Acylotransferazy uczestniczące w metabolizmie wtórnym roślin

Acylotransferazy uczestniczące w metabolizmie wtórnym roślin

Acylotransferazy uczestniczące w metabolizmie wtórnym
roślin: klasyfikacja, struktura, mechanizm działania
STRESZCZENIE
A
cylotransferazy funkcjonują w wielu różnych szlakach metabolicznych u roślin, między
innymi w metabolizmie wtórnym. Enzymy te katalizują przeniesienie grupy acylowej
z bogatej w energię cząsteczki donorowej na grupę nukleofilową cząsteczki akceptorowej z
jednoczesnym wytworzeniem wiązania estrowego. Wyróżnia się dwie rodziny acylotransferaz: acylotransferazy podobne do karboksypeptydaz serynowych (SCPL) oraz acylotransferazy BAHD, nazwane tak od czterech pierwszych opisanych enzymów z tej rodziny: BEAT
(ang. benzylalcohol O-acetyltransferase), AHCT (ang. anthocyanin O-hydroxycinnamoyltransferase), HCBT (ang. anthranilate N-hydroxycinnamoyl-/benzoyltransferase) oraz DAT
(ang. deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase). Na podstawie różnic w specyficzności substratowej oraz sekwencji aminokwasowej acylotransferazy BAHD zostały zaklasyfikowane
do pięciu grup. Acylotransferazy SCPL jako donor grupy acylowej wykorzystują bogate w
energię estry 1-O-β-D-glukozy zamiast tioestrów koenzymu A, będących substratami dla
liczniejszej rodziny acylotransferaz BAHD. Acylotransferazy SCPL wykazują homologię
względem hydrolaz z rodziny karboksypeptydaz serynowych i dzielą z nimi pewne elementy strukturalne, takie jak konserwowana ewolucyjnie triada katalityczna oraz charakterystyczne dla aktywności hydrolitycznej pofałdowanie α/β.
WPROWADZENIE
Metabolity wtórne są małocząsteczkowymi naturalnymi składnikami roślinnymi, które pierwotnie uważano za produkty uboczne metabolizmu roślinnego,
nieistotne dla normalnego wzrostu i rozwoju roślin. Chociaż rola wielu z nich
wciąż nie jest znana, wiadomo, że metabolity wtórne odgrywają istotną rolę w
fizjologii roślin oraz odpowiedziach obronnych wywoływanych zarówno przez
czynniki biotyczne jak i abiotyczne [1]. Roślinne metabolity wtórne mają także wiele zastosowań praktycznych, szczególnie po selektywnym zwiększeniu
ich pozyskiwania z roślin metodami biotechnologicznymi. Znajdują one zastosowanie jako środki ochrony roślin, wykorzystuje się je również w przemyśle
spożywczym, kosmetycznym oraz farmaceutycznym. Bogactwo i różnorodność
roślinnych metabolitów wtórnych, szacowanych na ponad 200 000, jest cechą
charakterystyczną metabolizmu roślin [1]. To oznacza, że rośliny musiały rozwijać w trakcie ewolucji wyspecjalizowane aktywności enzymatyczne umożliwiające powstawanie tych składników.
Wyjątkowa strukturalna i funkcjonalna różnorodność naturalnych produktów roślinnych jest efektem ich modyfikacji w wyniku glikozylacji, hydroksylacji, dekarboksylacji, metylacji oraz szczególnie szeroko rozpowszechnionych w
szlakach metabolizmu wtórnego reakcji acylacji zachodzących z udziałem acylotransferaz [2,3]. Acylotransferazy (EC 2.3.1.x) katalizują przeniesienie grupy
acylowej z bogatej w energię cząsteczki donora na grupę nukleofilową (hydroksylową, aminową lub tiolową) akceptora z jednoczesnym wytworzeniem wiązania estrowego. Wśród acylotransferaz wyróżnia się dwie rodziny enzymów różniące się rodzajem wykorzystywanego donora grupy acylowej oraz lokalizacją
wewnątrzkomórkową: rodzina BAHD, która swoją nazwę zawdzięcza czterem
pierwszym opisanym enzymom tej grupy: BEAT (ang. benzylalcohol O-acetyltransferase), AHCT (ang. anthocyanin O-hydroxycinnamoyltransferase), HCBT (ang.
anthranilate N-hydroxycinnamoyl-/benzoyltransferase) i DAT (ang. deacetylvindoline
4-O-acetyltransferase) [3,4] oraz rodzina SCPL (ang. serine carboxypeptidase-like)
[2,5].
Anna Ciarkowska
Maciej Ostrowski
Anna Jakubowska
Zakład Biochemii, Wydział Biologii i
Ochrony Środowiska, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Toruń
Zakład Biochemii, Wydział Biologii i
Ochrony Środowiska, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, ul. Lwowska 1, 87-100 Toruń;
tel.: (56) 611 45 42; e-mail: [email protected]

Artykuł otrzymano 2 września 2014 r.
Artykuł zaakceptowano 27 listopada 2014 r.
Słowa kluczowe: karboksypeptydazy serynowe, acylotransferazy BAHD, acylotransferazy SCPL, metabolizm wtórny
Wykaz skrótów: BAHD — BEAT (ang. benzylalcohol O-acetyltransferase); AHCT (ang.
anthocyanin O-hydroxycinnamoyltransferase);
HCBT (ang. anthranilate N-hydroxycinnamoyl-/benzoyltransferase); DAT (ang. deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase); SalAT —
7-O-acetylotransferaza salutaridinolu; DAT
— acetylotransferaza deacetylowindoliny;
SCP — karboksypeptydazy serynowe;
SCPL — białka podobne do karboksypeptydaz serynowych; SGT — glukozylotransferaza UDP-glukoza : kwas synapinowy;
SMT — synapoilotransferaza synapoiloglukoza : jabłczan; SCT — synapoliotransferaza synapoiloglukoza : cholina; SAT
— synapoilotransferaza synapoiloglukoza:
antocyjan; SST — synapoilotransferaza synapoiloglukoza : synapoiloglukoza; IAA —
kwas indolilo-3-octowy
W artykule przedstawiono dotychczasową wiedzę na temat występowania,
mechanizmu działania i roli acylotransferaz w metabolizmie wtórnym roślin.
Postępy Biochemii 61 (1) 2015
69
ACYLOTRANSFERAZY Z RODZINY BAHD
Rodzina BAHD, zdecydowanie liczniejsza w porównaniu z rodziną SCPL, obejmuje zróżnicowane funkcjonalnie
acylotransferazy, które jako donor reszty acylowej wykorzystują tioestry koenzymu A. Enzymy te uczestniczą w
tworzeniu i modyfikacji specyficznych metabolitów, takich
jak estry alkoholowe określające zapach kwiatów i aromat
owoców, antocyjany czy flawonole występujące w barwnikach [4]. Większość scharakteryzowanych do tej pory acylotransferaz BAHD uważa się za rozpuszczalne białka cytosolowe, ponieważ, jak pokazują analizy in silico, nie zawierają
peptydów kierujących do organelli komórkowych [4]. Masa
cząsteczkowa tych enzymów waha się od 48 do 54 kDa.
