Plik

S ł u p s k i e P r a c e B i o l o g i c z n e 1 • 2005
Grzegorz Wawrzyniak
Akademia Wychowania Fizycznego, Poznań
Z BADAŃ ONTOGENETYCZNEJ ZMIENNOŚCI
WSKAŹNIKA ELEKTROFORETYCZNEJ RUCHLIWOŚCI
JĄDER KOMÓRKOWYCH
Miarą dojrzałości biologicznej dzieci jest poziom ich rozwoju fizycznego. Kontrola
rozwoju służy określeniu położenia osobnika na tle populacji i zakresu zmienności
danej cechy biologicznej. Są to najczęściej cechy ilościowe: wysokość i masa ciała,
grubość fałdów skórno-tłuszczowych itp. Charakteryzując procesy rozwoju, rozumiane jako rozwój biologiczny polegający na zwiększaniu się wymiarów ciała (w czasie
i przestrzeni), oceniać możemy tempo przyrostów cechy w odstępach czasu lub
poziom rozwoju cechy w ontogenezie w danym momencie jej trwania – w momencie badania. Oceniamy obraz fenotypowy osobnika przyjmując często, iż wyższa
wartość cechy odpowiada wyższemu poziomowi rozwoju. Oceniany poziom rozwoju
jest funkcją czynników genetycznych i środowiskowych, zapewniających indywidualność osobników. Ze względu na realizację cechy przez osobników na różnym, właściwym sobie poziomie rozwoju (indywidualny poziom w ramach normy adaptacyjnej
właściwej dla populacji), obserwujemy zróżnicowanie fenotypowe.
Na podstawie zmian natury czynnościowej, odpornościowej czy też adaptacyjnej, zachodzących w obrębie organizmu, możemy wyodrębnić trzy zasadnicze
fazy rozwojowe. Najbardziej dynamiczna faza trwająca od momentu zapłodnienia do
osiągnięcia przez osobnika pełnej dojrzałości nazywa się fazą progresywną. Charakteryzuje się ona procesami wzrostu różnicowania i dojrzewania. W następnym
etapie, stabilnym, stan funkcjonalny organizmu utrzymywany jest w granicach
pewnego stałego poziomu. Procesy inwolucyjne ulegają nasileniu w fazie trzeciej –
kończącej się śmiercią organizmu. W fazie progresywnej określamy stopień zaawansowania procesów rozwojowych, a więc drogę, jaka pozostała osobnikowi do osiągnięcia pełnej dojrzałości. Wiek biologiczny w fazie inwolucyjnej określa odcinek,
jaki pozostał do przebycia osobnikowi do zakończenia życia. Wiek biologiczny
określa tutaj stopień „zużycia” organizmu, czyli prawdopodobieństwo śmierci. Faza
stabilna nie charakteryzuje się kierunkowymi zmianami i dlatego trudno znaleźć
punkt odniesienia, wobec którego należałoby ocenić osobnika.
Brakuje wyznacznika, który byłby miernikiem rozwoju bez względu na etap ontogenezy. Konieczne jest więc znalezienie takiego wyznacznika, który informowałby o stanie całego organizmu. Cechy morfologiczne, najłatwiejsze do zmierzenia
165
w badaniach antropologicznych, mają największy udział w ujmowaniu i opisywaniu
zjawisk rozwojowych, zwłaszcza dotyczących fazy progresywnego wzrastania. Cechy
biologiczne jednak, stanowiąc podstawę wyznaczników wieku rozwojowego (kryterium kostne, zębowe, morfologiczne, drugorzędowych cech płciowych itp.) w pewnym okresie ontogenezy – przed rozpoczęciem realizacji ontogenezy ujmowanej
jako okres stabilny – osiągają stan nieróżnicowania osobników między sobą ze
względu na różny stopień zaawansowania w rozwoju. Niemal rutynowo przy ocenie
poziomu rozwoju fizycznego dzieci określa się wiek rozwojowy masy i wysokości
ciała. Jest to słuszne postępowanie metodologiczne, traktujące wzrastanie jako
proces natury ilościowej, będący wynikiem interakcji komponenty genetycznej i modyfikującego wpływu środowiska. Cechy te jednak mogą stać się zawodne w ocenie poziomu rozwoju biologicznego, będącego zarazem wskaźnikiem stanu
zdrowia i odżywienia populacji, gdy same w sobie stanowią kryterium doboru do
dyscypliny sportowej, np. w akrobatyce preferowane są dzieci o małej masie ciała
i niskim wzroście, poniżej wartości przeciętnych.
Zrodziła się więc potrzeba poszukiwania takiego wyznacznika, który dawałby
możliwość oceny wieku rozwojowego (poziomu rozwoju) bez względu na etap ontogenezy, nie stanowiłby kryterium doboru do dyscypliny oraz spełniał wszystkie
warunki dopuszczające cechę, właściwość biologiczną jako wyznacznik wieku rozwojowego.
