Znaczenie cytometrii przepływowej w diagnostyce białaczki z

Znaczenie cytometrii przepływowej w diagnostyce białaczki z

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2009 • Volume 45 • Number 2 • 125-135
Praca oryginalna • Original Article
Znaczenie cytometrii przepływowej w diagnostyce
białaczki z dużych ziarnistych limfocytów T
Katarzyna Błachnio1, Grzegorz Rymkiewicz1,2, Monika Gos3, Tomasz Sadowski4,
Anna Borawska5, Konrad Ptaszyński2
1
Pracownia Cytometrii Przepływowej Zakładu Patologii, 2Zakład Patologii, 3Zakład Biologii Komórki, 4Zakład Chemii Klinicznej,
5
Klinika Nowotworów Układu Chłonnego Centrum Onkologii - Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie w Warszawie
Streszczenie
Cel badań: Omówienie danych kliniczno-patologiczno-laboratoryjnych i analiza skuteczności procedur diagnostycznych
u chorych podejrzanych o procesy rozrostowe z dużych ziarnistych limfocytów T ze szczególnym uwzględnieniem roli cytometrii przepływowej (FCM) w ustaleniu ostatecznego rozpoznania. Metody badawcze: U 12 pacjentów wykonano morfologię krwi
z rozmazem, badania histopatologiczno-immunohistochemiczne (HP/IH) trepanobiopsji szpiku, badania FCM krwi lub szpiku
oraz badania molekularne (PCR). Wyniki: Neutropenię i limfocytozę obserwowano u wszystkich pacjentów, splenomegalię
u 8, reumatoidalne zapalenie stawów u 4, autoimmunologiczne zapalenie tarczycy u 2, w pojedynczych przypadkach zespół
Sjögrena i twardzinę. Rozpoznanie białaczki T-LGL ustalono u 11 chorych, a u 1 chorego poliklonalną limfocytozę z dużych,
ziarnistych limfocytów T (LGLs). Komórki T-LGL wykazują zawsze dodatnią ekspresję: CD45, CD2 i CD3, zwykle CD8 z ujemną ekspresją CD4. T-LGL w FCM różniły się od LGLs utratą lub spadkiem ekspresji antygenów pan-T, najczęściej CD5, CD7
i CD43, obniżoną ekspresją CD44 i CD52, obecnością izoformy cząsteczki CD45 - CD45RA, CD11c i antygenów komórek NK
(CD16, CD56 i CD57), brakiem ekspresji CD25, CD27, CD71. W badaniu HP/IH trepanobiopsji szpiku komórki T-LGL zlokalizowane były śródmiąższowo, tworząc drobne skupienia oraz w zatokach. Wnioski: Najważniejszym elementem w rutynowej
diagnostyce T-LGL jest badanie FCM uzupełnione o badanie morfologii komórek białaczkowych. Wykazano 100% zgodność
badań FCM i PCR w różnicowaniu T-LGL od LGLs.
Flow cytometry signification in T-cell large granular leukemia diagnosis
Summary
Aim: The purpose of this study was to review the clinical, pathological and laboratory data of patients (pts) with the initial diagnosis of T-cell large granular leukemia (T-LGL), where particular attention was given to the results obtained with the use of
3-color flow cytometry (FCM) to make a final diagnosis. Methods: Histopathological (HP), immunohistochemical (IH) and FCM
evaluations of peripheral blood (PB) / bone marrow (BM) of 12 pts with suspicion of T-LGL were performed. When the diagnosis
of T-LGL was suspected, evaluation of a PB film was necessary. The PB samples were also investigated by polimerase chain
reaction (PCR). Results: There was a neutropenia and lymphocytosis observed in all pts investigated, 8 pts showed splenomegaly. An autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis was seen in 3 pts, Hashimoto`s thyroiditis in 2 pts. Sjögren
syndrom or scleroderma was present in 1 pt each. The T-LGL was diagnosed in 11 cases and only one of the pts had features
of reactive polyclonal lymphocytosis (LGLs). The T-LGL cells are usually CD8 positive, CD4 negative and differed from cells
of pts with LGLs in FCM. The T-LGL cells showed CD45, CD45RA, CD2 and CD3 expression; an absence or decrease of
pan-T-cell antigens expression such as CD5, CD7 and CD43; weaker expression of CD44 and CD52; expression of CD11c
and NK antigens such as: CD16, CD56, CD57; absence of CD25, CD27, CD71. The IH studies of the BM trephines showed
interstitial clusters and intrasinusoidal linear infiltrations of lymphocytes. Conclusions: FCM is the most important components
of the routine diagnosis of T-LGL cells supplemented with the examination of morphologic features of those cells. In summary,
we have shown a high conformation of FCM and PCR in differentiating T-LGL cells from those of LGLs lymphocytosis.
Słowa kluczowe:białaczka z dużych ziarnistych limfocytów T (T-LGL), cytometria przepływowa
Key words:T-cell granular lymphocyte leukemia (T-LGL), flow cytometry
Szczególne podziękowania chcielibyśmy złożyć paniom: Prof. dr hab. med. Oldze Mioduszewskiej i dr med. Monice Prochorec-Sobieszek
za krytyczne uwagi dotyczące niniejszej publikacji.
125
Znaczenie cytometrii przepływowej w diagnostyce białaczki z dużych ziarnistych limfocytów T
Wstęp
Białaczka z dużych, ziarnistych limfocytów T (ang. T-cell
large granular leukemia, T-LGL) stanowi około 2-3% białaczek z dojrzałych komórek T/NK. T-LGL jest rzadką i heterogenną chorobą o przewlekłym przebiegu (limfocytoza > 6
miesięcy) z obecnością we krwi obwodowej zwiększonego
odsetka dużych, ziarnistych limfocytów, komórek o obfitej
jasnoniebieskiej cytoplazmie z azurofilnymi ziarnistościami.
W badaniach laboratoryjnych stwierdza się prawidłową lub
podwyższoną wartość leukocytozy (WBC>10x109/l), neutropenię (<1,5x109/l) oraz nieznaczną lub średnią limfocytozę
w zakresie 2-20 x 109/l. Choroba przeważnie występuje
u osób dorosłych w wieku 45-75 lat, z taką samą częstością
zachorowań zarówno u mężczyzn, jak i u kobiet. Rzadkie
(<3%) są przypadki, kiedy choroba rozwijała się u osób młodych poniżej 25. roku życia [1, 2, 7, 8, 12, 20, 23].
Początkowe objawy T-LGL są niespecyficzne. U około 6070% pacjentów choroba wykrywana jest przypadkowo
w trakcie badań okresowych i często połączona jest z nawracającymi infekcjami bakteryjnymi. Chorzy często skarżą
się na zmęczenie, mają podwyższoną temperaturę ciała
oraz uczucie pełności i bóle w brzuchu będące wynikiem
splenomegalii (>14 cm w długiej osi w badaniach USG i TK),
która opisywana jest w 20-50% przypadków [1, 7, 8, 10, 11,
20, 23].
Komórki T-LGL zajmują krew obwodową (ang. peripheral
blood, PB), szpik (ang. bone marrow, BM), wątrobę i śledzionę. Powiększenie węzłów chłonnych (limfadenopatia)
nie występuje [1, 2, 7- 9, 12, 19, 20, 23].
Zaobserwowano występowanie T-LGL u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (RZS), które występuje
u około 30% chorych [7, 8, 11, 10-12, 19, 20, 23].
Unikalną cechą T-LGL jest częste współistnienie z innymi
chorobami autoimmunologicznymi, hematologicznymi i nowotworowymi, takimi jak: zespół Sjögrena, toczeń rumieniowaty układowy, twardzina, nawracające zapalenie błony
naczyniowej oka, zapalenie tarczycy typu Hashimoto, autoimmunologiczne endokrynopatie, wrzodziejące zapalenie jelita grubego, autoimmunologiczne zapalenie wątroby, zespół
hemofagocytarny, autoimmunologiczne cytopenie i zespoły
mielodysplastyczne, a nawet z innymi chłoniakami z komórek B, głównie o mniejszej złośliwości. Białaczka T-LGL
może towarzyszyć także niedoborom immunologicznym, na
przykład: pospolitemu zmiennemu niedoborowi odporności
(ang. common variable immunodeficiency, CVID). Chorzy
z T-LGL mają często różne nieprawidłowości serologiczne,
takie jak: czynnik reumatoidalny (ang. rheumatoid factor, RF),
przeciwciała przeciwjądrowe, przeciwpłytkowe, antyfosfolipidowe, krążące kompleksy immunologiczne i hipergammaglobulinemię poliklonalną [1, 2, 5, 7, 8, 10-12, 19, 20, 23].