Badania z wykorzystaniem ukierunkowanej mutagenezy
wykazały obecność kilku konserwatywnych motywów w
obrębie struktury białek BAHD, nieodzownych dla katalizy
enzymatycznej. Pierwszy ze wspomnianych motywów stanowi fragment HXXXDG krytyczny dla przeniesienia reszty acylowej. Reszta histydyny występująca w tym motywie
uczestniczy w odłączeniu protonu od grupy aminowej lub
hydroksylowej podczas ataku nukleofilowego cząsteczki
substratu na tioester CoA [6]. Drugim charakterystycznym
motywem transferaz BAHD jest peptyd DFGWG położony
blisko C-końca białek.
Na podstawie struktury krystalicznej syntazy winoryny,
enzymu z Rauvolfia serpentine katalizującego biosyntezę alkaloidu indolowego stwierdzono, że acylotransferazy BAHD
są białkami globularnymi, złożonymi z dwóch domen połączonych pętlą [6]. Na podstawie analizy filogenetycznej
opartej na specyficzności substratowej oraz sekwencji aminokwasowej polipeptydów podzielono je na pięć grup [4].
Grupę I reprezentują acylotransferazy przenoszące głównie
resztę malonylową i katalizujące syntezę antocyjanów. Enzymy tej grupy zawierają, oprócz wcześniej wspomnianych
motywów, zachowany w ewolucji fragment YFGNC. W obrębie grupy II wyróżniono białka zaangażowane w syntezę
wosków zawierających długołańcuchowe alkohole, lecz w
przeciwieństwie do pozostałych grup, nieznana jest specyficzna reszta acylowa przenoszona przez tioestry CoA podczas katalizowanej reakcji [4]. Reszty: acetylowa i malonylowa są przyłączane do cząsteczki akceptora przez enzymy
należące do grupy III, wśród których znajdują się transferazy uczestniczące w syntezie olejków eterycznych kwiatów i
owoców, kapsaicyny, antocyjanów oraz alkaloidów o znaczeniu farmakologicznym (tebaina, morfina) [4,7].
Na tle wymienionych transferaz BAHD, skromnie wyróżnia się grupa IV, do której, jak dotąd, należy tylko jeden
enzym: kumaroilotransferaza agmatyny (ACT). Piąta grupa
liczy około 20 enzymów przenoszących różne grupy acylowe oraz, co odróżnia ją od pozostałych BAHD, także resztę
arylową (benzylową) [8]. Wśród tych białek zidentyfikowano transferazy syntetyzujące benzylobenzoesan, alkaloidy
chinolizydynowe czy intermediaty w biosyntezie lignin [810]. Acylotransferazy z rodziny BAHD są interesujące m.in.
z tego powodu, że katalizują biosyntezę leków stosowanych
w leczeniu nowotworów złośliwych. Wspomniane terapeutyki, z uwagi na skomplikowaną strukturę chemiczną,
są trudne do uzyskania w czystej postaci podczas syntezy
70
organicznej, stąd zainteresowanie biotechnologów budzi
możliwość produkcji rekombinowanych enzymów BAHD.
Jednym z przedstawicieli wspomnianej rodziny jest, należąca do podklasy V, N-benzoilotransferaza 2-N-debenzenoilotaksolu (DBNTBT), katalizująca ostatni etap syntezy taksolu [11,12]. Taksol (paklitaksel) jest diterpenoidem
występującym naturalnie w owocach Taxus baccata i od lat
z powodzeniem stosowanym w farmakoterapii niektórych
nowotworów złośliwych. Gen kodujący DBNTBT został
sklonowany, a oczyszczone rekombinowane białko charakteryzuje się wysoką specyficznością względem N-debenzoilotaksolu, jako substratu reakcji oraz benzoilo~CoA, jako
donora reszty arylowej.
Innym przykładem acylotransferazy z rodziny BAHD
zaangażowanej w syntezę metabolitów wtórnych o ważnym znaczeniu farmakologicznym jest 7-O-acetylotransferaza salutaridinolu (SalAT) z maku Papaver somniferum,
która uczestniczy w biosyntezie alkaloidów: kodeiny i
morfiny [7]. Enzym ten należy do podklasy III BAHD i
przeprowadza reakcję acetylacji salutaridinolu do 7-O-acetylosalutaridinolu, który następnie ulega spontanicznemu
przekształceniu do tebainy. Analiza sekwencji aminokwasowej SalAT wykazała wysokie podobieństwo (37% identyczności) z acetylotransferazą deacetylowindoliny (DAT)
z Catharanthus roseus, katalizującą syntezę windoliny, która
jest prekursorem winblastyny stosowanej w chemioterapii
nowotworów [13].
ACYLOTRANSFERAZY Z RODZINY SCPL
Ponad dekadę temu zidentyfikowano nowy, niezwykle
interesujący typ acylotransferaz, które jako donor reszty acylowej wykorzystują alternatywny substrat: estry
β-acetalowe glukozy (estry 1-O-β-D-glukozy) charakteryzujące się wysokim potencjałem przenoszenia grupy acylowej [14]. Ich biosyntezę katalizują glukozylotransferazy
zależne od UDP-glukozy [15,16]. Acylotransferazy z tej rodziny wykazują homologię względem karboksypeptydaz
serynowych, SCP (ang. serine carboxypeptidases) z rodziny
peptydaz S10, które hydrolizują wiązania peptydowe między przedostatnią i C-końcową resztą aminokwasową białka lub peptydu. Z tego względu enzymy te określa się jako
acylotransferazy podobne do karboksypeptydaz serynowych, SCPL (ang. serine carboxypeptidase-like) [2,5]. Zarówno karboksypeptydazy SCP, jak i acylotransferazy SCPL
posiadają charakterystyczne dla aktywności hydrolitycznej
elementy strukturalne: pofałdowanie α/β oraz konserwowaną ewolucyjnie triadę katalityczną, którą stanowią reszty
seryny, histydyny i kwasu asparaginowego (Ser-His-Asp).
Acylotransferazy SCPL nie są jednak w stanie hydrolizować wiązań peptydowych [17,18]. Uważa się, że SCP i SCPL
powstały w wyniku ewolucji dywergentnej, która w przypadku białek SCPL doprowadziła do utraty aktywności hydrolitycznej na rzecz aktywności transferazowej [17,19]. W
odróżnieniu od przedstawionych wyżej acylotransferaz z
rodziny BAHD, enzymy z rodziny SCPL charakteryzują się
obecnością N-końcowego peptydu sygnałowego kierującego te białka do wakuoli centralnej [20,21].
www.postepybiochemii.pl
Acylotransferazy SCPL funkcjonują w licznych i różnorodnych szlakach metabolicznych, między innymi w biosyntezie metabolitów wtórnych, koniugacji niektórych hormonów roślinnych i herbicydów, degradacji białek zapasowych związanej z kiełkowaniem nasion [22-24]. Potwierdza
to ich znaczenie dla prawidłowego wzrostu i rozwoju roślin,
odporności na ksenobiotyki, reakcji obronnych w odpowiedzi na patogeny, stres oksydacyjny i promieniowanie UV.