Taką propozycją oceny wieku rozwojowego – fizjologicznego jest elektroforetyczna ruchliwość jąder komórkowych (Electrophoretical Mobility of Nuclei –
EMN), która wykorzystuje fakt poruszania się jąder komórkowych w zmiennym polu
elektrycznym oraz fakt zmiany proporcji między liczbą komórek posiadających ruchliwe jądro i komórek o jądrze nie ruszającym się. Do oceny stopnia ruchliwości
jąder komórkowych stosuje się aparat Biotest, pozwalający przeprowadzić elektroforezę (zmienne pole elektryczne o napięciu 20-30 V, natężeniu 0,l mA i częstości
zmian pola elektrycznego w granicach 1-2 Hz). W opisanym badaniu wykorzystuje się
nabłonek jamy ustnej, ze względu na łatwość i bezinwazyjność pobrania materiału.
Pobrana tkanka umieszczona w 0,09% NaCl nie wymaga dodatkowego przygotowania. Komórki i jądra są dobrze widoczne już pod 160-krotnym powiększeniem. Do
obserwacji wybiera się komórki z drugiej warstwy, a więc dojrzałe. Pomija się natomiast komórki najmniejsze – niedojrzałe i największe – złuszczające się. Eliminuje
się również z obserwacji komórki o jądrach pałeczkowatych lub zaczernionych, jak
również o stosunkowo małej lub zdecydowanie dużej ilości cytoplazmy. Selekcja
powyższa po wykonaniu kilkudziesięciu preparatów nie sprawia żadnych trudności.
Elektroforetyczna ruchliwość jąder komórkowych (EMN) jako miernik rozwoju
może być stosowana – co trzeba podkreślić – przez całą ontogenezę. Wskaźnik EMN
wykazuje przez wszystkie fazy kierunkowość – jego wartość początkowo wzrasta,
mając dodatnią korelację z wiekiem, osiąga wartość maksymalną w wieku około 17
lat, po czym przy ujemnej korelacji z wiekiem jego wartość spada (ryc. l). Wartość
liczbowa wskaźnika EMN odzwierciedla stosunek komórek o jądrach ruchliwych
do komórek o jądrach pasywnych w zmiennym polu elektrycznym (Makałowska
1992, Wawrzyniak 1998).
166
wskaźnik EMN
chłopcy
dziewczęta
wiek kalendarzowy
wiek rozwojowy
Ryc. 1. Ontogenetyczna zmienność EMN
Fig. 1. The ontogenetic mutuality of EMN ratio
chłopcy
wiek BV
dziewczęta
wiek MC
wiek EMN
wiek kalendarzowy
Ryc. 2. Wiek rozwojowy dzieci uprawiających akrobatykę sportową
Fig. 2. The developmental age of children practicing sport acrobatic
167
Tabela l
Wartości współczynnika korelacji między wiekiem a poszczególnymi cechami
Table 1
The values of coefficient correlation between age and individual characteristics
Cecha
Wiek
Wysokość
ciała
Liczba
zębów
chłopcy
Wskaźnik
EMN
Wysokość
ciała
Liczba
zębów
dziewczęta
Wskaźnik
EMN
0,7522**
0,808**
0,214**
0,701**
0,686**
0,255**
** poziom istotności 0,01
Tabela 2
Wartości współczynnika korelacji między wiekiem rozwojowym chłopców i dziewcząt
Table 2
The values of coefficient correlation between boys and girls’ developmental age
Cecha
Wiek wysokości
Wiek zębowy
ciała
Wiek wysokości
ciała
chłopcy
Wiek wsk. EMN
Wiek wysokości ciała
Wiek
zębowy
dziewczęta
0,232**
0,140
0,164*
0,176*
–
0,539**
–
0,501**
* poziom istotności 0,05
** poziom istotności 0,01
Dzięki dużej czułości wskaźnik EMN może służyć jako miernik oceny zróżnicowania między różnymi grupami wyodrębnionymi ze względu na działanie czynników
zewnętrznych (różny poziom aktywności ruchowej, proces chorobowy, poziom higieny życia – alkohol, papierosy, stres). Wskaźnik EMN może służyć ocenie grup
zawodników uprawiających różne dyscypliny sportowe (ryc. 2; Wawrzyniak 1997)
oraz wpływu wysiłku treningowego na stopień ruchliwości jąder komórkowych
i szybkości biologicznej samoregeneracji organizmu po ustaniu obciążenia treningowego. Wskaźnik EMN jako właściwość biologiczna organizmu spełnia wszystkie
warunki kryterium wieku rozwojowego:
1. wykazuje zmienność w trakcie rozwoju; zmienność ta może przejawiać się poprzez
zmianę wartości przeciętnych lub zmianę zakresu zmienności;
2. wykazuje skorelowanie z wiekiem kalendarzowym, korelacja ta nie jest zbyt silna,
3. odzwierciedla istotne zmiany będące przejawem zjawisk rozwojowych,
4. zmienność cechy w obrębie grupy wiekowej jest na tyle silna, że można wyodrębnić
wyraźne grupy biologicznie starsze i młodsze,
5. zmiany w obrębie rozkładu cechy charakteryzują się jednakowym kierunkiem
u wszystkich osobników, to znaczy poszczególne etapy występują u nich w ta168
wiek rozwojowy
kiej samej kolejności, a różnice międzyosobnicze wynikają jedynie ze zróżnicowania tempa rozwoju tej właściwości,
6. cecha jest silnie wrażliwa na działanie czynników środowiskowych.