Ocena fenotypu komórek limfoidalnych za pomocą cytometrii przepływowej z oceną morfologii w rozmazach z PB i BM
ma najważniejsze znaczenie w codziennej rutynowej diagnostyce T-LGL w Centrum Onkologii w Warszawie (COI),
jak i w innych ośrodkach diagnostyczno-leczniczych. Cyto126
metria przepływowa pozwala na precyzyjną ilościową oraz
jakościową analizę fenotypu komórek T-LGL i różnicowanie
z procesami nienowotworowymi i innymi białaczkami z dojrzałych komórek T/NK [12].
Ocena klonalności komórek przeprowadzona z użyciem reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. Polimerase Chain Reaction, PCR) z zastosowaniem starterów specyficznych dla
genów TCR (ang. T-cell Receptor) traktowana jest w COI
jako metoda pomocnicza w przypadkach wątpliwych.
Celem pracy było omówienie danych kliniczno-patologiczno-laboratoryjnych i analiza skuteczności procedur diagnostycznych, takich jak: badania histopatologiczno-immunohistochemiczne (HP/IH) trepanobiopsji BM, badania
rozmazów PB i BM, badania cytometryczne (FCM) i molekularne (PCR) u chorych podejrzanych o procesy rozrostowe
z dużych ziarnistych limfocytów T (LGLs) krwi obwodowej
ze szczególnym uwzględnieniem roli FCM w ustaleniu ostatecznego rozpoznania na podstawie materiału od chorych
COI w Warszawie.
Materiał i metody
Pacjenci
Badaniem objęto 12 pacjentów z podejrzeniem o procesy
rozrostowe z dużych, ziarnistych limfocytów T krwi obwodowej postawionym na podstawie oceny morfologii w rozmazach PB, cech klinicznych i wstępnych badań laboratoryjnych
zdiagnozowanych w latach 1998-2008 w COI w Warszawie.
Wszystkie dane kliniczno-laboratoryjne, np. objawy ogólne,
choroby towarzyszące, stan chorych podczas przyjęcia i wyniki badań laboratoryjnych, zaczerpnięto z dostępnej dokumentacji klinicznej. Rozpoznanie T-LGL ustalono w oparciu
o nową klasyfikację WHO rozrostów hematopoetycznych
i limfoidalnych [2] z wykorzystaniem cytometrycznych kryteriów diagnostycznych [1, 3, 6, 12, 24], oceny morfologii
komórek limfoidalnych PB i BM w rozmazach i badaniach
HP szpiku, oceny immunofenotypu w badaniach FCM i IH
[2, 15, 19] oraz analizy molekularnej w korelacji z danymi
kliniczno-laboratoryjnymi [14, 19].
Badania morfologiczne
Morfologię PB i BM oceniano w rozmazach barwionych
metodą May-Grünwald-Giemza (MGG). Trepanobiopsje
BM utrwalano w utrwalaczu Oksfordzkim, przeprowadzano
i barwiono w sposób rutynowy hematoksyliną i eozyną (HE)
oraz oceniono mikroskopowo. W badaniu HE szpiku oceniano komórkowość, typ zajęcia BM przez komórki T-LGL, linie:
czerwonokrwinkową, granulocytarną i megakariocyty oraz
obecność odczynowych grudek chłonnych. W pojedynczych
przypadkach, przy braku dostępnego badania HE oceniano poszczególne linie szpikowe w mielogramie (pacjent nr
8) lub na podstawie oceny trepanobiopsji z innego ośrodka
(pacjenci 10-11) (tab. I-III).
Badania immunohistochemiczne
Odczyny immunohistochemiczne z użyciem zestawu wizualizującego EnVision TM Detection System (DAKO) wykonano na skrawkach parafinowych trepanobioptatów z wykorzy-
K. Błachnio i inni
Tabela I
Parametry laboratoryjne w białaczce T-LGL i LGLs.
nr
płeć/
wiek
WBC
(x109/l)
LYMPH
analizator
(x109/l)
LYMPH
FCM
(x109/l)
LYMPH
FCM
(%)
T-LGL
FCM
(x109/l)
T-LGL
FCM
(%)
NEU
(x109/l)
PLT
RBC
HCT
(x109/l) (x1012/l) (%)
HGB MCV
γ
(g/
(fl)
glob.
dl)
S
1
k/36
15,7
11,9
11,3
72
9,9
88
2,55
381
3
24,8
8,2
86
↑
+
2
k/55
17,8
16,4
15,8
89
14,6
92
0,71
285
3,3
33,4
10,9
102
↑
-
3
k/28
5,41
3,6
4,3
79
2,3
55
1,24
309
3,8
34,9
12
90,9
↑
-
4
m/70
36,4
34,5
34,6
95
32,5
94
0,06
57
5,1
46,3
14,9
90,4
↑
+
5
k/57
7,7
6,3
6,5
85
4,8
73
0,8
21
nb
nb
7,8
nb
↑
+
6
k/58
9,2
6,6
7
77
5,1
72
1.7
230
3
24,8
13,4
86
↑
-
7
m/54
2,6
2,1
2
76
1,9
95
0,4
267
4,2
36,2
12,1
87,1
nb
+
8
m/59
4,2
3,3
3,2
77
2,5
79
0,58
114
4,9
39,9
11,2
80
↑
+
9
m/40
22,6
18
8,6
38
7,4
86
0,74
176
4,7
37,7
13,0
80
nb
+
10
k/34
4,58
4
3,9
86
3,5
88
0,25
70
3,32
29,2
10,3
88
↑
+
11
k/43
3,20
1,97
1,8
56
1,2
70
0,84
143
4,71
40,3
14,2
8,6
N
-
12
m/37
11,1
9,1
5,5
50
4,7^
84^
0,12
68
5,2
44
14,2
83
↓
+
Skróty: k – kobieta, m – mężczyzna, ↑ zwiększona, ↓ obniżona, N – norma, nb – nie badano, WBC – krwinki białe, LYMPH – limfocyty, oceniane w analizatorze hematologicznym i cytometrii przepływowej (FCM) – wartości podane w (%) i wartościach bezwzględnych, T-LGL – ilość
komórek białaczkowych podana w (%) i wartościach bezwzględnych, ^ ilość LGLs podana w (%) i wartościach bezwzględnych, NEU – granulocyty, PLT – płytki krwi, RBC – krwinki czerwone, HCT – hematokryt, HGB – hemoglobina, MCV – średnia objętość krwinki czerwonej,
γ glob – gamma globuliny, S – splenomegalia.
staniem przeciwciał mono- i poliklonalnych: CD3 (polyclonal,
DAKO), CD4 (4B12, Novocastra), CD8 (C8/144B, DAKO),
CD56 (CD564, Novocastra), CD57(NK-1, Novocastra), granzyme B (11F1, Novocastra). Rutynowo stosowano kontrole
pozytywne i negatywne dla ww. przeciwciał. W badaniach IH
nie stosowano odczynów: CD2, CD7 i CD43, gdyż odczyny
te są pozytywne również na innych komórkach pochodzenia
szpikowego, uniemożliwiając ocenę ich ewentualnej utraty
na komórkach limfoidalnych. Nie oceniano odczynu IH antyCD5 na komórkach limfoidalnych, gdyż w szpiku występują
limfocyty B o koekspresji CD5. W pojedynczych przypadkach, przy braku dostępnego badania HP/IH, oceniano stopień zajęcia BM za pomocą oceny analizy FCM (pacjenci nr
7-9) (tab. I-III).