Pierwszym scharakteryzowanym enzymem z grupy
acylotransferaz SCPL była zależna od 1-O-β-acyloglukozy
izobutyrylotransferaza z dzikiego pomidora Lycopersicon
pennellii [25,26]. Enzym ten katalizuje jeden z etapów syntezy poliestrów cukrowcowych (acylocukrów), które nadają
roślinie odporność na pewne owady, np. mszyce [27-29],
miniarkę ciepłolubkę [30] i mączliki ostroskrzydłe [31]. Trichomy gruczołowe Lycopersicon pennellii wydzielają dwa
rodzaje acylocukrów: acyloglukozę i acylosacharozę. Acyloglukoza jest kompleksem składającym się z trzech reszt
O-acylowych i β-D-glukozy, w którym grupy acylowe
mogą być rozgałęzionymi lub prostymi resztami kwasów
tłuszczowych o zróżnicowanej długości (od 4-5 do 10-12
atomów węgla) [32,33]. W szlaku biosyntezy
acyloglukozy, kwasy tłuszczowe aktywowane
są przez glukozylotransferazę UDP-glukoza :
kwas tłuszczowy, która powoduje powstanie
bogatej w energię 1-O-acylo-β-glukozy. Służy ona jako donor grupy acylowej w dwuetapowej reakcji transacylacji. Pierwszy etap to
reakcja dysproporcjonowania dwóch cząsteczek 1-O-acylo-β-glukozy do 1,2-di-O-acyloβ-glukozy, z uwolnieniem cząsteczki glukozy.
Następnie zachodzi anomeryczna wymiana
grupy acylowej, podczas której reszta acylowa
przy anomerycznym atomie węgla cząsteczki 1-O-acylo-β-glukozy przenoszona jest na
β-glukozę (Ryc. 1) [25].
Analiza aktywności oczyszczonej izobutyrylotransferazy zależnej od 1-O-β-acyloglukozy z
Lycopersicon pennellii pokazała, że enzym ten
katalizuje oba etapy transacylacji (reakcję dysproporcjonowania oraz anomerycznej wymiany grupy acylowej). Okazało się również, że
acylotransferaza jest glikoproteiną zbudowaną
z dwóch podjednostek: o masie cząsteczkowej
34 kDa i 24 kDa [25]. Identyfikacja cDNA, a następnie analiza sekwencji reszt aminokwasowych pokazały, że izobutyrylotransferaza z Lycopersicon pennellii przejawia homologię względem SCP. Sekwencja reszt aminokwasowych
acylotransferazy wykazała 76% podobieństwa
i 35% identyczności względem sekwencji karboksypeptydazy I z jęczmienia [26].
W sekwencji acylotransferazy wykryto również obecność charakterystycznej dla SCP zachowanej w ewolucji triady katalitycznej (His,
Ser, Asp). Katalityczna reszta seryny zlokalizowana jest w podjednostce izobutyrylotransferazy o masie cząsteczkowej 24 kDa, a reszty histydyny i asparaginianu w podjednostce o masie cząsteczkowej 34 kDa. Badania z użyciem
diizopropylofluorofosforanu (DFP), silnego inhibitora SCP, który działa poprzez wiązanie się
w sposób nieodwracalny z katalityczną seryną
udowodniły, że triada katalityczna His, Ser,
Asp uczestniczy w reakcji transacylacji. Diizopropylofluorofosforan w stężeniu 170 μM w
50% hamował aktywność dysproporcjonującą
Rycina 1. Schemat reakcji katalizowanych przez izobutyrylotransferazę (na podstawie [25], zmieniono).
Postępy Biochemii 61 (1) 2015
71
izobutyrylotransferazy, natomiast 1 mM DFP powodował
całkowitą utratę aktywności enzymatycznej [26].
SYNAPOILOTRANSFERAZY
Najlepiej poznaną grupą acylotransferaz SCPL są enzymy odpowiedzialne za syntezę estrów kwasu synapinowego, fenylopropanoidowych metabolitów wtórnych nadających roślinie odporność na działanie promieni UV [34]. A.
thaliana i niektóre inne Brassicaceae akumulują trzy najważniejsze estry kwasu synapinowego: synapoilocholinę magazynowaną w nasionach, synapoilo-L-jabłczan akumulowany w tkankach wegetatywnych oraz 1-O-synapoiloglukozę
będącą bezpośrednim prekursorem tych dwóch związków
[22]. 1-O-synapoiloglukoza jest wysokoenergetycznym estrem β-acetalowym [14], który powstaje w wyniku transferu cząsteczki glukozy z UDP-glukozy na kwas synapinowy
katalizowanego przez glukozylotransferazę UDP-glukoza :
kwas synapinowy (SGT, ang. UDP-glucose: sinapate glucosyltransferase) [35,36]. W szlaku biosyntezy estrów kwasu synapinowego uczestniczą również dwie acylotransferazy: synapoilotransferaza synapoiloglukoza : jabłczan (SMT, ang.
sinapoylglucose: malate sinapoyltransferase)
i synapoilotransferaza synapoiloglukoza
: cholina (SCT, ang. sinapoylglucose: choline sinapoyltransferase) (Ryc. 2), a także
esteraza synapoilocholiny (SCE, ang. sinapoylcholine esterase). W nasionach kwas
synapinowy ulega koniugacji z choliną
za pośrednictwem synapoiloglukozy w
wyniku aktywności SGT i SCT. Podczas
kiełkowania nasion kwas synapinowy
zostaje uwolniony z synapoilocholiny na
drodze hydrolizy katalizowanej przez
SCE. W siewkach wolny kwas synapinowy ponownie ulega koniugacji, tym
razem z L-jabłczanem w wyniku dwóch
następujących po sobie reakcji katalizowanych przez SGT i SMT [35,37]. Wyjątek stanowią naturalnie występujący
mutant A. thaliana Pna-10 oraz sztucznie
wytworzony mutant sng1, które nie posiadają genu kodującego SMT, w związku z czym nie wytwarzają synapoilo-L-jabłczanu [38]. Z kolei mutant sng2 nie
posiada genu kodującego SCT [39].
oraz 23% z karboksypeptydazą z pszenicy [22]. Okazało
się również, że AtSMT zawiera triadę katalityczną charakterystyczną dla białek SCP: S173, D358 i H411. Na tej
podstawie zaklasyfikowano ten enzym do rodziny acylotransferaz SCPL. Późniejsze badania wykazały, że obecność
wspomnianej triady katalitycznej Ser, His, Asp jest niezbędna dla aktywności transferazowej AtSMT. Wprowadzenie
mutacji Ser173Ala oraz His411Ala spowodowało całkowitą
utratę aktywności katalitycznej AtSMT. Natomiast mutacja
Asp358Ala spowodowała spadek aktywności enzymu o
80% [19].
Analiza w oparciu o metody immunochemiczne wykazała, że w komórkach roślinnych AtSMT jest monomerem
o masie cząsteczkowej 55 kDa [21]. Jest to o 8 kDa więcej
niż obliczona na podstawie teoretycznej sekwencji kodującej masa dojrzałego białka (47,2 kDa) i o 11 kDa więcej niż
wyznaczona masa rekombinowanej SMT produkowanej w
E. coli (44 kDa) [22]. Różnice w masie cząsteczkowej oraz
obecność w sekwencji aminokwasowej sześciu potencjalnych miejsc glikozylacji wskazują, że SMT jest glikoproteiną [21,22]. SMT podlega również obróbce proteolitycznej
Synapoilotransferaza synapoiloglukoza : jabłczan (SMT) katalizuje przeniesienie reszty kwasu synapinowego
z 1-O-synapoiloglukozy na L-jabłczan
z wytworzeniem synapoilo-L-jabłczanu. Analiza sekwencji SMT z A. thaliana
wykazała 18% identyczności z karboksypeptydazą Y z Saccharomyces cerevisiae
Rycina 2. Schemat syntezy estrów synapinowych z
udziałem specyficznych acylotransferaz zależnych od
1-O-synapoilo-glukozy. SMT – synapoilotransferaza
synapoiloglukoza : jabłczan; SCT – synapoliotransferaza synapoiloglukoza : cholina; SAT – synapoilotransferaza synapoiloglukoza: antocyjan; SST – synapoilotransferaza synapoiloglukoza : synapoiloglukoza (na
podstawie [18], zmieniono).
