komórek Coulter Counter. Komórki rosnące w postaci monowarstwy naleŜy przed
policzeniem „odkleić” od powierzchni naczynia hodowlanego np. za pomocą 0.25% roztworu
trypsyny.
siatka Thoma
szkiełko nakrywkowe
dozowanie próbki
szkiełko podstawowe
Rys. 3. Hemocytometr
Rys. 4. Siatka Thoma - schemat
4. Wykonanie ćwiczenia
Zadaniem studentów będzie zaszczepienie komórek ludzkiej białaczki MOLT4 na szalki
Petriego. Otrzymane od prowadzącego komórki linii MOLT4 naleŜy policzyć zarówno
w komorze hemocytometru, jak równieŜ w liczniku komórek Coulter Counter, a następnie
rozcieńczyć w poŜywce RPMI 1640 z 10% dodatkiem FBS (bydlęcej surowicy płodowej) do
gęstości 250 tys./ml i przenieść do naczynia hodowlanego.
Metodyka liczenia komórek w hemocytometrze
-
obiektyw mikroskopu x 10,
komorę hemocytometru ustawić w taki sposób, aby widoczne było największe pole
ograniczone liniami potrójnymi,
liczyć komórki leŜące wewnątrz kwadratów o boku 1/20 mm, a takŜe na dolnych
i prawych liniach ograniczających, natomiast nie liczyć komórek znajdujących się na
górnych i lewych liniach ograniczających (pozwoli to uniknąć liczenia tych samych
komórek po dwa razy).
Obliczenie gęstości zawiesiny komórek
-
obliczyć średnią z trzech zliczeń
gęstość zawiesiny komórek, wyraŜoną w szt./ml, obliczyć z następującego wzoru:
c=n/v
gdzie: c – gęstość zawiesiny komórek,
n – średnia ze zliczeń,
v - objętość komory.
5. Opracowanie wyników
-
Sprawozdanie z wykonania ćwiczenia powinno zawierać:
zwięzły opis jego przebiegu wraz z wyjaśnieniem zasad postępowania,
porównanie morfologii komórek nowotworowych rosnących w postaci monowarstwy
i w zawiesinie (prezentowanych przez prowadzącego w czasie trwania zajęć),
porównanie dwóch stosowanych na zajęciach metod liczenia komórek.
6. Literatura
1.” Hodowla komórek i tkanek”, Stanisława Stokłosa
2. „Culture of animal cells. A manual of basic technique”; R. Ian Freshney
3. „Cancer cell culture. Methods and protocols”; Simon P. Langdon