Cytometria przepływowa
Immunofenotypowanie komórek limfoidalnych przeprowadziliśmy, wykorzystując 3-kolorową FCM z użyciem panelu
przeciwciał do analizy limfocytów T i NK opisanych przez
nas wcześniej [22]. Zakres przeciwciał: Zastosowane przeciwciała monoklonalne były bezpośrednio połączone z flu-
oresceiną (FITC), fikoerytryną (PE, R-PE) lub Peridinin
– chlorophyll fikoerytryną (PerCP). Panel przeciwciał monoklonalnych przeciwko określonym antygenom różnicowania (ang. cluster of differentiation, CD) zastosowanych
do analizy FCM zawierał następujące przeciwciała: CD45
FITC (2D1), i jego izoformy: CD45RA FITC (L48), CD45RO
PE (UCHL1) oraz CD2 PE (S5.2), CD3 PerCP, (UCHT1),
CD4 FITC (4SK3), CD5 FITC (L17F12), CD7 FITC (4-H9),
CD8 PE i PerCP (SK1), CD11c PE (S-HCL3), CD14 PE (14MOP9), CD25 PE (2A3), CD27 FITC (L128), CD16&56 PE
(16&56-MY31), CD56 PE (NCAM16.2), CD57 FITC (NHK1), CD62L PE (SK11), CD71 FITC (LO1.1), CD95 PE (DX2),
HLADR PE (HLADR-L243), TCRαβ FITC (WT31), TCRγδ
PE (11F2) firmy Becton Dickinson (BD). Ponadto, CD3 FITC
i RPE (UCHT1) oraz CD16 RPE (DJ130c) firmy DAKO,
CD43 RPE (L10), CD52 RPE (YTH34.5) firmy SEROTEC,
CD44 RPE (MEM-85) firmy CALTAG. Negatywne kontrole
inkubowano z połączoną z fluorochromami immunoglobuliną o identycznym izotypie, jak pozostałe przeciwciała: simultest (BD) i IgG1 PerCP (BD). Antygeny komórek wyznako127
Znaczenie cytometrii przepływowej w diagnostyce białaczki z dużych ziarnistych limfocytów T
TCRG
((PCR)
TCRG
((PCR)
-*
-
-
-
+↓ +↓ +↓
-
+/- +/-
-
+/- αβ+, γδ-
VγIf,Vγ10-Jγ
Vγ9,Vγ11-Jγ
B
2
+
+
-
+
+
-
-
-
+
+/-
-
+/-
-
-
-
+↓ +↓ +↓
-
+ +/-
-
nb αβ+, γδ-
VγIf,Vγ10-Jγ
M
3
+
+
-
+
+
-
+
-*
+
+
-
-* +/-
-
-
+↓ +↓ +↓
-
4
+
+
-
+ +/-↓
-
+/-↓ +/-↓ +
+
-
+/- +/-
-
-
+↓ +↓ +↓
-
5
+
+
-
+
+
-
+ +/-↓ +
nb
nb
6
+
+
-
+↓
+
-
7
+
+
-
+↓
+↓
-
+↓ +/-↓ +
8
+
+
-
+↓
+↓
-
+↓
9
+
+
-
-
+
+↓
-
-
10 +
+
-
+
+
-
-/+↓ +
+
+/-
11 +
+
-
+↓
+
-
+/-↓ +
+
+/- -/+
+
+
-
12 + -/+ +/-
- +↓
+/-↓
+
-
-
-
+↓ +/- +/- +/- +
-
-
-
+
+ +/-
+/- +
+
CD62L
CD27
-
CD95
CD25
+/-
HLADR
CD57
-* +/-↓ +
CD11c
CD16&56
-
CD71
CD56
+
CD52
CD16
+
CD44
CD4
-
CD43
CD3
+
CD8
CD2
+
CD7
RA
RO
1
nr
CD5
CD45
CD45
TcR (FCM)
Tabela II
Cytometryczna ocena immunofenotypu i ocena klonalności w białaczce T-LGL i LGLs.
-
αβ+, γδ-
VγIf,Vγ10-Jγ
M
-
αβ+, γδ-
VγIf,Vγ10-Jγ
B
nb
nd
αβ-, γδ+
VγIf,Vγ10-Jγ
B
nb nb nb nb nb +/- +/- nb nb αβ+, γδ+↑ +↓ +↓
-
nb +
-
+/-
-
-
+/-
-
-
+ +↓ +↓
-
+
-
+/- αβ+, γδ-
VγIf,Vγ10-Jγ
M
+↑ +/-
-
-
-
-
-
+↑ +↓ +↓
-
+ +/-
-
+/- αβ+, γδ-
VγIf,Vγ10-Jγ
B
+↓ +/- +/-
+
+
-
-
-
+↓ +↓ +↓
-
+
-
-
αβ-, γδ+
VγIf,Vγ10-Jγ
M
-
-/+
-
-
-
+↓ +↓ +↓
-
+
-
nb nb αβ+, γδ-
Vγ9,Vγ11-Jγ
M
-
-/+
-
-
+ +↓ +↓
-
VγIf,Vγ10-Jγ
B
-
-
-
nd
P
+
+
+
-
-
+/- +
+
+
+
-
+/- -/+
-
-
+/-
-
-
-
αβ+, γδ-
+/- αβ+, γδ-
Skróty: [-] ujemna ekspresja, [-*] ekspresja na mniej niż 20%, [+/-] ekspresja na subpopulacji komórek (>20<100% komórek), [+] ekspresja
(100% komórek), ↓ nieprawidłowa niższa ekspresja CD2, CD3 CD5,CD7 i CD43 (mglista, na subpopulacji) – niższa ewentualnie wyższa ↑,
niż ekspresja na prawidłowych limfocytach T, TCRG (PCR): M – produkt monoklonalny, B – product biklonalny/bialleliczny, P – produkt poliklonalny, nb – nie badano.
Tabela III
Morfologia szpiku i wyniki badań immunohistochemicznych w T-LGL.
Komórkowość
Typ
zajęcia
szpiku
LGL
(%)
1
↑
s,w.
58
CD3+,CD4-,CD8+,CD57-,granzym B+
↓
N←
N
+
2
↑
s,w.
20
CD3+,CD4-,CD8+,CD57-,granzym B+
N
↓←
N
+
3
↓
s,w.
20
CD3+,CD4-,CD8+,CD57+,granzym B+
↓
N←
N
-
4
↑
s.w.
25
CD3+,CD4-,CD8+,CD57+/-,granzym B+
N
N←
N
-
5
↑
s.w.
20
CD3+,CD4-,CD8+,CD57-,granzym B+/-
↓
N←
N
-
6
N
s.w.
15
CD3+,CD4-,CD8-,CD57+/-,granzym B+/-
N
↑←
N
+
7
bd
bd
73*
CD3+,CD4-,CD8+,CD56-*
bd
bd
bd
bd
8
bd
bd
48*^
CD3+,CD4-,CD8+,CD56-*
N
↓←
N
bd
9
N
w
35*
CD3+,CD4-,CD8+,CD56- granzym B+
N
N←
N
-
10
↑
s
30#
CD3+
N
N←
N
+
11
↑
s
10#
CD3+
N
N←
N
-
nr
IH (Immunofenotyp)
Prekursory
Prekursory
Megaka- Grudki chłonne
czerwonokrwin- granulocytów& riocyty
(skupiska
kowe
odczynowych
limfocytów)
Skróty: ↑zwiększona, ↓obniżona, N-norma, * ocena cytometryczna szpiku,^ mielogram szpiku, # oszacowanie szpiku w innym ośrodku hematologicznym, s. – zajęcie śródmiąższowe, limfocyty skupione w grupy, w. – zajęcie wewnątrzzatokowe, limfocyty położone w naczyniach, ←
przesunięcie dojrzewania granulocytów w lewo, bd – brak danych.
128
K. Błachnio i inni
wane ww. przeciwciałami w sposób rutynowy analizowano
w ciągu 1 godziny przy użyciu cytometru przepływowego
FACSCalibur (BD) z laserem argonowym o długości fali
488nm, ustawiając bramkę na populacji komórek limfoidalnych (5000 komórek/próbkę). Bramka na komórkach limfoidalnych została ustawiona w oparciu o wielkość (FSC)
i ziarnistość komórek (SSC) (ryc. 2A) z wykorzystaniem przeciwciał CD45/CD14, które pozwalają na dokładne zlokalizowanie badanych komórek limfoidalnych CD45+/CD14- (ryc.
2B) w analizowanej próbce. Immunofenotypowo ekspresję
antygenów powierzchniowych ocenialiśmy na skali logarytmicznej. Do analizy wyników użyto programu CellQuest.
Sposób interpretacji: Ekspresję powierzchniową oceniano na
podstawie porównania mediany intensywności fluorescencji
(ang. median fluorescence intensity, MFI) badanego antygenu na komórkach T-LGL z intensywnością fluorescencji
w próbce zawierającej kontrolę izotopową i MFI antygenów
na prawidłowych limfocytach T z PB lub BM współistniejących z T-LGL. Przyjęto, że komórki badane wykazują ekspresję analizowanego antygenu, jeżeli odsetek komórek wykazujących fluorescencję jest wyższy niż kontrola izotypowa
i wynosi nie mniej niż 20 procent. Ustalono, że ekspresja
antygenów pan-T (CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD25
i CD43) na komórkach T-LGL może mieć następujący charakter: i) jednopikowy typu bright, taki sam jak na prawidłowych limfocytach T (+) (ryc. 2B), ii) mglisty typu dim, obniżony
w stosunku do prawidłowych limfocytów T na 100% komórek
T-LGL (+↓), iii) mglisty typu dim, obniżony w stosunku do
prawidłowych limfocytów T na subpopulacji (>20<100%) komórek T-LGL (+/-↓) oraz iv) komórki T-LGL nie mają ekspresji badanego antygenu (-). Dodatkowo, ekspresję antygenów
innych niż pan-T (CD27, CD44, CD45 i jego izoformy, CD16,
CD16&CD56, CD56, CD57, CD52, CD62L, CD71, CD95
i HLADR) oceniano na komórkach T-LGL w podobny sposób: dodatnia na wszystkich komórkach (+), na subpopulacji
(+/-), (>20<100%) i brak ekspresji (-). W przypadku ekspresji CD52 i CD44 porównywaliśmy MFI na komórkach T-LGL
z prawidłowymi limfocytami T. Jako kryterium klonalności
T-LGL: przyjmowaliśmy utratę antygenów pan-T na populacji komórek wykazującej ekspresję TCRαβ+ lub TCRγδ+.