72
www.postepybiochemii.pl
polegającej na usunięciu 19-aminokwasowej sekwencji N-końcowej. Badania z wykorzystaniem znakowania immunofluorescencyjnego i mikroskopii fluorescencyjnej pozwoliły ustalić, że dojrzała SMT zlokalizowana jest w centralnej
wakuoli mezofilu liści i komórek epidermy A. thaliana [21].
Pozwala to wnioskować, że AtSMT syntetyzowana jest w
formie białka prekursorowego, które następnie kierowane
jest do siateczki śródplazmatycznej, gdzie usunięty zostaje
N-końcowy peptyd sygnałowy. Z ER białko jest transportowane do aparatu Golgiego, gdzie ulega glikozylacji i zostaje
przetransportowane do wakuoli.
Z wykorzystaniem narzędzi bioinformatycznych oraz
w oparciu o znane struktury krystaliczne białek będących
homologami AtSMT, Stehle i wsp. [19] przedstawili model
strukturalny tej acylotransferazy. Na tej podstawie można
stwierdzić, że w strukturze AtSMT występuje charakterystyczne dla aktywności hydrolitycznej SCP pofałdowanie
α/β, a konformacja enzymu stabilizowana jest przez trzy
mostki dwusiarczkowe. Siedem reszt aminokwasowych
AtSMT odpowiada za rozpoznanie pierwszego substratu
- 1-O-synapoiloglukozy. Dla właściwego przebiegu reakcji
konieczne jest prawidłowe ustawienie reszty kwasu synapinowego, które następuje w wyniku oddziaływania z dwiema resztami aminokwasowymi AtSMT: Glu215 i Arg219.
Glutaminian 215 tworzy wiązanie wodorowe z hydroksylem węgla C4 pierścienia aromatycznego substratu, natomiast Arg219 tworzy wiązanie wodorowe z tą samą grupą oraz z sąsiadującą grupą metylową. W wiązaniu reszty
glukozy cząsteczki substratu uczestniczą inne aminokwasy:
Trp71, Asn73, Gly74, Glu87, Asp172.
Drugi substrat, L-jabłczan, jest również rozpoznawany
przez wytworzenie wiązań wodorowych z odpowiednimi
resztami aminokwasów. Uprotonowana grupa karboksylowa L-jabłczanu oddziałuje z łańcuchami bocznymi Asn73
i Asp172. Ponadto, w rozpoznawaniu L-jabłczanu prawdopodobnie uczestniczą również His272, Lys268 i Asp278,
ponieważ ich podstawienie innym aminokwasem powoduje znaczny spadek aktywności enzymatycznej AtSMT. Bardzo ważną funkcję pełni też Arg322, czego dowodem jest
prawie całkowity brak aktywności acylotransferazy AtSMT
niosącej mutację Arg322Glu. Arg322 oddziałuje zarówno z
resztą glukozową 1-O-synapoiloglukozy jak i z grupą karboksylową L-jabłczanu. Odłączenie glukozy od centrum
aktywnego, zawierającego Arg322 wywołuje zmianę konformacyjną, co powoduje ustawienie L-jabłczanu w sposób
umożliwiający katalitycznej His411 przyłączenie protonu z
grupy hydroksylowej substratu, a także atak L-jabłczanu na
kompleks acyloenzymatyczny, co powoduje wytworzenie
produktu reakcji: synapoilo-L-jabłczanu [19].
Karboksypeptydazy serynowe, SCP zawierają charakterystyczny motyw otaczający katalityczną resztę seryny:
Gly-Glu-Ser-Tyr-Ala [40]. Synapoilotransferazy zawierają podobny motyw, jednakże Glu został zastąpiony przez
Asp, a Ala przez Ser (Gly-Asp-Ser-Tyr-Ser). Substytucja Glu
przez Asp najpewniej umożliwiła acylotransferazom SCPL
wykorzystanie estrów 1-O-glukozy jako substratów, jako że
dłuższy łańcuch boczny glutaminianu powoduje powstanie
zawady sterycznej uniemożliwiającej związanie acyloglukozy [19].
Postępy Biochemii 61 (1) 2015
Badania wykazały, że AtSMT jest specyficzna względem
L-jabłczanu, ponieważ (S)-2-hydroksymaślan, (R)-3-hydroksymaślan, glutaran oraz bursztynian, które wykazują
podobieństwo strukturalne względem L-jabłczanu, nie stanowią alternatywnych substratów dla enzymu. Działają natomiast jako inhibitory kompetycyjne hamując jego aktywność [41]. (S)-2-hydroksymaślan i (R)-3-hydroksymaślan
hamują aktywność AtSMT o około 12%, natomiast glutaran
o około 15%. Najsilniejszym inhibitorem okazał się bursztynian, który hamuje aktywność AtSMT o 21%. Aktywność
AtSMT jest również hamowana przez fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF), będący znanym inhibitorem karboksypeptydaz serynowych, SCP. Trzydziestominutowa preinkubacja AtSMT w obecności 30 mM PMSF powoduje spadek aktywności tej acylotransferazy o 30% [22].
Podstawową aktywnością SMT jest synteza synapoilo-L-jabłczanu z 1-O-β-synapoiloglukozy i L-jabłczanu. AtSMT
wykazuje taką aktywność w standardowych warunkach, w
pH 6,0. Okazuje się jednak, że zmiana warunków wpływa
na specyficzność tego enzymu. W pH 8,0 i przy nieobecności L-jabłczanu, AtSMT katalizuje tworzenie 1,2-di-Oβ-synapoiloglukozy [19]. Słabsze wiązanie akceptorowej
1-O-synapoiloglukozy w porównaniu do L-jabłczanu może
wyjaśniać, dlaczego w warunkach in vitro aktywność dysproporcjonująca AtSMT względem 1-O-synapoiloglukozy
jest wykrywalna jedynie pod nieobecność L-jabłczanu - AtSMT w czasie wiązania L-jabłczanu tworzy z nim pięć wiązań wodorowych, natomiast z 1-O-synapoiloglukozą tylko
dwa.
W normalnych warunkach AtSMT wykazuje również
niewielką aktywność hydrolityczną względem 1-O-βsynapoiloglukozy, co prowadzi do uwolnienia cząsteczki
glukozy i kwasu synapinowego. Aktywność hydrolityczna enzymu rośnie przy wzroście pH (pH 8,0) i przy braku
L-jabłczanu. W tym samym pH AtSMT wykazuje jedynie
śladową aktywność acylotransferazową względem L-jabłczanu. Specyficzność AtSMT wobec L-jabłczanu jest więc
największa w pH 6,0, co pokrywa się z warunkami panującymi w wakuoli, w której zlokalizowana jest AtSMT. Różne
aktywności enzymatyczne AtSMT sugerują, że enzym ten w
dalszym ciągu ulega zmianom ewolucyjnym i nie wykazuje
jednoznacznej specyficzności substratowej, a także nie utracił do końca właściwości hydrolitycznych [42].
