(SDS-PAGE).

ĆWICZENIE 12
Elektroforeza poliakrylamidowa białek w warunkach denaturujących
(SDS-PAGE).
Materiały:
2 płytki szklane z „uszami”
2 płytki szklane z naklejonymi paskami
2 uszczelki sylikonowe
podstawka do wylewania żelu
aparat do elektroforezy
zasilacz prądu stałego
pipety automatyczne
naczynia do wybarwiania żeli
Rys.1. Szybka z „uszami”.
Rys.2. Szybka z naklejonymi paskami.
Odczynniki chemiczne:
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
•
Roztwór akrylamidów: 30%: 29% akrylamid , 1% N, N-metyleno-bisakrylamid
Woda 2x destylowana
Roztwór 10% SDS
Roztwór nadsiarczanu amonu (APS) 10%
Roztwór 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)
Roztwór 1 M Tris-HCl (pH 6.8)
TEMED - N, N, N’, N’- tetrametyloetylenodiamina
Barwnik denaturujący (5x stężony) (do nanoszenia próbek na żel):
Tris-HCl (pH 6.8)
EDTA (pH 8.0)
50 mM
5 mM
SDS
25%
sacharoza
50%
2-merkaptoetanol (βMe)
25%
błękit bromofenolowy
0.05%
ƒ
Bufor glicynowy do elektroforezy SDS-PAGE:
Tris-HCl (pH 8.3)
glicyna
SDS
ƒ
ƒ
•
ƒ
ƒ
25 mM
250 mM
0.1%
Roztwór F1 do barwienia srebrem:
50% aceton
50% TCA
37% HCHO
60 ml
1.5 ml
25 µl
Roztwór F2 do barwienia srebrem:
ddH2O
10% Na2S2O3
60 ml
200 µl
Roztwór F3 do barwienia srebrem:
ddH2O
20% AgNO3
37% HCHO
60 ml
0.8 ml
0.6 ml
Roztwór F4 do barwienia srebrem:
ddH2O
37% HCHO
10% Na2S2O3
Na2CO3
60 ml
25 µl
25 µl
1.2 g
Roztwór F5 do barwienia srebrem:
1% bezwodny kwas octowy
60 ml
INSTRUKCJA DO WYKONANIA ĆWICZENIA:
A. Przygotowanie żelu poliakrylamidowego.
1. Starannie umyć szyby detergentem, osuszyć czystym ręcznikiem papierowym i
przetrzeć wewnętrzne powierzchnie szyb etanolem.
2. Suchą silikonową uszczelkę umocować wokół szyby z naklejonymi paskami, tak, aby
nacięcia na uszczelce znalazły się po zewnętrznej stronie szyby (po stronie bez
naklejonych pasków). Nie dotykać wewnętrznych powierzchni szyb palcami!
3. Na szybę z paskami z założoną uszczelką nałożyć drugą szybkę z „uszami”, w taki
sposób, aby krawędzie jednej szyby nie wystawały poza pole drugiej szyby.
4. Złożone szybki umocować za pomocą spinaczy do podstawki do wylewania. (szybka z
„uszami” powinna znaleźć się po zewnętrznej stronie, do góry „uszami”).
5. Sporządzić roztwór żelu dolnego o odpowiednim stężeniu (według Tab.1).
6. Wymieszać ostrożnie wszystkie składniki i wlać mieszaninę pomiędzy płytki szklane
do takiej wysokości, żeby zostawić miejsce na około 1 cm żelu górnego i grzebień.
7. Na żel nawarstwić ostrożnie 1-2 mm wody. Pozostawić do polimeryzacji (20-30
minut)
UWAGA !
APS powoduje rozpoczęcie polimeryzacji, dlatego APS i TEMED dodaje się na samym końcu,
chwilę przed wlaniem roztworu żelu między szyby!!!
Składniki (na 15 ml)
Procentowość żelu
H2O
30 % akrylamidy
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)
10% SDS
10% APS
TEMED
6[%]
7.9 ml
3.0 ml
3.8 ml
150 µl
150 µl
12 µl
Objętość
8[%]
6.9 ml
4.0 ml
3.8 ml
150 µl
150 µl
9 µl
10 [%]
5.9 ml
5.0 ml
3.8 ml
150 µl
150 µl
6 µl
Tab. 1 Skład żelu dolnego.
Składniki na 4 ml
H2O
30 % akrylamidy
1.5 M Tris-HCl (pH 6.8)
10% SDS
10% APS
TEMED
Objętość
2.7 ml
0.67 ml
0.5 ml
40 µl
40 µl
4 µl
Tab. 2 Skład żelu górnego.
