Endonukleazy restrykcyjne I klasy

Endonukleazy restrykcyjne
– molekularne nożyczki
Inżynieria genetyczna – nauka o technikach
badawczych pozwalających na świadomą i zamierzoną
ingerencję w materiał genetyczny organizmów w celu
wyizolowania i charakterystyki określonych genów oraz
zmiany ich właściwości dziedzicznych
Dzięki technikom inżynierii genetycznej możemy :
•izolować z komórki fragmenty materiału genetycznego (geny)
•powielać geny (klonowanie molekularne) i całe organizmy
•wprowadzać zmiany do informacji genetycznej
•przenosić fragmenty DNA (geny) do komórek innego organizmu
Nie należy utożsamiać inżynierii genetycznej z biotechnologią
Biotechnologia to pojęcie szersze, obejmujące wszelkie manipulacje żywymi
organizmami (zwłaszcza mikroorganizmami) w celu osiągnięcia określonych
korzyści.
Inżynieria genetyczna istnieje od ok. 40 lat, biotechnologia od niepamiętnych
czasów
Współczesna biotechnologia opiera się w dużej mierze na
technikach inżynierii genetycznej. Dzięki nim możliwa jest:
•heterologiczna ekspresja genów kodujących określone białka
•zmiana (optymalizowanie) poziomu ekspresji konkretnego genu
•wprowadzanie celowych zmian sekwencji nukleotydowych powodujących
zmiany aminokwasów a co za tym idzie modyfikacje właściwości białka,
często ulepszenie funkcjonowania
• transgeneza bakterii, roślin i zwierząt – organizmy genetycznie
zmodyfikowane (GMO)
•terapia genowej
Klonowanie genu ludzkiej insuliny i produkcja
zrekombinowanej insuliny w bakteriach
Transformation
Aby manipulować genami niezbędne są odpowiednie
narzędzia molekularne, które pozwalają uzyskać tzw.
zrekombinowane DNA (umożliwiają rekombinację
materiału genetycznego in vitro czyli w próbówce).
Najważniejsze z nich to:
• enzymy restrykcyjne,
•ligazy,
•wektory
Klonowanie genu
ludzkiej insuliny i
produkcja
zrekombinowanej
insuliny w bakteriach
1. Wszelkie zabiegi na
materiale genetycznym
muszą rozpocząć się od
jego wyizolowania z
komórki.
2. Cząsteczki DNA są
następnie dzielone na
mniejsze fragmenty za
pomocą enzymów
restrykcyjnych
Enzymy restrykcyjne jako narzędzie w
inżynierii genetycznej i biologii molekularnej
Enzymy restrykcyjne (ER)
•pod względem biochemicznym to endonukleazy – „przecinają” szkielet
cukier-fosforan w DNA
•ER działają na określone sekwencje w DNA (miejsce rozpoznania): żeby
strawić DNA enzym restrykcyjny musi „zobaczyć” określony ciąg liter
Nazewnictwo (Smith i
Nathans)
Nazewnictwo enzymów
restrykcyjnych opiera się na
literowych skrótach, w
których pierwsza litera
pochodzi od rodzaju bakterii,
a druga i trzecia od gatunku.
Następna litera oznacza
szczep lub typ, a kolejne
enzymy z danego typu lub
szczepu otrzymują liczby
rzymskie.