Drugim, dobrze poznanym enzymem uczestniczącym
w syntezie estrów kwasu synapinowego jest synapoilotransferaza synapoiloglukoza : cholina (SCT) katalizująca
przeniesienie reszty kwasu synapinowego z 1-O-synapoiloglukozy na cholinę z wytworzeniem synapoilocholiny.
Analiza sekwencji SCT z A. thaliana (AtSCT) [39] i Brassica
napus (BnSCT) [43] wykazała, że enzym ten należy do rodziny acylotransferaz SCPL i zawiera zachowaną w ewolucji
triadę katalityczną charakterystyczną dla SCP (S178, D388,
H442 w AtSCT i S175, D390, H444 w BnSCT) [19,39]. Sekwencje aminokwasowe AtSCT i BnSCT wykazują względem siebie 84% identyczności [43].
Analiza AtSCT za pomocą metod immunochemicznych
wykazała, że dojrzałe białko jest heterodimerem zbudowa-
73
Rycina 3. Reakcja enzymatycznej syntezy indolilo-3-acetylo-myo-inozytolu.
nym z podjednostek o masie cząsteczkowej 30 kDa i 17 kDa,
które powstają w wyniku proteolitycznego rozszczepienia
białka prekursorowego o masie 50 kDa [44]. Szacowana
masa cząsteczkowa BnSCT również wynosi 50 kDa, a w sekwencji aminokwasowej acylotransferazy wykryto peptyd,
który zostaje wycięty w trakcie dojrzewania białka. Oznacza to, że dojrzała forma BnSCT także jest heterodimerem
[43]. Oba enzymy posiadają N-końcową sekwencję sygnałową kierującą do siateczki śródplazmatycznej, która zostaje
usunięta w czasie obróbki proteolitycznej oraz potencjalne
miejsca glikozylacji, co pokazuje, że podobnie jak SMT są
one glikoproteinami [43,44].
AtSCT charakteryzuje się szeroką specyficznością substratową względem donora grupy acylowej i może wykorzystywać różne estry hydroksycynamoiloglukozy (glukozydy kwasu ferulowego, kawowego oraz p-kumarowego)
jako alternatywne substraty. Mimo że enzym wykazywał
wyraźną specyficzność względem choliny jako akceptora
reszty kwasu synapinowego, może także wykorzystywać
alternatywne akceptory grupy acylowej (pochodne etanoloaminy, neopentanol, glicerol), jeżeli występują w odpowiednio wysokim stężeniu [44]. Podobnie jak w przypadku
AtSMT, PMSF działa hamująco na aktywność AtSCT, prowadząc do 25% spadku aktywności enzymatycznej [39].
Analiza struktury przestrzennej SCT z rzepaku wykazała, że podobnie jak w przypadku AtSMT, białko enzymatyczne charakteryzuje się występowaniem pofałdowania
α/β i jest stabilizowane przez trzy mostki dwusiarczkowe.
Rozpoznanie 1-O-synapoiloglukozy zachodzi z udziałem
reszt Glu217 (Glu220 w AtSCT) i Arg221 (224 w AtSCT),
które tworzą wiązania wodorowe z resztą kwasu synapinowego oraz Thr74 (77 w AtSCT), Asp174 (177 w AtSCT) i
Ser320 (319 w AtSCT), które tworzą wiązania wodorowe z
resztą glukozy w cząsteczce substratu. Z kolei cholina jest
rozpoznawana przez Glu274 (277 w AtSCT), Glu447 (445
w AtSCT), Cys281 (284 w AtSCT) i Thr445 (443 w AtSCT).
Po rozcięciu wiązania estrowego w 1-O-synapoiloglukozie
i uwolnieniu glukozy z miejsca aktywnego, reszta Asp174
(Asp177 w AtSCT) wymusza ustawienie się choliny na jej
miejsce, co umożliwia powstanie synapoiloglukozy [19].
Poza opisanymi wyżej enzymami, znane są także inne
synapoilotransferazy. Chromosom 2 A. thaliana zawiera
pięć ułożonych tandemowo genów SCPL, które kodują białka wykazujące względem siebie bardzo wysoki stopień podobieństwa: identyczność sekwencji dwóch białek wynosi
od 71 do 78% [20,46]. Jeden z tych genów koduje synapoilotransferazę synapoiloglukoza : synapoiloglukoza (SST, ang.
sinapoylglucose: sinapoylglucose sinapoyltransferase), która ka-
74
talizuje przeniesienie grupy acylowej z 1-O-synapoiloglukozy na drugą cząsteczkę 1-O-synapoiloglukozy z wytworzeniem 1,2-di-synapoiloglukozy (Ryc. 2) [45,46].
Produktem kolejnego z tych genów jest synapoilotransferaza synapoiloglukoza : antocyjan (SAT, ang. sinapoylglucose: anthocyanin sinapoyltransferase), która uczestniczy w
acylacji antocyjanów, co w istotny sposób wpływa na ich
właściwości biologiczne [46,47]. Za ten typ modyfikacji odpowiadają przede wszystkim acylotransferazy z rodziny
BAHD, jednakże zidentyfikowano również acylotransferazy SCPL uczestniczące w acylacji antocyjanów [48,49], do
których należy też AtSAT katalizująca powstanie pochodnej
cyjanidyny (Ryc. 2).
INDOLILOACETYLOTRANSFERAZY
Jednym z procesów odpowiedzialnych za regulację stężenia wolnego IAA (kwas indolilo-3-octowy), który jest aktywną biologicznie formą auksyny w komórce roślinnej, jest
jego koniugacja z różnymi cząsteczkami za pośrednictwem
wiązań amidowych lub estrowych. [50]. Koniugaty IAA
pełnią funkcję magazynu auksyny, stanowią jej formę transportową oraz, w niektórych przypadkach, są intermediatami procesów oksydacyjnej degradacji IAA. Przyczyniają się
w ten sposób do regulacji poziomu IAA w poszczególnych
tkankach i zapewniają zachowanie hormonalnej homeostazy koniecznej dla prawidłowego rozwoju rośliny [51].
Dominującą formę związanej auksyny u roślin jednoliściennych stanowią koniugaty estrowe syntetyzowane z
udziałem acylotransferaz [52]. Szlak biosyntezy koniugatów estrowych rozpoczyna synteza 1-O-indolilo-3-acetyloβ-D-glukozy (1-O-IAGlc) katalizowana przez glukozylotransferazę UDP-glukoza : IAA [15,53]. Następnie, acylotransferaza 1-O-IAGlc : myo-inozytol katalizuje przeniesienie reszty IAA z 1-O-IAGlc na myo-inozytol, co prowadzi
do powstania IA-myo-inozytolu (IAInos) [54,55] (Ryc. 3).
Analiza częściowej sekwencji aminokwasowej oczyszczonej
acylotransferazy 1-O-IAGlc : myo-inozytol z kukurydzy wykazała homologię z acylotransferazami z rodziny SCPL [56].
W wyniku oczyszczania acylotransferazy uzyskano dwa
peptydy: α i α’ o masie cząsteczkowej odpowiednio 56,4
kDa oraz 53,5 kDa. Ponieważ peptydy te nie różnią się między sobą sekwencją, różnica w ich masie zapewne wynika
z różnego stopnia glikozylacji białka. Natywny enzym jest
monomerem (56,4 kDa) lub dimerem (αα lub αα’). Podobnie jak AtSMT, acylotransferaza 1-O-IAGlc : myo-inozytol,
również zachowała aktywność hydrolityczną i jest w stanie
katalizować hydrolizę IAInos z uwolnieniem IAA. Ponadto,
enzym ten katalizuje przeniesienie IAA z IAInos na niektówww.postepybiochemii.pl
re monosacharydy: glukozę i mannozę oraz, w mniejszym
stopniu, na galaktozę i arabinozę.