8. Przygotować żel górny zagęszczający według Tab.2.
9. Zlać wodę z nad żelu dolnego i osuszyć ręcznikiem papierowym.
10. Wlać roztwór żelu górnego między szyby i szybko włożyć grzebień. Grzebień
powinien być włożony symetrycznie, w taki sposób, aby miedzy zębami było ujście
dla powietrza wychodzącego spomiędzy szyb po wylaniu żelu. Uważać aby nie
powstały pęcherzyki powietrza. Zostawić żel do polimeryzacji.
Rys. 3. Prawidłowo umieszczony grzebień.
11. Po spolimeryzowaniu żelu górnego (około 15 min) wyjąć ostrożnie grzebień.
Następnie należy ściągnąć złożone płytki z żelem z podstawki, wyjąć uszczelkę
silikonową.
12. Szybki z żelem przymocować do aparatu (szybka z „uszami” musi być skierowana do
aparatu). Zalać żel buforem glicynowym (1 x stężonym). Napełnić buforem dolne i
górne naczynie elektrodowe (studzienki w żelu muszą być wypełnione buforem). Za
pomocą pipety automatycznej ostrożnie przepłukać studzienki buforem i usunąć
pęcherzyki powietrza z dolnej części płytki.
B. Przygotowanie i nanoszenie próbek. Rozdział elektroforetyczny.
1. Przygotować próbki do elektroforezy. W tym celu próbki należy zmieszać z
barwnikiem denaturującym w proporcji 1: 4, a następnie inkubować we wrzącej łaźni
wodnej przez 5 min. Przygotowane, gorące próbki należy nanieść do kolejnych
studzienek w żelu przy pomocy pipety automatycznej.
2. Przeprowadzić elektroforezę wstępną przy napięciu 60V. Po wniknięciu próbek w żel
zwiększyć napięcie do 120-150V i kontynuować rozdział dopóki barwnik nie znajdzie
się 0.5 cm od końca żelu.
3. Po skończonym rozdziale wyłączyć prąd, wylać bufor i wyjąć żel z aparatu. Następnie
ostrożnie oddzielić szyby, wyjąć żel i umieścić w pudełku do barwienia z
przygotowanym roztworem F1.
UWAGA !
Akrtylamidy są neurotoksyczne. Unikać kontaktu ze skórą i błonami śluzowymi.
C. Barwienie żelu. Metoda barwienia żeli poliakrylamidowych srebrem (Nesterenko i
wsp., 1994)
1. Żel poliakrylamidowy umieścić w roztworze F1 w plastikowych pojemniku i
delikatnie wytrząsać w temperaturze pokojowej przez 5 min.
2. Następnie trzykrotnie przepłukać żel wodą dejonizowaną (3x 5 s).
3. Po dokładnym odpłukaniu roztworu F1, żel pozostawić w ddH2O przez 5 min.
4. Następnie ponownie trzykrotnie przepłukiwać wodą (ddH2O).
5. Żel umiescić w 60 ml 50% roztworu acetonu na okres 5 min.
6. Nstępnie przenieść żel do roztworu F2 na okres 1 min.
7. Ponownie płukać żel wodą (ddH2O) (3x 5 s)
8. Utrwalać w roztworze F3 przez 8 min.
9. Roztwór F3 usunąć przez dwukrotne płukanie wodą
10. W celu wywołania żel umieścić w 60 ml roztworu F4 na 10-20 sekund.
11. Reakcję zahamować poprzez dodanie 60 ml 1% roztworu lodowatego kwasu
octowego na czas 30 sekund, a następnie przez 10 sekund płukać wodą.
12. Obejrzeć żel na transiluminatorze UV.
13. Wykonać dokumentację żelu.
UWAGA! Wszystkie roztwory sporządzano bezpośrednio przed użyciem.
SPRAWOZDANIE:
W sprawozdaniu z wykonanego ćwiczenia należy umieścić krótki wstęp teoretyczny,
zawierający oprócz krótkiej informacji o podstawowej technice elektroforezy również
informacje o innych modyfikacjach tej metody oraz o metodach barwienia białek w żelach
poliakrylamidowych . Podać cel ćwiczenia i opisać poszczególne jego etapy. Przeprowadzić
analizę żelu (umieścić zdjęcie żelu wraz z opisem). Zmierzyć drogę migracji poszczególnych
białek wzorcowych. Wykonać wykres zależności drogi migracji od logarytmu masy
cząsteczkowej białek wzorcowych. Odczytać wartość masy cząsteczkowej nieznanego białka.
Przeprowadzić dyskusję wyników i podać wnioski.