Badania molekularne
Ocenę klonalności komórek przeprowadzono za pomocą
techniki PCR z zastosowaniem starterów specyficznych dla
locus TCRG i analizy heterodupleksów. Do badania wykorzystywano DNA genomowe wyizolowane z PB lub BM od
pacjentów z podejrzeniem T-LGL. Ocenę klonalności przeprowadziliśmy u 12 pacjentów. Reakcje amplifikacji przeprowadziliśmy z wykorzystaniem starterów i zgodnie z warunkami opracowanymi w ramach programu BIOMED-II [25].
W reakcjach używano 100ng DNA, które powielono stosując
dwa zestawy starterów specyficznych dla locus TCRG (I zestaw - VγIf, Vγ10-Jγ, II zestaw - Vγ9, Vγ11-Jγ). Otrzymany
produkt denaturowano w 95º C przez 5 minut, a następnie
renaturowano w 4º C przez 1 godzinę. Przygotowane w ten
sposób próbki rozdzielono w 6% niedenaturującym żelu po-
liakrylamidowym (napięcie: 110V, czas: 2h), który po elektroforezie barwiono w roztworze bromku etydyny (0,5 µg/ml).
Kryterium klonalności T-LGL: detekcja na żelu poliakrylamidowym jednego wyraźnego prążka świadczy o obecności
monoklonalnej rearanżacji w locus TCRG. Jednakże w wielu
przypadkach rozrostów T-komórkowych dochodzi do rearanżacji locus TCRG na obu kopiach chromosomu 7 (rearanżacja bialleliczna), co uwidacznia się na żelu w postaci dwóch
prążków. Obraz ten może być podobny, jeśli w badanym
materiale obecne są dwie populacje komórek białaczkowych
(wyjątkiem są rearanżacje niewykrywalne przez stosowany
zestaw starterów). Z tego powodu próbki, w których w analizie heterodupleksów wykryto dwa wyraźne prążki, określane
są jako biklonalne/bialleliczne [13, 25].
Wyniki
Rozrosty LGLs w naszym materiale zdarzają się bardzo
rzadko. Spośród 2450 wykonanych badań u chorych na
rozrosty limfoidalne, przesłanych do Pracowni Cytometrii
Przepływowej COI, tylko 12 (<0,5%) dotyczyło badań LGLs.
Pacjenci z objawami kliniczno-laboratoryjnymi związanymi
z podejrzeniem LGLs, częściej niż do onkologów trafiają
do hematologów, reumatologów i immunologów klinicznych. U 11 chorych (pacjenci nr 1-11) rozpoznaliśmy T-LGL
a u chorego nr 12 (tab. I-III) poliklonalną limfocytozę z dużych, ziarnistych limfocytów T (LGLs) towarzyszącą pospolitemu zmiennemu niedoborowi odporności (CVID) przebiegającemu z hipogammaglobulinemią, nawracającymi
infekcjami bakteryjnymi, splenomegalią – objawami kliniczno-patologiczno-laboratoryjnymi przypominającymi T-LGL.
Charakterystyka laboratoryjno-kliniczna pacjentów
Omawiana grupa obejmuje 7 kobiet i 5 mężczyzn w wieku 2870 lat (średnia 47 lat). Objawy ogólne (nawracające infekcje,
wieloletni przebieg kliniczny chorób autoimmunologicznych,
nieprawidłowości w obrazie morfologii PB) wskazują, że
u 27% chorych (pacjenci nr 1,3, 10) choroba rozpoczęła się
przed 25. rokiem życia. W badaniach laboratoryjnych (tab. I)
Rycina 1
Charakterystyczne cechy cytologiczne T-LGL. Komórki
krwi obwodowej wykazują typowe ziarnistości cytoplazmatyczne (strzałka). (MGG, powiększenie 1000x).
129
Znaczenie cytometrii przepływowej w diagnostyce białaczki z dużych ziarnistych limfocytów T
u wszystkich pacjentów z T-LGL stwierdziliśmy limfocytozę
w zakresie 1,97-34,5 x 109/l z medianą 6,3 x 109/l, odpowiadającą limfocytozie od 38 do 95% (mediana: 77%), trwającą
co najmniej 6 miesięcy, neutropenię w zakresie 0,06-2.55 x
109/l z medianą 0,74 x 109/l, odpowiadającą neutropenii od
0,1 do 26,2% (mediana: 13,9%). U 4/11 pacjentów z T-LGL
wykazaliśmy podwyższoną leukocytozę (WBC>10 x 109/l),
u 2 obserwowaliśmy leukopenię (WBC<4 x 109/l), zaś u 5/11
pozostałych pacjentów wartość leukocytozy mieściła się
w granicach normy. Anemię (HGB<12 g/dl dla kobiet i <14
g/dl dla mężczyzn) wykazaliśmy u 7/11 badanych chorych,
małopłytkowość (PLT<150 x 109/l) u 5 pacjentów. Na podstawie analizy średniej objętości krwinek czerwonych (ang.
mean corpuscular volume, MCV) u 6 chorych występowała niedokrwistość normocytarna, a u 1 niedokrwistość makrocytarna. W badaniu elektroforetycznym białek surowicy
u 8/9 pacjentów stwierdziliśmy poliklonalną hypergammaglobulinemię. Splenomegalię, obecność RF, zapalenie tarczycy
typu Hashimoto z podwyższonym mianem przeciwciał przeciwtarczycowych, zespół Sjögrena i twardzinę stwierdziliśmy
odpowiednio u 7, 3 (pacjenci nr 5, 6, 8), 2 (pacjenci nr 5, 6),
1 (pacjent nr 11) i 1 (pacjent nr 10) na 11 chorych z T-LGL.
U jednego chorego (pacjent nr 5) zdiagnozowano chłoniaka
sytemu MALT kilka lat przed wystąpieniem objawów T-LGL.
U pacjenta nr 12 z LGLs w badaniach występowała neutropenia, leukocytoza z limfocytozą, małopłytkowość, prawidłowy poziom HGB i krwinek czerwonych, hipogammaglobulinemia oraz splenomegalia bez współistniejących chorób
autoimmunologicznych. Wyłącznie u tego pacjenta występowała okresowa limfadenopatia, która najprawdopodobniej
towarzyszyła przewlekłym i nawracającym infekcjom.
Badania morfologii krwi obwodowej i szpiku
We krwi obwodowej pacjentów dominowały duże, ziarniste
limfocyty T z niskim stosunkiem jądrowo-cytoplazmatycznym. Cytoplazma komórek była obfita z obecnymi mniej
lub bardziej licznymi ziarnistościami (ryc. 1). Pacjent nr 9
posiadał nieliczne i drobne ziarnistości cytoplazmatyczne,
widoczne w pojedynczych komórkach pod immersją obiektywu mikroskopu (powiększenie 1000x). U wszystkich chorych jądra komórkowe, owalne lub okrągłe, położone były
ekscentrycznie, zaś chromatyna skondensowana. Wśród 11
zbadanych pacjentów z rozpoznaniem T-LGL, u 9 wykonano
trepanobiopsję BM (tab. III). U 1 z 9 badanych (pacjent nr 9)
pacjentów wykazaliśmy wyłącznie zajęcie BM z obecnością
pojedynczych limfocytów w ławicach wewnątrz zatok szpiku,
u 6 obserwowano dyskretne zajęcie wewnątrz zatok oraz
Rycina 2
Analiza cytometryczna komórek nowotworowych T-LGL i prawidłowych limfocytów T i B we krwi obwodowej. A)
Obraz FSS/SSC (wielkość/ziarnistość) – widoczna jest jedna populacja komórek limfoidalnych stanowiąca 74% jądrzastych elementów morfotycznych krwi obwodowej, B) CD45 vs. CD14, kk. Neo. z ekspresją CD45 o charakterze
„bright”, C) CD4 vs. CD8, kk. Neo. są CD8+, kk T są CD4+ i CD8+ o niższej ekspresji (R2,R3), D) CD7 vs. CD2, kk. Neo.
są CD7-/CD2+, kk T są CD7+/CD2+ (R4), E) CD7 vs. CD43, kk. Neo. są CD7+/-/CD43+ o niższej ekspresji, niż prawidłowe
limfocyty T (R5), F) CD7 vs. CD3, kk. Neo. są CD3+/CD7+, kk T mają wyższą ekspresję CD7+/CD3+ (R6), G) CD5 vs.