IAA z 1-O-IAGlc może być przenoszony nie tylko na
myo-inozytol, ale również na niektóre cukry. Reakcja ta jest
katalizowana przez indoliloacetylotransferazę 1-O-IAGlc
: cukier (1-O-IAGlc-SugAc, ang. 1-O-(indole-3-acetyl)-β-Dglucose: sugar indoleacetyl transferase) [57]. Enzym ten wykazuje najwyższą aktywność względem monosacharydów
(mannozy, glukozy i galaktozy), niższą dla disacharydów
(celobiozy i gentobiozy) i trisacharydów (rafinozy) oraz
śladową aktywność w stosunku do oligosacharydów. 1-O-IAGlc-SugAc, poza aktywnością transferazową, wykazuje
również niewielką aktywność hydrolityczną oraz dysproporcjonującą względem 1-O-IAGlc, które prowadzą do powstania odpowiednio: wolnego IAA oraz 1,2-di-O-indolilo3-acetylo-β-D-glukozy. Jak dotąd, nie wykonano analizy
sekwencji aminokwasowej 1-O-IAGlc-SugAc, jednakże charakter katalizowanych przez nią reakcji wskazuje, że enzym
ten najprawdopodobniej jest przedstawicielem rodziny acylotransferaz SCPL.
MECHANIZM KATALITYCZNY
ACYLOTRANSFERAZ SCPL
Acylotransferazy SCPL, podobnie jak karboksypeptydazy serynowe SCP posiadają, jak wcześniej wspomniano,
zachowaną w ewolucji triadę katalityczną (Ser, His, Asp)
oraz charakterystyczne dla aktywności hydrolitycznej pofałdowanie α/β [18,19]. Mimo to, białka SCPL nie wykazują
aktywności hydrolitycznej względem peptydów, lecz katalizują reakcje transacylacji.
Hydroliza wiązania peptydowego katalizowana przez
SCP zachodzi według mechanizmu podwójnego przeniesienia (jeden lub więcej produktów uwalnianych jest przed
związaniem wszystkich substratów) [5]. Reakcję rozpoczyna nukleofilowy atak katalitycznej seryny na karbonylowy
węgiel rozcinanego wiązania. Proton z grupy hydroksylowej katalitycznej reszty seryny zostaje przeniesiony na histydynę, w wyniku czego wytworzony zostaje dodatni ładunek stabilizowany przez katalityczną resztę asparaginianu. Proton jest następnie przenoszony na azot w wiązaniu
peptydowym, co powoduje rozcięcie tego wiązania. N-końcowa część białka jest połączona wiązaniem estrowym z
resztą seryny tworząc kowalencyjny intermediat, natomiast
C-koniec zostaje uwolniony. Następnie acylowany intermediat zostaje zhydrolizowany przy udziale cząsteczki wody,
a katalityczna reszta seryny ulega regeneracji w wyniku
przyłączenia protonu.
Mechanizm reakcji katalizowanej przez SCPL nie jest w
pełni poznany. Ze względu na podobieństwo triady katalitycznej SCPL i SCP uważano, że przypomina on mechanizm hydrolizy wiązania peptydowego z tą różnicą, że w
przypadku reakcji transacylacji wodę zastępuje drugi substrat, akceptor grupy acylowej. Katalityczna reszta seryny
acylotransferazy posiadająca silnie nukleofilowy charakter
atakuje węgiel grupy karbonylowej substratu estrowego, w
efekcie czego powstaje intermediat: acylowany enzym. Następnie, wiązanie estrowe wytworzone między enzymem a
Postępy Biochemii 61 (1) 2015
Rycina 4. Zarys mechanizmu reakcji katalizowanej przez synapoilotransferazę
synapoiloglukoza: cholina (SCT). A) W centrum aktywnym AtSCT wiąże się
pierwszy substrat: synapoiloglukoza. Katalityczna reszta seryny (Ser178) AtSCT
przeprowadza atak nukleofilowy na cząsteczkę substratu, co prowadzi do rozcięcia wiązania estrowego i uwolnienia glukozy. B) Powstaje intermediat: acylowany enzym. Wytworzone w ten sposób wiązanie estrowe zostaje rozcięte w wyniku ataku choliny, na którą przeniesiona zostaje grupa acylowa. C) Prowadzi to do
uwolnienia cząsteczki produktu: synapoilocholiny (na podstawie [5], zmieniono).
substratem zostaje rozcięte w wyniku ataku drugiego substratu, na który przeniesiona zostaje grupa acylowa [17].
Analiza kinetyczna rekombinowanej SCT z A. thaliana
pokazała, że kataliza z udziałem tego enzymu rzeczywiście zachodzi według mechanizmu działania SCP (Ryc.
4A,B,C) [44]. Jednakże podobne badania wykonane dla rekombinowanej SMT z A. thaliana wskazują, że enzym ten
działa według odmiennego mechanizmu i katalizuje reakcję przeniesienia grupy acylowej zgodnie z przypadkowym
mechanizmem sekwencyjnym: oba substraty muszą być
związane w centrum aktywnym przed rozpoczęciem reakcji, ale kolejność ich wiązania jest przypadkowa (Ryc. 5)
[19]. Reakcję transacylacji katalizowaną przez AtSMT rozpoczyna związanie obu substratów w miejscu aktywnym
75
Rycina 5. Zarys mechanizmu reakcji katalizowanej przez synapoilotransferazę synapoiloglukoza: jabłczan (SMT). A) W centrum aktywnym AtSMT wiążą się oba substraty reakcji: synapoiloglukoza oraz L-jabłczan. B) Katalityczna reszta seryny (Ser173) AtSMT atakuje cząsteczkę synapoiloglukozy, co prowadzi do powstania intermediatu:
acylowanego enzymu oraz uwolnienia cząsteczki glukozy. C) L-jabłczan atakuje acylowany enzym, w wyniku czego powstaje synapoilojabłczan, który następnie opuszcza centrum aktywne AtSMT (na podstawie [18], zmieniono).
enzymu (Ryc. 5A). Katalityczna Ser173 atakuje cząsteczkę
1-O-β-synapoiloglukozy będącą donorem grupy acylowej.
W wyniku odcięcia cząsteczki glukozy tworzy się intermediat: acylowany enzym (Ryc. 5B). Cząsteczka akceptorowa
(L-jabłczan) zostaje zaktywowana przez katalityczną resztę
histydyny i atakuje acylowany enzym. Ostatecznie, synapoilo-L-jabłczan i glukoza opuszczają centrum aktywne enzymu (Ryc. 5C) [19].
PODSUMOWANIE
Acylotransferazy SCPL stanowią nową i słabo poznaną
rodzinę acylotransferaz roślinnych, pełniącą istotną rolę w
szlakach metabolizmu wtórnego. Badania filogenetyczne
sugerują, że zarówno u roślin jednoliściennych, jak i dwuliściennych występuje wiele enzymów należących do tej
rodziny [58]. Podobieństwo sekwencji oraz struktury wskazuje, że acylotransferazy SCPL wywodzą się od hydrolaz z
rodziny karboksypeptydaz serynowych. Acylotransferazy
SCPL stanowią więc interesujący obiekt badań nad metabolizmem wtórnym roślin oraz mechanizmem ewolucji
uczestniczących w nim enzymów.