Enzym
Pochodzenie
Miejsce trawienia
5' -->3'
Ava I
Bam HI
Bgl II
Eco RI
Eco RII
Hae III
Hha I
Hind III
Hpa I
Kpn I
Mbo I
Mbo I
Pst I
Sma I
SstI
Sal I
Taq I
Xma I
Anabaena variabilis
Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus globigii
Escherichia coli RY 13
Escherichia coli R245
Haemophilus aegyptius
Haemophilus haemolyticus
Haemophilus inflenzae Rd
Haemophilus parainflenzae
Klebsiella pneumoniae
Moraxella bovis
Moraxella bovis
Providencia stuartii
Serratia marcescens
Streptomyces stanford
Streptomyces albus G
Thermophilus aquaticus
Xanthamonas malvacearum
C* C/T C G A/G G
G* G A T C C
A* G A T C T
G* A A T T C
* C C A/T G G
GG*CC
GCG*C
A* A G C T T
G T T *AA C
G G TAC * C
*G A T C
*G A T C
CTGCA*G
CCC*GGG
GAGCT* C
G*TC GAC
T*C GA
C*CCGGG
•Podział enzymów restrykcyjnych na klasy I, II i III
•Główne różnice pomiędzy klasami enzymów ER
dotyczą:
•wzajemnej lokalizacji systemu restrykcji i metylacji DNA
•W klasie I i III te dwie aktywności są w obrębie jednego kompleksu
enzymatycznego, złożonego z dwóch lub trzech heterologicznych
podjednostek, w II są rozdzielone
•lokalizacji miejsca trawienia względem miejsca rozpoznania DNA
•Enzymy poszczególnych klas różnią się także wymaganiami co do
kofaktorów
Endonukleazy restrykcyjne I klasy
•Aktywność metylacji i ATP-zależnej restrykcji są w tym samym białku
•Substratem jest dwuniciowy DNA (dsDNA) zawierający określoną
sekwencję – miejsce rozpoznania
Enzymy klasy I rozpoznają taką sekwencję
Przykłady enzymów I klasy:
CfrA1
GCANNNNNNNNGTGG
EcoAI
GAGNNNNNNNGTCA
EcoBI
TGANNNNNNNNTGCT
EcoKI
AACNNNNNNGTGC
Ogólnie:
3 nt/6-8 N/4-5 nt - sekwencja rozpoznawana jest asymetryczna
•przecinają obydwie nici w pewnej odległości (kilkadziesiąt-kilkaset pz) od
rozpoznanej sekwencji
Do swojej aktywności wymagają S-adenozylo-metioniny (SAM), Mg+2 i ATP.
Endonukleazy restrykcyjne III klasy
•Substratem jest dsDNA
•Aktywność metylacji i ATP-zależnej restrykcji są w tym samym białku
• Rozpoznają asymetryczne miejsca 5-7 nukleotydowe:
EcoP I
AGACC
EcoP 15I
CAGCAG
Hinf III
CGAAT
przecinają DNA w odległości 24-26 nt od miejsca rozpoznania
•Wymagają do działania jonów Mg+2 i ATP.
Endonukleazy restrykcyjne II klasy
•Posiadają rozdzieloną aktywność restryktazy i metylazy,
ich geny zwykle sąsiadują w genomie
•Enzymy typu II trawią obydwa pasma DNA w obrębie
miejsca rozpoznania - krótkiej sekwencji (4 -12
nukleotydów)
•Substratem jest dwuniciowe DNA - dsDNA (nieliczne
enzymy mogą przecinać określone sekwencje w
jednoniciowym ssDNA).
• Większość enzymów restrykcyjnych nie przecina zmetylowanego
DNA na jednym lub obu pasmach ich miejsca rozpoznania, choć
nieliczne wymagają metylacji
•do aktywności in vitro bezwzględnie wymagają jonów magenzu
Właściwości miejsca rozpoznania ER klasy II
•Większość miejsc rozpoznania jest ścisłym palindromem z symetrią
rotacyjną
•ma długość 4, 5, 6, 7, 8 nt
•Niekiedy palindrom może być przerwany przez serie 1-9 dowolnych nt
np. Sfi I GGCCNNNNNGGCC
Długość sekwencji rozpoznawanej warunkuje częstość trawienia DNA
np.: (zakładając że G+C = 50%)
enzymy z 8 nt sekwencją rozpoznania tną DNA co ok. 65 kpz (służą np. do
konstrukcji bibliotek genomowych)
z 6 nt sekwencją rozpoznania tną DNA co 4096 bp (46) (wygodne do izolowania
odcinków DNA obejmujących pojedyczne geny)
4 nt sekwencją rozpoznania trawioną DNA z częstością co 256 bp (44)
(tworzenie tzw. odcisków palca DNA – fingerpinting)
Enzymy rzadkotnące:
•Rozpoznają 7-8 nukleotydowe sekwencje np.:
SapI 5’- GCTCTTC -3’
Sgf1 5’- GCGATCGC -3’
•Enzymy, które rozpoznają sekwencje bogate w pary GC albo AT
SmaI rozpoznaje 5’ – CCCGGG -3’, trawi co 78 kb;
NotI rozpoznaje 5’ –GCGGCCGC – 3’ , trawi co 10 MB.