CD25, kk. Neo. są CD5+/CD25-, kk T są CD5+/CD25+ (R7), H) CD5 vs. CD19, kk. Neo. są CD5-/CD19-, kk. T są CD5+/
CD19- (R8), I) CD5 vs. CD16, kk. Neo. są CD5+/CD16+/-, kk. T. są CD5+/CD16+ (R10), kk NK są CD16+/CD5- (R9), J) CD5
vs. CD56, kk. Neo. są CD5-/CD56+, kk T są CD5+/CD56- (R11), K) CD11c vs. CD57, kk. Neo. są CD11c+/CD57+/-, kk T i
B są CD57-/CD11c- (R12), L) CD2 vs. CD57, kk. Neo. są CD2+/CD57-, kk T są CD2+/CD57+ (R15).
130
K. Błachnio i inni
śródmiąższowe nacieki a u 2 pozostałych (pacjenci nr 1011) stwierdzono wyłącznie nacieki śródmiąższowe T-LGL.
Komórkowość BM ocenialiśmy na zwiększoną w 6/9, na
zmniejszoną w 1 i na prawidłową w 2 pozostałych przypadkach T-LGL. U wszystkich badanych pacjentów proces dojrzewania granulocytów w BM był zahamowany przy jednoczesnym wzroście liczby młodych postaci (tzw. przesunięcie
dojrzewania w lewo, ←) i przy współistniejącej neutropenii
w PB. Jednocześnie stwierdziliśmy spadek stosunku liczby komórek szeregu mieloidalnego do liczby komórek szeregu czerwonokrwnikowego u 2 chorych, u 7 stosunek był
w granicach normy, a w 1 przypadku wzrosła odsetkowo linia
mieloidalna. U 3 chorych obserwowaliśmy także spadek liczby erytroblastów, zahamowanie ich dojrzewania, hipoplazję
oraz zmiany megaloidalne, które towarzyszyły niedokrwistości, a u pozostałych 7 chorych stwierdziliśmy prawidłową
ilość prekursorów linii czerwonokrwinkowej. Liczba i morfologia megakariocytów nie wykazywała odchyleń od normy.
U 4/9 chorych stwierdziliśmy odczynowe grudki chłonne usytuowane śródmiąższowo.
Badania immunohistochemiczne
Wykonane odczyny dostarczyły informacji o stopniu zajęcia
BM przez T-LGL oraz pozwoliły ocenić formę nacieku. Badania IH wykazały, że komórki T-LGL są zazwyczaj CD3+/
CD4-/ CD8+/granzym B+ oraz wykazują zmienny odczyn na
CD57. U chorych nr 10 i 11 dysponowaliśmy jedynie opisami badań HP/IH, które zostały ocenione w innym ośrodku
diagnostycznym z oceną IH obejmującą tylko odczyny CD3
i CD20 (tab. III).
Badania cytometryczne
W większości (9/11) badanych przypadków T-LGL obecna
była monoklonalna populacja limfocytów o fenotypie: CD3+/
CD4-/CD8+/TCRαβ+. U pacjenta nr 9 stwierdzono populację
monoklonalną: CD3+/CD4-/CD8-/TCRγδ+. U chorego nr 6
wykazaliśmy obecność dwóch różnych populacji komórek
nowotworowych: pierwsza: CD3+/CD4-/CD8+dim/ TCRγδ+
i druga: CD3+/CD4-/CD8-/TCRγδ+, co odpowiadało biklonalnej T-LGL (tab. II). Limfocyty pacjenta nr 12 były CD3+/
CD4-/CD8+/TCRαβ+. U 10/11 badanych chorych obserwowaliśmy dodatnią ekspresję CD8+ i brak ekspresji CD4(ryc. 2C), a u pacjenta nr 9, z biklonalnym fenotypem, jedna
populacja komórek była (CD8+dim) o obniżonej ekspresji,
a druga populacja komórek była (CD8-) [18]. We wszystkich
badanych przypadkach T-LGL wykazaliśmy nieprawidłową ekspresję lub utratę co najmniej 1 antygenu pan-T, zaś
u 10/11 chorych 2 lub większej ilości antygenów. W większości badanych przypadków T-LGL komórki nowotworowe
miały niższą ekspresję CD7, CD5 i CD43 niż prawidłowe limfocyty T (ryc. 2E-2G, 2I). W przypadku antygenu CD7, u 2/11
pacjentów zaobserwowaliśmy utratę jego ekspresji (CD7-)
(ryc. 2D), a w 6/11 przypadkach stwierdziliśmy ekspresję
dim na wszystkich komórkach T-LGL (CD7+↓)(ryc. 2F) lub na
zmiennej subpopulacji komórek T-LGL (CD7+/-↓) (ryc. 2E).
W 3 przypadkach ekspresja CD7 na komórkach prawidłowych i białaczkowych była porównywalna (CD7+). Ekspresja
CD5 w analizowanych przypadkach T-LGL była heterogenna.
W 2/11 przypadków doszło do utraty tego antygenu (CD5-)
(ryc. 2H, 2J), w 5/11 przypadkach stwierdziliśmy ekspresję
dim na wszystkich komórkach T-LGL (CD5+↓) (ryc. 2G, 2I),
lub na zmiennej subpopulacji komórek T-LGL (CD5+/-↓).
W 2 przypadkach ekspresja CD5 była porównywalna z ekspresją na prawidłowych limfocytach T. W przypadku biklonalnej T-LGL jedna subpopulacja komórek była (CD5-), a druga
(CD5+/-↓) [18]. Wśród antygenów o zmienionej ekspresji,
które zawsze występowały na T-LGL było CD43, CD2 i CD3.
Ich ekspresja była niższa niż na prawidłowych limfocytach T
odpowiednio w 6/10 (CD43+↓), 4/11 (CD2+↓) (ryc. 2E) i 4/11
(CD3+↓) przypadkach. U 2 pacjentów zaobserwowaliśmy
wyższą ekspresję (CD43+↑), zaś ekspresja była taka sama,
jak na współistniejących prawidłowych limfocytach T odpowiednio w 2/10 (CD43+), 7/11 (CD2+) i 7/11 (CD3+) przypadkach. W 1/11 przypadków stwierdziliśmy ekspresję CD3
tylko na subpopulacji komórek (CD3+/-↓). Ponadto, ekspresję CD11c na różnym odsetku komórek T-LGL stwierdziliśmy
u wszystkich chorych (ryc. 2K). We wszystkich przypadkach
T-LGL, komórki posiadały ekspresję CD45 typu bright, miały wyłącznie ekspresję izoformy CD45RA, a brak ekspresji
CD45RO. Ekspresję CD16, CD56 i CD57 stwierdziliśmy
na wszystkich komórkach T-LGL odpowiednio w 2/10, 0/11
i 1/11, a na subpopulacji komórek w 8/10 2/10 i 4/11 przypadkach (ryc. 2I-2K). Brak ekspresji ww. antygenów stwierdziliśmy w 0/10, 7/10 i 6/11 przypadków. W przypadkach braku
ekspresji CD57 na komórkach nowotworowych, prawidłowe
limfocyty T często ją miały (ryc. 2L). W przypadku biklonalnej
T-LGL jedna subpopulacja komórek była (CD57+), a druga
(CD57-) [18].
Komórki T-LGL miały zmienną ekspresję antygenów CD95,
CD62L, a ponadto były CD44+ i CD52+ we wszystkich przypadkach. Ekspresja CD52 i CD44 na komórkach T-LGL była
zawsze niższa (CD52+↓) (CD44+↓), niż na współistniejących, nielicznych prawidłowych limfocytach T. Ekspresja
antygenu HLADR była w 9/11 przypadków dodatnia, aczkolwiek występowała na zmiennej subpopulacji komórek. Nie
stwierdziliśmy obecności antygenów CD25, CD27 czy CD71
w komórkach T-LGL badanych pacjentów (ryc. 2G).
U pacjenta nr 12 z odczynową limfocytozą nie obserwowaliśmy zmian immunofenotypu komórek, w tym utraty ekspresji
antygenów pan-T a komórki nie miały: CD11c, CD16, CD56,
CD57 i CD16&CD56. Ponadto, komórki posiadały równocześnie obie izoformy cząsteczki CD45 i częściowo ekspresję CD27+/- na subpopulacji limfocytów T. Ekspresja CD52
i CD44 na limfocytach ziarnistych była taka sama, jak na pozostałych limfocytach T.
Badanie molekularne
Za pomocą metody multipleks PCR z wykorzystaniem
starterów specyficznych dla locus TCRG i analizy heterodupleksów ocenialiśmy klonalność w badanych próbkach
Obecność monoklonalnego lub biklonalnego/biallelicznego
produktu rearanżacji w locus TCRG stwierdziliśmy w 10 badanych przypadkach. Rearanżacji w locus TCRG najczęściej
131
Znaczenie cytometrii przepływowej w diagnostyce białaczki z dużych ziarnistych limfocytów T
Rycina 3
Przykładowy wynik oceny klonalności z wykorzystaniem
zestawu starterów specyficznych dla locus TCRG.