76
PIŚMIENNICTWO
1. Hartmann T (2007) From waste products to ecochemicals: Fifty years
research of plant secondary metabolism. Phytochem 68: 2831-2846
2. Mugford ST, Milkowski C (2012) Serine carboxypeptidase-like acyltransferases from plants. Method Enzymol 516: 279-297
3. Yu X-H, Gou J-Y, Liu C-J (2009) BAHD superfamily of acyl-CoA dependent acyltransferases in Populus and Arabidopsis: bioinformatics
and gene expression. Plant Mol Biol 70: 421-442
4. D’auria JC (2006) Acyltransferases in plants: a good time to be BAHD.
Curr Opin Plant Biol 9: 331-340
5. Schaller A (2004) A cut above the rest: the regulatory function of plant
proteases. Planta 220: 183-197
6. Ma X, Koepke J, Panjikar S, Fritzsch G, Stockigt J (2005) Crystal structure of vinorine synthase, the first representative of the BAHD superfamily. J Biol Chem 280: 13576-13583
7. Grothe T, Lenz R, Kutchan TM (2001) Molecular characterization of
the salutaridinol 7-O-acetyltransferase involved in morphine biosynthesis in opium poppy Papaver somniferum. J Biol Chem 276: 3071730723
8. Boatright J, Negre F, Chen XL, Kish CM, Wood B, Peel G, Orlova I,
Gang D, Rhodes D, Dudareva N (2004) Understanding in vivo benzoid metabolism in Petunia petal tissue. Plant Physiol 135: 1993-2011
9. Okada T, Hirai MY, Suzuki H, Yamazaki M, Salto K (2005) Molecular characterization of a novel quinolizidine alkaloid O-tigloyltranswww.postepybiochemii.pl
ferase: cDNA cloning, catalytic activity of recombinant protein and
expression analysis in Lupinus plants. Plant Cell Physiol 46: 233-244
10. Hoffmann L, Besseau S, Geoffroy P, Ritzenthaler C, Meyer D, Lapierre C, Pollet B, Legrand M (2005) Acyltransferases-catalysed pcoumarate ester formation is a committed step of lignin biosynthesis.
Plant Biosyst 139: 50-53
11. Long RM, Lagisetti C, Coates RM, Croteau RB (2008) Specificity of the
N-benzoyl transferase responsible for the last step of Taxol biosynthesis. Arch Biochem Biophys 477: 384-389
12. Walker K, Long R, Croteau R (2002) The final acylation step in Taxol
biosynthesis: cloning of the taxoid C13-side-chain N-benzoyltransferase from Taxus. Proc Natl Acad Sci USA 99: 9166-9171
13. St Pierre B, De Luca V (2000) Evolution of acyltransferases genes: origin and diversification of the BAHD superfamily of acyltransferases
involved in secondary metabolism. W: Romeo JT, Ibrahim R, Varin L,
De Luca V (red) Evolution of Metabolic Pathways, Rec Adv Phytochem Vol 34, Elsevier, str. 285-315
14. Mock HP, Strack D (1993) Energetics of the uridine 5’-diphosphoglucose: hydroxycinnamic acid acyl-glucosyltransferase reaction. Phytochem 32: 575-579
15. Leźnicki AJ, Bandurski RS (1988) Enzymic synthesis of indole-3-acetyl-1-O- β-D-glucose. I. Partial purification and characterization of the
enzyme from Zea mays. Plant Physiol 88: 1474-1480
16. Ostrowski M, Jakubowska A (2013) UDP-glikozylotransferazy hormonów roślinnych. Post Biol Kom 40: 141-160
17. Milkowski C, Strack D (2004) Serine carboxypepidase-like acyltransferases. Phytochem 65: 517-524
18. Stehle F, Brandt W, Stubbs MT, Milkowski C, Strack D (2009) Sinapoyltransferases in the light of molecular evolution. Phytochem 70:
1652-1662
19. Stehle F, Brandt W, Milkowski C, Strack D (2006) Structure determinants and substrate recognition of serine carboxypeptidase-like
acyltransferases from plant secondary metabolism. FEBS Lett 580:
6366-6374
20. Fraser CM, Rider LW, Chapple C (2005) An expression and bioinformatics analysis of the Arabidopsis serine carboxypeptidase-like gene
family. Plant Physiol 138: 1136-1148
21. Hause B, Meyer K, Viitanen PV, Chapple C, Strack D (2002) Immunolocalization of 1-O-sinapoylglucose:malate sinapoyltransferase in
Arabidopsis thaliana. Planta 215: 26-32
22. Lehfeldt C, Shirley AM, Meyer K, Ruegger MO, Cusumano JC, Viitanen PV, Strack D, Chapple C (2000) Cloning of the SNG1 gene of
Arabidopsis reveals a role for a serine carboxypeptidase-like protein
as an acyltransferase in secondary metabolism. Plant Cell 12: 12951306
23. Liu H, Wang X, Zhang H, Yang Y, Ge X, Song F (2008) A rice serinecarboxypeptidase-like gene OsBISCPL1 is involved in regulation of
defense responses against biotic and oxidative stress. Gene 420: 57-65
24. Mugford ST, Qi X, Bakht S, Hill L, Wegel E, Hughes RK, Papadopoulou K, Melton R, Philo M, Sainsbury F, Lomonossoff GP, Roy AD,
Goss RJM, Osbourn A (2009) A serine carboxypeptidase-like acyltransferase is required for synthesis of antimicrobial compounds and
disease resistance in oats. Plant Cell 21: 2473-2484
25. Li AX, Eannetta N, Ghangas GS, Steffens JC (1999) Glucose polyester
biosynthesis. Purification and characterization of a glucose acyltransferase. Plant Physiol 121: 453-460
26. Li AX, Steffens JC (2000) An acyltransferase catalyzing the formation
of diacylglucose is a serine carboxypeptidase-like protein. Proc Natl
Acad Sci USA 97: 6902-6907
27. Goffreda JC, Mutschler MA (1999) Inheritance of potato aphid resistance in hybrid between Lycopersicon esculentum and Lycopersicon pennellii. Theor Appl Genet 78: 210-216
28. Goffreda JC, Mutschler MA, Tingey WM (1988) Feeding behavior of
potato aphid affected by glandular trichomes of wild tomato. Entomol Exp Appl 48: 101-108
Postępy Biochemii 61 (1) 2015
29. Rodriguez AE, Tigey WM, Mutschler MA (1993) Acylsugars of Lycopersicon pennellii deter settling and feeding of the green peach aphid
Homoptera aphididae. J Econ Entomol 86: 34-39
30. Hawthorne DJ, Shapiro JA, Tingey WM, Mutschler MA (1992) Trichome-borne and artificially applied acylsugars of wild tomato deter
feeding and oviposition of the leafminer Liriomyza trifolii. Entomol
Exp Appl 65: 65-73
31. Liedl BE, Lawson DM, White KK, Shapiro JA, Cohen DE, Carson WG,
Trumble JT, Mutschler MA (1995) Acylsugars of wild tomato Lycopersicon pennellii alters settling and reduces oviposition of Bemisia argentifolii (Homoptera: Aleyroididae). J Econ Entomol 88: 742-748
32. Burke BA, Goldsby G, Mudd JB (1987) Polar epicuticular lipids of Lycopersicon pennellii. Phytochem 26: 2567-2571
33. Walters DS, Steffens JC (1990) Branched chain amino acid metabolism in the biosynthesis of Lycopersicon pennellii glucose esters. Plant
Physiol 93: 1544-1551