W celu ukazania wzajemnych powiązań wybranych cech biologicznych w aspekcie oceny poziomu rozwoju dzieci wykonano pomiary wysokości, masy ciała 144
chłopców i 147 dziewcząt. Dokonano również pomiaru elektroforetycznej
ruchliwości jąder komórkowych oraz liczby wyrżniętych zębów. Powyższe cechy
wykazują istotny statystycznie związek z wiekiem kalendarzowym i zależności te
można opisać funkcją regresji (tab. l i 2). Siła związku kształtuje się odmiennie
w przypadku poszczególnych cech, dlatego krzywe regresji w różny sposób wyjaśniają związki między cechami. Poszczególne wyznaczniki informują o innych
właściwościach organizmu, inne jest podłoże ich istnienia i kształtowania się w ontogenezie. Wskaźnik EMN kształtuje się w ontogenezie niezależnie od zaawansowania
w rozwoju cech morfologicznych (ryc. 3, 4). Daje to możliwość dostarczenia pełniejszej informacji o rozwoju fizycznym dzieci i młodzieży.
Zainteresowanie się wskaźnikiem EMN jest wynikiem aspektu zmienności tej właściwości na wszystkich etapach ontogenezy. Niezwykle łatwy pomiar (w ramach
podstawowego przygotowania biologicznego) daje asumpt do wdrożenia tej metody do badań dzieci, młodzieży, ludzi starszych – ukazując osobnika na tle zmienności populacji. Ogromne zainteresowanie budzi fakt ekosensytywności cechy. Nie
do końca poznany jest wpływ wszystkich czynników środowiska zewnętrznego oddziałującego na organizm. Pojawia się zatem ogromne pole badawcze, pozwalające
jednocześnie na wdrażanie do auksologii już uzyskanych rezultatów.
wiek zębowy
wiek wsk. EMN
wiek BV
Ryc. 3. Wiek rozwojowy chłopców
Fig. 3. The developmental age of boys
169
wiek rozwojowy
wiek zębowy
wiek wsk. EMN
wiek BV
Ryc. 4. Wiek rozwojowy dziewcząt
Fig. 4. The developmental age of girls
PIŚMIENNICTWO
Makałowska I., 1992, Przydatność i zakres stosowalności kryteriów oceny wieku biologicznego w badaniach ontogenetycznych na przykładzie metody EMN i metody analizy
morfologicznej. UAM, praca doktorska
Wawrzyniak G., 1997, A proposal of estimation of developmental age in young acrobats,
Diagnostika pohyboveho systemu. Olomouc
Wawrzyniak G., 1998, The estimation of the level of the electrophoretical mobility of nuclei
(EMN) index. Poznań, maszynopis
Summary
FROM EXAMINATION OF ONTOGENETIC VARIABLE
OF THE ELECTROFORETICAL MOBILITY OF NUCLEI
The level of biological development of children and youths may be an indicative of the
state of health and nutrition of a given population. In auxological study it is important to
establish the development level and direction of a given variable compared with the population and if the development proceeds smoothly (not necessarily at the highest level of development). A means to meet these aims can be among others electroforetic method of mobility
170
of nuclei. To measure electroforetic mobility of nuclei the oral cavity cuticle is used. Cells
from the second layer built of mature cells, which have not yet been degenerated, are selected
for observation. To draw samples of cuticle sterile haematological knives are used which
ensure painless and bloodless sampling. The samples are stored in Eppendorf test tubes in the
temperature of 10ºC, in 0.09% solution of NaCl. The cells can be stored for 1 to 5 days;
longer storing is not advisable due to the damage of the cells by microorganisms. Samples of
cells are observed with a microscope enlarged to 160 the size in alternating electric field of
20-30 V of voltage, 0.1 mA intensity and the frequency of change of poles of 1-2 Hz. Electrophoresis is carried out using a Biotest device constructed especially for this type of study.
171