M – wzorzec wielkości – GeneRuler 50bp, Fermentas;
HD – heterodupleksy, MP – prążki wskazujące na obecność populacji monoklonalnej, kolumna 1,2 – kontrole pozytywne – monoklonalne, kolumny 3-9 – pacjenci
z T-LGL, kolumny 3, 4, 5, 6 i 9 odpowiednio pacjenci nr 2,
3, 7, 9 i 10 (produkt monoklonalny), kolumny 7 i 8 odpowiednio pacjenci 6 i 8 (produkt biklonalny/bialleliczny),
kolumna 10 – kontrola negatywna – poliklonalna, kolumna 11 – pacjent nr 12.
podlegały segmenty VγIf,Vγ10-Jγ, jedynie w dwóch przypadkach stwierdziliśmy rearanżację segmentów Vγ9,Vγ11Jγ (pacjenci nr 1, 10). W przypadku pacjentki nr 5 dysponowaliśmy jedynie materiałem BM zabezpieczonym w bloczku
parafinowym. Wyizolowane z tego materiału DNA było zbyt
słabej jakości, aby uzyskać informacyjny wynik w analizie
molekularnej. Wzór prążków charakterystyczny dla populacji poliklonalnej zaobserwowaliśmy u pacjenta z odczynową
limfocytozą (pacjent nr 12) (tab. II, ryc. 3).
Dyskusja
Spektrum proliferacji dużych ziarnistych limfocytów (ang.
large granular lymphocytosis, LGLs) obejmuje 4 jednostki nozologiczne: i) reaktywną (przemijającą <6 miesięcy)
ekspansję LGL, najczęściej na podłożu infekcji wirusowej,
ale również w chorobach autoimmunologicznych i innych
nowotworach) ii) przewlekłą limfocytozę LGL (>6 miesięcy),
najczęściej na podłożu chorób autoimmunologicznych i niedoborów immunologicznych iii) klasyczną, przewlekłą białaczkę LGL (T-LGL) i iv) rzadką agresywną białaczkę LGL
występującą w Azji i Ameryce Południowej. Białaczki LGL są
klasyfikowane zgodnie z klasyfikacją WHO jako nowotwory
układu chłonnego. Wyróżnia się białaczkę CD3+/T-cell LGL
(85% przypadków) i CD3-/natural killer (NK)-cell LGL (15%
przypadków) [2, 7, 20, 23].
W tym opracowaniu przedstawiliśmy różnicowanie nienowotworowej przewlekłej limfocytozy LGLs z białaczką CD3+/TLGL, które charakteryzują się podobnymi cechami kliniczno-laboratoryjnymi, obecnością dużych, ziarnistych limfocytów
w rozmazach PB i współistnieją z podobnymi chorobami bez
wyraźnych różnic w badaniach hematologicznych.
Celem naszej pracy była możliwie jak najszersza charakterystyka kliniczno-patologiczno-laboratoryjna i analiza
skuteczności procedur diagnostycznych u pacjentów COI
z rozpoznaniem T-LGL z zastosowaniem metod rutynowych
132
(ocena morfologii komórek w rozmazach, IH na skrawkach
parafinowych trepanobioptatu, analizy biochemiczne) i nowych metod diagnostycznych (FCM i PCR), ze szczególnym uwzględnieniem wyników uzyskanych za pomocą FCM
w ustaleniu rozpoznania i diagnostyki różnicowej z procesami nienowotworowymi.
W naszych badaniach laboratoryjnych, podobnie jak w piśmiennictwie, stwierdziliśmy splenomegalię i niedokrwistość
w 64%, RZS w 36%, podwyższoną limfocytozę w 100%
z prawidłową lub podwyższona leukocytozą odpowiednio
w 45 i 36%, neutropenię w 100% i hypergammaglobulinemię poliklonalną [8, 10, 11, 19, 20]. W badaniu elektroforetycznym surowicy u 89% zbadanych chorych wykazaliśmy
hipergammaglobulinemię, mimo że zdarzają się przypadki
T-LGL z hipogammaglobulinemią lub gammapatią monoklonalną [8, 11, 20]. Obecność podwyższonej frakcji gamma
globulin wskazuje na toczący się przewlekły proces zapalny
lub chorobę autoimmunologiczną współistniejącą z T-LGL.
Nadmierna reaktywność limfocytów B zależy od zaburzeń
ich funkcjonowania, wskutek wpływu patologicznego klonu
T-LGL. Przypuszcza się, że nieznany czynnik etiologiczny
(np. wirus), stymuluje klonalną proliferację LGLs i jednocześnie pobudza poliklonalną aktywność komórek B [7, 10, 16,
23, 26].
U pacjenta z odczynową ekspansją LGLs, w porównaniu do
chorych z T-LGL, w badaniach laboratoryjnych nie stwierdziliśmy niedokrwistości, a dodatkowo wykazaliśmy hipogammaglobulinemię, która jest składową CVID.
Prawidłowa liczba dużych, ziarnistych limfocytów T (LGLs)
mieści się w zakresie 0,2-0,4 ×109/l (tab. I). Według WHO
i obserwacji innych autorów wykrycie monoklonalnej populacji T-LGL w liczbie >2,0× 109/l jest ważnym kryterium diagnostycznym [1, 2, 23]. W naszych badaniach wzrost liczby
T-LGL > 2,0× 109/l (zakres 1,2-32,5×109/l, mediana 4,8×109/l,
tab. I) stwierdziliśmy u 9/11 (82%) chorych z T-LGL, co jest
zgodne z wynikami innych autorów [8, 9]. Z naszego punktu
widzenia, podobnie jak wg innych autorów, ocena morfologii
komórek ziarnistych w rozmazie wraz z nieprawidłową ekspresją antygenów pan-T są najbardziej specyficzne dla ustalenia rozpoznania T-LGL, niezależnie od liczby limfocytów
ziarnistych w PB [2, 20]. Należy jednak pamiętać, że zdarzają się T-LGL (pacjent nr 9) zbudowane z drobniejszych
komórek z ledwie widocznymi w mikroskopie ziarnistościami
cytoplazmatycznymi. Rozpoznanie w takich przypadkach,
poza immunofenotypem, należy ustalać w korelacji z danymi
kliniczno-laboratoryjnymi.
Białaczka T-LGL jest rzadko występującą, heterogenną chorobą, wywodzącą się z limfocytów CD45RA+/CD45RO-/
CD27-, w której w około 80% dochodzi do rozrostu klonalnego aktywowanych, cytotoksycznych i efektorowych limfocytów T: CD3+/CD4-/ CD8+/TCRαβ+. W naszej grupie 11
chorych z T-LGL, ten wariant rozpoznaliśmy u 9 (82%) chorych. Znane są rzadsze warianty białaczki T-LGL: i) CD3+/
CD4+/CD8-/TCRαβ+, ii) CD3+/CD4+/CD8+/TCRαβ+, iii)
CD3+/CD4-/CD8-/TCRγδ+, który rozpoznaliśmy u pacjen-
K. Błachnio i inni
ta nr 9 oraz pojedyncze przypadki iv) biklonalnych T-LGL,
który rozpoznaliśmy u pacjenta nr 6 i który został opisany
przez nas wcześniej [2, 18] (tab. II). U naszych chorych, jak
i w piśmiennictwie, ww. warianty immunofenotypowe T-LGL
nie różnią się między sobą przebiegiem klinicznym, morfologią i chorobami współistniejącymi.
Komórki T-LGL zawsze są CD3+, najczęściej CD8+ z częstym spadkiem lub utratą ekspresji antygenów pan - T: CD5,
CD7, CD43 oraz decydującą w rozpoznaniu ekspresją antygenów związanych z komórkami NK (ang. NK-associated
antigens): przeważnie CD57, rzadziej CD16, a w nielicznych
przypadkach CD56, co można ustalić za pomocą badania
FCM [3, 12, 14, 23]. Dodatnie są odczyny na granzym-B,
perforynę oraz TIA-1 (ang. cytotoxic granule-associated proteins) oceniane głównie w badaniach IH [4, 15, 17, 19].
Nieprawidłowości ekspresji antygenów pan-T nie są wyłącznie cechą T-LGL, ale są wspólną cechą różnych podtypów
chłoniaków z obwodowych i prekursorowych limfocytów
T/NK, w których dochodzi do utraty ww. antygenów [3, 7].
We wszystkich zbadanych przez nas przypadkach, podobnie
jak w innych badaniach dotyczących T-LGL [1, 12, 19, 20]
zaobserwowaliśmy zmiany w ekspresji powierzchniowych
antygenów charakterystycznych dla komórek T, dokładnie
omawianych przez nas w wynikach. W 91% przypadków
zmiany ekspresji dotyczyły 2 lub więcej antygenów. W 82%
i 73% przypadków T-LGL był wyraźny spadek lub utrata
ekspresji odpowiednio, CD5 i CD7 w porównaniu do współistniejących prawidłowych limfocytów T. Nasze obserwacje
są zgodne z wynikami uzyskanymi przez Lundell i wsp. [12]
i wskazują na charakterystyczne zmiany ekspresji CD7
i CD5 w T-LGL. Dodatkowo, stwierdziliśmy częste zmiany ekspresji CD43 w T-LGL, wcześniej nie publikowane.