34. Landry LG, Chapple CCS, Last RL (1995) Arabidopsis mutants lacking phenolic sunscreens exhibit enhanced ultraviolet-B injury and
oxidative damage. Plant Physiol 109: 1159-1166
35. Milkowski C, Baumert A, Strack D (2000) Cloning and heterologous
expression of rape cDNA encoding UDP-glucose:sinapate glucosyltransferase. Planta 211: 883-886
36. Wang SX, Ellis BE (1998) Enzymology of UDP-glucose: sinapic acid
glucosyltransferase from Brassica napus. Phytochem 49: 307-318
37. Milkowski C, Strack D (2010) Sinapate esters in brassicaceous plants:
biochemistry, molecular biology, evolution and metabolic engineering. Planta 232: 19-35
38. Li X, Bergelson J, Chapple C (2010) The ARABIDOPSIS accession Pna10 is a naturally occurring sng1 deletion mutant. Mol Plant 3: 91-100
39. Shirley AM, McMichael CM, Chapple C (2001) The sng2 mutant of
Arabidopsis is defective in the gene encoding the serine carboxypeptidase-like protein sinapoylglucose:choline sinapoyltransferase. Plant
J 28: 83-94
40. Derewenda U, Brzozowski AM, Lawson DM, Derewenda ZS (1992)
Catalysis at the interface: the anatomy of the conformational change
in a triglyceride lipase. Biochemistry 31: 1532-1541
41. Stehle F, Stubbs MT, Strack D, Milkowski C (2008) Heterologous expression of a serine carboxypeptidase-like acyltransferase and characterization of the kinetic mechanism. FEBS J 275: 775-787
42. Stehle F, Brandt W, Schmidt J, Milkowski C, Strack D (2008) Activities of Arabidopsis sinapoylglucose: malate sinapoyltransferase shed
light on functional diversification of serine carboxypeptidase-like acyltransferases. Phytochem 69: 1826-1831
43. Milkowski C, Baumert A, Schmidt D, Nehlin L, Strack D (2004) Molecular regulation of sinapate ester metabolism in Brassica napus: expression of genes, properties of the encoded proteins and correlation
of enzyme activities with metabolite accumulation. Plant J 38: 80-92
44. Shirley AM, Chapple C (2003) Biochemical characterization of
sinapoylglucose:choline sinapoyltransferase, a serine carboxypeptidase-like protein that functions as an acyltransferase in plant secondary metabolism. J Biol Chem 278: 19870-19877
45. Baumert A, Milkowski C, Schmidt J, Nimtz M, Wray V, Strack D
(2005) Formation of a complex pattern of sinapate esters in Brassica
napus seeds, catalyzed by enzyme of a serie carboxypeptidase-like acyltransferases family? Phytochem 66: 1334-1345
46. Fraser CM, Thompson MG, Shirley AM, Ralph J, Schoenherr JA, Sinlapadech T, Hall MC, Chapple C (2007) Realated Arabidopsis serine
carboxypeptidase-like sinapoylglucose acyltransferases display distinct but overlapping substrate specificities. Plant Physiol 144: 19861999
47. Yoshimoto M, Okuno S, Yamaguchi M, Yamakawa O (2001) Antimutagenicity of deacylated anthocyanins in purple-fleshed sweet potato.
Biosci Biotechnol Biochem 65: 1652-1655
48. Miyahara T, Sakiyama R, Ozeki Y, Sasaki N (2013) Acyl-glucose-dependent glucosyltransferase catalyses the final step of anthocyanin
formation in Arabidopsis. J Plant Physiol 170: 619-624
77
49. Nakayama T, Suzuki H, Nishino T (2003) Anthocyanin acyltransferases: specificities, mechanism, phylogenetics, and applications. J Mol
Catal 23b: 117-132
54. Kęsy JM, Bandurski RS (1990) Partial purification and characterization of indol-3-ylacetylglucose:myo-inositol indol-3-ylacetyltransferase (indoleacetic acid-inositol synthase). Plant Physiol 94: 1598-1604
50. Ludwig-Müller J (2011) Auxin conjugates: their role for plant development and in the evolution of land plants. J Exp Bot 62: 1757-1773
55. Michalczuk L, Bandurski RS (1982) Enzymic synthesis of 1-O-indol3-ylacetyl-β-glucose and 1-O-indol-3-ylacetyl-myo-inositol. Biochem J
207: 273-281
51. Kai K., Wakasa K, Miyagawa H (2007) Metabolism of indole3-acetic acid in rice: identification and characterization of N-β-Dglucopyranosyl indole-3-acetic acid and its conjugates. Phytochem
68: 2512-2522
52. Jakubowska A, Kowalczyk S (2004) The auxin conjugate 1-O-indole3-acetyl-β-D-glucose is synthesized in immature legume seeds by
IAGlc synthase and may be used for modification of some high molecular weight compounds. J Exp Bot 55: 791–801
53. Michalczuk L, Bandurski RS (1980) UDP-glucose: indoleacetic acid
glucosyl transferase and indoleacetyl-glucose: myo-inositol indoleacetyl transferase. Biochem Biophys Res Commun 93: 588-592
56. Kowalczyk S, Jakubowska A, Zielińska E, Bandurski RS (2003) Bifunctional indole-3-acetyl transferase catalyses synthesis and hydrolysis of indole-3-acetyl-myo-inositol in immature endosperm of Zea
mays. Physiol Plant 119: 165-174
57. Starzyńska E, Kowalczyk S (2012) Novel 1-O-indole-3-acetyl-β-Dglucose-dependent acyltransferase transferring indoleacetyl moiety
to some mono- di- and oligosaccharides. Acta Physiol Plant 34: 53-63
58. Mugford ST, Osbourn A (2010) Evolution of serine carboxypeptidaselike acyltransferases in the monocots. Plant Signal Behav 5: 193-195
Acyltransferases involved in plant secondary metabolism:
classification, structure, reaction mechanism
Anna Ciarkowska, Maciej Ostrowski, Anna Jakubowska
Department of Biochemistry, Nicolaus Copernicus University, 1 Lwowska St., 87-100 Toruń, Poland

e-mail: [email protected]
Key words: serine carboxypeptidases, BAHD acyltransferases, SCPL acyltransferases, secondary metabolism
ABSTRACT
Acyltransferases participate in many metabolic pathways in plants, especially in secondary metabolism pathways. These enzymes catalyse
transfer of an acyl group from energy-rich donor molecule to nucleophilic group of an acceptor molecule resulting in ester bond formation.
Plant acyltransferases can be divided into two families: serine carboxypeptidase-like acyltransferases (SCPL) and BAHD acyltransferases
(named after its first four characterized enzymes). Based on differences in substrate specificity and aminoacid sequence, BAHD acyltransferases have been classified into five clades. SCPL acyltransferases utilise energy-rich 1-O-β-D-glucose esters as donors of an acyl group, instead of
coenzyme A thioesters, which are substrates for acyltransferases from more abundant BAHD family. SCPL acyltransferases are homologous to
hydrolases from serine carboxypeptidases family. They share some structural elements, such as conserved catalitic triad or α/β hydrolase fold.
78
www.postepybiochemii.pl