Niektóre enzymy pochodzące
z różnych bakterii rozpoznają
identyczne sekwencje, są to
tzw. izoschizomery i
mogą przecinać te sekwencje
w dokładnie taki sam sposób
Neoizoschizomery – enzymy rozpoznające taką samą sekwencję, ale
przecinające ją w inny sposób.
Przykłady:
SmaI
XmaI
5’…CCC▼GGG…3’
5’…C▼CCGGG…3’
Trawienie enzymami restrykcyjnymi tworzy wolne
końce DNA
Lepkie końce mogą być różnej długości (zwykle są 2 lub 4 nt, ale
mogą być także 1 lub 3 nt) i mogą mieć nadmierności typu 5’ lub 3’,
w zależności od użytego enzymu restrykcyjnego.
Mogą też tworzyć tępe końce
Większość enzymów trawi DNA generując końce z 5’- fosforanem lub
3’ –OH (wyjątek np. Nci I tworzy końce: 3’-fosforan i 5’-OH)
Jeśli lepkie końce są komplementarne, ligaza może je bardzo łatwo połączyć
niezależnie od pochodzenia DNA, tworząc formy rekombinacyjne
Możemy łączyć ze sobą również końce tępe ale jest to trochę trudniejsze
zrekombinowane DNA
Użycie ER in vitro
Czynniki wpływające na aktywność enzymów restrykcyjnych
Skład buforu:
•Enzymy mają różne preferencje jeśli chodzi o siłę jonową (stęż. soli) i kationy (Na lub K).
Zwykle pracują w pH 8.0. Bufory są zwykle dostarczane razem z enzymem przez
producenta. Źle dobrany bufor powoduje albo brak trawienia albo tzw. częściowe trawienie.
•można trawić równocześnie kilkoma enzymami dobierając pośrednie warunki reakcji
Bufor do przechowywania:
Tris-EDTA, EDTA jest inhibitorem działania enzymów restrykcyjnych, ale nie w stężeniach
poniżej 0,05 mM
Temperatura inkubacji;
Większość enzymów pracuje w 37 C. Enzymy izolowane z termofilnych bakterii tną DNA w
temp. 50 – 65 C, inne z bakterii psychrofilnych, ze względu na krótki okres półtrwania, w
temp. 25 C.
Jednostka aktywności
Ilość enzymu potrzebna to strawienia 1μg DNA faga  w 60 min, w odpowiedniej temp., w
objętości 50 μl
Na wydajność trawienia duży wpływ ma czystość DNA:
kontaminacje solami (np. z innych buforów – ważne przy wielokrotnych trawieniach),
inhibitory, nukleazy mogą powodować trawienie częściowe lub jego kompletny brak
DNA
Rodzaj użytego DNA
•Oligonukleotydy i produkty PCR
•Plazmidowe i fagowe DNA
•Genomowe DNA (w roztworze)
•Genomowe DNA w postaci bloczków agarozowych (więcej enzymu, dłuższa
inkubacja)
Aktywność gwiaździsta (star activity, relaxation of specificity)
Enzym w niestandardowych warunkach tnie DNA w miejscach innych niż
miejsce rozpoznania, np.
BamHI (GGATCC) może trawić sekwencje: NGATCC, GPuATCC, GGNTCC
Niestandardowe warunki to:
 zbyt długa inkubacja
 bardzo wysokie stęż. enzymu
wysokie pH lub niska siła jonowa,
 za wysokie stęż. glicerolu,
 obecność rozpuszczalników organicznych w reakcji (etanol, DMSO)
 zastąpienie jonów Mg innymi dwuwartościowymi kationami jak Mn lub Co
Zastosowanie enzymów restrykcyjnych
1. Izolacja wybranych fragmentów DNA (np. genów)
2. Rekombinowanie DNA in vitro i klonowanie
molekularne
3. Mapowanie fizyczne genomów
4. Diagnostyka (np. chorób) i identyfikacja (np.
ustalanie pokrewieństwa