Ponadto, stwierdziliśmy ekspresję CD11c i CD45RA we
wszystkich przypadkach T-LGL. W każdym opracowaniu
dotyczącym diagnostyki T-LGL autorzy podkreślają znaczenie oceny CD16, CD56 i CD57 [1-3, 6-12, 19, 20, 23-26].
Przykładowo wszystkie analizowane przypadki przez Lundell i wsp. [12] były CD57+, chociaż autorzy podkreślają, że
połowa przypadków miała ekspresję tego antygenu tylko na
subpopulacji komórek T-LGL. U badanych chorych nie wykazaliśmy ekspresji CD57 aż w 6/11 przypadków, natomiast
ekspresja CD57 występowała na prawidłowych limfocytach
T, utrudniając interpretację cytometryczną antygenów NK na
komórkach T-LGL (ryc. 2L). W tej sytuacji ocena odczynu
CD57 w badaniu IH wydaje się niewiarygodna, gdyż często
występuje tylko na subpopulacji odczynowych limfocytów T,
które towarzyszą komórkom T-LGL i nie można ich odróżnić
od komórek białaczkowych w badaniu HP/IH trepanobiopsji szpiku. W naszych przypadkach ekspresję CD16, CD56,
CD57 i CD16&CD56 stwierdziliśmy odpowiednio w 10/10,
3/10, 5/11 i 5/11 badanych chorych. Naszym zdaniem jej
znaczenie jest przeceniane w diagnostyce T-LGL, tym bardziej, że około 1/3 przypadków z podwyższonym odsetkiem
poliklonalnych limfocytów T γδ w przebiegu chorób zapalnych, autoimmunologicznych oraz infekcji wirusowych po-
siada ekspresję CD16 i CD57 na limfocytach T, które równocześnie tracą, lub mają obniżoną ekspresję CD5 w stosunku
do prawidłowych limfocytów T [21]. W takich przypadkach,
podejrzewanych o T-LGL, z ekspresją TCRγδ+, przy zmianach ekspresji dotyczących CD5 należy szczególnie ostrożnie formułować rozpoznanie T-LGL i konfrontować je łącznie
z danymi kliniczno-laboratoryjnymi. Na podstawie naszych
wyników przypuszczamy, że najbardziej użytecznym antygenem NK w diagnostyce T-LGL jest CD16. Według naszej
opinii, ocena ekspresji antygenów komórek NK nie ma większego znaczenia w diagnostyce różnicowej między T-LGL0
i LGLs a służy do wykluczenia innych białaczek CD8+/CD4z dojrzałych komórek T/NK. W diagnostyce różnicowej z białaczkami CD8+/CD4- z dojrzałych komórek T/NK, wykorzystaliśmy również charakterystyczną w naszych badaniach
ekspresję CD11c i CD43 i brak ekspresji antygenów CD25,
CD27 czy CD71 na komórkach T-LGL. Z uwagi na doniesienia o próbach stosowania w terapii T-LGL Alemtuzumabu
(przeciwciało anty-CD52) potwierdziliśmy ekspresję tego antygenu na komórkach wszystkich 10 zbadanych przypadków
T-LGL, która podobnie jak ekspresja CD44, była niższa niż
na prawidłowych limfocytach T [1, 20]. Na komórkach T-LGL
opisywano wysoką ekspresję CD95, CD62L i HLADR, której
w naszych przypadkach nie potwierdziliśmy, a stwierdziliśmy
odpowiednio w 2/9, 3/8 i 9/11 przypadkach. Ten typ ekspresji ww. antygenów w naszych przypadkach nie różnicował
T-LGL od LGLs [8, 24].
Do badania włączyliśmy także pacjenta z objawami klinicznymi charakterystycznymi dla T-LGL z obecnością we PB
dużych, ziarnistych limfocytów T, u którego rozpoznaliśmy
CVID. W badaniu FCM u tego pacjenta nie stwierdziliśmy
nieprawidłowości ekspresji antygenów charakterystycznych
dla limfocytów T lub komórek NK oraz CD11c. Ponadto, ekspresja antygenów powierzchniowych CD44 i CD52 była taka
sama, jak na prawidłowych limfocytach T z ekspresją obu
izoform cząsteczki CD45.
Zmiany ekspresji analizowanych przez nas antygenów
w diagnostyce LGLs wskazują na największą użyteczność
FCM do prawidłowego rozpoznania T-LGL. Sama analiza
cytologiczna preparatów PB i BM barwionych metodą MGG
jest niewystarczająca do ustalenia rozpoznania, choć stanowi pierwszy element w algorytmie diagnostycznym. Utrata
antygenów pan-T na LGLs różnicuje w sposób najprostszy
T-LGL od procesów nienowotworowych, ale zdarzają się
choroby autoimmunologiczne, zapalenia czy infekcje wirusowe, w których obserwuje się wzrost populacji limfocytów T
γδ z utratą lub obniżoną ekspresją CD5 [21].
Innym z badań, które pozwalają na różnicowanie pomiędzy
białaczką T-LGL a LGLs jest ocena klonalności genów TCR
przeprowadzana z wykorzystaniem łańcuchowej reakcji polimerazy i analizy heterodupleksów. Szacuje się, że metoda
jest w stanie wykryć około 70-80% rearanżacji w obrębie genów TCR z wykorzystaniem zestawów starterów specyficznych dla loci TCRG, TCRB i TCRD. W naszych badaniach
wykorzystywaliśmy jedynie zestaw starterów specyficzny dla
133
Znaczenie cytometrii przepływowej w diagnostyce białaczki z dużych ziarnistych limfocytów T
locus TCRG, co pozwoliło jednak na potwierdzenie rozpoznania białaczki T-LGL u 11 pacjentów i braku klonalnej rearanżacji loci TCRG u chorego nr 12 (tab. II, ryc. 3). Zdarzają
się także przypadki T-LGL, w których produkt klonalny wykrywany jest jedynie z pomocą starterów specyficznych dla
locus TCRB [19]. W związku z tym, wydaje się uzasadnione
stosowanie wszystkich dostępnych zestawów starterów specyficznych dla genów TCR.
Ocena klonalności nie zawsze jednak pozwala na ostateczne
potwierdzenie rozpoznania białaczki T-LGL, choć w naszych
przypadkach stwierdziliśmy 100% zgodność badań FCM
i PCR. Podobny wynik oceny klonalności mogą dawać oligoklonalne/monoklonalne rozrosty komórek T, występujące
w trakcie odpowiedzi immunologicznej na silne antygeny
(np. infekcja HIV czy EBV) lub w przebiegu chorób autoimmunologicznych [26].
Metody molekularne (PCR i ewentualnie Southern blot) nie
pozwalają także na ocenę klonalności w wybranych populacjach komórek T bez uprzedniego sortowania lub wzbogacania populacji komórek. Problem ten rozwiązano, między
innymi w diagnostyce T-LGL, stosując do oceny klonalności techniki FCM z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych, licznych specyficznych przeciwciał względem części
zmiennej białek z rodziny TCRβ (TCR-Vβ) [1, 12]. Badania
porównujące czułość obu tych metod wykazały, że mimo
swoich zalet (szybkość oznaczenia, oznaczenie ilościowe
i jakościowe) FCM nie jest aż tak czuła jak metody molekularne, głównie ze względu na brak przeciwciał specyficznych
dla wszystkich TCR-Vβ. Autorzy tych badań zaproponowali
następujący schemat postępowania: próbki, które w wyniku analizy TCR-Vβ z wykorzystaniem FCM, dały niejednoznaczny wynik lub nie wykazano w nich rozrostu klonalnego
powinny zostać przesłane do dalszych analiz molekularnych
[12, 14].
Rutynowe badanie HP/IH trepanobioptatu BM u 4 naszych
pacjentów, diagnozowanych początkowo w innych ośrodkach hematologicznych, okazało się niewystarczające do
ustalenia podejrzenia lub rozpoznania T-LGL. Wynikało to,
między innymi z wykorzystania tylko odczynu CD3 i CD20 do
oszacowania komórek limfoidalnych i współistnienia innych,
licznych zmian jakościowych i ilościowych w populacjach
komórek szpiku. W przypadkach podejrzenia T-LGL diagnostykę IH poszerzamy, podobnie jak w innych ośrodkach,
o ocenę odczynu IH: CD4, CD8, granzym B oraz CD57,
mimo iż ocena odczynu CD57 może być niewiarygodna
i występować wyłącznie na nienowotworowych limfocytach
T [1, 19]. Stosowanie innych odczynów IH: CD2, CD5, CD7,
CD43 i ich interpretacja jest utrudniona w BM z powodu
obecności dodatnich na te odczyny nielimfoidalnych populacji komórkowych. Należy podkreślić nieporównywalnie niską
wartość badań IH (materiał utrwalony) w ocenie utraty antygenów pan-T w stosunku do badań FCM (materiał nieutrwalony, znakowanie żywych komórek). W naszych badaniach,
w pobranym BM od chorych z białaczką T-LGL, najczęściej
obserwowaliśmy zwiększoną komórkowość, opisywaną
134
w ponad 50% przypadków oraz zahamowanie dojrzewania
granulocytów ze wzrostem odsetka młodszych postaci [2, 8,
11, 19]. Ocena IH wykazała obecność dyskretnych, wewnątrz
zatok lub rzadziej śródmiąższowych nacieków limfocytów T:
CD3+/CD8+/CD57+/granzym B+, opisywanych wcześniej
przez Evansa i Osuji [4, 17] i szeroko omówionych przez
Prochorec i wsp. [19]. Zgodnie z piśmiennictwem, jak i wg
naszych obserwacji sama ocena HP/IH jest niewystarczająca dla rozróżnienia różnych form rozrostów LGLs z T-LGL.
Ponadto, według naszej opinii i wcześniejszych opracowań,
nowoczesna diagnostyka FCM T-LGL jest wysoce czuła
i specyficzna i nie wymaga potwierdzenia rozpoznania badaniem HP/IH trepanobioptatu szpiku [11].
Nowoczesna diagnostyka nowotworów układu chłonnego,
w tym T-LGL, wymaga współdziałania wielu specjalistów,
w tym: hematopatologów, cytometrystów, analityków medycznych i lekarzy klinicystów. W ciągu ostatnich lat obserwuje się znaczący wzrost ilości laboratoriów cytometrycznych
w rękach diagnostów laboratoryjnych, przy braku wprowadzania standardów oceny immunofenotypu i jego interpretacji w większości z nich oraz braku prawidłowego współdziałania ww. specjalistów. Naszym celem było przedstawienie
znaczenia diagnostycznego cytometrii przepływowej w rzadkiej postaci białaczki T-LGL i przedstawienie standardu interpretacji ekspresji poszczególnych antygenów w diagnostyce
cytometrycznej chłoniaków w naszym laboratorium.
Wnioski
1. Na podstawie przeprowadzonych badań wnioskujemy, że
w przypadkach z klasycznymi objawami kliniczno-laboratoryjnymi, nieprawidłowa ekspresja antygenów pan-T,
szczególnie CD7, CD5 i CD43, obecność jednej izoformy
cząsteczki CD45 - CD45RA, ekspresja CD11c i CD16, obniżenie ekspresji CD44 i CD52 oraz brak ekspresji CD25,
CD27 i CD71 w badaniach FCM wraz z oceną morfologiczną komórek limfoidalnych BM i PB są konieczne do
ustalenia rozpoznania T-LGL.
2. Samodzielne badanie HP/IH trepanobiopsji okazuje się
często niewystarczające do ustalenia prawidłowego rozpoznania. W przypadku braku dostępności badań FCM,
badania HP/IH powinny być uzupełnione oceną klonalności metodami molekularnymi.
Piśmiennictwo
1. Aribi A, Huh Y, Keating M i wsp. T-cell large granular lymphocytic (T-LGL) leukemia; Experience in a single institution over 8
years. Leuk Res 2007; 7: 939-945.
2. Chan WC, Foucar K, Morice WG i wsp. T-cell large granular
lymphocyte leukemia. W: Swerdlow SH, Campo E, Harris NL
i wsp. World Health Organization classification of tumors. Pathology and genetics of tumours of hematopoietic and lymphoid
tissues. Lyon: IARC Press; 2008: 272-273.
3. Craig FE, Foon KA. Flow cytonetric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood 2008; 111: 3941-3967.
4. Evans HL, Burks E, Viswanatha D i wsp. Utility of immunohistochemistry in bone marrow evaluation of T-lineage large granular lymphocyte leukemia. Hum Pathol 2000; 31: 1266-1273.
5. Holm AM, Tjønnfjord G, Yndestad A i wsp. Polyclonal expan-
K. Błachnio i inni
sion of large granular lymphocytes in common variable immunodeficiency-association with neutropenia. Clin Exp Immunol
2006; 144: 418-424.
6. Jennings D, Foon KA. Recent advances in flow cytometry: Application to the diagnosis of hematologic malignancy. Blood
1997; 90: 2863-2892.
7. Lamy T, Loughran TP Jr. Large granular lymphocyte leukemia.
Cancer Control 1998; 5: 25-33.
8. Lamy T, Loughran TP Jr. Clinical features of large granular lymphocyte leukemia. Semin Hematol 2003; 40: 185-195.
9. Langerak AW, Sandberg Y, van Dongen JJ. Spectrum of T-large
granular lymphocyte lymphoproliferation: ranging from expanded activated effector T cells to T-cell leukaemia. Br J Haematol
2003; 123: 561-562.
10. Loughran TP Jr, Starkebaum G, Kidd P i wsp. Clonal proliferation of large granular lymphocytes in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988; 31: 31-36.
11. Loughran TP Jr. Clonal diseases of large granular lymphocytes.
Blood 1993; 82: 1-14.
12. Lundell R, Hartung L, Hill S i wsp. T-cell large granular lymphocyte leukemias have mulitple phenotypic abnormalities involving
pan-T-cell antigens and receptors for MHC molecules. Am J Clin
Pathol 2005; 124: 937- 946.
13. Meleshko AN, Lipay NV, Stasevich IV i wsp. Rearrangements of
IGH, TCRD and TCRG genes as clonality marker of childhood
acute lymphoblastic leukemia. Exp Oncol 2005; 27: 319-324.
14. Morice WG, Kimlinger T, Katzmann JA i wsp. Flow cytometric
assessment of TCR-Vbeta expression in the evaluation of peripheral blood involvement by T-cell lymphoproliferative disorders: a comparison with conventional T-cell immunophenotyping and molecular genetic techniques. Am J Clin Pathol 2004;
121: 373-383.
15. Morice WG, Kurtin PJ, Tefferi A i wsp. Distinct bone marrow findings in T-cell granular lymphocytic leukemia revealed by paraffin
section immunoperoxidase stains for CD8, TIA-1, and granzyme
B. Blood 2002; 99: 268-274.
16. O’Keefe CL, Plasilova M, Wlodarski M i wsp. Molecular analysis of TCR clonotypes in LGL: a clonal model for polyclonal responses. J Immunol 2004; 172: 1960-1969.
17. Osiuj N, Beiske K, Randen U i wsp. Characteristic appearances
of the bone marrow in T-cell large granular lymphocyte leukaemia. Histopathology 2007; 50: 547-554.
18. Prochorec-Sobieszek M, Chełstowska M, Rymkiewicz G i wsp.
Biclonal T-cell receptor γδ+ large granular lymphocyte leukemia
associated with rheumatoid arthritis. Leukemia&Lymphoma
2008; 49: 828-831.
19. Prochorec-Sobieszek M, Rymkiewicz G, Makuch-Lasica H i
wsp. Characteristics of T-cell large granular lymphocyte proliferations associated with neutropenia and inflammatory arthropathy. Arthritis Res Ther 2008; 10: R55.
20. Rose MG, Berliner N. T-cell large granular lymphocyte leukemia
and related disorders. Oncologist 2004; 9: 247-258.
21. Roden AC, Morice WG, Hanson CA. Immunophenotypic attributes of benign peripheral blood gammadelta T cells and conditions associated with their increase. Arch Pathol Lab Med 2008;
132: 1774-1780.
22. Siwicki JK, Rymkiewicz G, Błachnio K i wsp. Spontaneously immortalized T lymphocytes from Nijmegen Breakage Syndrome
patients display phenotypes typical for lymphoma cells. Leuk
Res 2008; 32: 569-577.
23. Sokoł L, Loughran TPJr. Large granular lymphocyte leukemia.
Oncologist 2006; 11: 263-273.
24. Sun T. Chronic T-Large Granular Lymphocytic Leukemia. Flow
cytometric analysis of hematologic neoplasms. A color atlas and
text. Second edition. Lippincott Williams & Wilkins A Woltters
Kluvver Company 2002: 160-164.
25. van Dongen JJ, Langerak A.W., Brüggemann M i wsp. Design
and standardization of PCR primers and protocols for detection
of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2
Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia 2003; 12: 22572317.
26. Włodarski MW, Schade AE, Maciejewski JP. T-large granular
lymphocyte leukemia: current molecular concepts. Review. Hematology 2006; 11: 245-256.
Adres Autorów:
Pracownia Cytometrii Przepływowej Zakładu Patologii
Centrum Onkologii – Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie
ul. Roentgena 5
02-781 Warszawa
e-mail: [email protected]
(Praca wpłynęła do Redakcji: 2009-02-12)
(Praca przekazana do opublikowania: 2009-07-03)
135